專利名稱：創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物生物技術領域，尤其涉及一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法。
背景技術：
番茄紅素是目前發(fā)現(xiàn)最強的清除氧自由基的物質(zhì)，其抗氧化作用是β-胡蘿卜素的3倍，維生素E的100倍，能預防和治療多種癌癥，尤其是整個消化道系統(tǒng)的癌病，包括胃癌、前列腺癌和胰腺癌等。番茄紅素的抗癌作用一方面通過保護機體細胞免受氧化傷害而實現(xiàn)其生理活性，同時，番茄紅素還可以阻止癌細胞的分裂，從多方面達到防癌和抗癌的目的[Hischberg，Current Opinion inBiotechnology 1999，10186-191]。番茄紅素也是一個與男性生殖系統(tǒng)健康密切相關的化合物，它被吸收后，分布最高的部位是腎上腺和睪丸，可以預防前列腺疾病、性功能障礙、精子質(zhì)量數(shù)量下降、生育能力下降等[Fraser PD&Bramley PM，Progress in Lipid Research 2004，43228-265]。
通過遺傳改良提高西瓜品種番茄紅素含量已成為國內(nèi)外育種學家孜孜以求的目標。但番茄紅素的含量是受多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳背景非常復雜，而栽培番茄種質(zhì)資源比較狹窄，缺乏高番茄紅素含量的育種親本材料。由于在我國長期以來消費者更傾向于大果型品種，而番茄紅素的含量與果實大小呈線性負相關[Chen FQ，Molecular Breeding，1999，5(3)283-299]，長期的高產(chǎn)選育目標導致我國生產(chǎn)上所用的栽培番茄品種番茄紅素含量普遍降低。因此利用傳統(tǒng)的雜交轉(zhuǎn)育技術，很難選擇一個比較優(yōu)良的適合中國人口味的高番茄紅素的鮮食番茄品種。所以過去多年傳統(tǒng)育種，盡管果實產(chǎn)量有很大提高，果實甜度也加大，但番茄紅素含量沒有提高，部分品種甚至下降。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展以及植物番茄紅素代謝分子基礎研究的不斷深入，利用遺傳工程技術提高番茄果實茄紅素的含量已成為可能。通過基因工程技術調(diào)控果實番茄紅素的代謝途徑，有望突破缺乏相應種質(zhì)資源的“瓶頸”，創(chuàng)建高番茄紅素番茄新種質(zhì)。
盡管果實番茄紅素含量是一個由多基因控制的復雜數(shù)量性狀，但通過導入番茄紅素合成途徑相關基因以改變相關代謝酶活性從而改變果實的類胡蘿卜素含量以及組成，國外已有一些成功的實驗報道。獲得的轉(zhuǎn)基因植株果實番茄紅素明顯提高[Fray RG，.Plant J 1995，8693-701；Ronen G，Proc Natl AcadSci 2000；9711102-7]。但由于前人研究大多采用組成型表達啟動子，番茄植株的生長以及番茄果實的其他品質(zhì)性狀受到較大影響，表現(xiàn)為植株生長異常、果實變小等，影響了其在高品質(zhì)番茄育種上的利用價值[Fraser PD，Proc NatlAcad Sci 2002，991092-1097]。本發(fā)明通過構建果實成熟特異性表達載體，將酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因(ySAMdc)導入栽培番茄中，提高果實中番茄紅素的含量，同時不影響植株的營養(yǎng)生長過程，可以彌補前人研究方案中的不足之處，因而該技術路線具有較強的創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法。
方法步驟如下1)將含有酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟專一性表達啟動子之后，構建植物特異性表達載體；2)將上述載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌LBA4404感染番茄子葉；3)感染后的番茄葉片置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；4)田間種植、多代自交后，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因自交系，獲得高含番茄紅素的轉(zhuǎn)基因番茄材料。
所述的將含有酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟專一性表達啟動子之后，構建植物特異性表達載體分別以番茄果實專一性啟動子E8與組成型啟動子CaMV 35S連接于ySAMdc基因上游區(qū)域，再與相應的經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切的植物表達載體pBI 121連接；所構相應的表達載體利用“凍融法”或“三親雜交法”將陽性質(zhì)粒導入到土壤根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。
感染后的番茄葉片置于分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)是指感染后的番茄葉片置于由MS、BAP 2mg/L、IAA 0.15mg/L、頭孢霉素300mg/L、卡那霉素50mg/l。組成的固體培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)。
田間種植、多代自交后，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因自交系是指將分子檢測后的轉(zhuǎn)基因植株移栽于田間種植，通過2-3代嚴格自交形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。
本發(fā)明采用番茄果實專一性高效表達的啟動子E8，實驗證實利用這一果實成熟特異表達啟動子不僅具有十分特異的果實專一性，而且表達量明顯高于通用的組成型表達啟動子CaMV 35S。在不影響植株正常生長前提下，提高果實番茄紅素代謝酶活性，顯著增加成熟果實中番茄紅素的含量。在我們的實施方案中，我們還將該方法應用于西瓜，獲得的轉(zhuǎn)基因西瓜果實番茄紅素含量也顯著提高。證明通過該技術手段提高蔬菜或瓜果類作物產(chǎn)品器官中的番茄紅素的含量是切實可行的。


圖1是pBI121-E8-ySAMdc雙元表達載體結構簡圖，該載體以E8啟動子取代質(zhì)粒載體pBI 121的35S啟動子，酵母SAMdc基因cDNA片斷插入pBI 121的Pst I和BamH I酶切位點間；圖2是表達載體pBI 121-e8-ySAMdc表達載體PCR驗證圖，其中M為DNA分子量標準，從上到下依次為3000bp，2000bp，1500bp，1200bp，1031bp，900bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp。第1，2，3泳道為以E8的上下游引物進行的PCR擴增。第4泳道為空質(zhì)粒對照；第5，6，7，8泳道為以SAMdc基因上下游引物進行的PCR擴增結果，由圖2看出擴增條帶完全正確，說明所構建的表達載體是正確的；圖3(a)是轉(zhuǎn)基因番茄抗性芽篩選；圖3(b)是轉(zhuǎn)基因番茄抗性芽培養(yǎng)；圖3(c)是轉(zhuǎn)基因番茄抗性小植株生根培養(yǎng)；圖3(d)是轉(zhuǎn)基因番茄轉(zhuǎn)基因植株移栽；圖3(e)是轉(zhuǎn)基因番茄偃轉(zhuǎn)基因植株番茄果實。
具體實施例方式
番茄是在全世界廣為栽培的常規(guī)蔬菜種類，栽培番茄中番茄紅素含量很低。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術提高番茄果實中番茄紅素含量的方法。通過農(nóng)桿菌介導法，將酵母SAMdc基因?qū)朐耘喾阎?，提高了番茄果實中番茄紅度含量，獲得了可用于高番茄紅素番茄品種選育的新材料。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，利用PCR技術分離釀酒酵母ySAMdc基因cDNA全序列。
本發(fā)明依據(jù)文獻報道的番茄果實專一性啟動子E8的核苷酸序列以及特征，設計一對引物，成功擴增出含有所述啟動子的1092bp啟動子區(qū)域。
在本發(fā)明的具體實施例中，對本發(fā)明所述制備的轉(zhuǎn)基因番茄的基因轉(zhuǎn)化過程加以檢測，具體步驟如下1)將含有酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟特異性表達啟動子E8之后，構建植物果實專一性表達載體；同時構建以CaMV 35S啟動子驅(qū)動的含有ySAMdc cDNA組成型表達載體。
2)將上述載體利用“凍融法”或“三親雜交法”轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。
3)農(nóng)桿菌菌液濃度稀釋到OD560等于0.2-0.5，感染番茄子葉。
4)感染后的番茄葉片置于由MS、BAP 2mg/L、IAA 0.15mg/L、Cef 300mg/L、Kan 50mg/l。組成的固體培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；5)取分化葉片進行PCR，Northern雜交等分子檢測；6)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行農(nóng)藝學性狀觀察與果實番茄紅素含量的分析。
實施例1)、材料番茄自交系“T01-254”(Lycopersicon esculentum Mill)種子由浙江大學蔬菜所培育保存。
PCR反應所用的Taq酶由上海生工公司購買與合成。限制性內(nèi)切酶和連接酶購自Fermentas公司與Promega公司，雜交用的尼龍膜購自美國AmershamPharmacia Biotech公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、X-Gluc購自上海生工生物工程公司，探針標記試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，Trizol試劑購自Life Technologies公司，PCR引物均委托上海生物工程公司合成。其余抗生素及其它試劑均為國產(chǎn)或進口的分析純產(chǎn)品。
2)、ySAMdc基因的分離釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由浙江大學生命科學院金維正博士提供，YPD培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)，離心后提取酵母DNA。
根據(jù)酵母SAM羧化酶基因全序列以及與番茄SAMdc基因序列差異，設計擴增引物為P1 SAMdc5’-GCGCTG CAGACA TGG CTG TCA CCA TAA AAG AAT TGA CP2 SAMdc5’-ACAAAG GATCCT TTT CAT ATT TTC TTC TGC AAT TTC這兩個引物分別同ySAMdc基因序列中的415-445以及1605-1572片斷序列相同。引物1的5’端增加了一個Pst I酶切位點，P2 SAMdc引物還包含有一個BamH I酶切位點。PCR擴增程序94℃5min變性后，95℃45s，58℃60s，72℃90s，共30循環(huán)。將上述PCR產(chǎn)物回收純化后，重組到pUC18質(zhì)粒上，進行序列分析，同Spec2基因序列比較。最終獲得了一個1216bp的DNA片斷(包括引物)。所分離基因序列見Seq 1。
3)、果實特異表達載體的構建分別以番茄果實專一性啟動子E8與組成型啟動子CaMV 35S連接于ySAMdc基因上游區(qū)域，進一步與相應的經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切的植物表達載體pBI 121連接(如圖1所示)。用T4 DNA連接酶連接，連接條件為10μL反應體系(30mmol/L Tris HCl，pH7.8，10mmol/L MgCl2，1U ATP，10U DTT，5％(w/v)PEG8000，1U T4DNA連接酶)，室溫放置1h后，4℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌液涂于LB/Amp平板上，37℃培養(yǎng)過夜。所構相應的表達載體分別為pBI 121-6，pBI 121-8。挑取轉(zhuǎn)化菌落于LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒經(jīng)HindIII和BamHI酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定陽性克隆(如圖2所示)。利用“凍融法”或“三親雜交法”將陽性質(zhì)粒導入到土壤根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。利用菌落原位雜交驗證目的基因是否轉(zhuǎn)入。
4)、植物遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體再生a)播種挑取飽滿的種子自來水沖洗數(shù)分鐘，然后加幾滴吐溫沖洗干凈，約50℃溫水浸種30min，超凈臺中酒精消毒30s，次氯酸鈉浸20min，無菌水沖洗4-5次，播種于1/2MS培養(yǎng)基。
b)預培養(yǎng)切取7d苗齡的無菌苗子葉，切去葉尖和葉柄，外植體約0.5cm大小，在添加2.0mg/L BAP、0.15mg/LIAA的MS分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)48h(每皿約放120個)，此時外植體生長較快。
c)共培養(yǎng)菌種LBA4404培養(yǎng)在附加卡那霉素(Kanamicin)50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，20-28℃下100rpm的搖床中過夜培養(yǎng)。菌液在冰凍離心機上離心(5000rpm，5min)，取沉淀，用1/2MS液體培養(yǎng)基溶解沉淀，在可見光λ＝600時測定0.D值(0.2-0.5范圍適宜)，這時菌液可用于轉(zhuǎn)化。將預培養(yǎng)過的子葉浸入前述農(nóng)桿菌菌液5-10min，取出用濾紙吸干多余的菌液，置于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上(與預培養(yǎng)基相同只是多放一層濾紙)，于28℃下暗培養(yǎng)48h(如圖3a所示)。
d)分化培養(yǎng)與生根共培養(yǎng)之后的外植體轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基含2.0mg/L BAP+0.15mg/L IAA+300mg/L頭孢霉素+50mg/l?？敲顾氐腗S固體培養(yǎng)基(如圖3b所示)。約20d左右有再生芽分化出，芽較大時進行繼代培養(yǎng)。進一步篩選看是否為抗性芽，若不是會在繼代過程中白化死亡。繼代培養(yǎng)基添加相同濃度的抗生素。再生芽長到2cm高時轉(zhuǎn)移到MS+卡那霉素30mg/L+頭孢霉素300mg/L進行生根(如圖3c所示)，根長成時進行移栽(如圖3d所示)。
5)、轉(zhuǎn)基因植株的命名以E8為啟動子的轉(zhuǎn)基因株系，當代為SET0加上各自的株系號，如SET0-1，SET0-2等。各株系自交后代為SET1加上各自的株系號，如SET1-1，SET1-2等。其余后代類推。以CaMV 35S為啟動子的轉(zhuǎn)基因株系，當代為SCT0加上各自的株系號，如SCT0-1，SCT0-2等。各株系自交后代為SCT1加上各自的株系號，如SCT1-1，SCT1-2等。其余后代類推。
6)、轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測PCR檢測取轉(zhuǎn)化植株幼嫩葉片0.1-0.2g用CTAB法提取基因組DNA。利用前述SAMdc兩端引物PSAMdc1與PSAMdc2進行PCR反應以檢測SAMdc在轉(zhuǎn)基因植株中存在與否。PCR反應按標準方法進行。同時為檢測E8與ySAMdc基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中一起整合到番茄基因組中，參照E8啟動子序列與ySAMdc基因片段兩端序列設計PCR引物，引物的序列為PE815’-TGTCTCTTTC TTGTTCCCATTTC-3’，PSAM25’-TGG TTG TAG TAC CGC ACGTC-3’。在25μL的反應體系中，含有1×的Pfu Buffer，0.2μM的dNTPs，0.2μM的每條引物，1u的Taq酶。PCR擴增條件為94℃，預變性3min；94℃，變性1min；54℃，退火45s；72℃，延長1.5min s；35個循環(huán)，最后72℃，10min；4℃保存。PCR擴增結束后，分別吸取10μL PCR反應產(chǎn)物點樣于1.2％的瓊脂糖凝膠進行電泳觀察。取部分植株的PCR產(chǎn)物送到上海博亞生物公司測序，所得結果與目的基因的堿基序列完全相同，由此證明番茄植株的基因轉(zhuǎn)化是成功的。
Southern雜交制備酵母SAMdc探針。SAMdc探針利用引物PSAMdc1與PSAMdc2，從質(zhì)粒中利用PCR擴增獲得，擴增的1.2kb SAMdc純化后，用α-32P-dCTP HighPrimer labeling Kit(Boehringer mannhelm，USA)隨機標記。YSAMdc探針并不同內(nèi)源番茄的SAMdc基因雜交。10μg DNA用HindIII、EcoR I或Pst I(NewEngland Biolabs，USA)，酶切16h，在0.8％agrose gel上電泳40v，8h，并將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上(Sambrook等，1989)。以非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，Northern雜交取0.2-0.5g番茄莖、葉、紅熟果實樣品，用Trizol法提取RNA，用0.2％甲醛變性膠電泳(0.5M甲醛)100V，2h，所用探針與雜交方法同Sorthern雜交。
7)、轉(zhuǎn)基因植株田間性狀的觀察以及果實番茄紅素含量分析。
通過對T0，T1代植株田間園藝性狀觀察表明，同野生型01-254相比，以E8啟動子構建的特異性表達載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因株系在番茄生長勢、植株抗性、果實外觀品質(zhì)以及產(chǎn)量上沒有顯著性差異(如圖3e所示)。而以CaMV 35S啟動子構建的表達載體植株生長后期表現(xiàn)不正常。植株矮化，生長速度慢，果實變小，著果數(shù)變少，果實轉(zhuǎn)色很慢。含E8啟動子轉(zhuǎn)基因單株番茄紅素含量同對照相比都有明顯地提高(見表1)。
表1不同轉(zhuǎn)基因株系與對照番茄果實性狀分析

SEQ ID No.1的信息SEQUENCE LISTING<110>浙江大學<120>一種創(chuàng)建富含番茄紅素番茄新種質(zhì)的方法<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1216<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>1
gcgctgcaga catgactgtc accataaaag aattgactaa ccacaactac attgaccacg 60aactatcagc cactttagac tcaacggatg cgttcgaggg tcccgagaag ttgctggaaa120tctggttctt ccctcacaag aagtccatca cgaccgaaaa gacattaaga aatattggca180tggatagatg gatcgagatt ttgaaattag tgaaatgcga agttctttcc atgaagaaga240ctaaagaact ggatgccttt ttgttgagtg agtcttccct cttcgtcttc gatcacaaat300tgacgatgaa gacgtgcggt actacaacca cattgttctg tctcgaaaag cttttccaga360tcgttgagca agagttatcg tgggctttcc gcacaacaca agggggcaag tacaaaccat420ttaaagtgtt ttattctaga cgatgtttcc ttttcccctg taagcaagcc gctatccatc480aaaactgggc tgacgaagtc gactatttga acaaattttt cgacaatggt aaaagttatt540ccgtgggaag aaatgacaag agcaaccact ggaacctgta cgtcaccgag acggaccgct600ccacacctaa gggaaaggag tacatcgagg atgacgacga aactttcgaa gtactgatga660cggagctgga cccagaatgc gctagtaagt ttgtttgcgg gcctgaggca tccacaaccg720ctctcgtgga gccaaacgaa gataagggcc acaacctcgg ctaccaaatg actaaaaata780caaggcttga cgaaatatat gtcaactcgg cccaagactc cgatttatca tttcaccacg840atgcatttgc gttcacgcca tgtggatact catccaatat gattctcgct gaaaaatact900attacaccct gcacgtgact ccggaaaagg gttggtctta cgcctctttc gaaagtaaca960tacccgtatt tgacatttcc caagggaagc aagacaactt ggacgttctt ctacatattc 1020tgaacgtttt tcaaccaaga gagttctcga tgaccttttt taccaaaaat tatcagaacc 1080aatccttcca aaaactacta agcatcaacg agtcactgcc cgactacatc aagttagaca 1140aaattgttta tgatctggac gactaccacc ttttctatat gaaattgcag aagaaaatat 1200gaaaaggatc ctttgt 121權利要求
1.一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法，其特征在于方法步驟如下1)將含有酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟專一性表達啟動子之后，構建植物特異性表達載體；2)將上述載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌LBA4404感染番茄子葉；3)感染后的番茄葉片置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；4)田間種植、多代自交后，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因自交系，獲得高含番茄紅素的轉(zhuǎn)基因番茄材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法，其特征在于，所述的將含有酵母S-腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟專一性表達啟動子之后，構建植物特異性表達載體分別以番茄果實專一性啟動子E8與組成型啟動子CaMV 35S連接于ySAMdc基因上游區(qū)域，再與相應的經(jīng)過HindIII和BamHI雙酶切的植物表達載體pBI 121連接；所構相應的表達載體利用“凍融法”或“三親雜交法”將陽性質(zhì)粒導入到土壤根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法，其特征在于，所述的感染后的番茄葉片置于分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)是指感染后的番茄葉片置于由MS、BAP 2mg/L、IAA 0.15mg/L、頭孢霉素300mg/L、卡那霉素50mg/L組成的固體培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求1.中所述的一種創(chuàng)建高番茄紅素轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)的方法，其特征在于，所述的田間種植、多代自交后，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因自交系是指將分子檢測后的轉(zhuǎn)基因植株移栽于田間種植，通過2-3代嚴格自交形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種創(chuàng)建富含番茄紅素番茄新種質(zhì)的方法。方法步驟如下1)將含有酵母S－腺苷基蛋氨酸脫羧酶基因cDNA片斷接入番茄果實成熟專一性表達啟動子之后，構建植物特異性表達載體；2)將上述載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌LBA4404感染番茄子葉；3)感染后的番茄葉片置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；4)田間種植、多代自交后，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因自交系。本發(fā)明采用番茄果實專一性高效表達的啟動子E8，利用這一果實成熟特異表達啟動子不僅具有十分特異的果實專一性，而且表達量明顯高于通用的組成型表達啟動子CaMV 35S。在不影響植株正常生長前提下，提高果實番茄紅素代謝酶活性，顯著增加成熟果實中番茄紅素的含量。
文檔編號A01H1/00GK1759663SQ20051006034
公開日2006年4月19日 申請日期2005年8月9日 優(yōu)先權日2005年8月9日
發(fā)明者盧鋼, 丁淑麗, 壽森炎, 曹家樹, 李建勇, 任彥 申請人:浙江大學