專利名稱：：利用來(lái)自轉(zhuǎn)基因雜交體的分離子來(lái)開發(fā)新的種質(zhì)的制作方法利用來(lái)自轉(zhuǎn)基因雜交體的分離子來(lái)開發(fā)新的種質(zhì)發(fā)明領(lǐng)域o咖植物育種領(lǐng)域的本發(fā)明提供了利用來(lái)自轉(zhuǎn)基因株系的分離子(segregate)來(lái)開發(fā)植物種質(zhì)的方法。本發(fā)明還公開了接合性測(cè)試的方法，以評(píng)估轉(zhuǎn)基因的缺乏。發(fā)明背景|0002廣泛種植的作物種質(zhì)通常代表了最優(yōu)良的抹系，其含有栽培者最期望的產(chǎn)量性狀、農(nóng)學(xué)性狀以及害蟲和疾病抗性性狀的組合。由于它的優(yōu)良性狀組合，該種質(zhì)可以用來(lái)產(chǎn)生商業(yè)上可獲得的種子，也可以用作將來(lái)進(jìn)行植物育種工作的來(lái)源。在某些情況下，該種質(zhì)除了包含它展現(xiàn)的優(yōu)良性狀之外，常常還可以包含轉(zhuǎn)基因性狀。因而，在植物育種領(lǐng)域中，需要這樣的方法，以在才直物育種中補(bǔ)足(complement)作物的現(xiàn)存種質(zhì)基礎(chǔ)的全部，而無(wú)論在可能用于育種試驗(yàn)的任何優(yōu)良變品種中是否存在轉(zhuǎn)基因。人們還需要進(jìn)一步應(yīng)用接合性測(cè)試來(lái)改善植物育種工作效率的方法。1,31基于實(shí)時(shí)定量TAQMANPCR(qRT-PCR)的接合性和拷貝數(shù)測(cè)試已經(jīng)用于分析轉(zhuǎn)基因植物后代(例如，BubnerandBaldwin,PlantCellRep.23:263-271(2004))。這種技術(shù)可以允"i午對(duì)才直物基因組中給定DNA序列的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)和定量，并且僅需要少量的植物組織。與之前用于檢測(cè)和定量轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的方法(例如Southern印跡)相比，該技術(shù)的每份樣品勞動(dòng)強(qiáng)度更低得多。盡管如此，它對(duì)于起始模板DNA的濃度和純度以及其它變量非常敏感。因而，它的用途主要是作為正式開始選擇育種之前轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)的初步篩選，隨后通過(guò)其它方式例如Southern印跡來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。已知其適合于，例如，鑒定下述高拷貝數(shù)事件，在轉(zhuǎn)基因植物事件分析的早期，所述事件在選定的事件被交給育種者之前可以被丟棄。該方法未被用于單拷貝優(yōu)良轉(zhuǎn)基因育種材料。0004i如果轉(zhuǎn)基因植物抹系將用于育種程序，那么，除去轉(zhuǎn)基因、或篩選它的缺失的有效的方法是期望的。已經(jīng)報(bào)道了對(duì)轉(zhuǎn)基因序列(例如編碼可選擇標(biāo)記的基因)的特異性消除，包括Cre〃ojc重組酶系統(tǒng)(HareandChua，NatureBiotechnol.20:575-580(2002))。該方法可以特異性地導(dǎo)致插入的轉(zhuǎn)基因DNA序列從轉(zhuǎn)基因植物中消除，但是/ojc位點(diǎn)序列必需仍然保留，其側(cè)翼于切除的序列的位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)后代中的遺傳分離來(lái)篩選轉(zhuǎn)基因的缺失是公知的另一種方法，但這需要相當(dāng)多的時(shí)間和工作來(lái)實(shí)現(xiàn)。因而，人們期待更有效的、篩選特定序列的缺失的方法，特別是確保所有插入的轉(zhuǎn)基因序列完全消除的方法。謂5|新近的大豆育種的重要部分利用了含有事件40-3-2中發(fā)現(xiàn)的ROUNDUPREADY⑧性狀的抹系，因?yàn)楫?dāng)前在美國(guó)提供銷售的大豆種質(zhì)的可能多達(dá)80-95%含有這個(gè)轉(zhuǎn)基因事件。該種質(zhì)展現(xiàn)出了優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因A5403親本林系、以及優(yōu)于許多傳統(tǒng)的(即，非轉(zhuǎn)基因的)大豆育種才朱系的一組農(nóng)業(yè)性狀。因而這些轉(zhuǎn)基因ROUNDUPREADY大豆品種本身在植物育種計(jì)劃中是有用的。為了完全實(shí)現(xiàn)它們的有用性，人們希望能夠鑒定出這些ROUNDUPREADY⑧抹系的下述后代，所述后代保留了親本抹系的優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀而沒(méi)有來(lái)自事件40-3-2的轉(zhuǎn)基因插入物的草甘膦抗性和事件40-3-2中存在的相關(guān)轉(zhuǎn)基因序列。謹(jǐn)6大豆事件40-3-2的功能性轉(zhuǎn)基因的序列和它的相關(guān)側(cè)翼植物DNA可以用于檢測(cè)40-3-2的后代中轉(zhuǎn)基因的存在。已經(jīng)表征了大豆事件40-3-2中側(cè)翼于功能性轉(zhuǎn)基因插入物的DNA序歹'J(Padgetteetal.CropSci.35:1451-1461(1995);Windelsetal.Eur.FoodRes.Technol.213:107-112(2001)。i,71在許多國(guó)家關(guān)于特定轉(zhuǎn)基因植物事件的核發(fā)和商業(yè)化的管理批準(zhǔn)可能需要公開側(cè)翼于插入的DNA的基因組DNA序列，以及檢測(cè)特異于該事件的DNA的方法。因而，早先已經(jīng)報(bào)道了在大豆事件40-3-2中側(cè)翼于功能性插入物的某些序列(MonsantoMSL-16646，可在http4連4妻〃archive.food.gov.uk/pdf一files/acnfp/dossier.pdf獲《尋)。在http鏈才妻〃gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm也報(bào)道了檢測(cè)包含轉(zhuǎn)基因事件NK603的玉米的方法。
發(fā)明內(nèi)容1,81;tt物育種家可以利用一組"優(yōu)良"栽培種作為開發(fā)新的改進(jìn)的作物品種的基礎(chǔ)，所述品種展現(xiàn)了與生長(zhǎng)、適應(yīng)性、害蟲和疾病抗性、種子產(chǎn)量、抗倒伏性、萌發(fā)、成熟、晚季節(jié)植物完整性、林高和抗脫粒性等等相關(guān)的優(yōu)越性狀。然后可將這些性狀的組合封包(package)導(dǎo)入具有一種或多種其它期望性狀的新的育種系，以有效地改善育種種質(zhì)。如果用作進(jìn)一步育種的基礎(chǔ)的優(yōu)良栽培種已經(jīng)包含轉(zhuǎn)基因，那么，當(dāng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的植物育種方法針對(duì)其它農(nóng)學(xué)性質(zhì)來(lái)篩選后代時(shí)，能夠鑒定出許多分離的后代之中轉(zhuǎn)基因是否存在是非常有用的。00091實(shí)踐本發(fā)明的植物育種家可以〗吏用各種技術(shù)。遞歸選拷:(Recurrentselection)是一皮設(shè)計(jì)來(lái)在種群中積累針對(duì)一種或多種性狀的有利基因的育種操作。雜交親本抹系，評(píng)估它們的后代的一種或多種性狀，將最好地表達(dá)該性狀的后代互相雜交，以在連續(xù)世代上重復(fù)該操作。遞歸選擇的變體包括，例如，全同胞(full-sib)選擇、半同胞家族(half-sibfamily)選擇和Si后代遞歸選擇。還可以采用例如回交育種、混合選擇、標(biāo)記物輔助育種等技術(shù)。這些技術(shù)可以用于在自花授粉的和異花授粉作物中選擇感興趣的性狀，視情況而定。雜交個(gè)體；從所述選4^的Fl雜交個(gè)體繁衍出至少下一代世代的種子或植物；從展現(xiàn)所述優(yōu)良系的常規(guī)衍生的優(yōu)良性狀或特征的雜交個(gè)體的F2或更后的后代中篩選轉(zhuǎn)基因的存在；以及選擇展現(xiàn)所述優(yōu)良系的常規(guī)來(lái)源的優(yōu)良性狀或特征的后代，其中所述轉(zhuǎn)基因是后代基因組缺乏的。,8i本發(fā)明還涉及在植物育種計(jì)劃中鑒定轉(zhuǎn)基因的空白分離子的方法，包括雜交第一系和第二系，所述第一系含有編碼有用性狀的、插入其基因組中的轉(zhuǎn)基因；獲得F1雜交個(gè)體；從所述F1個(gè)體繁衍出至少下一代世代的種子或植物；對(duì)后代加以選擇，選出其中缺乏轉(zhuǎn)基因元件并且轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)被恢復(fù)到近似其天然狀態(tài)的后代，以及繁衍選擇的后代的后續(xù)世代，所述后代中，所述轉(zhuǎn)基因的消除不是由轉(zhuǎn)基因重組酶的存在引起的。io闊本發(fā)明還涉及鑒定來(lái)自包含轉(zhuǎn)基因的親本后代的生物樣品中DNA序列的存在或缺乏的方法，所述方法基于引物或探針，所述引物或探針特異性地識(shí)別轉(zhuǎn)基因事件的插入物的5'和3'植物DNA側(cè)翼序列。取決于轉(zhuǎn)基因的存在或缺乏，可以檢測(cè)到特定大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。,。本發(fā)明還涉及試劑盒，用于跟蹤優(yōu)良轉(zhuǎn)基因事件的分離后代中轉(zhuǎn)基因序列的分離，所述試劑盒包含至少一種引物或探針，所述引物或探針特異性地識(shí)別所述事件的5'或3'側(cè)翼區(qū)域，從而給定事件的存在、缺乏或拷貝數(shù)可以在植物育種過(guò)程期間被跟蹤。|0021優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒除了特異性識(shí)別給定事件的5'或3'側(cè)翼區(qū)域的引物之外還包含第二引物，所述笫二引物特異性識(shí)別所述事件的插入的DNA內(nèi)的序列，用于PCR鑒定方案。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含兩種(或更多)特異性引物，其中之一識(shí)別事件的5'側(cè)翼區(qū)域內(nèi)的序列，例如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的植物DNA區(qū)域內(nèi)的序列，另一個(gè)識(shí)別插入的DNA內(nèi)的序列。特別優(yōu)選地，識(shí)別5'側(cè)翼區(qū)域內(nèi)的植物DNA序列的引物包含SEQIDNO:4的核普酸序列，識(shí)別插入的DNA的引物包含SEQIDNO:3的核苷酸序列。0022I以下附圖形成了本說(shuō)明書的一部分，其一皮包括進(jìn)來(lái)以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考這些附圖中的一幅或多幅，結(jié)合對(duì)在此給出的特定實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明。附圖l是40-3-2事件和擴(kuò)增結(jié)果的示意圖。附圖2說(shuō)明了大豆育種過(guò)程。附圖3提供了空白的驗(yàn)證方案。序列表的說(shuō)明0023|以下序列表形成了本說(shuō)明書的一部分，被包括進(jìn)來(lái)以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考這些序列中一條或多條，結(jié)合對(duì)在此給出的特定實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>定義本發(fā)明部分地基于保持優(yōu)良種質(zhì)，這通過(guò)下述來(lái)實(shí)現(xiàn)鑒定出下述基因組區(qū)域，所述基因組區(qū)域包含經(jīng)遺傳修飾作物第一親本優(yōu)良植物的基因組中插入的轉(zhuǎn)基因以及不具有相同轉(zhuǎn)基因插入物的相同物種的第二親本植物的基因組中的同源區(qū)域，在DNA檢測(cè)方法中利用DNA分子來(lái)選擇產(chǎn)自親本植物的雜交的后代植物，其中所述選擇的后代植物不含有所述第一親本植物的特定轉(zhuǎn)基因插入物但含有所述第一親本的某些或所有優(yōu)良種質(zhì)特征。以下描述被提供來(lái)更好地定義本發(fā)明以及指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另作說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)的用法來(lái)理解術(shù)語(yǔ)。在分子生物學(xué)中通用術(shù)語(yǔ)的定義也可在Riegerefa/.,GlossaryofGenetics:ClassicalandMolecular,5thedition,Springer-Verlag:NewYork,(1991);禾口Lewin,GenesV,OxfordUniversityPress:NewYork，(1994)中找到。使用在37CFR§1.822闡述的DNA堿基的命名。使用氨基酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)的單字母和三字母命名。00251"DNA片段"是指已經(jīng)從特定物種的總基因組DNA分離的DNA分子。[oo26術(shù)語(yǔ)"大豆，，是指"Gcwe或大豆，包括可以用大豆育種的所有植物品種，包括野生大豆物種。4和T25玉米、H177玉米和TC1507玉米。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物包括但不限于昆蟲抗性作物，例如，棉花事件，例如MON15985、281-24-236、3006-210-23、MON531、MON757、MON1076和COT102;或玉米事件，例如176、BTll、CBH-351、DAS-06275-8、、DBT418、MON80100、MON810、MON863、TC1507、MIR152V、3210M和3243M。i,2]以下實(shí)施例被包括進(jìn)來(lái)以說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，下文實(shí)施例中公開的技術(shù)代表著本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，它們能很好地用于本發(fā)明的實(shí)踐，因此可被認(rèn)為構(gòu)成了用于理解，可以對(duì)/^開的特定實(shí)施方式進(jìn)^t許多變化，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下仍可獲得相像的或類似的結(jié)果。實(shí)施例實(shí)施例1:缺乏插入的DNA的40-3-2的后代0043i將包含ROUNDUPREADY⑧事件40-3-2的優(yōu)良大豆栽培種與常規(guī)的(非轉(zhuǎn)基因)栽培種雜交，性狀和轉(zhuǎn)基因的分離通過(guò)RNA接合性測(cè)試來(lái)跟蹤。5'或3'接點(diǎn)序列的存在可能如附圖1示意性示出的那樣來(lái)跟蹤。PCR分析可以是單路的(singleplex)或多路的(multiplex)?？梢园▋?nèi)部定量對(duì)照。在40-3-2事件的情況下，插入的DNA在5'到3'方向上由功能性插入物、間插(重排的)基因組DNA、編碼CP4EPSPS的基因的72bp的無(wú)功能片段和其它的基因組序列組成。參考附圖1,例如，針對(duì)來(lái)自大豆事件40-3-2與另一植物的雜交的后代的模板DNA,使用引物集A-B-C,容許人們主動(dòng)地區(qū)分對(duì)于插入的DNA純合的、對(duì)于插入的DNA半合的、或缺乏插入的DNA的后代。根據(jù)已知的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物是本領(lǐng)域公知的。本實(shí)施例中示例性的引物包括SEQIDNO:3(引物B)、SEQIDNO:4(引物A)和SEQIDNO:5(引物C)。,4I從來(lái)自上述雜交的后代的植物葉組織或磨碎的種子提取模板DNA。筒言之，可用用7-mm孔洞打孔器來(lái)收獲幼小植物(低于1個(gè)月大)的新形成的葉的組織。將組織凍干，并保存在試管中直到需要時(shí)。將三個(gè)3mm玻璃珠添加到組織中，搖動(dòng)試管來(lái)將組織研磨成細(xì)4分。添加600ju1提取纟爰沖液(100mMTris;1mMKC1;10mMEDTA;pH9.5),在搖動(dòng)試管重懸浮粉末化組織之后，在65。C孵育1小時(shí)，之后在1500RPM下離心1分鐘。添加200jul沉淀緩沖液(5MKAc;pH7.0),搖動(dòng)試管以徹底地混合，隨后在3000RPM離心10分鐘。將含有DNA的600jul上清液轉(zhuǎn)移到含有500jul異丙醇的新試管中，混合，在室溫下保持10分鐘。然后在3000RPM將試管離心5分鐘，使DNA沉淀，除去上清液。DNA沉淀團(tuán)在65。C干燥30分鐘，然后添加200ju1TE(10mMTns;lmMEDTA)緩沖液，在室溫下孵育至少30分鐘。搖動(dòng)沉淀團(tuán)l分鐘，在1000RPM離心1分鐘，保存在4。C。|0045]在模板DNA提取之后，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行TAQMANTMPCR多路擴(kuò)增反應(yīng)。將3jul提取的模板DNA與懸浮在18兆歐純水[SigmaCatalogNo.W-4502]中的0.2jli1WTVIC內(nèi)部對(duì)照探針[SEQIDNO:7](0.2juM終濃度)；懸浮在18兆歐純水中的0.2jlU事件6-FAMMGB探針[SEQIDNO:6](0.2nM終濃度)；懸浮在18兆歐純水中的0.2pi接合性探針引物混合物(1.0yM終濃度)(其是通過(guò)以20juM的濃度懸浮每種引物(SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5)在18兆歐水中制備的)；和5jul2x通用主緩沖液混合物[AppliedBiosystemspartNo.4304437]混合。用18兆歐水將最終體積調(diào)節(jié)至10fi1,在AppliedBiosystemsGeneAmpPCRSystem9700或MJResearchDNAEnginePTC-225熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR,使用以下參數(shù)50°C、2分鐘1個(gè)循環(huán)；95°C、10分鐘1個(gè)循環(huán)；95°C、15秒，隨后64°C、l分鐘，-rC/循環(huán)，IO個(gè)循環(huán)；95°C、15秒，隨后54。C、1分鐘，30個(gè)循環(huán)；以及1(TC的一個(gè)循環(huán)，保持溫度。接合性分析熱循環(huán)儀條件在StratageneRobocycler,MJEngine,Perkin-Elmer9700或EppendorfMastercyclerGradient熱循環(huán)儀中使用以下循環(huán)參數(shù)繼續(xù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。當(dāng)在EppendorfMastercyclerGradient或MJEngine中運(yùn)行PCR時(shí)，熱循環(huán)儀應(yīng)當(dāng)以計(jì)算的才莫式運(yùn)行。當(dāng)在Perkin-Elmer9700中進(jìn)行PCR時(shí)，使用設(shè)置為最大值的斜坡速度運(yùn)行熱循環(huán)4義。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例3:含有GA21事件的玉米系的轉(zhuǎn)化一分離子分析10053i本發(fā)明可以應(yīng)用于玉米育種。將包含事件GA21的自交玉米系與包含事件NK603的另一個(gè)自交系雜交，跟蹤后代的分離，以有效地鑒定出缺乏與GA21事件相關(guān)的序列、包含NK603事件、并且展現(xiàn)包含GA21的原始親本抹系的其它DNA標(biāo)記物的后代。l00S41通過(guò)基于事件特異性PCR的^^測(cè)的多層(multi-tiered)標(biāo)記物輔助育種方法、連接的標(biāo)記物PCR和Southern印跡分析，確認(rèn)事件NK603相關(guān)DNA序列的存在和事件GA21相關(guān)DNA序列的缺乏，來(lái)進(jìn)行GA21系的轉(zhuǎn)化。在多次回交之后，我們確認(rèn)了NK603事件的存在，以及與包含GA21的原始親本的遺傳背景和農(nóng)學(xué)性質(zhì)相關(guān)的DNA標(biāo)記物的存在。00均將回交親本玉米自交系RR728-18GA21與供體親本9CX34(5)NK603雜交，并與回交親本回交。將BC1S0與回交親本雜交，通過(guò)基于PCR的分析來(lái)篩選其基因型。選擇在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因基因座上展現(xiàn)可能的雜合性的抹系，根據(jù)回交親本(RP)存在的PCR標(biāo)記物的數(shù)目對(duì)其進(jìn)行排序。將選定的抹系(BC2S0世代)與回交親本(BC3S0)再次雜交，自交，并通過(guò)TaqmanPCR進(jìn)行篩選。在采樣的558個(gè)才朱系中，165個(gè)包含NK603事件，根據(jù)GA21事件分析和共優(yōu)勢(shì)(co-dommant)連接的標(biāo)記物，這165個(gè)中的38個(gè)被認(rèn)為高度可能是對(duì)于GA21雜合的。使該世代自交，產(chǎn)生BC3F2世代，針對(duì)GA21連接的PCR標(biāo)記物、基于NK603PCR的接合性分析以及回交親本標(biāo)記物的百分比(基于PCR的)再次篩選后代。在這個(gè)階段選出的、用于進(jìn)一步育種的抹系包含多達(dá)幾乎95%的回交親本標(biāo)記物，它們對(duì)于GA21來(lái)說(shuō)是雜合的，并包含NK603(表4)。表4柹、系％回交親本標(biāo)"i己物30490.8931289.7832391.9433694.9439790.7240692.700561使BC3F2世代自交，種植后代，并針對(duì)對(duì)ROUNDUP的耐受性加以選才奪；針對(duì)純合的空白GA21以及純合的NK603的存在進(jìn)行標(biāo)記物輔助選擇，以及針對(duì)最高百分比的回交親本標(biāo)記物選擇。251個(gè)篩選的抹系中的15個(gè)是純合的空白GA21(即，缺乏GA21事件)并且對(duì)NK603事件是純合的。對(duì)每個(gè)選擇的林系5個(gè)后代的六十個(gè)庫(kù)進(jìn)行Southern印跡分析(用經(jīng)EcoRV消化的基因組DNA)。對(duì)照泳道包括來(lái)自已知GA21和NK603玉米系的基因組DNA,以及按照1:9稀釋入NK603基因組DNA的GA21基因組DNA的樣品，以模擬五個(gè)植物庫(kù)中含GA21的半合植物的存在。loo"使用稻米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子探針。使用pDPG434作為模板DNA,合成來(lái)制備探針，隨后進(jìn)行毛地黃毒苷標(biāo)記。pDPG434是用于得到GA21事件的質(zhì)粒構(gòu)建體(美國(guó)專利6,040,497,通過(guò)引用合并在此)，其含有與用于得到NK603事件的質(zhì)粒構(gòu)建體相同的元件。該探針是跨越稻米肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子、內(nèi)含子和5'非翻譯區(qū)域(UTR)的1.4KbDNA片段。使用該探針，含有NK603的基因組DNA產(chǎn)生4Kb的雜交條帶，含有GA21的基因組DNA產(chǎn)生約21Kb的雜交條帶。產(chǎn)生的雜交圖型顯示了實(shí)-瞼泳道中可檢測(cè)的NK603特異性信號(hào)和沒(méi)有可才僉測(cè)的GA21特異性信號(hào)。對(duì)照泳道產(chǎn)生了預(yù)期大小的GA21和NK603特異性信號(hào)，這確認(rèn)了該分析是足夠敏感到可以在五個(gè)植物的庫(kù)中鑒定單個(gè)半合的GA21個(gè)體的。轉(zhuǎn)化的自交系一皮鑒定為9034(NK603)。10058該方法也可以用于鑒定例如以上描述的雜交中的非轉(zhuǎn)基因后代(即，對(duì)于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件而言的空白分離子)。在這種情況下，此類空白分離子將不包含GA21或NK603事件，但是可以包含任一或兩種親本抹系的遺傳標(biāo)志和農(nóng)學(xué)性質(zhì)。|0059本文公開以及本文所要求保護(hù)的所有方法可以才艮據(jù)當(dāng)前的公開來(lái)制造和執(zhí)行，而不需要進(jìn)行過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。雖然已經(jīng)就優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明的方法，但對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，可以將多種變化應(yīng)用于在此描述的方法的步驟或步驟的順序中，而不背離本發(fā)明的相克念、精神和范圍。對(duì)本領(lǐng)域:技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的所有此類相似的替換和修改都被認(rèn)為是在本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻(xiàn)[00601以下參考文獻(xiàn)通過(guò)引用特別地并入本文，并入程度與所述文獻(xiàn)提供示例性方案或?qū)Ρ疚年U述的那些有所補(bǔ)充的其它細(xì)節(jié)的程度一致美國(guó)專利6,825,400;6,818,807;6,468,747;6,563,026;6,040,497Hare&Chua,NatureBiotechnol.20:575-580Padgette,CropSci.35:1451-1461Windels,EurFoodRes.Technol.213:107-112Bubner,BMCBiotechnol.4:14(2004)Schmidt,PlantCellRep.20:422-428Song,PlantCellRep.20:948-954Bubner,PlantCellRep.23:263-271Windels，Med.Fac.LandbouwwUniv.Gent.64/5b:459-462Fehr，W.R.1987.尸"力cZ//eso/Cw/z7wrZ)eve/o/wew/1，F(xiàn)o/.A.7Tzeo^y朋dT^c/2m々亂Simmonds，N.W.andJ.Smartt.1999.PrinciplesofCropImprovement.2ndEd.權(quán)利要求1.一種開發(fā)優(yōu)良作物品種的方法，所述方法包括a)雜交第一優(yōu)良系和第二系，所述第一優(yōu)良系包含編碼有用性狀的轉(zhuǎn)基因，并且其展現(xiàn)了至少一種其它的優(yōu)良性狀，所述第二系展現(xiàn)了有用性狀；b)獲得單獨(dú)的F1雜交系；c)選擇展現(xiàn)了來(lái)自所述第一或第二系的有用性狀的至少一個(gè)F1雜交個(gè)體；d)從選擇的所述F1雜交個(gè)體繁衍出至少下一代的后代世代；e)針對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在，對(duì)展現(xiàn)出所述第一系的至少一種所述其它優(yōu)良性狀的F2或更后的后代加以篩選；和f)鑒定出缺乏所述第一系的轉(zhuǎn)基因的至少一個(gè)個(gè)體。2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(e)的篩選過(guò)程包括接合性分析或ELISA分析。3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(f)中鑒定的個(gè)體還包含所i第二系的有用性狀。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述有用性狀是除草劑耐受性。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述有用性狀是草甘膦耐受性。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述草甘膦耐受性通過(guò)草甘膦耐受性CP4EPSPS、EPSPS、GOX或GAT的表達(dá)提供。7.權(quán)利要求5的方法，其中由所述第一和第二系展現(xiàn)的有用性狀都包含除草劑耐受性。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述作物選自由大豆、玉米、棉花、稻米、小麥、油菜、苜蓿、翦股穎、亞麻、甜菜、馬鈴薯和菊苣構(gòu)成的組。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述作物是大豆，所述第一優(yōu)良系包含草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述作物是玉米，所述第一優(yōu)良系包含事件GA21。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二系包含轉(zhuǎn)基因。12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括g)將步驟(f)的至少一個(gè)個(gè)體與草甘膦耐受性系雜交，以獲得至少一個(gè)單獨(dú)的Fl植物；h)選擇展現(xiàn)草甘膦耐受性的至少一個(gè)F1個(gè)體植物；i)從所述F1個(gè)體繁衍出至少下一代的世代；j)針對(duì)所述第一系的所述其它優(yōu)良性狀以及草甘膦耐受性的存在，對(duì)所述世代加以篩選；和k)選擇下述后代種子或植物，其中所述種子或植物展現(xiàn)草甘膦耐受性。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述草甘膦耐受性通過(guò)CP4EPSPS、EPSPS、GOX或GAT的表達(dá)提供。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述作物是大豆，步驟(a)的所述草甘膦耐受性系是大豆事件781。15.—種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因優(yōu)良作物品種的方法，包括a)將優(yōu)良系和常規(guī)的非轉(zhuǎn)基因系雜交，所述優(yōu)良系包含轉(zhuǎn)基因，并展現(xiàn)了一種或多種轉(zhuǎn)基因衍生的優(yōu)良性狀，以及一種或多種常規(guī)衍生的優(yōu)良性狀；-b)獲得單獨(dú)的Fl雜交系；c)選擇展現(xiàn)了所述優(yōu)良系的至少一個(gè)優(yōu)良特征的至少一個(gè)Fl雜交個(gè)體；d)從所述選擇的F1雜交個(gè)體繁衍出至少下一代的后代世代；e)針對(duì)轉(zhuǎn)基因的存在，對(duì)展現(xiàn)所述優(yōu)良系的至少一個(gè)常規(guī)衍生的優(yōu)良性狀的雜交個(gè)體的后代加以篩選；和f)選擇展現(xiàn)所述優(yōu)良系的至少一個(gè)常規(guī)衍生的優(yōu)良性狀的后代，其中沒(méi)有轉(zhuǎn)基因DNA序列存在于所述后代基因組中。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述優(yōu)良系包含大豆事件40-3-2。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述包含大豆事件40-3-2的優(yōu)良系已經(jīng)暴露給誘變?cè)噭?，以發(fā)展獨(dú)特的遺傳分布型。18.權(quán)利要求15的方法，其中所述優(yōu)良系展現(xiàn)出選自由除草劑耐受性、昆蟲抗性和雄性不育構(gòu)成的組的一種或多種性狀。19.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括g)將步驟(f)的至少一個(gè)后代與另一個(gè)系雜交，以獲得至少一個(gè)單獨(dú)的Fl植物；h)選擇展現(xiàn)了來(lái)自其任一親本的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀的至少一個(gè)Fl個(gè)體一直物；i)從所述F1個(gè)體繁衍出至少下一代的世代；j)針對(duì)優(yōu)良性狀的存在對(duì)所述下一代的世代加以篩選；和k)選擇下述后代種子或植物，其中所述種子或植物展現(xiàn)一種或多種優(yōu)良性狀。20.—種在植物育種計(jì)劃中鑒定對(duì)于轉(zhuǎn)基因的空白分離子的方法，包括a)使第一系和第二系雜交，所述第一系含有編碼有用性狀的、插入其基因組中的轉(zhuǎn)基因；b)獲得Fl雜交個(gè)體；c)從所述F1個(gè)體繁衍出至少下一代的后代世代；d)對(duì)所述下一代的后代世代進(jìn)行接合性分析，以及任選的Southern或western分析；e)選擇下述后代，其中轉(zhuǎn)基因的元件是缺乏的并且所述轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn),皮恢復(fù)到近似它的天然狀態(tài)，以及f)繁衍選擇的所述后代的后續(xù)世代，其中所述轉(zhuǎn)基因的消除不是由轉(zhuǎn)基因重組酶的存在引起的。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼除草劑耐受性。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼草甘膦耐受性。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼CP4EPSPS、EPSPS、GOX或GAT。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼來(lái)自Sa"〃w/2wn力gz.e似"的殺昆蟲毒素。25.通過(guò)權(quán)利要求l、12、15、19或20產(chǎn)生的植物、后代植物或種子。26.通過(guò)權(quán)利要求l、12或19的方法產(chǎn)生的植物或種子，其中所述植物包含轉(zhuǎn)基因。27.權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)基因植物或種子，其含有編碼EPSPS酶的異源基因，所述EPSPS酶具有1到150juM之間的對(duì)于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km以及約2到500之間的Pd(草甘膦)/Km(PEP)比，所述植物在1磅/英畝的比例下展現(xiàn)對(duì)N-膦酰曱基甘氨酸除草劑的耐受性，而沒(méi)有由于除草劑應(yīng)用導(dǎo)致的顯著產(chǎn)量降低。28.通過(guò)權(quán)利要求15、19或20的方法產(chǎn)生的植物或種子，其中所述植物不包含轉(zhuǎn)基因。29.包含農(nóng)學(xué)優(yōu)良性狀的植物、種子、后代植物或后代種子，其中所述農(nóng)學(xué)優(yōu)良性狀來(lái)自供體系，所述供體系包含所述農(nóng)學(xué)優(yōu)良性狀和至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因插入物，其中所述植物、種子、后代植物或后代種子進(jìn)一步的特征在于，缺乏所述供體系的一種或多種轉(zhuǎn)基因插入物。30.權(quán)利要求29的植物，其中所述優(yōu)良性狀之一是除草劑耐受性。31.權(quán)利要求30的植物，其中所述優(yōu)良性狀是草甘膦耐受性。32.權(quán)利要求31的植物，其中所述草甘膦耐受性通過(guò)草甘膦耐受性CP4EPSPS、EPSPS、GOX或GAT的表達(dá)提供。33.權(quán)利要求6、13或23的方法，其中所述編碼CP4EPSPS的轉(zhuǎn)基因包含植物DNA病毒啟動(dòng)子；葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，CP4EPSPS;和NOS終止子。全文摘要本發(fā)明提供了一種方法，用于與基于PCR的接合性測(cè)試和任選的Southern印跡分析組合，利用來(lái)自轉(zhuǎn)基因株系的分離子，來(lái)開發(fā)新的植物種質(zhì)。文檔編號(hào)A01H1/04GK101278053SQ200680036315公開日2008年10月1日申請(qǐng)日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日發(fā)明者C·阿內(nèi)維克,G·赫克,J·利斯特洛,J·索特爾斯,R·多伯特,吳坤生,曾清義申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司