專利名稱：對(duì)鞘翅目害蟲高效的cry8F基因、其表達(dá)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種對(duì)鞘翅目害蟲具有活性的蘇云金芽孢桿菌菌株，涉及對(duì)鞘翅目害蟲高毒力的cry8E和cry8F基因的核苷酸序列和分別由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，涉及協(xié)同組合使用cry8E與cry8F基因表達(dá)產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
金龜子屬于鞘翅目金龜總科(Scarabaeidae)，其幼蟲(俗稱蠐螬，本發(fā)明以下也簡稱為“蠐螬”)是一類重要的世界性分布地下害蟲，可危害糧食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、煙草、牧草、花卉、草坪草、果樹等多種植物。大量調(diào)查表明，蠐螬在地下害蟲中的危害居首位，其中主要以鰓金龜科和麗金龜科幼蟲為主，占總地下害蟲量的70-80％以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全國蠐螬發(fā)生面積約1億畝，嚴(yán)重年份曾達(dá)3億2千萬畝，產(chǎn)量損失高達(dá)20％以上，有些地塊甚至絕產(chǎn)。近年發(fā)生面積最大、發(fā)生量最多的為黃淮海地區(qū)，主要危害糧食、油料等作物；其它地區(qū)的危害情況也很嚴(yán)重，如危害甘蔗的蠐螬，在廣東、廣西、云南、四川、福建等地普遍發(fā)生；在西藏、青海、甘肅、新疆等西部地區(qū)，蠐螬的發(fā)生也很嚴(yán)重(魏鴻鈞等，《中國地下害蟲》，上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989，1-41；王永祥等，“冀中平原區(qū)蠐螬種類及綜合防治技術(shù)”，《河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)》(自然科學(xué)版)，1998，22(2)268-270)。以在我國油料作物中種植面積僅次于油菜居第二位的花生為例。我國的花生產(chǎn)量占世界花生總產(chǎn)量的35％左右，居世界首位，年出口收入達(dá)207億美元，2001年全國花生面積(500萬公頃)和總產(chǎn)(1450萬噸)均達(dá)到歷史最高水平。但蠐螬對(duì)花生的危害十分嚴(yán)重。為控制蠐螬的危害，一般采用農(nóng)業(yè)、化學(xué)、物理等綜合防治策略，這雖有一定成效，卻難以達(dá)到持續(xù)控制的效果。因此，尋找新的有效防治方法，已成為當(dāng)務(wù)之急。
在獲得對(duì)蠐螬高毒力Bt基因的基礎(chǔ)上，培育殺蠐螬的轉(zhuǎn)基因植物是一條值得探索的新的防治途徑。
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌。它在形成芽孢的同時(shí)，能產(chǎn)生蛋白性質(zhì)的伴孢晶體(parasporal crystal)，對(duì)鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And Molecular Biology Review，1998，623775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又稱δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。
目前人們已經(jīng)克隆了300多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬141種模式基因。近年國際上cry8類基因的研究動(dòng)向引人矚目。研究表明，這類基因?qū)瘕斪涌啤⑾蠹卓?、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺蟲作用。1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對(duì)金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M.et al.，Aunique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specificfor scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.1454-57)，1994年Sato等從中克隆出一種新的殺蟲基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of anovel crystal protein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic toscarabaeid insects，Curr.Microbiol.1994.2815-19.4)。目前已發(fā)現(xiàn)9種基因，編碼的蛋白由1160-1210個(gè)氨基酸組成，分子量在128-137kDa之間。詳細(xì)的信息見表1(Asano，S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding the protein，and controllingagent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP2002045186-A/2))。其中美國Mycogen公司分離的Cry8Aa1和Cry8Ba1對(duì)金龜科的多種害蟲具有明顯的殺蟲活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillus thuringiensis toxins active against scarabpests，1994，USP5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，發(fā)現(xiàn)對(duì)西方玉米根葉甲(Western corn rootworm)具有顯著的殺蟲效果并已用于轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的開發(fā)(Abad，Andre，R.，Duck Nicholas，B.，F(xiàn)eng，Xiang，F(xiàn)lannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans，2002，WO 02/34774 A2)。在我國，河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)近年來先后篩選獲得多株對(duì)黃褐麗金龜(Anomala exoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株，室內(nèi)生測死亡率均達(dá)100％(馮書亮等，“一株對(duì)金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株”，《中國生物防治》，2000，16(2)74-78)。
表1蘇云金芽孢桿菌Cry8類殺蟲晶體蛋白

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供對(duì)暗黑鰓金龜、椰心葉甲等鞘翅目重要害蟲具有高毒力的一種蘇云金芽孢桿菌菌株和兩種新的cry8E和cry8F模式基因序列，以及一種對(duì)暗黑鰓金龜具有明顯增效作用的cry8E和cry8F基因組合，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。
本發(fā)明的技術(shù)方案1.對(duì)鰓金龜?shù)叵潞οx有效的Bt菌株185的篩選與鑒定本發(fā)明自行分離了Bt菌株185。土壤采自河北省保定市順平縣蘋果園。取0.1-0.2g土樣放入裝有10ml滅菌水和玻璃珠的試管中，在旋渦振蕩器上振蕩3分鐘，將土粒打碎，然后放于200rpm搖床上振蕩10分鐘，75℃水浴鍋中水浴17分鐘，充分將非芽孢菌殺死，待稍靜置后，選取10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度，分別吸取100ul菌懸液于BP平板上，涂布均勻，于37℃培養(yǎng)三天，挑取似Bt菌落涂片鏡檢。發(fā)現(xiàn)一株含有球形晶體的Bt菌株(見附圖1)。
該菌株的培養(yǎng)條件為30℃，普通LB培養(yǎng)基，pH7.0。該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)、蘇云金芽孢桿菌種，并已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期為2004年11月5日，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1242。經(jīng)鑒定，關(guān)于該菌株的信息包括能形成芽孢，同時(shí)能形成球形伴孢晶體，SDS-PAGE電泳表明其殺蟲晶體蛋白約為130kDa(見附圖2)；其晶體蛋白在14小時(shí)開始表達(dá)，而生長曲線表明其14小時(shí)已進(jìn)入停滯期(見附圖3)，表明該晶體蛋白啟動(dòng)子可能為依賴芽孢形成的；生物學(xué)測定表明，該菌株對(duì)金龜科地下害蟲暗黑鰓金龜具有明顯殺蟲作用，7天校正死亡率達(dá)90％，對(duì)椰心葉甲也具有一定的殺蟲活性(見表2)。
表2Bt菌株185的殺蟲活性

2.菌株185中cry基因鑒定根據(jù)cry8類基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物S5un85-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’S3un85-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
表3是這些基因與引物的同源序列，表4是用這對(duì)引物預(yù)測的cry8基因擴(kuò)增產(chǎn)物，以及酶切片段大小，通過這種PCR-RFLP方法可以分別鑒定出將這些基因。
表3引物與cry8各基因的保守區(qū)配對(duì)情況及配對(duì)區(qū)在基因上的位置

注“N”為不配對(duì)堿基。
表4cry8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和限制性酶切長度多態(tài)性

用下列PCR反應(yīng)體系(50μL)鑒定了Bt菌株185


超純水補(bǔ)至50μL，混勻離心，加石蠟油30μL。
擴(kuò)增循環(huán)94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
結(jié)果(見附圖4)顯示與已知cry8類基因的圖譜不同，表明菌株185中可能含有新的cry8殺蟲基因。
3.菌株185中cry8E基因的克隆用PstI和KpnI酶切Bt菌株總DNA，用載體pBluescript SK(+)分別建立了兩個(gè)DNA片段庫，然后用引物S5un8/S3un8(見表3)和PCR方法檢測兩個(gè)DNA庫，得到兩個(gè)陽性克隆pSS3612和pSS162，分別插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(見附圖5)。酶切分析pSS3612，7kb的PstI和KpnI雙酶切片段含有cry8Ea1的全長基因，用pBluescript SK(+)亞克隆該片段，得到pSS3612-7，同時(shí)亞克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(見附圖6)。將pSS162和pSS3612-7的插入序列測序。得到序列SEQ ID NO 1。
4.cry8Ea1基因的序列分析序列SEQ ID NO 1為pSS3612中PstI和KpnI雙酶切片段，序列全長7276bps，分析表明其含有兩個(gè)較大的開放閱讀框，ORF1的位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152，GC含量為38.03％，編碼1164個(gè)氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性，表5為其同源性數(shù)據(jù)。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Ea1。
表5Cry8蛋白同源比較數(shù)據(jù)

本發(fā)明進(jìn)一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸組成(見表6，附圖7)，得知其分子量為131.56kDa，等電點(diǎn)為pH4.735(見附圖8)。
表6Cry8Ea1蛋白的氨基酸組成

5.cry8Fa1基因的克隆對(duì)pSS162質(zhì)粒中插入序列進(jìn)行了分析，片段長2.3kb，具有完整的3’端序列，與cry8Ea1序列完全同源，但5’端差異較大，并且缺少完整的讀碼框，根據(jù)該序列的特異區(qū)段設(shè)計(jì)了1對(duì)引物(5-185-KpnITTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-KpnlTATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆該全長基因，將菌株185的質(zhì)粒DNA用XbaI酶切，與載體pBluescript SK(+)連接，篩選得到插入約9Kb外源片段的陽性克隆pSS266(見附圖9)，進(jìn)一步酶切分析表明ClaI酶切產(chǎn)生的3.0kb片段含有5’端讀碼框(見附圖10)，用pBluescript SK(+)亞克隆得到該片段，陽性克隆命名為pSS266-3，對(duì)該片段進(jìn)行了測序，把得到的序列與pSS162中的插入序列進(jìn)行拼接得到3.9kb片段。
6.cry8F基因的序列分析對(duì)上述3.9kb的核酸片段進(jìn)行測序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。對(duì)該序列進(jìn)行分析表明該序列含有1個(gè)較大的開放閱讀框357-3878；GC含量為36.88％；編碼1174個(gè)氨基酸組成的蛋白(其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。進(jìn)一步的同源分析表明，該蛋白質(zhì)與Cry8類蛋白有較高的同源性(同源性數(shù)據(jù)見以上表5)。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有64.8％(Cry8Ea1)，該蛋白被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Fa1。
本發(fā)明用生物分析軟件Bioedit進(jìn)一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸組成，結(jié)果見表7和附圖11。結(jié)果表明，該蛋白的分子量為133.08kDa，等電點(diǎn)為pH4.565(見附圖12)。
表7Cry8Ea1蛋白的氨基酸組成

7.cry8E和cry8F基因的表達(dá)本發(fā)明根據(jù)克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全長序列，設(shè)計(jì)了用于表達(dá)兩種基因的引物，序列如下8E1CGCGGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG8E2ACGCGTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC8F1CGCGGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG8F2CATTAACTCTGCCCACGGATCT(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG8F3CTTGACTTCTTTGCACCAGAA(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG8F4CCGCTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC引物8E1和8E2分別引入BamHI和SalI位點(diǎn)，以含全長cry8Ea1的pSS3612質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到全長基因，插入Bt表達(dá)載體pSXY422b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD-73-中(該突變株來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，可以向公眾提供)，得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全長基因內(nèi)存在1個(gè)BamHI切點(diǎn)，用重疊引物PCR的方法對(duì)這一位點(diǎn)進(jìn)行了突變，重疊引物8F2和8F3中引入了點(diǎn)突變(劃線部分)、引物8F1和8F4分別引入BamHI和XhoI。以含全長cry8Fa1基因的pSS266質(zhì)粒DNA為模板，分別用8F1和8F2、8F3和8F4擴(kuò)增得到0.3kb和3.1kb產(chǎn)物，再分別以它們?yōu)槟０澹謩e利用引物8F1和8F4擴(kuò)增得到3.4kb的全長基因，插入Bt表達(dá)載體pSXY422b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。
分別將上述兩株工程菌30℃于牛肉膏培養(yǎng)基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，121℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌)中培養(yǎng)30小時(shí)，取500μL菌液至Eppendorf管中，超聲波破碎30秒鐘(B.Braun U Labsonic，230V，T間隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5N NaOH，25℃作用5分鐘；加入65μL 3×樣品緩沖液(925μL上樣緩沖液+75μL β-巰基乙醇)，100℃煮沸5分鐘。離心除去沉淀。上樣10uL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析結(jié)果(方法參見Sambrook，J.et al，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.1989)。結(jié)果(見附圖13)表明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均獲得了表達(dá)，表達(dá)物的分子量為130kDa左右。
8.Cry8E和Cry8F蛋白的活性測定將Bt工程菌株接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。將受體菌株HD-73-接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天。將培養(yǎng)物洗下，2倍梯度濃度稀釋，將40ml菌懸液加入到200g有均勻粗細(xì)土豆絲的細(xì)土(紫外線滅菌)中，混勻，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鰓金龜15天齡幼蟲20頭，以加入清水的處理為空白對(duì)照，28℃感染飼養(yǎng)，14天檢查死蟲數(shù)，計(jì)算LC50。結(jié)果見表8，表明工程菌株對(duì)暗黑鰓金龜具有極高的毒殺活性。其表達(dá)的Cry8E和Cry8F蛋白均具有殺暗黑鰓金龜幼蟲的活性。
表8Bt工程菌和185菌株對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲的毒力測定

菌種保藏信息菌種名稱芽孢桿菌屬、蘇云金芽孢桿菌，Bacillus thuringiensis保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏日期2004年11月5日保藏編號(hào)CGMCC NO.124

圖1185菌株芽孢和晶體形態(tài)。
圖2185菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析。
圖3185菌株生長曲線。
圖4菌株185的PCR-RFLP圖譜。其中M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.PCR產(chǎn)物，2.PCR產(chǎn)物酶切。
圖5重組質(zhì)粒pSS162和pSS3162的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切分析。
其中M.λDNA/Eco 130I，1.pSS162 PCR產(chǎn)物，2.pSS3162 PCR產(chǎn)物，3.pBlueScriptSK(+)/KpnI，4.pSS162/KpnI，5.pSS3162/PstI。
圖6pSS3612插入片段的亞克隆酶切分析。
其中M.λDNA/Eco 130I，1.pBlueScript SK(+)/KpnI，2.pSS3162/PstI+KpnI，3.pSS3612/KpnI，4.pSS3162/PstI+KpnI。
圖7Cry8Ea1蛋白的氨基酸組成圖。
圖8Cry8Ea1蛋白的滴定曲線。
圖9重組質(zhì)粒pSS266的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切分析。其中M.λDNA/Eco 130I，1.pSS266 PCR產(chǎn)物，2.pSS162/XbaI，3.pBlueScript SK(+)/XbaI。
圖10重組質(zhì)粒pSS266的酶切分析。
其中1.XbaI，2.NotI，3.PstI，4.NdeI，5.ClaI，6.SacI，7.KpnI，M.λDNA/Eco130I。
圖11Cry8Fa1蛋白的氨基酸組成圖。
圖12Cry8Fa1蛋白的滴定曲線。
圖13cry8Ea1和cry8Fa1基因在Bt無晶體突變株中的表達(dá)。
其中M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.Biot8E，2.Biot8F，3.Bt 185，4.HD-73-。
具體實(shí)施例方式
以下敘述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
實(shí)施例1、對(duì)鰓金龜?shù)叵潞οx有效的Bt菌株185的篩選與鑒定土壤采自河北省保定市順平縣蘋果園。取0.1-0.2g土樣放入裝有10ml滅菌水和玻璃珠的試管中，在旋渦振蕩器上振蕩3分鐘，將土粒打碎，然后放于200rpm搖床上振蕩10分鐘，75℃水浴鍋中水浴17分鐘，充分將非芽孢菌殺死，待稍靜置后，選取10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度，分別吸取100ul菌懸液于BP平板上，涂布均勻，于37℃培養(yǎng)三天，挑取似Bt菌落涂片鏡檢。發(fā)現(xiàn)一株含有球形晶體的Bt菌株(見附圖1)。
該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)、蘇云金芽孢桿菌種。將該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提交保藏，保藏日期為2004年11月5日，保藏編號(hào)為CGMCCNO.1242。經(jīng)鑒定，關(guān)于該菌株的信息包括能形成芽孢，同時(shí)能形成球形伴孢晶體，SDS-PAGE電泳表明其殺蟲晶體蛋白約為130kDa(見附圖2)，其晶體蛋白在14小時(shí)開始表達(dá)，而生長曲線表明其14小時(shí)已進(jìn)入停滯期(見附圖3)，表明該晶體蛋白啟動(dòng)子可能為依賴芽孢形成的；生物學(xué)測定表明，該菌株對(duì)金龜科地下害蟲暗黑鰓金龜具有明顯殺蟲作用，7天校正死亡率達(dá)90％，對(duì)椰心葉甲也具有一定的殺蟲活性。
實(shí)施例2、菌株185中cry基因鑒定根據(jù)cry8類基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物S5un85-’CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3’S3un85-’CTGACTGATTTCCACCATCACG-3。
用下列PCR反應(yīng)體系(50μL)鑒定了Bt菌株185

超純水補(bǔ)至50μL，混勻離心，加石蠟油30μL。
擴(kuò)增循環(huán)94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。結(jié)果(見附圖4)顯示與已知cry8類基因的圖譜不同，表明菌株185中可能含有新的cry8殺蟲基因。
實(shí)施例3、菌株185中cry8E基因的克隆用PstI和KpnI酶切Bt菌株總DNA，用載體pBluescript SK(+)分別建立了兩個(gè)DNA片段庫，然后用引物S5un8/S3un8和PCR方法檢測兩個(gè)DNA庫，得到兩個(gè)陽性克隆pSS3612和pSS162，分別插入11kb的pstI片段和2.0kb的KpnI片段(見附圖5)。酶切分析pSS3612，7kb的PstI和KpnI雙酶切片段含有cry8Ea1的全長基因，用pBluescript SK(+)亞克隆該片段，得到pSS3612-7，同時(shí)亞克隆了4kb的KpnI片段中，得到pSS3612-4(如附圖6)。將pSS162和pSS3612-7的插入序列測序，得到序列SEQ ID NO 1。該序列為pSS3612中PstI和KpnI雙酶切片段，序列全長7276bps，分析表明其含有兩個(gè)較大的開放閱讀框，ORF1的位置是3658-7152，ORF2的位置是2799-3377。
ORF1的位置是3658-7152，GC含量為38.03％，編碼1164個(gè)氨基酸組成的蛋白，經(jīng)測定，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性(見表5)。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有58.2％(Cry8Bb1)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Ea1。
本發(fā)明進(jìn)一步分析了Cry8Ea1蛋白的氨基酸組成(見表6和附圖7)，得知其分子量為131.56kDa，等電點(diǎn)為pH4.735(見附圖8)。
實(shí)施例4、cry8Fa1基因的克隆對(duì)pSS162質(zhì)粒中插入序列進(jìn)行了分析，片段長2.3kb，具有完整的3’端序列，與cry8Ea1序列完全同源，但5’端差異較大，并且缺少完整的讀碼框，根據(jù)該序列的特異區(qū)段設(shè)計(jì)了1對(duì)引物(5-185-KpnITTGGTATGGCGTTTCGTTG；和3-185-KpnlTATTGCAGGTCCAGGATTCAC)，用于克隆該全長基因，將185質(zhì)粒DNA用XbaI酶切，與載體pBluescript SK(+)連接，篩選得到插入約9Kb外源片段的陽性克隆pSS266(見附圖9)，進(jìn)一步酶切分析表明ClaI酶切產(chǎn)生的3.0kb片段含有5’端讀碼框(見附圖10)，用pBluescript SK(+)亞克隆得到該片段，陽性克隆命名為pSS266-3，對(duì)該片段進(jìn)行了測序，把得到的序列與pSS162中的插入序列進(jìn)行拼接得到3.9kb片段。對(duì)核酸片段進(jìn)行測序，得到如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。對(duì)該序列進(jìn)行分析表明該序列含有1個(gè)較大的開放閱讀框357-3878；GC含量為36.88％；編碼1174個(gè)氨基酸組成的蛋白(該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示)。進(jìn)一步的同源分析表明，該蛋白質(zhì)與Cry8類蛋白有較高的同源性(見表5)。由于與已知的Cry8類蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有64.8％(Cry8Ea1)，該蛋白被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會(huì)命名為Cry8Fa1。
本發(fā)明用生物分析軟件Bioedit進(jìn)一步分析了Cry8Fa1蛋白的氨基酸組成(見表7和附圖11)。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的分子量為133.08kDa，等電點(diǎn)為pH4.565(見附圖12)。
實(shí)施例5、cry8E和cry8F基因的表達(dá)根據(jù)克隆的cry8Ea1和cry8Fa1基因的全長序列，設(shè)計(jì)了用于表達(dá)兩種基因的引物，序列如下8E1CGCGGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG8E2ACGCGTCGAC(Sal I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC8F1CGCGGATCC(Bam HI)GATGAGTCCAAATAATCAAAATG8F2CATTAACTCTGCCCACGGATCT(C)TCTGGTGCAAAGAAGTCCAG8F3CTTGACTTCTTTGCACCAGAA(G)GATCCGTGGGCAGTTAATG8F4CCGCTCGAG(Xho I)CTCTACGTCAACAATCAATCAATTC引物8E1和8E2分別引入BamHI和SalI位點(diǎn)，以含全長cry8Ea1的pSS3612質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到全長基因，插入Bt表達(dá)載體pSXY422b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8E。
由于cry8Fa1全長基因內(nèi)存在1個(gè)BamHI切點(diǎn)，用重疊引物PCR的方法對(duì)這一位點(diǎn)進(jìn)行了突變，重疊引物8F2和8F3中引入了點(diǎn)突變(劃線部分)、引物8F1和8F4分別引入BamHI和XhoI。以含全長cry8Fa1基因的pSS266質(zhì)粒DNA為模板，分別用8F1和8F2、8F3和8F4擴(kuò)增得到0.3kb和3.1kb產(chǎn)物，再分別以它們?yōu)槟０澹謩e利用引物8F1和8F4擴(kuò)增得到3.4kb的全長基因，插入Bt表達(dá)載體pSXY422b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SCS110，提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8F。
分別將上述兩株工程菌30℃于牛肉膏培養(yǎng)基中培養(yǎng)30小時(shí)，取500μL菌液至Eppendorf管中，超聲波破碎30秒鐘(B.Braun U Labsonic，230V，T間隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5NNaOH，25℃作用5分鐘；加入65μL 3×樣品緩沖液(925μL上樣緩沖液+75μL β-巰基乙醇)，100℃煮沸5分鐘。離心除去沉淀。上樣10uL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。結(jié)果(見附圖13)表明，工程菌Biot8E和Biot8F中的cry8Ea1和cry8Fa1基因均獲得了表達(dá)，表達(dá)物的分子量為130kDa左右。
實(shí)施例6、Cry8E和Cry8F蛋白的活性測定將Bt工程菌株接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天。將受體菌株HD-73-接種在普通細(xì)菌瓊脂克氏瓶培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天。將培養(yǎng)物洗下，2倍梯度濃度稀釋，將40ml菌懸液加入到200g有均勻粗細(xì)土豆絲的細(xì)土(紫外線滅菌)中，混勻，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鰓金龜15天齡幼蟲20頭，以加入清水的處理為空白對(duì)照，28℃感染飼養(yǎng)，14天檢查死蟲數(shù)，計(jì)算LC50。結(jié)果(見表8)表明工程菌株對(duì)暗黑鰓金龜具有極高的毒殺活性。其表達(dá)的Cry8E和Cry8F蛋白均具有殺暗黑鰓金龜幼蟲的活性。
附本發(fā)明所涉及的DNA序列和蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO 1(cry8Ea1基因的核苷酸序列)ctgcagaata gacacggata cgatcgcctt cacataaatg ctgaaatctt cttctagaca 60PstIttcttgtgtc acctcatttt ttgtttttaa actacagtat gttatatgca aaagaagggg120tagaggattg ggccttttac tacaaaaata caaaaacata cttatgattg catatggaga180tgtcaaagtg catgcattaa aaatggatta gaaatgattt caaataggca aaagcctatt240ccaatgaaga aagattgaca taggctattg tatatagaag aaggtaacga ggaacatact300gttagggtac acctaacata gaagtatgct tgtttgaagc atgtacatct tgaaatacca360gtagaaatat gggggaacat gttattttaa taattggtaa aatcttttgt tagaaggtga420aggcgtatga gacaacaaag agtatgtgag tgtaacaatt gtaggaaaaa gggtgagaag480aatcatcttt gtcaatatat aaaacgtggg gattgtatat gggtcagttc ctttggaagc540aagttacaaa agagtggtat tttcctgtta ataaaagatt cttttttatt atggtttgat600gaaaaacatc aattaaatca aaccagtcta caggggatcc atattgaaaa aagacaataa660atgaagaagg agtctcattg ttaacgaagt gtgtacatct atcatgtaca catcgtaagt720cgtatgttct acctgtatct ggtaggaaag aattgtcgca tgtgcaaggc gtatatacac780aaacatgttt tgttatattt ttgaataatt tgaaaataaa tatgttataa ttaatatact840ttcgtgtgtt ttttttgcga aatccctaga aagtatcgta aaaagtccct aacaattttg900tgaactgaac ccaaaaaatt agacaaatat attaagcagc tactaaggat tgaactctgt960attgcacggg ggacaatcct tttagttttg ttttaattct tttgtgattg tagtaatgaa1020tataagtttc tagttcttgc ttaaattgtt ccatactttc aaactcttta agataaagta1080attcagactt taataagcca aagaaatttt ccatgactgc attatctaag caatttccct1140tacgggacat actttggata acgttatgtt ttttaagcga ctgatgatat tgtcgcattt1200gataatgcca accttgatcc gagtgtaaaa taggagtttc cttatcattc aaacattgaa1260acgccttatt taacatttta gaaacaaggg aataggcagg tctatgttct atattgtaag1320ctataatttc tccgttatat aagtcttaaa tgggtgatag atatagtttt ttaccatgta1380agtggaactc cgtcacatct gttacccatt tctcgtttgg ttttgatgcg tgaaaattac1440gttttaaaat attaggagcg aatttcccga cagtcccttt atatgaacga tattttttta1500atcgaacaag acattttaat cccaggatat tcattaaacg tcgaacggtt ttatgattta1560atgcatggcc tcgattacgt aattccaatg taatacgacg ataaccatac ctcccaaaat1620tctcactaaa aatctcttta attaattctt taactttctt atatttatct ggacgtttcg1680cttgtttcat ccagtaataa tacgtactac gagcgatatt agcgactttc acaaggtcaa1740cgaccttata tttatgcctt aattcataaa tcaattgcgc tttgtcttgg tctgtgatgt1800tttcttcttt tgaactaagg cattcaactt ttttaaatag tcattttcca tacgcagacg1860ttcattctct gcttgtagcg cttctataga accttcaaga aatacttcgt tttgttttaa1920atgttgtagc ttagcttttt ctttggccat ggttagacgc ccctttttct ttgattttag1980ggcatctaat ccttctgttt cataagctac tttccatttt cggagtgttt cgcaagaagg2040aatattaaaa aaagcagctg tttctctcag agatgtccca ttttcattca tataatgaat2100tacatctagt ttatactcga gagggtaagt tgtatagcgt ttttcaaacg ccttttcccc2160tgaaaattca aaccgtttaa tccattgata aagttctcta ggatgaaccc ctatagaatt2220agcaatggtt tttccgcctt ccgtaccttc tagatatcgt tttactgctt gtattttatc2280
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EVLISERDAV KTAISLVGTI LGKLGVPLVG PIVSLYSTLI DVLWPGGKSQ WEIFMEQVEA120LINQKIAEYA RAKALAELEG LGNNYQLYLT ALEEWQENPS STRVLRDVRN RFEILDSLFT180QYMPSFRVTG YEVPLLSVYA QAANLHLLLL KDASIFGEEW GFSTTAINNY YNRQMSLIAQ240YSDHCVQWYR TGLDRLKGSN AKQWVEYNRF RREMTLSVLD IMTLFPMYDM RTYPMETKAQ300LTREVYTDPI GAIGAQGSWY DSAPSFNTLE STFIRGKHLF DFITRLSIYT GRSSFSASNY360LKKWIGHQIS SQPIGGSIQT QTYGTTSGSS VIATQQIGFT GFDVYKTLST AGVLFAYTSK420YYGVSKVVFD AIYPDNKYKT TFTYNPGSEG IGAQEKDSEV ELPPETLDQP NYEAYSHRLN480YVTFIRNPDV PVFSWTHRSA DRTNTVYSDK ITQIPVVKAS DGPKPSANEV GHYLGGDPIS540FNSSGSTGVI RLNINSPLSQ KYRVRIRYCS SVDFDLDVVR GGTTVNNGRF NKSAPNVGWQ600SLKYENFKFA SFSTPFTFNQ AQDTLKISVR NFSSIVGGSV VYIDRIELIP VNATYEAEQD660LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL FDAVKEAKRL720SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD TETYPTYLYQ780KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP PVNSDGRINR840CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF KITDPEGYAT900LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD RLYADYQDQQ960LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW GLYDQRNAIP1020NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV LRVTARKEGV1080GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK TVTFIPYTDQ1140VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE 1164SEQ ID NO 3(cry8Fa1基因的核苷酸序列)atcgataaag ggaatggaag acaactcgca aatggctcaa atatcgggtg ttttttattt60tgattatgca taattacaat gaaaacaaaa agaattcatt tgtatagtat tcccagaaat120atcgtgacat cgtttatcat acaataattc gttctaagaa gagccggatt atttttcaat180ctaacaggaa ttttattgtc tacagaagaa tattcttatc acggtaatga ggagagggag240tgaaaatcaa aagagtacct gatttgtcat gtaagaacaa aagaaatcga tcgtacagga300aagtcaaaag aaagtgtaaa aaattttata tcttttgtat gtata aaaatag 360RBS ORF→agtccaaata atcaaaatga atatgaaatt atagatatgg caccttctac atctgtaacc420aatgattcta acagataccc ttttgcgaat gagcccacaa atgcattaca aaatatgaat480tataaggatt atttaagaat gtctgaggga tattctcctg aatatttaac aagcctaagt540ccttacagcc agtttggcac agttgataag atcatcagta ttattagtct attgaatagt600gctgcaggta ttcctggtct tgattttttt actggattgc tgcaatttat tcttgacttc660tttgcaccag aggatccgtg ggcagagtta atggaactag tggaacaact catagatcaa720aaaataacag ttgctacaag agaaaaggcg ctcgcagaat taagaggact gataaatgga780taccttgtat atcagcaatc attagaaagt tggctggaaa atccaaatgc tacaagagct840agtatagttc gagaacaata tgtcgcttta gaacttgatt ttgttacttc gatttcatct900tttgcgatag ctggacagga agtaccgtta ttagccgtgt acgcacaagc tgctaattta960catttgttat tattgagaga tgtgtcaata tttggagaag aatggggatt aacagtaaat1020gaggttaata ccttctatat tcgtcaaatg acttatacaa ctgagtatag tgattattgt1080gtaagaattt ataatactgg cttaaataaa ttaaaaggat ctagtgcatc tagttgggtt1140gattataatc gctttcgtag agaaatgaac ttactagtac tagatattat tgcgttattt1200ccaaactatg atgttcgtag gtatccaatg gaaacaacaa cggaattaac aagagtagtt1260tacactgatc caattgtgtt tgacgaaagg aagggggtgg cgtcgactca tagttggacg1320gcgattgcac catctttctc aagtatagaa tctctaactc gacgaccagg attatttaca1380tggttagatc aactaactat tttttcgaaa cgcatatcgc aacctagtgt atttataaat1440
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MSPNNQNEYE IIDMAPSTSV TNDSNRYPFA NEPTNALQNM NYKDYLRMSE GYSPEYLTSL60SPYSQFGTVD KIISIISLLN SAAGIPGLDF FTGLLQFILD FFAPEDPWAE LMELVEQLID120QKITVATREK ALAELRGLIN GYLVYQQSLE SWLENPNATR ASIVREQYVA LELDFVTSIS180SFAIAGQEVP LLAVYAQAAN LHLLLLRDVS IFGEEWGLTV NEVNTFYIRQ MTYTTEYSDY240CVRIYNTGLN KLKGSSASSW VDYNRFRREM NLLVLDIIAL FPNYDVRRYP METTTELTRV300VYTDPIVFDE RKGVASTHSW TAIAPSFSSI ESLTRRPGLF TWLDQLTIFS KRISQPSVFI360NSWAGHKIST FRTQKTDILI NTTHGDTNNP IKEFVVDTKK VEDIYQTIAY PHAVANEVFY420LFGVPKVDFN MVPAGGSANS AHTLIFSDST GGRLESITKN SEAELPPTES LSDTPQPNQV480TYSHRLDYAT IIKANKSYGS GYIPLLGWTH RSVDRNNTIY PNKITQIPAV KAFSYTESFN540VNVIAGPGFT GGDLISLGHL ENIYMKLNVP NPQKFRVRIR YAASTTSYLQ ITGLSNLAQS600DRFEQTYSNE NENNLMFENF QYVELRNIFS VDAPLENHQV SIQNYQGNGF VIIDRIEFIP660VNATYEAEQD LDSAKKAVNT LFTNTKDGLR PGVTDYEVNQ AANLVECLSD DLYPNEKRLL720FDAVKEAKRL SEARNLLQDP DFQEINGENG WTASTGIEVV EGDALFKGRY LRLPGAREMD780TETYPTYLYQ KVEEGVLKPY TRYRLRGFVG SSQGLEISTI RHQTNRIVKN VPDDLLPDVP840PVNSDGRINR CSEQKYVNSR LEGERGLPNG NRSAEAHEFS LPIDIGELDY NENAGIWVGF900KITDPEGYAT LGNLELVEEG PLSGDALERL QREEQQWKLQ MTKRREETDR KYTAAKQAVD960RLYADYQDQQ LNPNVEITDI TAAQNLIQSI PYVYNEMFPE IQGMNYTKYT ELTNRLQQAW1020GLYDQRNAIP NGDFRNELSN WNTTSGVNVQ QINNTSVLVM PNWDGQVSQQ FTVQPNQRYV1080LRVTARKEGV GNGYVSIRDG GNQTETLTFS ASDYNTDSVY NTQVSNTNGL YNEQTGYTTK1140TVTFIPYTDQ VWIEMSETEG MFYIESVELI VDVE117權(quán)利要求
1.cry8F基因，其特征是該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
2.一種cry8Fal蛋白，其特征是該蛋白是由權(quán)利要求1的基因所編碼，且其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
3.權(quán)利要求1所述的cry8F基因在殺害鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，是將cry8F基因轉(zhuǎn)入植物或微生物中使其產(chǎn)生對(duì)鞘翅目害蟲的毒性。
5.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，是將cry8F基因表達(dá)的cry8Fal蛋白用于殺蟲劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及“對(duì)鞘翅目害蟲高效的cry8F基因、其表達(dá)蛋白及其應(yīng)用”，屬生物防治技術(shù)領(lǐng)域。使用cry8F基因或/和其編碼的蛋白質(zhì)，對(duì)鞘翅目害蟲產(chǎn)生高毒力，并可通過應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對(duì)相關(guān)害蟲的毒性，克服或延緩昆蟲對(duì)工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A01N63/02GK101054589SQ20071009054
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2004年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者宋福平, 張 杰, 馮書亮, 黃大昉, 王容燕, 郎志宏 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所