專利名稱：鹿角蕨的無菌孢子萌發(fā)和試管育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹿角蕨的繁殖栽培方法，具體來說涉及采用無菌孢子萌發(fā)和試管育苗繁殖栽 培鹿角蕨的方法。
技術(shù)背景鹿角蕨又名麋角蕨、蝙蝠蕨、鹿角羊齒等，水龍骨科鹿角蕨屬(,h^ce/^/歷)植物，是 觀賞蕨中姿態(tài)最為奇特的一類，屬于附生性觀賞蕨。鹿角蕨的葉有二型，營養(yǎng)葉較小，呈圓 形、橢圓形或扇形，密貼于附生物之上，孢子葉形狀十分別致，形似梅花鹿角，葉面密被毛 絨，新生時(shí)為嫩綠色，成熟時(shí)轉(zhuǎn)為淺褐色，十分逗人喜愛。鹿角蕨在歐美的公園、植物園、 商店、居室、窗臺(tái)等地方的裝飾和布置十分流行，是室內(nèi)觀葉植物中珍貴稀有的精品，特別 是室內(nèi)立體綠化的好材料。若將鹿角蕨貼生于古老枯木或裝飾于吊盆，可點(diǎn)綴書房、臥室、 客室和窗臺(tái)，若作懸吊式或鑲掛式布置，雅致而充滿異國風(fēng)情，更添自然景趣。鹿角蕨屬植 物全世界約有18種，原產(chǎn)于非洲、亞洲、大洋洲和南美的熱帶、亞熱帶雨林中，大多具有極 高的觀賞價(jià)值。我國僅重裂鹿角蕨(尸7at/cen'鵬附7h'c/^7)—種，屬于國家二級(jí)保護(hù)植物。 但目前，我國在大力引進(jìn)國外各貴花卉的同時(shí)，己幵始對其它鹿角蕨品種的引進(jìn)，并進(jìn)行了 開發(fā)利用，己并受到越來越多的人喜愛，具有巨大的市場前景。鹿角蕨的繁殖可采用分株和孢子播種繁殖，但分株繁殖速度慢，繁殖系數(shù)低。目前，國 內(nèi)、外未見對其進(jìn)行大規(guī)模組織培養(yǎng)生產(chǎn)和專利申請的報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種新穎的、簡單而快速的鹿角蕨繁殖方法。本發(fā)明采用無菌孢子萌發(fā)和試管成苗能成功地進(jìn)行鹿角蕨的快速繁殖，培養(yǎng)基成分獨(dú)特、 簡單，繁殖方法新穎、具有投入少，產(chǎn)出高的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。 本發(fā)明的鹿角蕨繁殖栽培方法，包括以下步驟-(1) 孢子無菌萌發(fā)采集健壯生長的鹿角蕨(尸7a^ceh鵬)葉背的成熟孢子用70% 75%酒精浸泡10 30 s，取出置于0. 1% 0. 2%升汞溶液或1% 2%的次氯酸鈉溶液消毒10 15 min，無菌水洗后，接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上；在(25±1) 'C先暗培養(yǎng)2 3周，然后8 12 h/天、1500 2000 lx光照下，培養(yǎng)形成原葉體，所述的培養(yǎng)基每升中含有活性炭0.5 1 g， 椰子乳50 150 mL，赤霉素0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其余為MS;(2) 配子體生長培養(yǎng)將步驟(1)的原葉體轉(zhuǎn)入配子體生長培養(yǎng)基，在(25±1) °C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照下培養(yǎng)，形成叢生葉狀的配子體，所述的培養(yǎng)基每升中含 有水解酪蛋白0. 1 0.3 g， 6-芐基嘌呤0.2 1.0mg，萘乙酸0. 1 0. 5mg，瓊脂5 7 g， 其余為MS;(3) 授精形成合子將步驟(2)的叢生的葉狀的配子體先接種到液體配子體生長培養(yǎng) 基上，在(25±1) 。C， 8 12h/天、1500 2000 lx光照，50 100 r/min振蕩培養(yǎng)2 3天， 再將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子體生長培養(yǎng)基，在與上述相同的條件下，繼續(xù)培養(yǎng) 長出2倍體的孢子體植株，所述的液體配子體生長培養(yǎng)基每升中含有活性炭0.5 1 g，椰子 乳50 150mL，赤霉素0.1 0.5mg，其余為MS，所述的固體配子體生長培養(yǎng)基每升中含有 水解酪蛋白O. 1 0.3 g， 6-芐基嘌呤0.2 1.0mg，萘乙酸0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其 余為MS;(4) 孢子體增殖培養(yǎng)將步驟(3)中的孢子體小植株接種到綠球體誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上， 在(25±1) 。C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照培養(yǎng)，在植株基部誘導(dǎo)形成綠球體，這些 綠球體在與上述相同的培養(yǎng)基上增殖，并形成小植株，所述的培養(yǎng)基每升中含有椰子乳100 150mL，蛋白胨l 2g， 6-芐基嘌呤0.2 1.0mg，瓊脂5 7 g,其余為MS;(5) 生根培養(yǎng)將步驟(4)得到的小植株接種到生根壯苗培養(yǎng)基上，在(25±1) °C， 8 12 h/天、1500 2000 lx光照培養(yǎng)，形成帶根的健壯植株，所述的培養(yǎng)基每升中含有活 性炭0. 3 0. 5 mg，吲哚丁酸0. 1 0. 5 mg，瓊脂5 7 g，其余為1/2 MS，所述的1/2 MS是 將MS中的大量元素減半，其它成分不變組成的培養(yǎng)基；(6) 出瓶移栽生根苗于70% 80%遮蔭的自然光下煉苗5 7天，將其由培養(yǎng)瓶中取出， 洗凈根部的培養(yǎng)基，栽培于水苔中，25 28°C， 80% 90%遮蔭，濕度60% 90%，保持通風(fēng)， 植株恢復(fù)生長。步驟(1)中的鹿角蕨可以是該屬中的各種鹿角蕨，例如重裂鹿角蕨(/^"7Ce/^， ^Jic/ i_z. )、 二叉鹿角蕨(尸7a^Kce"'咖A_z'/i/rcat，)、大鹿角蕨(/^atyceri"/ 7 gra"ofe)、 長葉鹿角蕨6^7at/ceri"歷wa7i/"ch7入美洲鹿角蕨(Z^cari〃歷3"(//"〃777)、昆士蘭鹿角 蕨(尸7at/ceri鵬/w'7h'力等，所述的無菌水洗5 6次，在25土rC先暗培養(yǎng)2 3周，然后 8 12 h/天，1500 2000 lx光照下，再培養(yǎng)4 5周，形成原葉體；步驟(2)中培養(yǎng)4 5 周，形成大量叢生葉狀的配子體；步驟(3)中先接種到液體配子體生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 3天，以促進(jìn)精子移動(dòng)到頸卵器形成合子，再將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子體生長 培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)3 4周，長出2倍體的孢子體植株；步驟(4)中培養(yǎng)6-8周，可以在 植株基部誘導(dǎo)形成大量綠球體；步驟(5)中培養(yǎng)4 6周，形成帶根的健壯植株；步驟(6) 培養(yǎng)1周后可見植株恢復(fù)生長，成活率80% 90%， 30-40天后可上盆栽培。上述培養(yǎng)基中的MS為國際通用的培養(yǎng)基，所述的1/2MS是將MS中的大量元素減半，其 它成分不變而形成的培養(yǎng)基，其成分和配制方法參看文獻(xiàn)(譚文澄、戴策剛主編.觀賞植物組 織培養(yǎng)技術(shù).北京中國林業(yè)出版社，1991.)。本發(fā)明采用無菌孢子萌發(fā)和試管成苗能成功地進(jìn)行鹿角蕨的快速繁殖，培養(yǎng)基成分獨(dú)特、 簡單，繁殖方法新穎、具有投入少，產(chǎn)出高的特點(diǎn)，是利用植物試管技術(shù)進(jìn)行珍稀植物種苗
的規(guī)?；a(chǎn)的高新生物技術(shù)，試管種苗移栽成活率達(dá)80% 90%。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。 實(shí)施例1:采集溫室栽培的重裂鹿角蕨(Wa^rer^歷ra〃ic力2'i Hook)健壯植株孢子葉背上的成 熟孢子，用70%酒精浸泡10 s，取出置于0.2%升汞溶液中消毒10 min ，無菌水洗5次后， 接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(每升中含有活性炭0.5g，椰子乳50mL，赤霉素0. lmg，瓊脂7 g, 其余為MS)，在25X:先暗培養(yǎng)2周，然后每天12小時(shí)1500 lx光照下培養(yǎng)5周，形成原葉體。 將原葉體轉(zhuǎn)入配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有水解酪蛋白0.1 g, 6-芐基嘌呤0.2 mg，萘 乙酸O. 1 mg，瓊脂7 g,其余為MS)， 25°C，每天12小時(shí)1500 lx光照下培養(yǎng)5周，形成大 量叢生葉狀的配子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有活性炭0. 5 g，椰子乳50mL,赤霉素0. lmg，其余為MS)， 25°C，每天12小時(shí)1500 lx光照，50r/min 振蕩培養(yǎng)2天，以促進(jìn)精子移動(dòng)到頸卵器形成合子；將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子 體生長培養(yǎng)基(每升中含有水解酪蛋白0.2 g， 6-芐基嘌呤0.2mg，萘乙酸O. lmg，瓊脂7 g，其余為MS),在與上述相同的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)4周，長出2倍體的孢子體植株。將孢子 體小植株接種到綠球體誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基(每升中含有椰子乳100 mL，蛋白胨lg， 6-芐基嘌 呤0.2 mg，瓊脂7 g,其余為MS), 25°C，每天12小時(shí)1500 lx光照，培養(yǎng)6周，可以在植 株基部誘導(dǎo)形成大量綠球體，這些綠球體在相同培養(yǎng)基上增殖，并形成小植株。將小植株接 種到生根壯苗培養(yǎng)基(每升中含有活性炭0. 5 mg，吲哚丁酸0. 1 mg，瓊脂7 g,其余為1/2 MS)， 25°C，每天12小時(shí)1500 lx光照，培養(yǎng)6周，形成帶根的健壯植株。生根苗于70%遮蔭的自 然光下煉苗7天，將其由培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，栽培于水苔中，25°C， 90%遮蔭， 濕度90%，保持通風(fēng)，l周后可見植株恢復(fù)生長，成活率90%。 一個(gè)月后可上盆栽培。實(shí)施例2:采集溫室栽培的大鹿角蕨(/^st/ceri^^r朋^)健壯植株孢子葉背上的成熟孢子，用 75%酒精浸泡10 s，取出置于0. 1%升汞溶液中消毒15 min ，無菌水洗6次后，接種到孢子 萌發(fā)培養(yǎng)基(每升中含有活性炭lg,椰子乳150mL，赤霉素0.5mg，瓊脂5 g，其余為MS)， 在24'C先暗培養(yǎng)3周，然后每天8小時(shí)2000 lx光照下培養(yǎng)4周，形成原葉體。將原葉體轉(zhuǎn) 入配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有水解酪蛋白0.3g， 6-芐基嘌呤l.Omg，萘乙酸0.5mg， 瓊脂5g，其余為MS)， 24°C，每天8小時(shí)2000 lx光照下培養(yǎng)4周，形成大量叢生葉狀的配 子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有活性炭1 g，椰子乳150 mL， 赤霉素0. 5rag，其余為MS)， 24°C，每天8小時(shí)2000 lx光照，100r/min振蕩培養(yǎng)3天，以 促進(jìn)精子移動(dòng)到頸卵器形成合子；將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子體生長培養(yǎng)基(每升 中含有水解酪蛋白0.3 g， 6-芐基嘌呤l.Omg，萘乙酸0.5mg，瓊脂5 g,其余為MS)，在
與上述相同的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)3周，長出2倍體的孢子體植株。將孢子體小植株接種到綠 球體誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基(每升中含有椰子乳150mL，蛋白胨2g， 6-節(jié)基嘌呤l.Omg，瓊脂5 g， 其余為MS)， 24°C，每天8小時(shí)20000 lx光照，培養(yǎng)4周，可以在植株基部誘導(dǎo)形成大量綠 球體，這些綠球體在相同培養(yǎng)基上增殖，并形成小植株。將小植株接種到生根壯苗培養(yǎng)基(每 升中含有活性炭0.3 mg，吲哚丁酸0.5 mg，瓊脂5 g,其余為1/2 MS) ， 24°C，每天8小時(shí) 2000 1x光照，培養(yǎng)4周，形成帶根的健壯植株。生根苗于80%遮蔭的自然光下煉苗7天，將 其由培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，栽培于水苔中，28°C, 80%遮蔭，濕度60%，保持通 風(fēng)，l周后可見植株恢復(fù)生長，成活率80%。 35天后可上盆栽培。 實(shí)施例3:采集溫室栽培的二叉鹿角蕨(/Vat/cen'鵬6i/"rc"鵬C. Chr.)健壯植株孢子葉背上的 成熟孢子，用70%酒精浸泡10 s，取出置于1.5%次氯酸鈉溶液中消毒10 min ，無菌水洗5 次后，接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(每升中含有活性炭0.5 g，椰子乳IOO mL，赤霉素0.2 mg， 瓊脂7 g，其余為MS)，在26'C先暗培養(yǎng)2周，然后每天10小時(shí)1800 lx光照下培養(yǎng)5周， 形成原葉體。將原葉體轉(zhuǎn)入配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有水解酪蛋白0.2g， 6-芐基嘌呤 0.5 mg，萘乙酸0.2 mg,瓊脂7 g (有？)，其余為MS)， 26°C，每天10小時(shí)1800 lx光照 下培養(yǎng)5周，形成大量叢生葉狀的配子體。將叢生的葉狀體接種到液體配子體生長培養(yǎng)基(每 升中含有活性炭0.5 g,椰子乳100 mL,赤霉素0.2 mg，其余為MS), 26°C，每天10小時(shí) 1800 1x光照，50r/min振蕩培養(yǎng)2天，以促進(jìn)精子移動(dòng)到頸卵器形成合子；將液體培養(yǎng)過的 葉狀體接種到固體配子體生長培養(yǎng)基(每升中含有水解酪蛋白0.2 g， 6-芐基嘌呤0.5 mg， 萘乙酸0.2mg，瓊脂6g，其余為MS)，在與上述相同的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)4周，長出2倍體 的孢子體植株。將孢子體小植株接種到綠球體誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基(每升中含有椰子乳100 inL， 蛋白胨lg， 6-芐基嘌呤0.5mg,瓊脂7g，其余為MS)， 26°C，每天10小時(shí)1800 lx光照， 培養(yǎng)6周，可以在植株基部誘導(dǎo)形成大量綠球體，這些綠球體在相同培養(yǎng)基上增殖，并形成 小植株。將小植株接種到生根壯苗培養(yǎng)基(每升中含有活性炭0.5 mg，吲哚丁酸0.2 mg，瓊 脂6g，其余為1/2MS), 26°C，每天10小時(shí)1800 1x光照，培養(yǎng)4周，形成帶根的健壯植株。 生根苗于80%遮蔭的自然光下煉苗7天，將其由培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，栽培于 水苔中，25°C， 90%遮蔭，濕度80%，保持通風(fēng)，1周后可見植株恢復(fù)生長，成活率85%。 40 天后可上盆栽培。
權(quán)利要求
1.鹿角蕨繁殖栽培方法，其特征包括以下步驟(1)孢子無菌萌發(fā)采集健壯生長的鹿角蕨(Platycerium)葉背的成熟孢子用70％～75％酒精浸泡10～30s，取出置于0.1％～0.2％升汞溶液或1％～2％的次氯酸鈉溶液消毒10～15min，無菌水洗后，接種到孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上；在(25±1)℃先暗培養(yǎng)2～3周，然后8～12h/天、1500～2000lx光照下，培養(yǎng)形成原葉體，所述的培養(yǎng)基每升中含有活性炭0.5～1g，椰子乳50～150mL，赤霉素0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其余為MS；(2)配子體生長培養(yǎng)將步驟(1)的原葉體轉(zhuǎn)入配子體生長培養(yǎng)基，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照下培養(yǎng)，形成叢生葉狀的配子體，所述的培養(yǎng)基每升中含有水解酪蛋白0.1～0.3g，6-芐基嘌呤0.2～1.0mg，萘乙酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其余為MS；(3)授精形成合子將步驟(2)的叢生的葉狀的配子體先接種到液體配子體生長培養(yǎng)基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照，50～100r/min振蕩培養(yǎng)2～3天，再將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子體生長培養(yǎng)基，在與上述相同的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)長出2倍體的孢子體植株，所述的液體配子體生長培養(yǎng)基每升中含有活性炭0.5～1g，椰子乳50～150mL，赤霉素0.1～0.5mg，其余為MS，所述的固體配子體生長培養(yǎng)基每升中含有水解酪蛋白0.1～0.3g，6-芐基嘌呤0.2～1.0mg，萘乙酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其余為MS；(4)孢子體增殖培養(yǎng)將步驟(3)中的孢子體小植株接種到綠球體誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照培養(yǎng)，在植株基部誘導(dǎo)形成綠球體，這些綠球體在與上述相同的培養(yǎng)基上增殖，并形成小植株，所述的培養(yǎng)基每升中含有椰子乳100～150mL，蛋白胨1～2g，6-芐基嘌呤0.2～1.0mg，瓊脂5～7g，其余為MS；(5)生根培養(yǎng)將步驟(4)得到的小植株接種到生根壯苗培養(yǎng)基上，在(25±1)℃，8～12h/天、1500～2000lx光照培養(yǎng)，形成帶根的健壯植株，所述的培養(yǎng)基每升中含有活性炭0.3～0.5mg，吲哚丁酸0.1～0.5mg，瓊脂5～7g，其余為1/2 MS，所述的1/2 MS是將MS中的大量元素減半，其它成分不變組成的培養(yǎng)基；(6)出瓶移栽生根苗于70％～80％遮蔭的自然光下煉苗5～7天，將其由培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，栽培于水苔中，25～28℃，80％～90％遮蔭，濕度60％～90％，保持通風(fēng)，植株恢復(fù)生長。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的鹿角蕨繁殖栽培方法，其特征是步驟(1)中的鹿角蕨是重裂鹿角 蕨(f7aO"ceri〃歷,aJ力'c/w7 )、 二叉鹿角蕨(尸7atycerj'"/ff /^'f"rcat"/z7)、 大鹿角蕨(/^az^ceri"/ 7 ^ra/70fe )、 長葉鹿角蕨f尸7a t/ceri"邁 wa7A'/7ch'i J 、美洲鹿角蕨 (尸7at/ceri"/ 7 a"(///7t//77)或昆士蘭鹿角蕨(/7atycer/〃/Z7 Zw7力'i)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的鹿角蕨繁殖栽培方法，其特征是步驟(1)中所述的無菌水洗 5 6次，在25士rC暗先培養(yǎng)2 3周，然后8 12h/天，1500 2000 lx光照下，繼續(xù)培養(yǎng) 4 5周，形成原葉體；步驟(2)中培養(yǎng)4 5周，形成叢生葉狀的配子體；步驟(3)中先 接種到液體配子體生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 3天，再將液體培養(yǎng)過的葉狀體接種到固體配子體 生長培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)3 4周，長出2倍體的孢子體植株；步驟(4)中培養(yǎng)6-8周，在 植株基部誘導(dǎo)形成綠球體；步驟(5)中培養(yǎng)4 6周，形成帶根的健壯植株；步驟(6)培養(yǎng) 30-40天后可上盆栽培。
全文摘要
本發(fā)明涉及鹿角蕨的繁殖栽培方法，具體來說涉及采用無菌孢子萌發(fā)和試管育苗繁殖栽培鹿角蕨的方法。采集健壯生長的鹿角蕨屬(Platycerium)中各種鹿角蕨葉背的成熟孢子，經(jīng)過孢子無菌萌發(fā)、配子體生長培養(yǎng)、授精形成合子、孢子體增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、出瓶移栽等步驟繁殖栽培鹿角蕨。本發(fā)明方法能成功地進(jìn)行鹿角蕨的快速繁殖，培養(yǎng)基成分獨(dú)特、簡單，繁殖方法新穎，具有投入少，產(chǎn)出高的特點(diǎn)，是利用植物試管技術(shù)進(jìn)行珍稀植物種苗的規(guī)模化生產(chǎn)的高新生物技術(shù)，試管種苗移栽成活率達(dá)80％～90％。
文檔編號(hào)A01G1/04GK101133704SQ20071003059
公開日2008年3月5日 申請日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者吳坤林, 曾宋君, 俊 段, 楓 鄭, 陳之林 申請人:中國科學(xué)院華南植物園