專利名稱：利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種西瓜四倍體誘導(dǎo)技術(shù)，尤其是利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法。
背景技術(shù)：
西瓜是世界十大水果之一，因其多汁、風(fēng)味濃而受到消費者喜愛。西瓜栽培面積大，在熱帶和亞熱帶地區(qū)都有廣泛栽培；然而西瓜種質(zhì)資源的遺傳背景比較狹窄，因此采用新的技術(shù)方法獲得更多的種質(zhì)資源非常必要。三倍體無籽西瓜由于其良好的果實品質(zhì)更受消費者青睞，有著巨大的商業(yè)潛力。三倍體西瓜的獲得是通過常規(guī)二倍體與四倍體雜交而來，三倍體西瓜的生產(chǎn)受許多因素限制，其中一個原因就是四倍體的生產(chǎn)效率低。獲得四倍體的傳統(tǒng)方法是用誘變劑處理活體植株，活體誘導(dǎo)處理部位可為種子、幼苗莖尖、幼苗生長點等，誘變率一般在0.1％-3％，如秋水仙堿處理子葉期的西瓜幼苗，獲得的四倍體頻率低(1％-3％)(Nongkarn-Fongrin等，1993)，且嵌合率高(36％-75％)(McCuistion，1993)。因為傳統(tǒng)的活體誘導(dǎo)處理方法具有誘變率低、嵌合率高、且獲得的四倍體植株稔性低、不易獲得大量四倍體個體等缺陷；而采用離體培養(yǎng)過程中應(yīng)用誘變劑的誘導(dǎo)技術(shù)能夠克服活體誘導(dǎo)技術(shù)的缺點，因此人們開始更多的使用離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)技術(shù)。在植物倍性誘導(dǎo)過程中，秋水仙堿是一種常用的誘變劑，在多種植物上普遍應(yīng)用(James F.Hancock，1997)，許多研究者利用它進(jìn)行了離體培養(yǎng)染色體加倍研究(Giirel等，2000；Zhang等，1995；Li-Ying等，1999；Gmitter等，1991)。除草劑在植物倍性的研究過程中，具有多倍化程度高，藥害輕等特點，也被用來做誘變劑(VanTuyl JM等，1992)?！皻W拉靈”(Oryzalin)是一種二苯基胺類除草劑，對植物微管蛋白有更高的親和性，低濃度條件下具有更高的微管蛋白解聚能力。誘變劑處理會對培養(yǎng)材料產(chǎn)生毒害性，在除草劑“歐拉靈”處理之前，將材料放在不含除草劑“歐拉靈”的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時間，再轉(zhuǎn)入除草劑“歐拉靈”培養(yǎng)基處理，這樣可提高材料對除草劑“歐拉靈”的抗毒害性，同時還能提高染色體加倍率(Hansen-AL，2000)。
到目前為止，尚無利用除草劑“歐拉靈”離體高效誘導(dǎo)西瓜四倍體技術(shù)的發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種獲得四倍體頻率高的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實現(xiàn)的提供一種利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，是依次包括以下步驟1)、選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4.5～5.5天；該增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺(BA)、0.5毫克吲哚乙酸(IAA)、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；3)、將上述預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；該液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和400毫克歐拉靈除草劑的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)、將上述再生芽依次進(jìn)行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。
作為本發(fā)明的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法的改進(jìn)所述步驟2)中預(yù)培養(yǎng)時間為5天。步驟3)是在28℃、每分鐘150轉(zhuǎn)的恒溫振蕩器上震蕩，且處理時間為12小時。
本發(fā)明的步驟1)中所使用的4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體，是通過如下方法獲得的將飽滿的西瓜種子浸入蒸餾水浸泡6h后，小心去殼，用濃度為10％的次氯酸鈉溶液消毒10min，期間不停振搖，無菌水反復(fù)沖洗后接種于MS發(fā)芽培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃黑暗培養(yǎng)，待胚根露出2-3mm時再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。然后選用4天苗齡子葉近胚軸端5×5mm小塊(帶1mm下胚軸)作為外植體。該MS發(fā)芽培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
本發(fā)明的步驟5)具體內(nèi)容如下將步驟4)所得的再生芽轉(zhuǎn)移到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根15天后，開瓶練苗2天，小心洗去根部的MS生根培養(yǎng)基，然后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液。用塑料薄膜將營養(yǎng)缽遮住，以減少水分蒸發(fā)，并通風(fēng)透氣，4天后揭去薄膜。移入培養(yǎng)室在有散射光的室內(nèi)培養(yǎng)5天，然后移栽到溫室培養(yǎng)，就可獲得四倍體的西瓜再生植株。所用的MS生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖、6克瓊脂和0.1毫克萘乙酸(NAA)的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
本發(fā)明中使用的所有培養(yǎng)基均用1mol/L的NAOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至5.8，在121～126℃之間恒溫滅菌20min。MS基本培養(yǎng)基為Murashige and Skoog1962年發(fā)明的植物組織基本培養(yǎng)基。BA代表6-芐基氨基瞟嶺，NAA代表萘乙酸，IAA代表吲哚乙酸。
本發(fā)明的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，利用誘變劑“歐拉靈”除草劑溶液處理誘導(dǎo)西瓜離體條件下的子葉，使染色體變異加倍；還確定了誘變劑的濃度、處理時間、處理方式及預(yù)培養(yǎng)試驗對四倍體離體誘導(dǎo)的影響。因此采用本發(fā)明的方法，四倍體的誘導(dǎo)頻率能達(dá)到85.6％；能克服傳統(tǒng)方法中誘導(dǎo)頻率低的缺點，為創(chuàng)制優(yōu)良西瓜種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。


圖1是西瓜子葉外植體(近胚軸端帶1mm的下胚軸)的示意圖；圖2是再生芽的示意圖；圖3是再生苗生根示意圖；圖4是再生苗定植示意圖；圖5是四倍體染色體鑒定圖。
具體實施例方式
實施例1、利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、制作外植體將飽滿的西瓜種子浸入蒸餾水浸泡6h后，小心去殼，用濃度為10％的次氯酸鈉溶液消毒10min，期間不停振搖，無菌水反復(fù)沖洗后接種于MS發(fā)芽培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃黑暗培養(yǎng)，待胚根露出2-3mm時再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。然后選用4天苗齡子葉近胚軸端5×5mm小塊(帶1mm下胚軸)作為外植體，該外植體的形狀如圖1所示。所用的MS發(fā)芽培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5天；增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
3)、將上述預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在28℃、每分鐘150轉(zhuǎn)的恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理12小時；液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和400毫克歐拉靈除草劑的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；該再生芽的形狀如圖2所示。所用的增植培養(yǎng)基同步驟2)中的增植培養(yǎng)基，培養(yǎng)室培養(yǎng)條件設(shè)定為白天溫度25-27℃，夜間溫度18-20℃，16/8h光周期，光照強度3000勒克司(lx)。
5)、將上述25天后的再生芽轉(zhuǎn)移到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根15天后(如圖3所示)，開瓶練苗2天，小心洗去根部的MS生根培養(yǎng)基，然后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液。用塑料薄膜將營養(yǎng)缽遮住，以減少水分蒸發(fā)，并通風(fēng)透氣，4天后揭去薄膜。移入培養(yǎng)室在有散射光的室內(nèi)培養(yǎng)5天，然后移栽到溫室培養(yǎng)(如圖4所示)，就可獲得四倍體的西瓜再生植株。所用的MS生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖、6克瓊脂和0.1毫克NAA的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
實施例2、對上述西瓜再生植株進(jìn)行四倍體的鑒定
早上8:00～9:00取上述西瓜再生植株的幼嫩根尖1～2cm作為材料，0.002M 8-羥基喹啉20℃處理2小時，乙醇洗滌，乙醇∶冰醋酸(體積比3∶1)固定液20℃固定12小時，用純酒精洗滌2～3次直至材料不含冰醋酸的味道，再用蒸餾水洗滌，用1mol/L鹽酸保持45℃解離30分鐘，蒸餾水洗滌，卡寶品紅染色，置于顯微鏡下觀察，各取30個染色體清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體計數(shù)，四倍體染色體鑒定圖如圖5所示。結(jié)論為采用本發(fā)明方法可以獲得高頻率的四倍體西瓜再生植株。
所有上述實驗過程中所用到的試劑為植物組織培養(yǎng)過程中的基本試劑，均可購自Sigma和上海生工生物工程有限公司。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，其特征是依次包括以下步驟1)、選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4.5～5.5天；所述增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；3)、將上述預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；所述液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和400毫克歐拉靈除草劑的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)、將上述再生芽依次進(jìn)行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟3)是在28℃、每分鐘150轉(zhuǎn)的恒溫振蕩器上震蕩。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟2)中預(yù)培養(yǎng)時間為5天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟3)中處理時間為12小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用歐拉靈除草劑離體誘導(dǎo)西瓜四倍體的方法，依次包括以下步驟1)選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)將外植體在增植培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4.5～5.5天；3)將預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；4)將處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)將再生芽依次進(jìn)行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。采用本發(fā)明方法可以獲得高頻率的四倍體西瓜再生植株。
文檔編號A01P21/00GK1826888SQ20061004959
公開日2006年9月6日 申請日期2006年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日
發(fā)明者張明方, 張全美, 楊景華, 齊曉花 申請人:浙江大學(xué)