專利名稱：含有包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的組合物、其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含萜和中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物及這些組合物的制備方法。所述組合物提高萜穩(wěn)定性和活性，并為所述萜提供合適的載體。本發(fā)明還涉及在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中使用這些組合物的方法。
萜是在自然界中廣泛分布的化學(xué)化合物，主要在植物中作為精油的成分。它們的結(jié)構(gòu)單元是烴異戊二烯(C5H8)n。萜的實(shí)例包括檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿卜素(維生素A1)、角鯊烯、百里酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene和里哪醇。
萜被歸類為Generally Recognized as Safe(GRAS)，并且在調(diào)味料和香料工業(yè)中已經(jīng)使用多年。檸檬醛在大鼠中的LD50為約5g/kg，這進(jìn)一步表明這些化合物的相對安全性。此外，一旦暴露于氧(例如空氣)，萜具有約28天的相對短暫的壽命。萜會分解為CO2和水。萜的這種分解或裂解表明本發(fā)明的組合物和方法的安全性和環(huán)境友好性。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)萜抑制癌細(xì)胞生長、減小腫瘤尺寸、降低膽固醇水平并且對體外微生物具有殺滅作用。Owawunmi(Letters in Applied Microbiology，1993，9(3)105-108)顯示，含多于0.01％檸檬醛的生長培養(yǎng)基降低大腸桿菌(E.coli)的濃度，并且在0.08％時(shí)具有殺菌作用。美國專利5,673,468描述了一種基于松油的萜制劑，其用作消毒劑或防腐清潔劑。美國專利5,849,956教導(dǎo)了在米中發(fā)現(xiàn)的萜具有抗真菌活性。美國專利5,939,050描述了一種口腔衛(wèi)生抗微生物產(chǎn)品，其含顯示協(xié)同作用的2種或3種萜的組合。幾項(xiàng)美國專利(美國專利5,547,677、5,549,901、5,618,840、5,629,021、5,662,957、5,700,679、5,730,989)教導(dǎo)了某些類型的水包油型乳液具有抗微生物、佐劑和遞送性質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)萜是有效且無毒的膳食抗腫瘤劑，它們通過多種作用機(jī)理發(fā)揮作用(Crowell等人，Crit.Rev.Oncog.，1994，5(1)1-22；Crowell等人，Adv.Exp.Med.Biol.，1996，401131-136)。萜香葉醇、生育三烯酚、紫蘇子醇、b-紫羅酮和d-苧烯抑制肝HMG-CoA還原酶活性，其是膽固醇合成中的限速步驟，并且適當(dāng)降低動物中的膽固醇水平(Elson等人，J.Nutr.，1994，124607-614)。D-苧烯和香葉醇減小乳腺腫瘤(Elegbede等人，Carcinogenesis，1984，5(5)661-664；Elegbede等人，J.Natl.CancerInst.，1986，76(2)323-325；Karlson等人，Anticancer Drugs，1996，7(4)422-429)，并且抑制移植腫瘤的生長(Yu等人，J.Agri.Food Chem.，1995，432144-2147)。
還發(fā)現(xiàn)萜抑制細(xì)菌和真菌的體外生長(Chaumont等人，Ann.Pharm.Fr，1992，50(3)156-166；Moleyar等人，Int.J.Food Microbiol，1992，16(4)337-342；和Pattnaik等人，Microbios，1997，89(358)39-46)和一些體內(nèi)和體外寄生蟲(Hooser等人，J.Am.Vet.Med.Assoc.，1986，189(8)905-908)。發(fā)現(xiàn)香葉醇通過提高鉀滲漏速率并破壞膜流動性而抑制白色念珠菌(Candida albicans)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生長(Bard等人，Lipids，1998，23(6)534-538)。通過抑制孢子萌發(fā)和在瓊脂中的生長抑制確定b-紫羅酮具有抗真菌活性(Mikhlin等人，A.Prikl.Biokhim.Mikrobiol，1983，19795-803；Salt等人，Adam.Physiol.Molec.Plant Path，1986，28287-297)。替普瑞酮(戊四烯酮)對幽門螺桿菌(H.pylori)具有抗菌作用(Ishii，Int.J.Med.Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis.，1993，280(1-2)239-243)。已表明Rosanol，一種含1％玫瑰油的市售產(chǎn)品，抑制幾種細(xì)菌的生長(假單胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococus)、大腸桿菌和幽門螺桿菌)。香葉醇是玫瑰油的活性成分(75％)。玫瑰油和濃度為2mg/L的香葉醇抑制幽門螺桿菌的體外生長。已表明來自草藥的一些提取物對幽門螺桿菌具有抑制作用，最有效的是前胡醇當(dāng)歸酸酯、前胡素、木蘭醇、小檗堿、肉桂酸、前胡醇和沒食子酸(Bae等人，Biol.Pharm.Bull.，1998，21(9)990-992)。已表明來自腰果的提取物、漆樹酸和(E)-2-己烯醛對幽門螺桿菌具有殺菌作用。
已表明二萜，即trichorabdal A(來自R.Trichocarpa)對幽門螺桿菌具有極強(qiáng)的抗菌作用(Kadota等人，Zentralbl.Bakteriol，1997，287(1)63-67)。
在體外測試中，11種不同萜的溶液有效抑制致病菌的生長；在100ppm至1000ppm之間的水平是有效的。用含1％聚山梨醇酯20的水稀釋所述萜(Kim等人，J.Agric.Food Chem.，1995，432839-2845)。
可能存在萜對抗微生物的不同作用模式；它們可以(1)干擾細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，(2)削弱多種酶系統(tǒng)(HMG-還原酶)，和(3)破壞或滅活遺傳物質(zhì)。相信由于萜的作用模式是如此基礎(chǔ)，例如阻斷膽固醇，以致感染劑不能建立對萜的耐藥性。
但是，使用萜有許多缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)包括-萜是液體，這使得它們難以處理并且不適于某些目的。
-萜與水不是非?？苫烊埽⑶移渫ǔＰ枰褂孟礈靹?、表面活性劑或其它乳化劑來制備水乳液。但是，通過在高剪切下混合所述萜可以獲得穩(wěn)定溶液。
-干粉萜制劑通常僅含有低重量百分比的萜。
-萜在水乳液系統(tǒng)中趨于氧化，這使長期貯存成問題。
存在對噴霧包衣、擠出、凝聚、分子包封和噴霧干燥/冷卻以提供成分遞送系統(tǒng)的當(dāng)前技術(shù)的限制。
發(fā)面酵母細(xì)胞壁來自發(fā)面酵母細(xì)胞，并且由不溶性生物聚合物β-1，3-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖、甘露聚糖和殼多糖組成。它們通常為2-4微米直徑的微球，具有厚度僅為0.2-0.3微米的殼壁，殼壁環(huán)繞著開放的空穴。這種材料具有可觀的液體保持容量，通常吸收5-25倍于其重量的液體。殼是充分多孔的，使尺寸高至150000道爾頓的有效負(fù)荷可以通過外殼，并被吸收入球形顆粒的空穴中。發(fā)面酵母細(xì)胞壁具有幾種獨(dú)特的性質(zhì)，包括熱穩(wěn)定性(例如高至121℃)、剪切穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性(例如pH2-12)以及在高濃度下它們不形成顯著的粘度。除了其物理性質(zhì)外，這種組合物還含有天然和健康的膳食纖維，它們具有心血管和免疫增強(qiáng)的健康益處。
通過從酵母細(xì)胞的可溶性成分提取和純化不溶性微粒部分而從酵母細(xì)胞制備酵母細(xì)胞壁。可以從酵母抽提物生產(chǎn)的不溶性副產(chǎn)物制備真菌細(xì)胞壁。此外，可以用氫氧化物水溶液處理酵母細(xì)胞，不破壞酵母細(xì)胞壁，氫氧化物水溶液消化細(xì)胞的蛋白質(zhì)和胞內(nèi)部分，使酵母細(xì)胞壁成分避免嚴(yán)重的蛋白質(zhì)污染，并且具有基本上未改變的β(1-6)和β(1-3)連接的葡聚糖的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。Jamas等人在美國專利4,810,646和共同在審專利申請U.S.Ser.No.166,929、U.S.Ser.No.297,752和U.S.Ser.No.297,982中更詳細(xì)地描述了完整葡聚糖顆粒及其制備方法。轉(zhuǎn)讓給Novogen Research Pty Ltd.的美國專利6,242,594描述了一種通過堿提取、酸提取然后用有機(jī)溶劑提取和最后干燥來制備酵母葡聚糖顆粒的方法。轉(zhuǎn)讓給AS Biotech-Mackzymal的美國專利5,401,727公開了獲得酵母葡聚糖顆粒的方法和使用它們增強(qiáng)水生動物抵抗力和作為疫苗佐劑的方法。轉(zhuǎn)讓給Alpha-BetaTechnology Inc.的美國專利5,607,677公開了中空完整葡聚糖顆粒作為遞送包裝和輔劑用于遞送多種藥劑的用途。上述專利和申請的教導(dǎo)引入本文作為參考。
其它類型的酵母和真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁不含葡聚糖?？梢酝ㄟ^與上述技術(shù)相似的技術(shù)分離這些酵母和真菌的細(xì)胞壁以獲得細(xì)胞壁顆粒。
此外，許多植物、藻類、細(xì)菌和其它微生物的細(xì)胞也包括細(xì)胞壁。不同微生物的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，但其通常是堅(jiān)固和相對惰性的結(jié)構(gòu)。通過常規(guī)技術(shù)如以上關(guān)于酵母所提及的技術(shù)，可能從這些細(xì)胞獲得細(xì)胞壁顆粒。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以將萜吸收并穩(wěn)定地包封在中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒中?？梢酝ㄟ^將顆粒與萜一起溫育而將所述萜包封入這些顆粒中。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種組合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
本文所用的術(shù)語“中空葡聚糖顆?！卑ㄈ魏伟暇厶亲鳛榻Y(jié)構(gòu)部分的中空顆粒。因此，該術(shù)語具體包括(經(jīng)純化或粗品形式的)酵母細(xì)胞壁或中空完整葡聚糖顆粒。術(shù)語“細(xì)胞壁顆?！敝?經(jīng)純化或粗品形式的)包括細(xì)胞的壁的顆粒，其中葡聚糖不是結(jié)構(gòu)部分。合適的顆粒包括植物、藻類、真菌或細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁顆粒通常保留它們所來源于的細(xì)胞的形狀，因此，像中空葡聚糖顆粒一樣，提供適于包封萜成分的中央空穴。
對于本發(fā)明，所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒能夠穩(wěn)定地包封所述萜成分是必要的。通常，這意味著在與所述萜成分一起溫育的過程中(通常所述萜成分處于相對高的濃度)，所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒必須能夠保持其結(jié)構(gòu)，并且所述萜成分必須能夠遷移入所述顆粒中。所述中空葡聚糖顆粒和細(xì)胞壁顆粒通常從相對惰性的材料形成并且是多孔的，所以可以認(rèn)為通常中空葡聚糖顆粒和細(xì)胞壁顆粒將能夠包封萜成分。
本發(fā)明的組合物有效對抗各種感染劑，包括細(xì)菌、病毒、支原體、真菌和/或線蟲。
本發(fā)明的組合物可以提供以下優(yōu)點(diǎn)-使萜有效負(fù)荷最大化；-使未包封的有效負(fù)荷最小化；-控制有效負(fù)荷穩(wěn)定性；-控制有效負(fù)荷釋放動力學(xué)；-產(chǎn)生液體萜的固體形式，以增加質(zhì)量(mass)和均勻性；-簡化萜的處理和應(yīng)用；和-掩蓋所述萜的氣味和味道。
特別合適的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒是真菌細(xì)胞壁，優(yōu)選酵母細(xì)胞壁。酵母細(xì)胞壁是酵母細(xì)胞的制劑，其保留它們所來源于的酵母細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)。因此它們具有中空結(jié)構(gòu)，其允許將所述萜成分包封在所述酵母細(xì)胞壁內(nèi)。酵母壁可以適當(dāng)?shù)貋碓从诎l(fā)面酵母細(xì)胞(可得自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)。也可以以商品名Nutricell MOS 55從Biorigin(SaoPaolo，Brazil)獲得具有合意性質(zhì)的酵母細(xì)胞壁顆粒。這些顆粒是噴霧干燥的釀酒酵母抽提物。
可選擇的顆粒是商品名為SAF-Mannan(SAF Agri，Minneapolis，MN)和Nutrex(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)的顆粒。這些顆粒是中空葡聚糖顆粒，其是來自酵母抽提物生產(chǎn)過程的不溶性廢物流。在生產(chǎn)酵母抽提物的過程中，部分自溶酵母細(xì)胞的可溶性成分被除去，而不溶性殘?jiān)怯糜谳蒲b載的合適材料。這些中空葡聚糖顆粒包含約25-35重量％β-1，3-葡聚糖。這些材料的關(guān)鍵屬性是它們含有多于10重量％脂質(zhì)，并且非常有效地吸收萜。此外，作為廢物流產(chǎn)物，它們是相對廉價(jià)的中空葡聚糖顆粒來源。
具有更高純度的可選擇的中空葡聚糖顆粒是由Nutricepts(NutriceptsInc.，Burnsville，MN)和ASA Biotech生產(chǎn)的顆粒。這些顆粒已經(jīng)過堿提取，其除去額外的細(xì)胞內(nèi)成分并除去細(xì)胞壁的外部甘露糖蛋白層，獲得50-65重量％葡聚糖的顆粒。
更高純度的中空葡聚糖顆粒是來自Biopolymer Engineering的WGP顆粒。這些顆粒經(jīng)酸提取除去額外的酵母成分，獲得75-85重量％葡聚糖的產(chǎn)物。
極高純度的中空葡聚糖顆粒是來自Alpha-beta Technology，Inc.(Worcester，MA)的AdjuvaxTM和來自Novogen(Stamford，CT)的微粒葡聚糖。這些顆粒經(jīng)有機(jī)溶劑提取，其除去殘余的脂質(zhì)，從而使所述顆粒包含多于90重量％葡聚糖。
在一些實(shí)施方案中，可能需要高純度的葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，例如當(dāng)需要嚴(yán)格控制可能的污染物時(shí)。在這些情況下，更高純度的顆粒將比其它較低純度的產(chǎn)品更優(yōu)選。對于其它實(shí)施方案，由于經(jīng)濟(jì)原因，較低純度的顆粒將是優(yōu)選的；還發(fā)現(xiàn)那些顆粒更有效地吸收萜。
優(yōu)選地，所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒含有少量脂質(zhì)，如1或2重量％脂質(zhì)。少量脂質(zhì)可以增加所述顆粒包封所述萜成分的能力。優(yōu)選地，所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的脂質(zhì)含量為5重量％或更高，更優(yōu)選10重量％或更高。
任選地，本發(fā)明的萜成分可以與表面活性劑締合。所述表面活性劑可以是非離子型、陽離子型或陰離子型的。合適的表面活性劑的實(shí)例包括十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯(decaglycerylmonocaprylate)、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig 30或其混合物。所述表面活性劑將所述萜成分保持在乳液中，還幫助將所述萜成分包封入所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒中。
本發(fā)明的萜成分可以包含單一的萜或多種萜的混合物。多種萜的混合物可以導(dǎo)致協(xié)同作用。
本文所用的術(shù)語“萜”不僅指式(C5H8)n的萜，而且包括萜衍生物，如萜醛或萜聚合物。包括天然和合成萜，例如單萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。此外，提及單個(gè)化合物名稱將包括該化合物的各種異構(gòu)體。例如，術(shù)語檸檬醛包括順式異構(gòu)體檸檬醛-a(或香葉醛)和反式異構(gòu)體檸檬醛-b(或橙花醛)。
應(yīng)該注意，也用含有萜的提取物或精油的名稱來稱呼萜，例如檸檬草油(含有檸檬醛)。
被美國規(guī)則豁免且列在EPA規(guī)則40 C.F.R.Part 152(被全文引入本文作為參考)的萜適用于本發(fā)明。
特別適用于本發(fā)明的萜包括選自以下的萜檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、百里酚、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿卜素(維生素A1)、角鯊烯、百里酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、里哪醇及其混合物。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的萜具有通式結(jié)構(gòu)C10H16，因?yàn)檫@一亞組通常更有效地對抗感染劑。
更優(yōu)選地，所述萜成分包含選自香葉醇、百里酚、檸檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚和b-紫羅酮的萜。
所述萜成分可以合適地包含百里酚，因?yàn)橐驯砻鬟@種萜特別有效地治療或預(yù)防真菌植物感染。
另一種特別合適的萜是檸檬醛，其表現(xiàn)對抗多種微生物的特別功效。
香葉醇、百里酚和丁子香酚的組合在對抗植物感染方面表現(xiàn)特別的功效，因此是特別合適的萜成分。
在治療植物感染方面顯示高功效的其它萜制劑包括(重量百分比)-100％百里酚；-50％香葉醇和50％百里酚；-50％丁子香酚和50％百里酚；
-33％香葉醇、33％丁子香酚和33％百里酚；-33％丁子香酚、33％百里酚和33％檸檬醛；-25％香葉醇、25％丁子香酚、25％百里酚和25％檸檬醛；-20％香葉醇、20％丁子香酚、20％檸檬醛、20％百里酚和20％L-香芹酮。
因此，包含任何以上制劑的萜成分都特別適用于本發(fā)明。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述萜成分包含一種或多種含氧的萜。檸檬醛，例如檸檬醛95，是一種氧化的C10H16萜，C10H16CAS No.5392-40-5(3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醛)?？梢孕纬筛咧良s2500ppm的檸檬醛的穩(wěn)定懸浮液?？梢詫幟嗜┲瞥筛咧良s500ppm的溶液?？梢灾苽鋼饺?5ppt檸檬醛的中空葡聚糖顆粒的穩(wěn)定懸浮液。
本發(fā)明的組合物可以包含1至99體積％萜、0至99體積％表面活性劑和1至99％中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。更具體地，所述組合物可以包含約10％至約67重量％萜、約0.1-10％表面活性劑和約40-90％中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒。
合適地，本發(fā)明的組合物包含約500至約10000ppm中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約1至約67％萜成分。優(yōu)選地，所述組合物包含約1000至約2000ppm中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約10至約50％萜成分。
例如，對于細(xì)菌和真菌，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，其在水或標(biāo)準(zhǔn)0.9％鹽水中，具有高至67％的L-香芹酮、高至67％的丁子香酚、高至67％的檸檬醛、高至67％的百里酚和L-香芹酮、高至67％的香葉醇或高至67％的檸檬醛和L-香芹酮和丁子香酚以及1％的Tween_80；對于霉菌，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，其在水或標(biāo)準(zhǔn)0.9％鹽水中，具有高至67％的檸檬醛和1％的Tween_80；或者對于支原體，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒，其在水或標(biāo)準(zhǔn)0.9％鹽水中，具有高至67％的檸檬醛、高至67％的L-香芹酮和丁子香酚、高至67％的丁子香酚、高至67％的香葉醇或高至67％的香葉醇、百里酚以及1％的Tween_80。
在本發(fā)明的組合物和方法中可以用作有效濃度的包封萜的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒濃度為1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、130、140、150、160、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1375、1425、1500、1600、1750或2000ppm。甚至更高的濃度(高至25ppt，即千分之...)可以得到制備并可以用于本發(fā)明。
本發(fā)明的組合物可以包含約1ppm至約25ppt(25000ppm)所述萜成分，優(yōu)選100至2000ppm所述萜成分，例如250、500、1000、2000ppm。
可以容易地購得或使用合成化學(xué)家公知的技術(shù)合成本發(fā)明的萜、表面活性劑和其它成分。
出于安全性和規(guī)章原因，高度優(yōu)選本發(fā)明中所用的萜至少是食品級萜(如美國FDA或美國以外的同等管理機(jī)構(gòu)定義)。
任選地，除了所述萜成分外，所述組合物還可以包含其它食品級活性化合物，例如其它抗微生物劑、酶等。
任選地，除了所述萜成分外，所述組合物還可以包含其它活性劑，例如抗微生物劑、抗真菌劑、殺蟲劑、抗炎藥、麻醉劑等。合適的活性劑包括-抗真菌劑細(xì)胞壁水解酶(假設(shè)它們不降解所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒)、細(xì)胞壁合成抑制劑、標(biāo)準(zhǔn)抗真菌劑。
-抗菌劑防腐劑、細(xì)胞壁水解酶、合成抑制劑、抗生素。
-殺蟲劑天然殺蟲劑、幾丁質(zhì)酶。
所述組合物可以包含抗氧化劑以減少所述萜的氧化。這種抗氧化劑的實(shí)例可以是迷迭香油、維生素C或維生素E。
本發(fā)明的組合物可以是干粉形式?？梢耘c液體、固體或凝膠樣形式的農(nóng)學(xué)、食品或藥學(xué)可接受的載體或賦形劑組合提供所述組合物。
對于固體組合物，合適的載體包括藥用級甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。合適地，制劑為片劑或小球形式。合適的載體也可以是人或動物食品材料。此外，也可以使用常規(guī)農(nóng)學(xué)載體。
所述組合物的小球、片劑或其它固體形式還可以優(yōu)選地含有分散劑，當(dāng)將所述組合物放入液體如水中時(shí)，所述分散劑促進(jìn)所述組合物的分散。合適的分散劑包括黃原膠、麥芽糖糊精、藻酸鹽等。
例如，通過將所述組合物分散在水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等中以形成溶液或懸浮液，可以制備液體組合物。如果合意，這些組合物可以含有少量無毒輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑(例如乙酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉或油酸三乙醇胺)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員，制備這些液體組合物的方法是已知的或著會是明顯的；例如參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy；Lippincott，Williams & Wilkins；(December 15，2000)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。此外，通過將所述組合物分散在人或動物液體食品或飲料中，可以制備液體組合物。還可以使用合適的農(nóng)學(xué)液體賦形劑。
對于口服給予，通常優(yōu)選片劑和膠囊劑。片劑可以含有粘合劑和潤滑劑。細(xì)粉或顆?？梢院邢♂寗⒎稚┖?或表面活性劑，并且可以存在于水或糖漿中。膠囊劑或小藥袋(sachet)可以方便地含有干燥狀態(tài)的所述組合物。所述組合物的非水溶液或懸浮液也是合適的，并且可以含有助懸劑。當(dāng)合意或必需時(shí)，可以包含調(diào)味劑、防腐劑、助懸劑、增稠劑或乳化劑。當(dāng)然，使用食品或飲料作為口服遞送方法也是適合的。
胃腸外給予通常的特征是注射。對于可注射物，可以理解，通常所述組合物中使用的所有材料和所用的任何賦形劑都必須是藥用級的?？梢詫⒖勺⑸湮镏苽涑沙Ｒ?guī)形式，作為液體溶液、乳液或懸浮液、適于在注射前溶解、懸浮在液體中的固體形式或者作為乳液。用于胃腸外給予的可選擇的方法包括使用緩釋或延遲釋放系統(tǒng)，從而保持穩(wěn)定的劑量水平。參見例如美國專利3,710,795，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。胃腸外制劑還可以含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(如油酸乙酯)。含水載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。其它胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸鈉林格氏液(lactatedRinger’s)或固定油。靜脈內(nèi)使用的載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏右旋糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
對于局部給予，可以使用液體、混懸劑、洗劑、乳膏、凝膠劑、軟膏劑、滴劑、栓劑、噴霧劑和散劑。如果必需或合意，可以使用常規(guī)藥用載體、含水基質(zhì)、粉末基質(zhì)或含油基質(zhì)、增稠劑等。
本發(fā)明還提供包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的制備方法，所述方法包括以下步驟a)提供萜成分；b)提供中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒；c)在適合萜包封的條件下，將所述萜成分和所述葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒一起溫育；和d)回收包封所述萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
任選地，以上方法還可以包括干燥包封所述萜成分的所述顆粒的步驟?？梢杂枚喾N方式實(shí)現(xiàn)干燥，并且可以提及冷凍干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥或噴霧干燥，所有這些都是公知的方法。
在以上方法的步驟a)中，所述萜成分任選地在表面活性劑存在下，以在含水溶劑中的懸浮液的形式提供。合適的所述溶劑為水。合適的表面活性劑為Tween-80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)，并且優(yōu)選所述表面活性劑存在的濃度為總反應(yīng)混合物的約0.1至10體積％，更優(yōu)選約1％?；蛘?，可以將所述萜成分以在溶劑如水中的真溶液的形式提供。通過在高剪切下混合萜和水直到獲得真溶液，可以獲得所述萜在水中的真溶液。公開WO03/020024提供了形成萜在水中的真溶液的更多細(xì)節(jié)。
在以上方法的步驟b)中，適合地以在水或其它合適液體中的懸浮液的形式提供所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒。合適地，所述懸浮液每毫升包含約1至1000mg顆粒，優(yōu)選200至400mg/ml?；蛘?，可以以干粉的形式提供所述顆粒，并添加到所述萜-表面活性劑懸浮液中。
或者，可以在最低程度地水化所述顆粒但不顯著過量的充足液體中提供所述顆粒。術(shù)語“流體力學(xué)體積(HV)”用于描述最低程度地水化所述顆粒所需的液體體積。因此，合適地，為所述顆粒提供HV至1.5倍HV(1.5HV)的體積。這使得隨后的干燥步驟更有效。而且，當(dāng)使用小體積液體(即約HV至1.5HV)時(shí)，還可能將成品擠出成小球或面條形式，這對于流化床干燥是方便的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述萜成分可以在室溫下被所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒包封。雖然包封速率在37℃下會提高，但應(yīng)該將溫度保持在所述組合物的任何成分的沸點(diǎn)或變性溫度以下。因此，對于以上方法的步驟c)，合適的條件是大氣壓和20℃至37℃的溫度。對特定包封反應(yīng)進(jìn)行條件優(yōu)化將是常規(guī)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。
本發(fā)明還提供殺死微生物的方法，所述方法包括以下步驟a)使所述微生物與包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物接觸。
合適的組合物是以上更詳細(xì)定義的組合物。
本發(fā)明還提供預(yù)防或治療患者的感染的方法，所述方法包括以下步驟a)給予所述患者治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物。
合適的組合物是以上更詳細(xì)定義的組合物。
所述患者的感染可能由任何感染劑引起。這些感染劑的實(shí)例包括但不限于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、煙曲霉(Aspergilliusfumigatus)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、青霉(Penicillium sp.)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)。
對于體內(nèi)給予，可以口服、陰道、直腸、吸入或者通過胃腸外途徑給予所述組合物，例如通過皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、動脈內(nèi)、淋巴內(nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)和氣管內(nèi)途徑給予。以上討論了用于這些途徑的所述組合物的合適制劑。
對于體外治療，可以局部施用所述組合物，例如作為乳劑或軟膏或者作為干粉施用，用于治療傷口。
在以上方法中給予的萜的量顯然應(yīng)該足以獲得合意的結(jié)果，即預(yù)防和/或治療感染，但其水平不應(yīng)為在患者中引起嚴(yán)重毒性作用的水平。
當(dāng)然，所給予的組合物的量將取決于給予方式、被治療的患者(即他們的體重、它們的年齡、狀態(tài)、性別)和個(gè)體中疾病的程度，并取決于處方醫(yī)師的判斷。劑量、給藥方案和給予途徑是可以變化的?；诒绢I(lǐng)域的常識和以下給出的實(shí)施例中的程序，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地確定給定應(yīng)用的抗感染量。應(yīng)該注意，本文所用的術(shù)語“患者”指向其施用所述治療的任何個(gè)體，人或動物。因此，所述患者可以是馴養(yǎng)動物(例如貓、狗等)、家畜(例如牛、馬、豬、羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)室動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、鳥和魚。合適地，所述個(gè)體為哺乳動物，尤其是靈長類動物，例如人。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療或防止植物感染的方法，所述方法包括以下步驟a)將治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物給予所述植物或所述植物附近的土壤。
合適的組合物是以上更詳細(xì)定義的組合物。
已表明萜消除多種植物病原體(參見WO03/020024)，并且如共同在審申請US60/538,627中所述，萜還有效殺死線蟲，其是重要的植物寄生蟲。但是，萜單獨(dú)在懸浮液或溶液中有些不穩(wěn)定，并且在土壤環(huán)境中迅速降解，從而失去功效。
將萜成分摻入中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒中可以降低萜釋放和降解的速率，從而增加所述萜在土壤中的作用時(shí)間。
合適地，要在以上方法中治療或預(yù)防的植物感染為線蟲感染。
可以治療或預(yù)防的其它植物感染包括真菌植物感染，尤其是影響植物表面的感染。這些感染包括霜霉病、白粉病或灰霉病(botrytis bunch rot)；這些感染特別地影響葡萄樹。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物感染可以由以下一種或多種引起煙曲霉、Sclerotinta homeocarpa、茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盤孢(Colletotrichum graminicola)或青霉。
基于萜處理植物的優(yōu)點(diǎn)是可以在快要收獲時(shí)施用之。
許多常規(guī)處理要求在再次進(jìn)入處理區(qū)域之前有較長的時(shí)間(通常為3周)。這意味著不能用常規(guī)處理來處理在快要收獲時(shí)的植物病害發(fā)作，因?yàn)檫@樣就不可能在合意的時(shí)間收獲作物。本發(fā)明的組合物可以合適地在直至收獲的任何時(shí)間施用，例如收獲前21天、收獲前14天、收獲前7天或甚至收獲前3天或更短。
包封萜顯示在處理葡萄的霜霉病、白粉病和灰霉病方面特別的功效，因此本發(fā)明提供治療或預(yù)防這些病害的方法。
通過有規(guī)律地用包封萜作為預(yù)防措施處理植物可以實(shí)現(xiàn)植物感染的預(yù)防。
合適地，本發(fā)明的組合物通過噴霧施用。這對于處理影響植物表面的植物病害是特別合適的。為了噴霧，可以使用在水中包含2g/l組合物的制劑。2至4g/l的濃度是特別有效的，并且可以根據(jù)需要使用高于4g/l的濃度。明顯地，重要的是所用組合物的濃度足以殺死或抑制致病劑，但不高到傷害被處理的植物。
當(dāng)噴霧植物時(shí)，500L/Ha或更高的比率適于覆蓋所述植物。優(yōu)選使用900L/Ha或更高，更優(yōu)選1200L/Ha或更高的比率以保證良好覆蓋。當(dāng)處理葡萄樹時(shí)，證明1200L/Ha的比率是合適有效的。
或者，可以通過灌溉施用本發(fā)明的組合物。這特別合于處理線蟲或其它土傳病原體或寄生蟲。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物，其用于預(yù)防或治療患者或植物的感染。合適的組合物是以上更詳細(xì)定義的組合物。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物在制備用于治療由微生物引起的感染的藥物中的用途。合適的組合物是以上更詳細(xì)定義的組合物。
現(xiàn)在將參考以下非限制性實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，在附圖中


圖1表示空酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖2表示包封L-香芹酮的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖3表示包封檸檬醛的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖4表示萜乳液的光學(xué)顯微照片。
圖5表示在流體力學(xué)體積(HV)的水中的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖6表示在5倍流體力學(xué)體積(HV)的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖7表示在HV的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖8表示在HV+5％的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖9表示在HV+10％的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖10表示在HV+20％的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖11表示在HV+30％的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖12表示在HV+40％的水中的包封萜的酵母細(xì)胞壁的光學(xué)顯微照片。
圖13表示顯示包封萜成分且不含黃原膠的干燥的中空葡聚糖顆粒的分散的光學(xué)顯微照片。
圖14表示在包含0.07g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖15表示在包含0.14g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖16表示在包含0.28g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖17表示在包含0.55g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖18表示在包含1.1g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖19表示在包含2.2g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖20表示在包含4.4g1％黃原膠時(shí)如
圖13中的光學(xué)顯微照片。
圖21顯示在位置18和20上的處理區(qū)域的圖示。
圖22顯示在位置18和20上的處理區(qū)域的圖示。
圖23顯示在位置7上的處理區(qū)域的圖示。
圖24顯示對比經(jīng)包封與未包封萜制劑的圖。
提供以下實(shí)施例以進(jìn)一步使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠制備或?qū)嵤┍景l(fā)明。它們完全是示例性的，并非用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，份數(shù)為所述的體積份或重量份，溫度為攝氏度(℃)或處于環(huán)境溫度，而壓力為處于或接近大氣壓。組合物及其制備或使用條件存在許多變化和組合，例如成分濃度、合意的溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和可以用于優(yōu)化從所述組合物和方法獲得的結(jié)果的其它范圍和條件。優(yōu)化它們僅需要合理和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1-證明萜裝載到發(fā)面酵母顆粒和純化的酵母葡聚糖顆粒中實(shí)施以下方案以證明萜會裝載到酵母細(xì)胞壁和其它中空葡聚糖顆粒中。
通過混合150μl所述萜和100μl 10％Tween 80的水溶液和250μl水來制備檸檬醛和L-香芹酮的乳液。
將可得自Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ的發(fā)面酵母顆粒(YP)或LevacanTM酵母葡聚糖顆粒(YGP)與水混合，形成250mg/ml懸浮液。
將500μl所述YP或YGP懸浮液和250μl所述萜乳液一起混合，并在持續(xù)攪拌下溫育過夜。用500μl YP或YGP懸浮液和500μl水作為對照。然后用水洗滌所述顆粒，直到?jīng)]有外部乳液。然后將顆粒制劑冷凍并冷凍干燥直到干燥。
然后將所述顆粒再水化，并在光學(xué)顯微鏡下檢查。結(jié)果示于
圖1至4中。
圖1顯示于其中心有黑暗區(qū)域的球形結(jié)構(gòu)，這些是空的中空葡聚糖顆粒。圖2和3顯示具有腫脹外觀和淺色內(nèi)部的球形結(jié)構(gòu)，這些是萜被包封在中央空穴中的顆粒，在圖2中萜為檸檬醛，而在圖3中萜為L-香芹酮。在圖2和3中還可以看到游離萜的小斑點(diǎn)，例如在圖2的頂部，就在中央的左側(cè)。圖4顯示萜乳液，其為懸浮在水中的萜小泡。
實(shí)施例2-確定發(fā)面酵母細(xì)胞壁顆粒(YP)中的最高檸檬醛和L-香芹酮裝載水平實(shí)施以下方案以確定裝載到Y(jié)P中的萜的最大量。
-通過將4.5g所述萜與0.3ml水一起超聲來制備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將4.5g Tween-80在40.5ml水中超聲來制備10％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成20mg/ml懸浮液來制備YP懸浮液。
-如表1所述進(jìn)行包封反應(yīng)。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與YP和Tween 80表面活性劑混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀。結(jié)果示于表1標(biāo)為游離萜的右手欄中。
表述“游離萜”指在經(jīng)離心的反應(yīng)混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述顆粒吸收。將由不存在游離萜證明被所述顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表1
從該結(jié)果可以看出，每10mg YP能夠吸收和包封至少16.5μl L-香芹酮萜乳液或至少5μl檸檬醛乳液。
實(shí)施例3-證明用表面活性劑改善萜裝載以及確定最佳Tween-80萜比率實(shí)施以下方案以證明表面活性劑的存在改善萜裝載，并確定YP萜裝載反應(yīng)所需的Tween-80表面活性劑的最低水平。
-通過將4.5g所述萜和0.3ml水一起超聲來制備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將4.5g Tween-80在40.5ml水中超聲來制備10％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成250mg/ml懸浮液來制備發(fā)面YP懸浮液。
如下表2所示進(jìn)行裝載反應(yīng)。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與含0-10％v/v Tween 80表面活性劑的YP混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀。結(jié)果示于表2標(biāo)為游離萜的右手欄中。
表述“游離萜”指在經(jīng)離心的反應(yīng)混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述YP吸收。將由不存在游離萜證明被所述YP吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表2
Sl＝輕微從該結(jié)果可以看出，Tween-80濃度為1％(即1000μl反應(yīng)混合物中含100μl 10％Tween-80)足以允許在上述反應(yīng)中萜的完全吸收。2％Tween-80不引起結(jié)果的改善，而用0.33％的濃度觀察到游離萜。這表明a)當(dāng)不存在表面活性劑時(shí)，萜被吸收到Y(jié)P顆粒中，但存在表面活性劑顯著增加萜吸收。
b)約1％的Tween-80濃度對于YP裝載是最佳的，因?yàn)槠浔ＷC適當(dāng)?shù)难b載，同時(shí)使YP顆粒的萜有效負(fù)荷最大化。
實(shí)施例4-確定在高發(fā)面酵母細(xì)胞壁顆粒(YP)水平下的最大萜裝載和包封實(shí)施以下方案以確定在高YP水平下裝載到Y(jié)P中的萜的最大量。
-通過將4.5g所述萜和3ml 1％Tween一起超聲來制備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將0.5g Tween-80在9.5ml水中超聲來制備5％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成250mg/ml懸浮液來制備YP懸浮液。
-如下表3所示進(jìn)行包封反應(yīng)。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與YP和Tween 80表面活性劑混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀。結(jié)果示于表3標(biāo)為游離萜的右手欄中。
表述“游離萜”指在經(jīng)離心的反應(yīng)混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述YP吸收。將由不存在游離萜證明被所述YP吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表3
從表3中的結(jié)果可以看出，在高YP濃度下，YP能夠吸收和包封萜。每125 mg YP吸收和包封至少112.5μl L-香芹酮萜乳液或至少75μl檸檬醛乳液。這證明在所測試的范圍內(nèi)萜包封反應(yīng)不依賴于YP濃度。實(shí)施例5-篩選用于萜吸收的市售顆粒實(shí)施以下方案以分析不同類型的顆粒的裝載性質(zhì)。所研究的顆粒是發(fā)面酵母細(xì)胞壁顆粒(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)、NutrexTMWalls(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)、SAF-MannanTM(SAF Agri，Minneapolis，MN)、Nutricept WallsTM(Nutricepts Inc.，Burnsville，MN)、LevacanTM(Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ)和WGPTM(Alpha-beta Technology，Inc.Worcester，MA)。
通過將7g萜+3ml 3.3％Tween-80超聲來制備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
下面的表4比較了純度與酵母顆粒數(shù)/mg和填充的(packed)固體重量/體積比。
表4
從表4可以得出結(jié)論，顆粒數(shù)/mg與純度成反比。因此，每mg WGP的顆粒數(shù)幾乎比發(fā)面YP高10倍。
如下制備所述YP懸浮液-通過混合250mg YP/ml 1％Tween 80來制備發(fā)面酵母細(xì)胞壁顆粒懸浮液(YP)。
-通過混合163mg Nutrex YGP/ml 1％Tween 80來制備Nutrex懸浮液。
-通過混合234mg Biospringer YGP/ml 1％Tween 80來制備SAFMannan懸浮液。
-通過混合99mg Nutricepts YGP/ml 1％Tween 80來制備Nutricepts懸浮液。
-通過混合217mg Lev YGP/ml 1％Tween 80來制備Levacan懸浮液。
-通過混合121mg WGP YGP/ml 1％Tween 80來制備WGP懸浮液。
以上顆粒的填充體積(packed volume)一樣，這意味著測定了相同數(shù)目的顆粒。
如表5所示進(jìn)行裝載反應(yīng)，并溫育過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀和小球中包封萜的顏色。結(jié)果示于表5的兩個(gè)右手欄中。將由不存在游離萜證明被顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。
表5
W＝白色；Y＝黃色；sl＝輕微；int＝中等從該結(jié)果可以得到以下結(jié)論-具有低脂質(zhì)含量的純化的顆粒在吸收萜方面效率較低。
-純度較低的顆粒在吸收萜方面更有效。
-當(dāng)包封在SAF-MannanTM中時(shí)，沒有形成檸檬醛的黃色降解產(chǎn)物。
-根據(jù)所測試的單一萜水平的定性裝載，SAF MannanTM似乎最佳，NutreTM第二，而Baker′s第三。
實(shí)施例6-萜裝載到不同類型的顆粒中的動力學(xué)和不同溫育溫度采用以下方案比較不同類型的酵母顆粒的裝載動力學(xué)。
-通過將7g萜和3ml 3.3％Tween-80一起超聲來制備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將1ml 10％Tween-80在10ml水中超聲來制備1％Tween-80溶液。
-通過將5g發(fā)面YP與20ml 1％Tween-80混合來制備發(fā)面YP。
-通過混合2g NutrexTMYGP和20ml 1％Tween-80來制備NutrexTMYGP懸浮液。
-通過混合2g SAF MannanTM和20ml 1％Tween-80來制備SAFMannanTM懸浮液。
如表6中所示進(jìn)行裝載反應(yīng)。
在室溫或37℃下將反應(yīng)物溫育1、3、6、9和24小時(shí)。在溫育后，將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀。結(jié)果示于表6的兩個(gè)右手欄中。將由不存在游離萜證明被所述顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。在24小時(shí)時(shí)評價(jià)包封小球的顏色。
表6
白色，W；黃色，Y；極黃，VY；室溫，Rt
從表6中所示的結(jié)果和其它觀察可以得到以下結(jié)論·萜裝載反應(yīng)花費(fèi)1至3小時(shí)。
·萜裝載在37℃下比在室溫下更迅速地發(fā)生。
·由于兩個(gè)原因，SAF MannanTM似乎是更優(yōu)選的顆粒-更快和更完全地吸收兩種萜。
-在37℃下24小時(shí)后，由不存在檸檬醛降解特征性的黃色證明檸檬醛在裝載時(shí)保持穩(wěn)定。
實(shí)施例7-篩選多種單一萜和萜組合的顆粒裝載采用以下方案比較發(fā)面YP與SAF MannanTM的裝載效率。
如下制備萜乳液-L-香芹酮-4.5g L-香芹酮于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-檸檬醛-4.5g檸檬醛于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-百里酚/L-香芹酮混合物(T/L)-2.25g百里酚和2.25g L-香芹酮于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-丁子香酚-4.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇-4.5g香葉醇于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-檸檬醛/L-香芹酮/丁子香酚混合物(C/L/E)-1.5g檸檬醛、1.5g L-香芹酮、1.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。
將萜∶水∶表面活性劑比率為0.75∶0.3∶0.05的乳液用于這些實(shí)驗(yàn)中。
如表7和8所示，在室溫下將增加體積的萜乳液與250mg/ml發(fā)面YP或250mg/ml SAF MannanTM混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，并評價(jià)漂浮在水層上的游離萜的外觀。將由不存在游離萜證明被發(fā)面YP或SAF MannanTM吸收的萜乳液的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。記錄小球中包封萜的顏色。表7和8中的結(jié)果顯示，所有單一萜和萜組合都有效地裝載到發(fā)面YP或SAF Mannan顆粒中。
表7-不同萜和萜混合物的發(fā)面YP裝載評價(jià)
表8-不同萜和萜混合物的SAF Mannan裝載評價(jià)
反轉(zhuǎn)的＝相反轉(zhuǎn)-固體漂浮在頂部-不含游離油；W＝白色；Y＝黃色從該結(jié)果得到以下觀察-所有萜看來都裝載入發(fā)面YP和SAF Mannan中。
-SAF Mannan的萜裝載容量高于發(fā)面YP的。
-萜的兩和三向混合物看來也被有效地裝載。
-萜丁子香酚的密度看來高于顆粒和水的，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它與小球締合。
-對于SAF Mannan，更高的裝載水平和更輕的顆粒導(dǎo)致在檸檬醛和香葉醇的情況下裝載顆粒漂浮在水層的表面上。
-SAF Mannan保護(hù)檸檬醛不被氧化，但發(fā)面YP沒有這種保護(hù)。
確定每種顆粒類型的近似最大裝載，并示于下面的表9和10中。裝載百分比表示裝載的萜量與存在的顆粒量的比率(重量比)。
表9-在發(fā)面YP中的最大萜裝載
表10-在SAF Mannan中的最大萜裝載
實(shí)施例8-評價(jià)在水乳液和包封萜制劑中的萜穩(wěn)定性通過觀察檸檬醛制劑的黃色氧化產(chǎn)物形成來評價(jià)萜穩(wěn)定性。如表5-8的右手欄中所示，檸檬醛乳液和檸檬醛包封發(fā)面YP隨時(shí)間而黃色不斷增加。但是，在SAF MannanTM中包封檸檬醛增加檸檬醛穩(wěn)定性，這由黃色隨時(shí)間減少或不存在黃色證明。
實(shí)施例9-在最少量的水中裝載萜進(jìn)行以下方案評價(jià)如下可能性，即可以在極高酵母顆粒(YP)固體水平下將萜裝載和包封到Y(jié)P中，以允許將裝載制劑直接擠出到流化床干燥器中。確定完全水化SAF MannanTM顆粒的最小水量為3.53g水/g固體。這定義了所述顆粒的流體力學(xué)體積(HV)或水吸收容量。在這樣的水量下，水化顆粒具有硬面團(tuán)的稠度，其是觸變性的，即像蛋黃醬一樣剪切稀化。添加水至超過HV 40％導(dǎo)致可流動的稠糊。以3 X HV的水進(jìn)行以上實(shí)施例中所用的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)。
進(jìn)行一系列萜(L-香芹酮)裝載反應(yīng)，保持顆?！幂啤肨ween(1∶0.44∶0.04)的比率不變，并將系統(tǒng)中的水量從HV(3.53g)變?yōu)镠V+40％水(4.92g)。對照是標(biāo)準(zhǔn)裝載系統(tǒng)，其使用3 X HV的水、僅顆粒和僅萜的反應(yīng)。在溫育過夜后，用顯微鏡評價(jià)混合物樣品的游離萜和吸收到所述顆粒中的萜的證據(jù)，并通過評價(jià)15分鐘內(nèi)在反轉(zhuǎn)試管中的流動來評價(jià)材料流動性。此外，通過用5 X HV水化反應(yīng)混合物，渦旋以使顆粒完全分散并離心以沉積顆粒包封的萜，來評價(jià)游離油的存在。結(jié)果示于表11和圖7至12中。圖7至12顯示以下試管的裝載結(jié)果-圖7-試管3-圖8-試管5-圖9-試管6-
圖10-試管8-
圖11-試管10-
圖12-試管11表11
表11和圖7至12中所示的結(jié)果證明，在所評價(jià)的所有水比率下都發(fā)生萜裝載和包封到所述顆粒中。令人驚訝地，即使在使用最小量的水水化所述顆粒的具有硬面團(tuán)的稠度的反應(yīng)物中進(jìn)行裝載反應(yīng)，也發(fā)生等價(jià)的裝載。用顯微鏡觀察到不存在游離萜(圖7至12)，并且萜在上清液中的水平較低，這由所述上清液相對于僅萜對照的顯著稠度降低證明。
這些結(jié)果擴(kuò)展了我們對將萜裝載到中空葡聚糖顆粒中的條件的理解。在裝載過程中可以使用最小體積的水來水化所述顆粒，這種適應(yīng)性將允許在反應(yīng)混合物是可延展面團(tuán)樣稠度的條件下，使用標(biāo)準(zhǔn)食品級掃描曲面揉面機(jī)(swept surface dough mixer)裝載所述萜。裝載著高固體萜的最終混合物的稠度適于直接擠出以形成用于流化床干燥的面條和小球。
放大以此方式的生產(chǎn)的合適的設(shè)備需要-Gaulin均質(zhì)器或等價(jià)物以產(chǎn)生穩(wěn)定的萜乳液。
-掃描曲面揉面槽。
-擠出機(jī)。
-流化床干燥器。
實(shí)施例10-評價(jià)間充水膠體(interstitial hydrocolloid)試劑幫助包封萜成分的干燥中空葡聚糖顆粒再水化時(shí)分散采用以下方案評價(jià)間充水膠體增加干燥中空葡聚糖顆粒包封萜制劑再水化時(shí)分散的效果。
-SAF MannanTM顆粒-0.1％Tween 80-L-香芹酮-黃原膠-1％w/v于0.1％Tween 80中。
如表12所示，通過溫育1.1g L-香芹酮乳液(L-香芹酮∶水∶表面活性劑比率為0.75∶0.3∶0.05)與1g SAF Mannan和含有0-1％黃原膠的4.4g 0.1％Tween 80，將L-香芹酮裝載到SAF Mannan中，評價(jià)提高黃原膠水平對干燥中空葡聚糖顆粒包封的L-香芹酮在水中分散的影響。
表12
表12和
圖13至20中的結(jié)果證明，在干燥顆粒包封的萜的過程中包含高分子量水膠體有助于微粒水化和分散成均勻懸浮液。這些水膠體試劑的其它實(shí)例是麥芽糖糊精、藻酸鹽等。
還可能值得做的是包括小球包衣以增加裝載的萜的穩(wěn)定性，并提供萜的持續(xù)釋放。
實(shí)施例11-評價(jià)萜乳液、新鮮發(fā)面YP和SAF Mannan包封的萜和冷凍干燥的發(fā)面YP和SAF Mannan包封的萜對金黃色葡萄球菌(S.aureus)的最小抑制濃度(MIC)下面的表13顯示為比較新鮮的和冷凍干燥的中空葡聚糖顆粒包封的萜制劑而實(shí)施的方案的結(jié)果。還測試了簡單的萜乳液，并顯示結(jié)果用于比較。
表13MICμg/ml萜
從以上結(jié)果得出的結(jié)論是-將萜裝載到中空葡聚糖顆粒中看來提高萜MIC。一般而言，新鮮萜乳液的功效比包封制劑低約4-375倍。
-裝載到SAF MannanTM中的萜表現(xiàn)稍好于裝載到發(fā)面YP中的。
-新鮮裝載的萜組合物表現(xiàn)稍好于冷凍干燥的組合物(在冷凍干燥過程中可能會從干燥組合物中揮發(fā)掉一些萜)。
-水乳液中的萜穩(wěn)定至少3周。
實(shí)施例12-中試規(guī)模的包封萜對抗金黃色葡萄球菌的功效用中試規(guī)模生產(chǎn)的包封萜和混合物對金黃色葡萄球菌進(jìn)行抗微生物測定。含有新鮮和冷凍干燥的包封萜樣品的材料都顯示強(qiáng)抗微生物活性。結(jié)果總結(jié)于下表14中。
以2.5kg規(guī)模將萜包封到SAF-MannanTM中。用100g Tween-80和8L水溶解和勻化三種萜(香葉醇275g；丁子香酚385g；和百里酚，440g)的混合物。添加SAF-MannanTM(2.5Kg)以形成均勻的懸浮液。使所述懸浮液通過Gaulin均質(zhì)器以減小顆粒尺寸，并將均勻混合物在室溫下溫育過夜。取出包封萜的樣品，并貯存在室溫下。然后在盤中將剩余的包封萜冷凍并冷凍干燥。將冷凍干燥的包封萜粉末研磨并貯存在室溫下。
表14
在中試規(guī)模下，以萜重量計(jì)，新鮮和冷凍干燥的樣品具有相等的功效。
基于大規(guī)模制備的結(jié)果，冷凍干燥制劑對金黃色葡萄球菌的預(yù)期有效劑量為200ppm(所述制劑含有約50重量％的萜)或0.2g/L水。
實(shí)施例13-包封萜對抗分枝桿菌的功效如下制備萜乳液-檸檬醛-4.5g檸檬醛于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-L-香芹酮/丁子香酚-2.25g L-香芹酮和2.25g丁子香酚于1.5ml3.3％Tween-80中。
-丁子香酚-4.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇-4.5g香葉醇于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇/百里酚混合物-2.25g香葉醇和2.25g百里酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。
-對照乳液-6ml 1％Tween-80。
將SAF-MannanTM(2.5g)與3ml每種乳液和7ml 1％Tween 80混合，并溫育過夜，以包封所述萜和萜混合物。將包封萜制劑冷凍并冷凍干燥，并將粉末研磨成細(xì)粉。測定包封萜的懸浮液(25mg/ml)和未包封萜乳液對抗分支桿菌的抗菌活性。結(jié)果列于表15中。
表15
FD＝(冷凍干燥)實(shí)施例14-包封萜的殺線蟲活性根據(jù)上述程序制備酵母細(xì)胞壁包封的檸檬醛制劑。中空葡聚糖顆粒含有17.5％檸檬醛，并且所述顆粒在測試制劑中的濃度為1000ppm。這意味著萜的有效濃度為175ppm。
將1.0ml測試制劑添加到0.1至0.15ml含有根結(jié)線蟲的水中。向所述線蟲中添加1.0水作為對照。
如前所述進(jìn)行觀察，并且在24和48小時(shí)后評價(jià)殺傷率(即死亡百分比)。下表16中所示的結(jié)果是2批結(jié)果的平均值。
表16-包封萜溶液(17.5％檸檬醛，1000ppm)的殺線蟲活性
結(jié)果證明，當(dāng)顆粒濃度為1000ppm(相當(dāng)于檸檬醛濃度僅為175ppm)時(shí)，包封萜的中空葡聚糖顆粒有效地殺死根結(jié)線蟲。
因此，包封萜的中空葡聚糖顆粒作為殺線蟲劑看來與溶液中的萜或與表面活性劑一同的萜同樣有效。盡管萜被包封在所述顆粒中，但仍然保留了殺線蟲活性?？梢灶A(yù)期，萜在所述中空葡聚糖顆粒中的更高濃度或者所述顆粒的更高濃度會導(dǎo)致甚至更高的殺傷率，就像在溶液中的萜或與表面活性劑一同的萜的情況一樣。
實(shí)施例15-包封和未包封萜的殺真菌性質(zhì)進(jìn)行以下方案評價(jià)各種萜組合的殺真菌性質(zhì)，并比較包封和未包封組合物的功效。
評價(jià)不同萜制劑的殺真菌性質(zhì)使用微量滴定板測定評價(jià)多種萜化合物對抗不同致病微生物的最小抑制濃度(MIC)。下文更詳細(xì)地描述用于每種微生物的測定，但重要的一般特征如下。
測定使用兩個(gè)溫育期以區(qū)別抑制(static)活性(生長抑制)和殺滅(殺死)活性。第一個(gè)溫育期允許評價(jià)生長抑制，但不能區(qū)別僅僅阻止細(xì)胞生長和殺死細(xì)胞。第二個(gè)溫育期的目的是允許存活于萜暴露的任何休眠或受抑制的細(xì)胞有足夠的時(shí)間和養(yǎng)分以增殖。被真菌抑制作用抑制的任何細(xì)胞都應(yīng)在第二個(gè)溫育期內(nèi)反應(yīng)并生長，而被萜暴露殺死的細(xì)胞則不會在新鮮培養(yǎng)基中生長。
用總共31種不同的萜制劑進(jìn)行初始篩選試驗(yàn)(表17)。用具有強(qiáng)活性的萜制劑子集重復(fù)這些試驗(yàn)(表18)。
還測試了包封在葡聚糖顆粒中的比率為2∶1∶2的香葉醇、丁子香酚和百里酚萜組合；該樣品稱為YP-GET。還測試了相同比率的未包封香葉醇、丁子香酚和百里酚組合，用于與包封形式比較。
使用釀酒酵母的MIC測定向96孔微量滴定板的每個(gè)孔中添加100μL釀酒酵母等分試樣(5×105個(gè)細(xì)胞/mL，在YPD生長培養(yǎng)基中)。將每板的至少一欄指定為僅細(xì)胞對照，不向這些孔中添加萜。向其余欄的第一行添加不同萜制劑的等分試樣(100μL)，并通過從一行向下一行轉(zhuǎn)移100μL來進(jìn)行系列2倍稀釋，總共7次。最后，為了保證所有孔中含有相同的體積，從最后一行棄去100μL。在30℃下將微量滴定板靜止溫育過夜。
在溫育后，評價(jià)板的生長抑制(由缺少濁度證明)。通過顯微鏡視覺證明生長抑制(≥75％)。
一旦確定每種制劑的MIC，就將微量滴定板離心，并且從不混濁的孔中除去用過的培養(yǎng)基。將細(xì)胞再懸浮于新鮮培養(yǎng)基(100μL)中，并在30℃下將所述板再溫育過夜。如前進(jìn)行生長抑制的評價(jià)。
使用混合接種物的MIC測定如關(guān)于釀酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀釋不同的萜制劑。然后將熔化的YPD瓊脂和5μL混合接種物(從發(fā)霉的葡萄葉制成濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/mL)一起添加到孔中。將所述板在室溫下靜止溫育24小時(shí)，并通過顯微鏡視覺評價(jià)孢子生長。
由于使用固體培養(yǎng)基，所以不能進(jìn)行在新鮮培養(yǎng)基中的第二個(gè)溫育期。
使用禾生毛盤孢的MIC測定如關(guān)于釀酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀釋不同的萜制劑。將禾生毛盤孢(300個(gè)孢子/孔)添加到經(jīng)稀釋的萜中，并將所述板在室溫下靜止溫育48小時(shí)。通過顯微鏡視覺評價(jià)孢子萌發(fā)和生長。
一旦確定每種制劑的MIC，就將微量滴定板離心，并從生長受抑制的孔中除去用過的培養(yǎng)基。將孢子再懸浮于新鮮培養(yǎng)基(100μL)中，并將所述板在室溫下再溫育過夜。如前進(jìn)行生長抑制的評價(jià)。
表17-從31種萜制劑的初始篩選中獲得的MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET制劑a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b按萜含量計(jì)算的MIC
表18-重復(fù)測定以確定MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET制劑說明樣品平行測定兩次。如果兩份樣品獲得不同的值，則報(bào)告較高的值。
沒有兩份樣品差別大于一個(gè)2倍稀釋a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b1×104個(gè)細(xì)胞/mL貯備懸浮液c按萜含量計(jì)算的MIC混合接種物使用混合接種物存在許多問題。制劑的孢子含量變化導(dǎo)致測定間的重復(fù)性較差，并且污染微生物的生長妨礙孢子萌發(fā)的評價(jià)。單細(xì)胞酵母種類在掩蓋孢子生長方面特別成問題。雖然不能從該測定獲得精確的數(shù)據(jù)，但也觀察到了萜的抑制作用。
與初始篩選測定相比，在評價(jià)重復(fù)測定時(shí)鑒別孢子更容易，因?yàn)槭褂昧烁罅康逆咦?約50個(gè)孢子/孔相對約10個(gè)孢子/孔)。因此，在重復(fù)測定過程中獲得的數(shù)據(jù)可能提供更可靠的MIC評價(jià)。
禾生毛盤孢與初始篩選測定相比，從重復(fù)測定獲得了通常更高的MIC值，這可能是因?yàn)椤な褂梅胖?周的萜溶液·使用新鮮制備的孢子，與初始篩選測定中使用的孢子相比，它們具有更高的存活力，因此可能更難殺死。
比較作為游離乳液的萜制劑和包封在中空葡聚糖顆粒中的相同萜制劑釀酒酵母MIC測定向96孔微量滴定板的每個(gè)孔中添加YPD生長培養(yǎng)基(100μL)，并向第一行添加不同萜制劑的等分試樣，使該行中的總體積達(dá)到200μL。將一欄指定為僅細(xì)胞對照，并且不向這些孔中添加萜。通過從一行向下一行轉(zhuǎn)移100μL來進(jìn)行系列2倍稀釋，總共7次。最后，為了保證所有的孔中含有相同的體積，從最后一行棄去100μL。然后向每個(gè)孔中添加100μL釀酒酵母等分試樣(5×105個(gè)細(xì)胞/mL，在YPD生長培養(yǎng)基中)，并用微量滴定板計(jì)數(shù)器測量每個(gè)孔在620nm的吸光度(A620)。在30℃下將微量滴定板靜止溫育過夜。
在溫育后，再次測量A620，并評價(jià)板的生長抑制(≥75％)。通過顯微鏡視覺證明生長抑制。
對于游離萜乳液，一旦確定了每種制劑的MIC，就將微量滴定板離心，并從生長受抑制的孔中除去用過的培養(yǎng)基。將細(xì)胞再懸浮于新鮮培養(yǎng)基(100μL)中，并將所述板在30℃下再溫育過夜。如前進(jìn)行生長抑制的評價(jià)。
MIC和殺真菌MIC結(jié)果總結(jié)于表19中。
結(jié)果表19-從篩選31種萜制劑獲得的對釀酒酵母的MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET制劑；YP-ETC，酵母包封的ETC制劑
a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b除非另有說明，為酵母包封的制劑c按萜含量計(jì)算的MICd未包封的乳液制劑對于萜乳液和酵母包封的萜，MIC典型地≤125ppm，其中活性最強(qiáng)的制劑在約60ppm下抑制生長。從萜乳液獲得的MIC值與從它們各自的酵母包封制劑獲得的MIC值相似。當(dāng)獲得不同的值時(shí)，它們僅相差約一個(gè)2倍稀釋。
在生長抑制MIC下，許多游離萜乳液都是殺真菌的，其中大多數(shù)在高2倍的濃度下顯示殺真菌活性。
這些結(jié)果證明，包封在葡聚糖顆粒中的萜至少與未包封形式一樣有效地殺死真菌。此外，所用的包封組合物可能具有降低的功效，因?yàn)樗鼈円呀?jīng)在4℃下貯存了45天，并且具有約4重量％的次佳(sub-optimal)萜含量。
確定殺真菌活性的測定包括離心步驟，其通過在孔底部產(chǎn)生細(xì)胞小球而試圖分離微生物細(xì)胞和生長培養(yǎng)基中的任何殘余萜。然后將該小球再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，并在無萜存在下溫育第二次。但是，離心步驟不能區(qū)分微生物細(xì)胞和酵母顆粒，因此當(dāng)使用酵母包封的萜時(shí)，細(xì)胞小球還會含有裝載萜的酵母顆粒。結(jié)果是，然后酵母顆粒和細(xì)菌細(xì)胞均被再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。
出于以下原因，認(rèn)為這種方法學(xué)不影響在上述實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果。
·在前面的實(shí)驗(yàn)中，使用萜乳液而不是裝載萜的酵母顆粒，并且已清楚地顯示了殺真菌活性。
·包封萜通過擴(kuò)散被釋放，并且在周圍培養(yǎng)基中迅速達(dá)到包封萜濃度和釋放萜濃度之間的平衡。因此，在離心和再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中后，生長培養(yǎng)基中釋放萜的濃度可能大大低于生長抑制活性所需要的濃度。
·當(dāng)將殺真菌MIC孔的內(nèi)容物鋪到固體瓊脂生長培養(yǎng)基上時(shí)，沒有生長。當(dāng)鋪到固體生長培養(yǎng)基上時(shí)，任何殘余的萜擴(kuò)散通過大體積的瓊脂板導(dǎo)致局部萜濃度太低以至于不引起生長抑制。因此，殺真菌MIC孔的內(nèi)容物缺少生長必然是因?yàn)槌跏細(xì)⒄婢钚?。相反，?dāng)獲得低于殺真菌MIC的MIC并且將MIC孔的內(nèi)容物鋪到固體瓊脂生長培養(yǎng)基上時(shí)，觀察到了生長，表明真菌抑制作用。
實(shí)施例16-制備用于田間試驗(yàn)的包封萜組合物以下方案的目的是將萜組合物包封到中空葡聚糖顆粒中，用于隨后的田間試驗(yàn)。
材料百里酚(由Alpha-Gamma Corporation供應(yīng))丁子香酚(由Alpha-Gamma Corporation供應(yīng))香葉醇(由Alpha-Gamma Corporation供應(yīng))1％Tween-80(由Alpha-Gamma Corporation供應(yīng))酵母細(xì)胞壁顆粒黃原膠酵母細(xì)胞壁顆粒以商品名Nutricell MOS 55得自Biorigin(Sao Paolo，Brazil)，并由Acucareira QuatáS.A，Usina Quatá，Quatá-Sao Paolo-Brazil-郵政編碼19780 000生產(chǎn)。所述顆粒是噴霧干燥的釀酒酵母細(xì)胞壁提取物，是淺米色至茶色的自由流動粉末。
方案以下方案適于1Kg顆粒，但可以簡單地放大到更大的生產(chǎn)。
1.制備萜混合物一在玻璃燒瓶中混合375克香葉醇+525克丁子香酚+600克百里酚并攪拌。
2.通過在2加侖白色桶中混合62克Tween 80和6.2L水來制備6.2L1％Tween 80?；旌弦孕纬扇芤骸?br> 3.將6.2克黃原膠添加到Tween溶液中并攪拌使溶解。
4.通過在白色桶中用polytron混合器混合1.5Kg萜混合物+6.2L 1％Tween 80/0.1％黃原膠來制備萜乳液。
5.添加1000克酵母細(xì)胞壁顆粒一用涂料混合器混合以形成均勻的懸浮液。
6.將步驟4的萜乳液添加到所述酵母細(xì)胞壁顆粒中，同時(shí)混合以形成稀蛋黃醬樣稠度。
7.將萜混合物傾入罐中并溫育過夜。
結(jié)果獲得包封在中空葡聚糖顆粒中的香葉醇、丁子香酚和百里酚，其為糊狀物。通過常規(guī)噴霧干燥技術(shù)將所述糊狀物容易地轉(zhuǎn)化為干燥粉末。在以下方案中將所述糊狀物稱為“液體”組合物，而所述“粉末”指噴霧干燥形式。
實(shí)施例17-包封萜組合物對霜霉病的田間試驗(yàn)在葡萄中，霜霉病由真菌葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)引起，其在世界范圍內(nèi)感染葡萄園，并且在作物產(chǎn)量和葡萄酒質(zhì)量方面可以引起葡萄種植者的毀滅性損失。該真菌攻擊葡萄樹的果實(shí)和所有綠色部分，引起葉子枯萎以及花和漿果腐爛。該病害的表現(xiàn)為葉的上表面上的不規(guī)則淺黃色或黃綠色斑點(diǎn)，伴有密集的白-灰、棉花樣真菌生長，其覆蓋葉損傷的下面。漿果也可能被霜霉生長所覆蓋，并且取決于感染時(shí)間，可能變成棕色并軟化，或者可能根本不變軟。霜霉病通過風(fēng)和雨分散孢子而傳播，并且感染需要潮濕的環(huán)境。在高濕度的環(huán)境中其特別成問題。推薦預(yù)防性措施來控制該病害，即早期施用殺真菌劑，然后以恰當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)施用。已經(jīng)對一些處理產(chǎn)生了耐藥性，雖然通過輪換使用不同的殺真菌劑可以使耐藥性的發(fā)生最小化，但其仍然是個(gè)問題。
本試驗(yàn)的目的是調(diào)查作為液體或粉末(噴霧干燥)制劑供應(yīng)的實(shí)施例16的包封萜制劑(YGP-GET)用于預(yù)防葡萄霜霉病的功效。
在Kir-Yianni葡萄園中，在位置20上標(biāo)出每個(gè)覆蓋0.1ha的四個(gè)相鄰地塊。
Kir-Yianni是35ha的葡萄園，海拔300m。其在北邊和西邊以混合橡木林為邊界，且南面和東面是果園和葡萄園。
在施用所述萜制劑之前，已經(jīng)用多種產(chǎn)品處理所有四個(gè)地塊。在2004年6月26日，以0.5g/L或2g/L的劑量向所述四個(gè)地塊中的兩個(gè)噴霧萜粉末制劑(參見圖21中的示意圖)。用常規(guī)Bordeaux混料加可濕性硫處理第三個(gè)地塊，而剩余地塊不作處理。在隨后的一周中監(jiān)測每個(gè)地塊中葡萄樹的霜霉病病征。
在Kir-Yianni葡萄園的位置18上標(biāo)出每個(gè)覆蓋0.1ha的另外四個(gè)相鄰地塊。在施用所述萜制劑之前，已經(jīng)用多種產(chǎn)品處理所有四個(gè)地塊。在2004年6月26日，以1g/L或4g/L的劑量向所述四個(gè)地塊中的兩塊噴霧萜液體制劑(圖21)(說明1g所述萜液體制劑的體積為1ml)。對于剩余兩個(gè)地塊，一個(gè)不作處理，而另一個(gè)在2004年6月28日噴霧Mikal_，其是對霜霉病的常規(guī)處理。在隨后的一周中監(jiān)測每個(gè)地塊中葡萄樹的霜霉病病征。
對于兩個(gè)位置，都以1200L/ha的比率施用所述萜產(chǎn)品。
記錄葡萄的以下生長階段-發(fā)芽，2004年3月26日-開花，2004年6月1日-轉(zhuǎn)色期(veraison)，2004年8月6日在轉(zhuǎn)色期前進(jìn)行研究施用。
2004年生長季節(jié)異常遲，并且一直都很潮濕。來自霜霉病的病害壓力極高，灰霉病(botrytis)水平升高，而白粉病壓力適中。粉末和液體YGP-GET制劑都貯存在室溫下。沒有使用特別的貯存條件。
比較產(chǎn)品的細(xì)節(jié)粉末制劑試驗(yàn)Bordeaux混料，由Manica Spa，Italy生產(chǎn)，由MoscholiosChemicals SA在希臘包裝；可濕性硫。
液體制劑試驗(yàn)Mikal_(乙磷鋁50％，滅菌丹25％)，由BayerCropScience生產(chǎn)，由Bayer Hellas SA在希臘分裝。如下施用所述比較產(chǎn)品在發(fā)芽前以15g/L的劑量施用一次，然后每年以6.5g/L的劑量再施用兩次。全部三次施用所用的噴霧比率都為1000L/ha。
粉末制劑試驗(yàn)在2004年6月26日施用Bordeaux混料(2g/L)和可濕性硫(2.2g/L)。
液體制劑試驗(yàn)在2004年6月28日施用Mikal(3.2g/L)。
視覺檢查葡萄樹的霜霉病癥狀。該病害發(fā)作的標(biāo)志是每片葉子上平均有兩塊油性斑點(diǎn)。認(rèn)為阻止更多斑點(diǎn)出現(xiàn)的處理提供對抗霜霉病的有效保護(hù)。
結(jié)果YGP-GET粉末制劑(噴霧干燥)Bordeaux混合物的常規(guī)處理提供對抗霜霉病的良好保護(hù)。在對照葡萄樹中觀察到霜霉病的輕微癥狀。0.5g/L萜產(chǎn)品濃度沒有提供保護(hù)，而2g/L萜產(chǎn)品濃度僅提供稍好于對照的保護(hù)。說明因?yàn)榻诘臍⑾x劑處理，在該位置的病害壓力非常低。
在溶解粉末制劑時(shí)遇到了困難，因?yàn)槠浞浅＜?xì)，導(dǎo)致在空氣中分散。這可能不利地影響產(chǎn)品的功效。
YGP-GET液體制劑當(dāng)以4g/L的劑量施用時(shí)，該萜產(chǎn)品提供對抗暴露樹冠上的霜霉病的極好保護(hù)。1g/L劑量沒有提供保護(hù)。在對照地塊中觀察到嚴(yán)重的霜霉病癥狀。
該液體制劑易于使用，并且具有舒適的氣味。
討論因?yàn)樗共ψ魑锂a(chǎn)量和葡萄酒質(zhì)量的影響，其可以引起葡萄種植者的毀滅性損失。對該病害的控制集中在預(yù)防上，因?yàn)橐坏┌l(fā)生病害，感染就可以迅速傳播。在噴霧粉末制劑的位置，YGP-GET在較低劑量(0.5g/L)下未表現(xiàn)出功效，而2g/L的劑量不如常規(guī)處理有效。在該位置，近期的殺蟲劑施用導(dǎo)致病害壓力低，這可能限制了該萜處理的表觀功效。但是，認(rèn)為萜產(chǎn)物的劑量低于2g/L是不夠的。
在噴霧液體制劑的位置，4g/L的較高劑量水平提供對暴露樹冠的極好保護(hù)。在該位置的過度植物生長導(dǎo)致對外部較新分枝的處理比對生長在樹冠內(nèi)部的較老分枝更有效。用該萜產(chǎn)品完全覆蓋葉是有用的，因?yàn)樵撎幚聿皇窍到y(tǒng)的。估計(jì)使用該萜處理，比用于常規(guī)系統(tǒng)處理的體積增加約30％會獲得良好覆蓋。
結(jié)論向葉施用濃度為4g/L的YGP-GET液體制劑高度有效地控制霜霉病。0.5g/L粉末和1g/L液體的較低濃度無效。
實(shí)施例18-包封萜組合物對白粉病的田間試驗(yàn)葡萄的白粉病由真菌葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)引起，并且導(dǎo)致葡萄樹生長減慢、果實(shí)質(zhì)量降低和葡萄樹的越冬性降低。在釀酒葡萄中，僅3％的漿果感染水平就可以影響葡萄酒質(zhì)量。該病害的特征是葉子上真菌生長的白-灰小斑點(diǎn)，其擴(kuò)大成白色粉狀被覆。該真菌生長還可以發(fā)生在漿果上，漿果可能破裂。與需要溫暖潮濕條件的霜霉病相反，白粉病是較干燥生長季節(jié)中的問題，因?yàn)樗矚g潮濕的蔭涼區(qū)域但不是多雨的氣候條件。推薦預(yù)防性措施以控制白粉病，其中早期施用殺真菌劑，然后以適當(dāng)?shù)拈g隔重復(fù)使用。
本研究的目的是調(diào)查施用YGP-GET組合物預(yù)防葡萄中的白粉病的功效。
在Kir-Yianni葡萄園中，在位置18上標(biāo)出每個(gè)覆蓋0.1ha的三個(gè)相鄰地塊。在2004年7月19日，以2ml/L的劑量向所述三個(gè)地塊中的一個(gè)噴霧YGP-GET液體制劑，而一塊不作處理。用Equesion(2.5g/L)、Alliete(0.9g/L)和Punch(0.075mL/L)的常規(guī)處理噴霧剩余地塊(參見圖22)。在隨后的一周中監(jiān)測每個(gè)地塊中葡萄樹的白粉病病征。
在Kir-Yianni葡萄園的位置20上標(biāo)出每個(gè)覆蓋0.1ha的另外三個(gè)相鄰地塊。在2004年7月20日，以2ml/L的劑量向所述三個(gè)地塊中的一個(gè)噴霧YGP-GET液體制劑，而剩余兩個(gè)地塊不作處理(參見圖22)。在隨后的一周中監(jiān)測每個(gè)地塊中葡萄樹的白粉病病征。
在兩個(gè)位置上，所述地塊以前都已用多種產(chǎn)品處理過，包括預(yù)先施用萜產(chǎn)品。
以1200L/ha的比率施用所有的萜處理以保證完全覆蓋。
記錄葡萄的以下生長階段-發(fā)芽，2004年3月26日
-開花，2004年6月1日-轉(zhuǎn)色期，2004年8月6日在轉(zhuǎn)色期前進(jìn)行研究施用。
2004年生長季節(jié)異常遲，并且一直都很潮濕。來自霜霉病的病害壓力極高，灰霉病水平升高，而白粉病壓力適中。
比較產(chǎn)品的細(xì)節(jié)在位置20不使用比較產(chǎn)品。下面詳述描述在位置18使用的比較處理。
Punch_(氟硅唑40％)，DuPont。
在2004年7月19日，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明，以0.075ml/L的劑量施用Punch，作為白粉病的預(yù)防性處理。
附加產(chǎn)品的細(xì)節(jié)在位置20不使用附加產(chǎn)品。下面詳述描述在位置18使用的附加產(chǎn)品。
Equesion系統(tǒng)(噁唑酮菌22.5％加霜脲氰30％)Alliete(乙磷鋁80％)在2004年7月19日，施用Equesion(2.5g/L)和Alliete(0.9g/L)，作為白粉病的預(yù)防性處理。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明確定劑量。
該比較產(chǎn)品和附加產(chǎn)品表示綜合病害控制方案中的常規(guī)處理。
視覺檢查葡萄樹的白粉病癥狀。
結(jié)果位置18在對照地塊中約20％的梗和莖為黑色，表明中度感染白粉病。在常規(guī)處理地塊和萜處理地塊，所有的莖和梗都是綠色的，表明已經(jīng)提供了足夠的保護(hù)。
位置20在任何地塊中都沒有觀察到白粉病感染的跡象。
附加觀察在生長季節(jié)結(jié)束時(shí)，位置18和20的地塊總的來說顯示比該葡萄園的其余部分更少的病害壓力。
由于葡萄樹生長減慢、果實(shí)質(zhì)量降低和葡萄樹越冬性降低，白粉病感染引起種植者的重大損失。此外，低至3％的漿果感染水平就可以影響葡萄酒質(zhì)量。對該病害的控制集中在預(yù)防上，因?yàn)橐坏┌l(fā)生病害，感染就可以迅速傳播。在本研究中，在位置18施用萜產(chǎn)品YGP-GET有效地防止白粉病感染，并且該萜產(chǎn)品表現(xiàn)出的控制水平與所述常規(guī)處理提供的控制水平相當(dāng)。但是，因?yàn)椴淮嬖诎追鄄「腥?，所以來自位?0的結(jié)果是不確定的。這種沒有感染可能是因?yàn)樵谠撗芯恐皬V泛施用了殺蟲劑，其導(dǎo)致病害壓力低。
在位置18和20的病害壓力水平較低提示在這些位置較早施用萜處理可能在長期感染控制方面是有益的。
結(jié)論YGP-GET有效預(yù)防白粉病感染，其控制水平與常規(guī)處理提供的控制水平相當(dāng)。
實(shí)施例18-包封萜組合物對白粉病的其它田間試驗(yàn)該研究旨在進(jìn)一步研究YGP-GET處理Grimson無核鮮食葡萄中白粉病的功效。
在2004年7月1日施用Cisteine時(shí)，由于疏忽而未對Tsigaras葡萄園(在Kir-Yianni葡萄園以南約80km)上的0.1ha小區(qū)進(jìn)行處理。后來這小區(qū)中的葡萄樹在葉、莖和葡萄上顯示嚴(yán)重的白粉病癥狀。在2004年7月12日，以1200 l/ha的比率向該未處理小區(qū)噴霧3ml/L YGP-GET液體制劑，并向該葡萄園的其余部分噴霧比較產(chǎn)品Rogana。在24小時(shí)后評價(jià)葡萄樹的白粉病癥狀。
在高lyre棚架系統(tǒng)中排列葡萄樹。
比較產(chǎn)品的細(xì)節(jié)Rogana(腈苯唑5％，binocap 16％)，由BASF(BASF Agro Hellas S.A.，Athens，Greece)生產(chǎn)。在2004年7月12日，將Rogana施用到Tsigaras葡萄園，作為白粉病的處理。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明確定劑量。
視覺檢查葡萄樹的白粉病癥狀。
結(jié)果在施用YGP-GET之前，嚴(yán)重白粉病的癥狀明顯。在施用YGP-GET后僅24小時(shí)，白粉病的白花就變成了黑色，表明有效的殺真菌活性。因?yàn)榇藭r(shí)有效地停止了病害，所以沒有施用進(jìn)一步的處理。YGP-GET顯示與常規(guī)處理相當(dāng)?shù)墓πА?br> 討論在本研究中，使用YGP-GET快速并有效地處理已發(fā)生的白粉病感染。在施用后僅24小時(shí)，通過施用該萜產(chǎn)品就停止了以前嚴(yán)重的白粉病感染，其功效與常規(guī)處理相當(dāng)。
從本研究獲得的初步數(shù)據(jù)提示，除了顯示預(yù)防能力外，YGP-GET還能有效處理已發(fā)生的真菌感染。
實(shí)施例19-包封萜組合物對白粉病的其它田間試驗(yàn)背景和基本原理在本試驗(yàn)中，作為使用有機(jī)產(chǎn)品控制白粉病的Tasmanian葡萄園(Frogmore Creek Vineyard，Hathaway Trading Pty Ltd，Box 187，RichmondTAS 7025，Australia)實(shí)驗(yàn)程序的一部分，研究YGP-GET的使用。本研究的目的是調(diào)查在有機(jī)控制Chardonnay葡萄園的白粉病中，施用YGP-GET的短期功效。
在該試驗(yàn)中，在2005年2月7日用萜產(chǎn)品YGP-GET處理葡萄樹(Chardonnay品種)或不作處理(對照)。雖然受到以前有機(jī)處理的抑制，但試驗(yàn)前白粉病的嚴(yán)重性仍然處于商業(yè)上明顯無法接受的水平，并且在6個(gè)活性處理小區(qū)和6個(gè)對照小區(qū)中同樣嚴(yán)重。作物階段為約E-L 33-34(轉(zhuǎn)色期前)。
向6個(gè)Chardonnay小區(qū)噴霧YGP-GET(4mL/L)(液體制劑)，這些小區(qū)以前曾用牛奶處理過。用六個(gè)Chardonnay小區(qū)作為未處理的對照，但它們以前曾用油/乳清處理過。每個(gè)小區(qū)中葡萄樹的數(shù)目典型地為7。
在本方案中所用的YGP-GET組合物的細(xì)節(jié)在表20中給出。
表20-在本研究中所用的制劑批次
在萜處理前3天和處理后3天評價(jià)白粉病的嚴(yán)重性。在每個(gè)小區(qū)中，任意選擇20串葡萄(每個(gè)側(cè)面(panel side)10串)，并將病害嚴(yán)重性評價(jià)為被活性霉菌菌落覆蓋的串的面積百分比。不可能做進(jìn)一步的評價(jià)，因?yàn)殡S后種植者又向整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域噴霧了硫和基于植物油的噴霧助劑(SynertrolHorti Oil)。
待處理植物的數(shù)量/面積測試產(chǎn)品向6個(gè)Chardonnay小區(qū)(總計(jì)約42棵葡萄樹)施用YGP-GET(4mL/L)，這些小區(qū)以前用牛奶處理過。
對照不向作為對照的6個(gè)Chardonnay小區(qū)(總計(jì)約42棵葡萄樹)使用處理，但它們以前用油/乳清處理過。
種植方法地塊B2的vitis vinifera(Chardonnay)葡萄樹用弓形藤條垂直投射定位。
種植排列間距行間距2.5m，葡萄樹間距1.25m(行內(nèi))，每公頃3200棵葡萄樹。行方向?yàn)閺谋毕蚰稀?br> 樹冠密度使用點(diǎn)樣方(point-quadrat)法表征試驗(yàn)前Chardonnay葡萄樹的樹冠密度(表21)。在2005年1月13日，在以前用硫處理或未處理的Chardonnay小區(qū)內(nèi)，選擇代表性的樹冠部分進(jìn)行測量。在每個(gè)處理前對6個(gè)小區(qū)各自進(jìn)行十次測量(即經(jīng)硫處理小區(qū)總計(jì)60次測量，未處理的對照小區(qū)總計(jì)60次測量)。此外，測量3個(gè)直立芽(每個(gè)小區(qū))的節(jié)點(diǎn)長度和數(shù)目。
表21-試驗(yàn)前Chardonnay葡萄樹的樹冠密度
NA，不適用一般條件與未處理的對照相比，以前用實(shí)驗(yàn)材料處理這些小區(qū)抑制白粉病。但是，認(rèn)為白粉病的水平在商業(yè)上是無法接受的，雖然其水平在經(jīng)牛奶處理和經(jīng)油/乳清處理小區(qū)中是相等的。
施用方法、劑量和方案在2005年2月7日，用連接軟管卷盤和泵的手工噴槍施用YGP-GET處理(4mL/L)，所述泵安在多用途車的平臺上。以1500-1600kPa(200-230psi)的泵壓力推進(jìn)噴霧，遞送約63mL/秒。使用常規(guī)處理的標(biāo)準(zhǔn)噴霧體積(約900L/ha)。
按被活性霉菌菌落覆蓋的葡萄串的面積(％)估計(jì)，評價(jià)在每個(gè)小區(qū)中任意選擇的20串(每個(gè)側(cè)面10串)的白粉病的嚴(yán)重性。在2005年2月4日，即施用YGP-GET處理前3天評價(jià)病害嚴(yán)重性，并且在2005年2月10日，即施用萜后3天再次評價(jià)。
用反正弦轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)以獲得平均分離。
結(jié)果在處理前，在6個(gè)要用萜處理的小區(qū)中，Chardonnay葡萄串的白粉病平均嚴(yán)重性(20.4％)與6個(gè)對照小區(qū)中的白粉病平均嚴(yán)重性(23.2％；表22)相似?；谶@些數(shù)據(jù)的反正弦轉(zhuǎn)換的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，處理前病害的嚴(yán)重性沒有顯著性差異(表23)。
但是，在處理后三天，在YGP-GET處理的串上白粉病的平均嚴(yán)重性為23.8％，而對照上為37.8％(表22)。這些數(shù)據(jù)的反正弦轉(zhuǎn)換顯示萜處理的葡萄串有利地具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，其活性霉菌菌落覆蓋的面積更小(p＝0.058；表23)。
表22.用YGP-GET處理前和處理后Chardonnay串的平均白粉病嚴(yán)重性(％)
表23.數(shù)據(jù)的反正弦轉(zhuǎn)換后處理的統(tǒng)計(jì)分離
討論葡萄樹感染白粉病可能由于對葡萄樹的生長和耐久力以及果實(shí)和葡萄酒質(zhì)量的有害影響而引起種植者的顯著損失。在有機(jī)控制的葡萄園中，種植者正在尋找諸如元素硫的處理的替代。
本研究在Tasmania，Australia的有機(jī)葡萄園中調(diào)查了作為液體制劑的包封萜制劑(4mL/L)在控制白粉病方面的功效。雖然在施用萜前僅3周時(shí)已經(jīng)使用了其它實(shí)驗(yàn)處理，但認(rèn)為白粉病感染水平在商業(yè)上仍然是無法接受的。在用YGP-GET處理Chardonnay葡萄樹后三天，被處理的葡萄上的白粉病的嚴(yán)重性就顯著低于未處理對照上的。盡管未處理對照的感染嚴(yán)重性在處理前和處理后評價(jià)的6天內(nèi)惡化，但是在經(jīng)處理的葡萄樹中其保持不變。因此，YGP-GET看來減緩了在處理前已經(jīng)充分存在孢子化白粉病菌落的葡萄串上病害增加的速率。推測起來，菌落擴(kuò)張受到抑制，雖然已有菌落在一定程度上仍在繼續(xù)形成孢子。不可能進(jìn)行更長期的功效評價(jià)，因?yàn)殡S后種植者向全部試驗(yàn)地塊噴霧了硫。
這些鼓舞人心的結(jié)果證明了YGP-GET在控制葡萄樹的白粉病方面的功效。
實(shí)施例20-包封萜組合物對灰霉病的田間試驗(yàn)葡萄的灰霉病由灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)，一種引起果實(shí)產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失的常見真菌引起。漿果是主要的感染位置，但該病害也可以感染花和葉。起初，受感染漿果出現(xiàn)軟化和水化，并且在高濕度和濕氣條件下可能被灰色真菌生長所覆蓋。受感染漿果隨時(shí)間枯萎和脫落?；颐共∠矚g空氣循環(huán)差的潮濕條件，且裂口或受損的漿果對感染的傳播尤其敏感。對灰霉病的控制策略包括在生長季節(jié)中促進(jìn)良好的空氣循環(huán)、防止損傷和在合適的時(shí)間施用殺真菌劑。
本研究的目的是調(diào)查YGP-GET在處理葡萄灰霉病感染方面的功效。
不能用常規(guī)農(nóng)藥處理(在施用Teldor_后3周)于2004年10月中旬Kir-Yianni葡萄園中出現(xiàn)的灰霉病，因?yàn)橄嚓P(guān)的再進(jìn)入時(shí)間限制會阻止計(jì)劃的收獲。因此，在該葡萄園的位置7上標(biāo)出兩個(gè)相鄰的0.1ha的小區(qū)，并在2004年10月12日，用4mL/L YGP-GET液體制劑處理這些小區(qū)中的一個(gè)，而另一個(gè)不作處理(參見圖23)。在3天后收獲作物，并確定每個(gè)小區(qū)的受感染漿果的比率(占總產(chǎn)量的重量百分比)。然后在發(fā)酵罐中混合來自經(jīng)處理和未處理小區(qū)的未感染漿果。
在施用所述萜制劑前已經(jīng)用多種產(chǎn)品處理過位置7，但仍然出現(xiàn)了灰霉病感染。
以1200l/ha的比率向葡萄樹一次施用4ml/L YGP-GET液體制劑。
記錄葡萄的以下生長階段-發(fā)芽，2004年3月26日，
-開花，2004年6月1日-轉(zhuǎn)色期，2004年8月6日-收獲，2004年10月15日本研究施用在收獲前3天進(jìn)行。
2004年生長季節(jié)異常遲，且一直很潮濕。來自霜霉病的病害壓力極高，白粉病壓力適中，而灰霉病水平升高。
此時(shí)施用YGP-GET以評價(jià)它對抗灰霉病感染的潛在功效，由于收獲前的殺蟲劑時(shí)間限制，不能用其它方式處理灰霉病感染。
在施用萜產(chǎn)品前，對位置的視覺評價(jià)顯示灰霉病感染的跡象。在收獲后，將漿果陳列在傳送帶上，并且在壓碎前手工分離受感染漿果和未受感染漿果。計(jì)算每個(gè)小區(qū)的受感染漿果的比例，以占總產(chǎn)量的百分比(重量)表示。
結(jié)果在施用YGP-GET前，對該位置的視覺評價(jià)顯示灰霉病感染的跡象。在收獲后(施用YGP-GET后3天)，經(jīng)處理和未處理小區(qū)的受感染漿果的比例分別為13％和23％。測試面積不足以評價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；但是，YGP-GET處理明顯減慢了病害的進(jìn)程。
將來自未處理和經(jīng)萜處理小區(qū)的未受感染漿果混合不影響發(fā)酵。
討論對灰霉病的常規(guī)處理必須在收獲前3周停止，給作物產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重?fù)p害的發(fā)生留下了時(shí)間。開發(fā)可以施用到收獲時(shí)或者與現(xiàn)有產(chǎn)品相比可以持續(xù)至接近收獲的處理會導(dǎo)致作物產(chǎn)量和葡萄酒質(zhì)量的顯著改善，這對種植者將相當(dāng)有益。在本研究中，在收獲前僅3天用萜產(chǎn)品YGP-GET處理顯著減慢已發(fā)生的灰霉病感染的進(jìn)程，導(dǎo)致在經(jīng)萜處理小區(qū)中受感染漿果的比例低于未處理小區(qū)中的。此外，雖然在接近收獲時(shí)使用YGP-GET，但將經(jīng)處理和未處理的葡萄組合不影響發(fā)酵。
這些結(jié)果提示，YGP-GET有效減少已發(fā)生的灰霉病感染的影響，并且可以在接近收獲時(shí)使用，而沒有對隨后發(fā)酵的有害影響。
實(shí)施例21-評價(jià)包封萜處理已發(fā)生的霜霉病，隨后評價(jià)葡萄質(zhì)量在25/08/04，以1000g/250升的比率施用組合物，進(jìn)行YGP-GET試驗(yàn)。
對由于霜霉病而100％感染并遭受嚴(yán)重葉損失的Cabernet Sauvignon葡萄園進(jìn)行噴霧。所有剩余葉都感染了霜霉病斑點(diǎn)，證據(jù)是葉上部有黃色斑點(diǎn)并且葉底部有絨毛生長；霜霉病的典型跡象。許多葉幾乎完全變黃，表明嚴(yán)重感染。這種葉損失和感染通常延遲葡萄的成熟，并且在許多情況下葡萄根本不完全成熟到滿足釀酒目的。
偶爾在葡萄樹中觀察到的完全未成熟(即直徑約1cm的深綠色硬漿果，卵形)串表明該葡萄樹可能在轉(zhuǎn)色期前受到感染，可能是在開花期或更早。早期沒有使用過銅(Bordeaux或堿式硫酸銅)。該葡萄園在以前收獲時(shí)受到嚴(yán)重感染，以至于沒有從Cabernet Sauvignon產(chǎn)出作物。去年的葉損失為100％，盡管曾試圖用碳酸氫鉀處理以接觸殺死霜霉病，然后施用Stilbourin作為長期系統(tǒng)保護(hù)。
在19/09/04，摘下在本試驗(yàn)中處理的葡萄并壓碎，對果汁進(jìn)行以下觀察(表24)表24
這些結(jié)果表明，來自經(jīng)處理葡萄樹的葡萄比來自未處理葡萄樹的葡萄更成熟。對葡萄本身的觀察表明，未處理葡萄平均起來顏色更淺，一些葡萄具有透明的桃色/紫色/綠色，表明葡萄剛剛過轉(zhuǎn)色期，而經(jīng)處理的葡萄平均起來為深紫色且不透明，是完全或接近完全成熟的葡萄所典型的。
品嘗這些葡萄顯示，經(jīng)處理的葡萄具有成熟Cabernet Sauvignon典型的更完全的葡萄味，而未處理的葡萄沒有該完全的葡萄味。未處理的葡萄具有青蘋果的澀味，表明蘋果酸/酒石酸比率可能較高，不適于優(yōu)良的釀酒。
將這些葡萄壓碎并去莖，準(zhǔn)備從這些葡萄制造葡萄酒，以證明這些葡萄的差異，并證明經(jīng)處理的葡萄對于釀酒的適合性。葡萄種植者擔(dān)心這種處理會影響葡萄酒的風(fēng)味，但按照我的建議，他在施用YGP-GET后的那天品嘗了經(jīng)處理的葡萄，并且沒有發(fā)現(xiàn)殘存的味道或氣味。
果汁的顏色進(jìn)一步證明了經(jīng)處理和未處理葡萄的差異。未處理葡萄的汁是淺綠色/無色的(有些像白葡萄酒果汁)，而來自經(jīng)處理葡萄的果汁是成熟Cabernet Sauvignon葡萄剛壓碎后典型的桃色。這些結(jié)果表明，通過殺死和停止霜霉病再感染，YGP-GET至少在短期內(nèi)在夏季后期葡萄園處理中有效。
進(jìn)一步研究YGP-GET在控制霜霉病方面的長期功效會是有用的，但所得結(jié)果顯示YGP-GET是有用的處理。
晚期發(fā)作霜霉病可以完全摧毀作物，并且目前沒有能在收獲前短期施用并保持其能力以提供保護(hù)的有效處理。YGP-GET的顯著功效是提供快速殺死，并且與其它接觸殺真菌劑相比在更長時(shí)間內(nèi)保持這種功效的能力。
在該市場中有許多抗真菌劑，它們具有對抗霜霉病的確定跟蹤記錄，但是它們在施用后都需要一些時(shí)間才能收獲作物。如果溫度升至高于85_，則不能使用一些處理(像含硫產(chǎn)品)。含銅殺真菌劑的植物毒性還主要取決于葡萄的品種。接觸殺真菌劑沒有長期作用，所以通常需要第二次施用更長效的殺真菌劑，但其可能受有關(guān)規(guī)章(例如PHI或REI)的限制。
用于霜霉病的許多常規(guī)處理具有再進(jìn)入限制(REI和/或PHI)，這意味著種植者不能施用這些處理，因?yàn)楹ε滤麑⑹┯靡恍┫馪HI為66天的代森錳鋅的農(nóng)藥；那么種植者就不能在最成熟的時(shí)候收獲他的葡萄。
認(rèn)為霜霉病是密西西比以東產(chǎn)出許多差葡萄酒的主要原因。在這個(gè)迅速成長的行業(yè)中，YGP-GET可以允許受到影響的葡萄適當(dāng)?shù)爻墒?，并在最成熟的時(shí)候被摘下。
有利地，YGP-GET應(yīng)該符合各種“有機(jī)”委員會(許多是自己指定的)批準(zhǔn)這種產(chǎn)品適用于在“有機(jī)”原則下栽培的葡萄的標(biāo)準(zhǔn)。這在美國和全世界快速成長的市場份額中打開了另一個(gè)適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 實(shí)施例22-體外評價(jià)包封和未包封萜的殺真菌性質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的測試以評價(jià)實(shí)施例15中所述的31種未包封萜制劑和葡聚糖顆粒包封的制劑16和22。
為了進(jìn)行這些測定，將20000個(gè)孢子放在1/3濃度的馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)中，并添加足量的所選萜制劑以得到10至1000ppm的濃度。將這些測試材料放在含灰色葡萄孢(B.c.)孢子的分離無菌加蓋微量離心管中，溫育24小時(shí)，然后通過離心回收所述孢子，并棄去萜溶液。用無菌水漂洗孢子/生物質(zhì)，再次離心，然后吸收回300μl 1/3濃度的PDB中，并轉(zhuǎn)移到96孔板中。隨時(shí)間測量長成菌絲體的存活孢子的光密度。將殺真菌活性定義為在24小時(shí)萜暴露后殺死全部20000個(gè)孢子，這由不存在菌絲體生長證明。
結(jié)果提示，在目前的測試條件下，某些制劑沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平的殺真菌性(結(jié)果未顯示)。這些制劑為1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、27、28、29、30。關(guān)于組合物的細(xì)節(jié)，參考實(shí)施例15(表17)。
在表26中列出了最有效化合物的最小抑制濃度。
表25
*在不同的測試中，沒有生長的最低濃度為500或750ppm化合物在水中和包封在中空葡聚糖顆粒中的對比測試根據(jù)前面描述的技術(shù)制備包封在中空葡聚糖顆粒中的制劑16(香葉醇、丁子香酚和百里酚)和22(丁子香酚、百里酚和檸檬醛)的樣品。然后使用前面關(guān)于未包封制劑所述的方案評價(jià)包封和未包封制劑的殺真菌性質(zhì)。
與懸浮在水中的萜相比，包封萜制劑的結(jié)果非常不同，如圖24所示。
最小有效濃度示于下表26中。
表26
因此，材料16和22當(dāng)在水懸浮液中時(shí)和當(dāng)包封在葡聚糖顆粒中時(shí)的結(jié)果非常不同。(說明如后面所述，懸浮在水中的萜的結(jié)果有些可變性，上述實(shí)驗(yàn)是其實(shí)例)。MIC值是來自幾個(gè)試驗(yàn)的復(fù)合。重要地，包封萜制劑的結(jié)果沒有遇到與萜水懸浮液相關(guān)的可變性的問題。對懸浮在水中的萜進(jìn)行五個(gè)分離的測試，對YP進(jìn)行三個(gè)分離的測試。
包封萜制劑容易地與水混合，并使萜制劑緩慢釋放到水介質(zhì)中。這導(dǎo)致孢子更長時(shí)問地暴露于所述萜。
遇到了監(jiān)測未包封萜制劑在測試介質(zhì)中的懸浮的問題，這可能影響了這方面的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.組合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒是真菌細(xì)胞壁。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒是酵母細(xì)胞壁。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述酵母細(xì)胞壁來自發(fā)面酵母細(xì)胞。
5.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒是來自酵母抽提物制備過程的不溶性廢產(chǎn)物。
6.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒已經(jīng)過堿提取。
7.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒已經(jīng)過酸提取。
8.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒已經(jīng)過有機(jī)溶劑提取。
9.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的脂質(zhì)含量為1％或更高。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的脂質(zhì)含量為5重量％或更高。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述脂質(zhì)含量為10重量％或更高。
12.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述萜成分包含選自以下的一種或多種萜檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、百里酚、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿卜素(維生素A1)、角鯊烯、百里酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、里哪醇或其混合物。
13.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述萜成分包含具有通式結(jié)構(gòu)C10H16的萜。
14.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述萜成分包含選自香葉醇、百里酚、檸檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚、b-紫羅酮或其混合物的一種或多種萜。
15.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述萜成分包含香葉醇、百里酚和丁子香酚的混合物。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含100％百里酚。
17.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含50重量％香葉醇和50重量％百里酚。
18.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含50重量％丁子香酚0和50重量％百里酚。
19.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含33重量％香葉醇、33重量％丁子香酚和33重量％百里酚。
20.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含33重量％丁子香酚、33重量％百里酚和33重量％檸檬醛。
21.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含25重量％香葉醇、25重量％丁子香酚、25重量％百里酚和25重量％檸檬醛。
22.權(quán)利要求14的組合物，其中所述萜成分包含20重量％香葉醇、20重量％丁子香酚、20重量％檸檬醛、20重量％百里酚和20重量％L-香芹酮。
23.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述萜成分與表面活性劑組合。
24.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所述表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig30或其兩種或多種的混合物。
25.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其包含1至99體積％萜、0至99體積％表面活性劑和1至99體積％中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
26.權(quán)利要求25的組合物，其包含約10至約67重量％萜、約0.1至約10重量％表面活性劑和約40至約90重量％中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
27.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其適于殺死細(xì)菌或真菌。
28.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其適于殺死霉菌。
29.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其適于殺死支原體。
30.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其中所用的萜是食品級的。
31.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其包含額外的食品級活性化合物。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述額外的食品級活性化合物為抗微生物劑或酶。
33.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其包含抗微生物劑、抗真菌劑、殺蟲劑、抗炎藥或麻醉劑。
34.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其還包含抗氧化劑。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述抗氧化劑為迷迭香油、維生素C或維生素E。
36.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其為干粉形式。
37.權(quán)利要求1至35之任一項(xiàng)的組合物，其為小球、片劑或其它固體形式。
38.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其包含分散劑，當(dāng)將所述組合物放入液體中時(shí)，所述分散劑促進(jìn)所述組合物的分散。
39.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其與液體、固體或凝膠樣形式的農(nóng)學(xué)、食品或藥學(xué)可接受的載體或賦形劑組合。
40.權(quán)利要求1至35之任一項(xiàng)的組合物，其懸浮或溶解在液體中。
41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述液體為水。
42.權(quán)利要求40或41的組合物，其包含約500至約10000ppm中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約1至約67％萜成分。
43.權(quán)利要求42的組合物，其包含約1000至約2000ppm中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約10至約50重量％萜成分。
44.權(quán)利要求40至43之任一項(xiàng)的組合物，其包含約1ppm至約25ppt萜成分。
45.權(quán)利要求44的組合物，其包含約100至約1000ppm萜成分。
46.權(quán)利要求1至39之任一項(xiàng)的組合物，其分散在水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或懸浮液。
47.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其包含潤濕劑、乳化劑或pH緩沖劑。
48.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其分散在人或動物液體食品或飲料中。
49.前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的組合物，其為適于口服給予的形式。
50.權(quán)利要求1至46之任一項(xiàng)的組合物，其為適于腸胃外給予的形式。
51.權(quán)利要求1至46之任一項(xiàng)的組合物，其為適于局部給予的形式。
52.包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的制備方法，所述方法包括以下步驟a)提供萜成分；b)提供中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒；c)在適合萜包封的條件下，將所述萜成分與所述葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒一起溫育；和d)回收包封所述萜成分的所述葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒。
53.權(quán)利要求52的方法，其還包括干燥包封所述萜成分的所述葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的步驟。
54.權(quán)利要求53的方法，其中通過冷凍干燥、流化床干燥、轉(zhuǎn)鼓式干燥或噴霧干燥來實(shí)現(xiàn)干燥。
55.權(quán)利要求52至54之任一項(xiàng)的方法，其中在步驟a)中提供的萜成分為在含水溶劑中的懸浮液。
56.權(quán)利要求55的方法，其中將萜成分與表面活性劑組合提供。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯，其濃度為總反應(yīng)混合物的約0.1至10體積％。
58.權(quán)利要求52至54之任一項(xiàng)的方法，其中在步驟a)中提供的萜成分為在含水溶劑中的真溶液。
59.權(quán)利要求52至58之任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)中提供的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒為在水或其它合適液體中的懸浮液。
60.權(quán)利要求59的方法，其中每毫升所述懸浮液包含約1至1000mg葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述顆粒分散在流體力學(xué)體積(HV)至1.5HV液體的體積中。
62.權(quán)利要求52至58之任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)中提供的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒為干粉。
63.權(quán)利要求52至62之任一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)中反應(yīng)在大氣壓和約20至37℃的溫度下進(jìn)行。
64.殺死微生物的方法，所述方法包括以下步驟-使所述微生物與包含包封萜成分的中空葡聚糖顆?；蚣?xì)胞壁顆粒的組合物接觸。
65.治療或預(yù)防植物感染的方法，所述方法包括以下步驟-將治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的組合物給予所述植物或所述植物附近的土壤。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述植物感染由線蟲引起。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述植物感染由真菌引起。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述真菌為霜霉病、白粉病或灰霉病。
69.權(quán)利要求65至68之任一項(xiàng)的方法，其中所述植物為葡萄樹。
70.權(quán)利要求65至69之任一項(xiàng)的方法，其中在從所述植物收獲作物前21天或更短的時(shí)間給予所述組合物。
71.權(quán)利要求70的方法，其中在收獲前14天或更短的時(shí)間給予所述組合物。
72.權(quán)利要求71的方法，其中在收獲前7天或更短的時(shí)間給予所述組合物。
73.權(quán)利要求72的方法，其中在收獲前3天或更短的時(shí)間給予所述組合物。
74.權(quán)利要求65至73之任一項(xiàng)的方法，其中通過噴霧施用所述組合物。
75.權(quán)利要求74的方法，其中以500L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
76.權(quán)利要求75的方法，其中以900L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
77.權(quán)利要求76的方法，其中以1200L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
78.權(quán)利要求65至73之任一項(xiàng)的方法，其中通過灌溉給予所述組合物。
79.本發(fā)明還提供預(yù)防或治療患者的感染的方法，所述方法包括以下步驟-給予所述患者治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的組合物。
80.權(quán)利要求79的方法，其中所述患者的感染由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、煙曲霉(Aspergillius fumigatus)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、青霉(Penicillium sp.)或肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)引起。
81.權(quán)利要求80的方法，其中通過口服、陰道、直腸、吸入、局部或胃腸外途徑給予所述組合物。
82.包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒的組合物，其用于預(yù)防或治療患者或植物的感染。
83.包封萜成分的中空葡聚糖顆粒在制備用于治療患者的感染的藥物中的用途。
84.權(quán)利要求83的用途，其中所述感染由煙曲霉、Sclerotintahomeocarpa、茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盤孢(Colletotrichumgraminicola)或青霉引起。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細(xì)胞壁顆粒的組合物、它們的制備方法和它們的用途。所述組合物適于預(yù)防和治療植物和包括人在內(nèi)的動物的感染。
文檔編號A01N35/06GK1997446SQ200580024514
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
發(fā)明者蘭妮·富蘭克林, 加里·奧斯特羅夫 申請人:伊頓研究有限公司