專利名稱：：從種植于銅污染土壤的海州香薷中提取殺菌活性劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從種植于銅污染土壤的海州香薷中提取殺菌活性劑的方法。
背景技術(shù)：
：海州香薷，唇形科香薷屬植物，在東南亞地區(qū)多作為民間藥草使用。有發(fā)汗解暑，和中祠濕之功效，主治胸痞腹痛，嘔吐腹瀉，水腫腳氣等。海州香薷花枝和葉片中含有精油、氨基酸、蛋白質(zhì)、色素、黃酮苷、生物堿、有機(jī)酸、酚類和多糖等天然有機(jī)成分，其中精油主成分為脫氫香薷酮和香薷酮，有很強(qiáng)的殺菌活性。胡珊梅等在江蘇連云港海州山的海州香薷精油中，鑒定出精油成分37種，主成分為香薷酮(85.27％)和脫氫香薷酮(2.00％)。脫氫香薷酮是銅污染土壤中海州香薷花枝或葉片精油的特征成分，花枝精油中脫氫香薷酮相對含量為56.8％～80.6％，香薷酮相對含量為9.1％～19.6％；葉片精油中脫氫香薷酮相對含量為46.6％～71.5％，香薷酮相對含量為和8.3％～15.6％。天然植物藥劑具有無公害、不易產(chǎn)生抗藥性、價格低廉、對光照溫度性能穩(wěn)定、貨柜壽命長、在空氣和土壤中易分解、無殘毒積累等特性，且使用的藥劑一般不提純，多為幾種有效植物成分按一定比例混合的提取液或浸提液。因此，海州香薷植物可作為化學(xué)合成殺菌活性劑替代品的開發(fā)資源。海州香薷植物資源豐富，近年來，銅耐性/富集植物海州香薷廣泛用于銅污染土壤的植物修復(fù)。這是因為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與土壤環(huán)境質(zhì)量密切相關(guān)，而重金屬污染是影響土壤環(huán)境質(zhì)量的主要因素之一。在不破壞農(nóng)田生態(tài)環(huán)境和種植功能的前提下，降低污染土壤中有效態(tài)銅含量，恢復(fù)土壤農(nóng)耕的目的，已經(jīng)開發(fā)出適合我國且具有我國獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的、利用我國原生銅耐性/富集植物海州香薷，修復(fù)利用銅污染土壤的技術(shù)(中國專利，ZL200310108946.1，銅污染土壤的生物原位修復(fù)方法)。隨著海州香薷植物修復(fù)銅污染土壤的大規(guī)模田間示范和應(yīng)用推廣，植物修復(fù)材料的產(chǎn)后處置和資源化是個急需解決的環(huán)境問題。如何合理開發(fā)和高效利用修復(fù)材料，獲得典型銅污染土壤植物修復(fù)—修復(fù)材料產(chǎn)后資源化的成套技術(shù)體系，對降低污染土壤植物修復(fù)成本，加快植物修復(fù)進(jìn)程，有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供從種植在銅污染土壤的海州香薷中提取植物源殺菌活性劑的方法，該方法以修復(fù)銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝或/和葉片為原料提取植物源殺菌活性劑，既可在食品防腐和綠色農(nóng)藥的開發(fā)利用方面應(yīng)用，同時可實現(xiàn)植物修復(fù)材料的產(chǎn)后資源化，提高其經(jīng)濟(jì)價值。本發(fā)明所提供的方法包括以下步驟1)盛花期收獲種植在銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝或/和葉片，洗凈、干燥、粉碎，將粉碎后的花枝或/和葉片用濃度為75％～100％乙醇進(jìn)行索氏提取，獲取提取液；或者將粉碎后的花枝或/和葉片用濃度為75％～100％乙醇室溫浸提，獲取提取液；2)于18～25℃，0.08～0.20Mpa下，真空濃縮提取液，然后用石油醚萃取，得到石油醚萃取液，石油醚的用量為提取液的0.1～0.3倍；3)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，濃縮石油醚萃取液，干燥，然后用水蒸汽蒸餾或超臨界CO2萃取，得到黃色透明的精油；4)精油用乙醇、乙酸乙酯或石油醚配制成濃度為10～25mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。本發(fā)明中，步驟1)海州香薷花枝或/和葉片粉碎料與乙醇的重量體積比一般為1∶20～1∶30；銅耐性/富集植物海州香薷的特征精油組分是具有抑菌性能的脫氫香薷酮和香薷酮，這是由于種植在銅污染土壤的海州香薷花枝和葉片中銅含量及其精油中脫氫香薷酮含量遠(yuǎn)高于非銅污染土壤生長的海州香薷。本發(fā)明中，精油得率為石油醚萃取液干燥物的31.5％～43.5％，精油中GC/MS測出脫氫香薷酮相對含量為73.3％～74.2％，香薷酮相對含量為18.4％～18.6％。本發(fā)明制得的殺菌活性劑的抗菌活性測定，所選用的菌種可以是細(xì)菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，或者是植物病菌番茄枯萎病、芒果蒂腐病菌、茄腐鐮刀病和水稻紋枯病菌。抗菌活性測定方法采用濾紙片平板抑菌圈直徑測定法，方法是瓊脂培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)后，冷卻至50～60℃，無菌操作傾注于干熱滅菌的直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約0.5cm。待培養(yǎng)基冷卻后，倒入1ml不同稀釋度的菌懸液分別均勻涂布平板，在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)結(jié)果，找出長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻的菌懸液濃度。用大號打孔器將普通分析濾紙制成直徑為5mm的圓片，放入干燥潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)120℃干熱滅菌4h，浸入本發(fā)明的殺菌活性劑溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并裝入大燒杯，包上牛皮紙，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌0.5h。用無菌吸管吸取已選定的適宜濃度的菌懸液1ml，加在已倒好且滅菌的平板皿培養(yǎng)基表面，涂抹均勻，用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放在上述的含菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在恒溫生物培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h，取出，量取抑菌直徑。本發(fā)明的殺菌活性劑對所測菌株，無論是大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，還是芒果蒂腐病菌或水稻紋枯病菌的生長都有抑制作用。本發(fā)明提取方法簡單，制得的殺菌活性劑綠色環(huán)保，為純天然植物源抗菌劑。不僅可以用于食品行業(yè)作為食品加工的防腐劑，抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長；而且可以服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防治芒果蒂腐病和水稻紋枯病的孳生。同時可實現(xiàn)種植在銅污染土壤的海州香薷植物的產(chǎn)后資源化利用，提高其經(jīng)濟(jì)價值。圖1為實施例1水醇索氏提取后石油醚萃取液的精油總離子流圖；圖2為精油中脫氫香薷酮和香薷酮結(jié)構(gòu)式及質(zhì)譜圖；圖3為實施例4水醇室溫浸提后石油醚萃取液的精油總離子流圖。具體實施例方式以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例11)盛花期收獲種植在銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝和葉片，洗凈、干燥、粉碎。稱取160g花枝和葉片干粉原料置于3200mL濃度為95％乙醇溶液的索氏提取器中，回流提取至少9小時，至索氏提取器內(nèi)的溶液澄清無色為止，得到的提取液；2)于20℃，0.08MPa下，真空濃縮提取液，然后用500mL石油醚萃取，至石油醚層澄清無色為止，得到石油醚萃取液，乙醇回收；3)于20℃，0.08MPa下，濃縮石油醚萃取液，干燥，石油醚回收。超臨界CO2萃取石油醚萃取液的干燥物，得到精油，精油為黃色透明液體，干燥后，得率為石油醚萃取液干燥物的43.5％。超臨界CO2萃取精油的條件為萃取溫度45℃，萃取壓力15MPa，CO2流量為27.9～28.6L/h，原料干粉投入量為200g/L。分離釜I壓力8MPa、溫度45℃；分離釜II壓力5.5MPa、溫度50.5℃。精油的總離子流圖如圖1所示，由圖可見，精油中含有脫氫香薷酮和香薷酮，經(jīng)GC/MS譜庫檢索得到脫氫香薷酮和香薷酮的相對含量分別為74.2％，18.6％；脫氫香薷酮和香薷酮的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜圖如圖2所示。4)精油用乙醇配制成濃度為20mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。實施例2步驟1)、2)、3)同實施例1，精油用乙酸乙酯配制成濃度為20mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。實施例3步驟1)、2)、3)同實施例1，精油用石油醚配制成濃度為20mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑?？咕钚詼y定瓊脂培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)后，冷卻至50～60℃，無菌操作傾注于干熱滅菌的直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約0.5cm。待培養(yǎng)基冷卻后，倒入1ml不同稀釋度的菌懸液(菌株為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)，分別均勻涂布平板，在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)結(jié)果，找出長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻的菌懸液濃度。用大號打孔器將普通分析濾紙制成直徑為5mm的圓片，放入干燥潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)120℃干熱滅菌4h，浸入本發(fā)明的殺菌活性劑溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并裝入大燒杯，包上牛皮紙，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌0.5h。用無菌吸管吸取已選定的適宜濃度的菌懸液1ml，加在已倒好且滅菌的平板皿培養(yǎng)基表面，涂抹均勻，用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放在上述的含菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在恒溫生物培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h，取出，量取抑菌直徑。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="784">試驗菌株抑菌圈孔外毫米數(shù)a實施例1實施例2實施例3大腸桿菌12.511.211.6金黃色葡萄球菌5.65.25.0</table></tables>a為抑菌圈孔外毫米數(shù)，不包括濾紙片的直徑(5mm)，每組試驗重復(fù)三次。溶劑作為對照，其抑菌圈孔外毫米數(shù)為0.8～1.1。表1為實施例1-3的殺菌活性劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。對大腸桿菌而言，其抑菌圈孔外毫米數(shù)分別為11.2～12.5，對金黃色葡萄球菌而言，其抑菌圈孔外毫米數(shù)分別為5.0～5.6。實施例41)盛花期收獲種植在銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝和葉片，洗凈、干燥、粉碎。稱取500g花枝和葉片干粉原料置于5000mL濃度為75％乙醇中浸提至少7天，濾出提取液。殘渣用回收的乙醇溶劑重提兩次，濾出提取液。合并三次的提取液。2)于25℃，0.20MPa下，真空濃縮提取液，然后用500mL石油醚萃取，至石油醚層澄清無色為止，得到石油醚萃取液，乙醇回收；3)于25℃，0.20MPa下，濃縮石油醚萃取液，干燥，水蒸汽蒸餾石油醚萃取液的干燥物，得到精油。精油為黃色透明液體，干燥后，得率為石油醚萃取液干燥物的31.5％。精油的總離子流圖如圖3所示，由圖可見，精油中含有脫氫香薷酮和香薷酮，經(jīng)GC/MS譜庫檢索得到脫氫香薷酮和香薷酮的相對含量分別為73.3％，18.4％；脫氫香薷酮和香薷酮的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜圖如圖2所示。4)精油用乙醇配制成濃度為10mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。實施例5步驟1)、2)、3)同實施例4，精油用乙酸乙酯配制成濃度為10mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。實施例6步驟1)、2)、3)同實施例4，精油用石油醚配制成濃度為10mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑?？咕钚詼y定瓊脂培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌(121℃，30min)后，冷卻至50～60℃，無菌操作傾注于干熱滅菌的直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，厚度約0.5cm。待培養(yǎng)基冷卻后，倒入1ml不同稀釋度的菌懸液(菌株為番茄枯萎病、芒果蒂腐病、茄腐鐮刀病、水稻紋枯病)，分別均勻涂布平板，在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h。觀察培養(yǎng)結(jié)果，找出長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻的菌懸液濃度。用大號打孔器將普通分析濾紙制成直徑為5mm的圓片，放入干燥潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)120℃干熱滅菌4h，浸入本發(fā)明的殺菌活性劑溶液中。在烘箱上保持35～37℃烘干，并裝入大燒杯，包上牛皮紙，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌0.5h。用無菌吸管吸取已選定的適宜濃度的菌懸液1ml，加在已倒好且滅菌的平板皿培養(yǎng)基表面，涂抹均勻，用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放在上述的含菌培養(yǎng)皿內(nèi)，在恒溫生物培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)35～37℃恒溫培養(yǎng)24h，取出，量取抑菌直徑。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="784">試驗菌株抑菌圈孔外毫米數(shù)a實施例4實施例5實施例6番茄枯萎病1.51.41.2芒果蒂腐病6.36.26.0茄腐鐮刀病2.22.02.0水稻紋枯病5.95.85.6</table></tables>a為抑菌圈孔外毫米數(shù)，不包括濾紙片的直徑(5mm)，每組試驗重復(fù)三次。溶劑作為對照，其抑菌圈孔外毫米數(shù)為0.8～1.1。表2為實施例4-6的殺菌活性劑對番茄枯萎病、芒果蒂腐病、茄腐鐮刀病、水稻紋枯病的抑菌效果。對芒果蒂腐病而言，其抑菌圈孔外毫米數(shù)分別為6.0～6.3，對水稻紋枯病而言，其抑菌圈孔外毫米數(shù)分別為5.6～5.9。權(quán)利要求1.從種植于銅污染土壤的海州香薷中提取殺菌活性劑的方法，其特征是包括以下步驟1)盛花期收獲種植在銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝或/和葉片，洗凈、干燥、粉碎，將粉碎后的花枝或/和葉片用濃度為75％～100％乙醇進(jìn)行索氏提取，獲取提取液；或者將粉碎后的花枝或/和葉片用濃度為75％～100％乙醇室溫浸提，獲取提取液；2)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，真空濃縮提取液，然后用石油醚萃取，得到石油醚萃取液，石油醚的用量為提取液的0.1～0.3倍；3)于18～25℃，0.08～0.20MPa下，濃縮石油醚萃取液，干燥，然后用水蒸汽蒸餾或超臨界CO2萃取，得到黃色透明的精油；4)精油用乙醇、乙酸乙酯或石油醚配制成濃度為10～25mg/mL的溶液，得到殺菌活性劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟1)中海州香薷花枝或/和葉片粉碎料與乙醇的重量體積比為1∶20～1∶30。全文摘要本發(fā)明涉及從種植于銅污染土壤的海州香薷中提取殺菌活性劑的方法。步驟如下盛花期收獲種植在銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷花枝或/和葉片，洗凈、干燥、粉碎后，用乙醇進(jìn)行索氏提取或室溫浸提，獲取提取液；濃縮提取液，用石油醚萃取，再濃縮、干燥、水蒸汽蒸餾或超臨界CO文檔編號A01P3/00GK1813544SQ20061004961公開日2006年8月9日申請日期2006年2月27日優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日發(fā)明者彭紅云,石偉勇,楊肖娥,吳龍華申請人:浙江大學(xué)