專利名稱：一種淡紫擬青霉新菌株及其利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株及其制劑的制備方法，特別是一種淡紫擬青霉新菌株及其利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法。
背景技術：
淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)作為植物線蟲卵寄生真菌引起了眾多研究人員的關注，國際馬鈴薯中心將此菌制成商品制劑在46個國家推廣實驗，防治馬鈴薯根結線蟲取得成效。淡紫擬青霉的液體培養(yǎng)通常使用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基或查氏培養(yǎng)基，固體大量培養(yǎng)通常使用麥麩培養(yǎng)基。
《微生物學通報》1997，24(2)107-109發(fā)表了潘滄桑的文章“用啤酒廠廢料生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑及防治試驗”，介紹了從寄生在番茄的南方根結線蟲卵塊中分離到一種破壞線蟲的內寄生真菌淡紫擬青霉，并利用啤酒廠的廢渣、廢液生產(chǎn)出菌劑。該菌劑每克樣本含孢子量為3.4×106。用其進行防治根結線蟲的盆栽試驗，每1600ml土壤施8g比施用1g菌劑的根結指數(shù)、蟲癭、卵塊、雌蟲和幼蟲分別減少65％、94％、94％、95％和97％。
專利號為95118468的發(fā)明專利“用啤酒廠廢液生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑的方法”，介紹了一種用啤酒廠廢料生產(chǎn)殺蟲劑的方法，該殺蟲劑可以用于許多農作物的線蟲防治，且有利于啤酒廠的廢料利用，減少污染。
淡紫擬青霉菌極少在生產(chǎn)上推廣應用，主要原因是缺乏高效菌株；廉價培養(yǎng)基和相應的培養(yǎng)技術。用已公開的方法制備淡紫擬青霉菌劑，成本高且產(chǎn)孢率低；目前，國內外對淡紫擬青霉仍然處于研究階段，主要目標是篩選穩(wěn)定高效的生產(chǎn)菌株、解決菌劑培養(yǎng)中的高成本低產(chǎn)率的技術瓶頸、研制穩(wěn)定高效的實用劑型。在國內淡紫擬青霉菌產(chǎn)品尚未在農業(yè)生產(chǎn)上應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是篩選高效淡紫擬青霉菌株，研制以蝦殼為培養(yǎng)原料的淡紫擬青霉菌培養(yǎng)基，制備高效低成本的淡紫擬青霉殺線蟲劑。
本發(fā)明的一種淡紫擬青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus-89，簡稱PL89)，是2002年11月17日從福州市黃山農場彩葉草根部的根結線蟲卵囊上分離培養(yǎng)純化，通過幾丁質平板與明膠平板誘變和篩選，獲得具有高產(chǎn)幾丁質酶和絲氨酸蛋白酶的菌株，2004年3月12日保藏于北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1109。PL89(CGMCC No.1109)可以在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上生長；能分解蝦殼和幾丁質；可以在蝦殼和水配制的培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)48小時的分生孢子量超過2×108/ml；具有耐堿性，適宜在pH7～11的培養(yǎng)基上生長(見表1)。同樣條件下加入0.4～0.8mol/L Mg+的培養(yǎng)基生長更快。
表1.不同pH值對淡紫擬青霉菌落生長的影響

本發(fā)明的一種利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，其特征在于以PL89(CGMCC No.1109)為生產(chǎn)菌株，采用液體培養(yǎng)法或者液固兩相培養(yǎng)法制備殺線蟲劑(1)液體培養(yǎng)法在水中加入50～200目蝦殼粉1％～5％(重量百分率，以下類同)，直接熱力滅菌制成液體培養(yǎng)基；然后在每升液體培養(yǎng)基中接入PL89(CGMCC No.1109)的孢子150×108～200×108個，在24～40℃、150～180r/min條件下培養(yǎng)48～72h，制成培養(yǎng)液。這種培養(yǎng)液可以作為種子使用，也可以直接作為液體殺蟲劑使用，或者用載體吸附后成為土壤添加劑使用。
(2)液固兩相培養(yǎng)法，包括以下步驟A、干料組份麩皮40～70％(重量百分率，以下類同)，50～200目蝦殼粉10～20％，谷殼或草粉20～30％；B、固體培養(yǎng)基配制在每百公斤干料中加水80～100公斤，裝瓶或裝袋后，121℃濕熱滅菌1～2小時；C、培養(yǎng)取所述液體培養(yǎng)法得到的PL89(CGMCC No.1109)培養(yǎng)液，調整成孢子濃度為1.5×108個/ml～3×108個/ml的液體種子，按每升液體種子接種含干料1～2kg的固體培養(yǎng)基，淺盤開放式培養(yǎng)；淺盤鋪放接種后的固體培養(yǎng)基，其厚度為3～5cm，培養(yǎng)溫度28～35℃，培養(yǎng)時間4～8天。
本發(fā)明的一種淡紫擬青霉新菌株PL89(CGMCC No.1109)具有耐堿、耐熱、抗污染、生長快、產(chǎn)幾丁質酶能力強等優(yōu)點，作為生產(chǎn)菌株利用蝦殼制備殺線蟲劑，工藝簡單、培養(yǎng)時間短、產(chǎn)孢子量大。以蝦殼作為培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，營養(yǎng)分析結果表明蝦殼粗蛋白含量為17～20％，幾丁質為40～50％，含有豐富的磷、鉀、鎂、鋅等元素。幾丁質作為碳源，粗蛋白作為氮源適合PL89(CGMCC No.1109)生長。蝦殼是水產(chǎn)品加工廠的廢料，價格低廉，用于培養(yǎng)基可以大幅度降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。生產(chǎn)的產(chǎn)品具有殺線蟲、防枯萎、促進作物生長的作用。盆栽和田間試驗結果表明，對作物根結線蟲病害防治效果顯著，同時有防枯萎、促進作物生長的作用。
用PL89(CGMCC No.1109)可濕性粉劑防治煙草根結線蟲病盆栽試驗和防治黃瓜根結線蟲病的小區(qū)試驗，都取得良好的效果。
煙草根結線蟲病盆栽防治試驗用病土種植三葉期煙苗。移栽時設三種處理3％呋喃丹顆粒劑2g/盆，PL89(CGMCC No.1109)可濕性粉劑5g/盆，不施藥為對照。50d后調查防治效果處理區(qū)煙草根結線蟲病的病情指數(shù)明顯下降，煙葉產(chǎn)量明顯增加，PL89(CGMCC No.1109)可濕性粉劑的防治效果優(yōu)于化學殺線蟲劑呋喃丹。(見表2)表2.PL89(CGMCC No.1109)可濕性粉劑防治煙草根結線蟲病盆栽試驗

黃瓜根結線蟲病防治小區(qū)試驗選擇根結線蟲病和鐮刀菌枯萎病發(fā)生嚴重的重茬土，用河砂營養(yǎng)袋培育黃瓜苗，移栽時每穴施PL89(CGMCC No.1109)可濕性粉劑5g(孢子量為30×108/g)。采收期調查發(fā)病率和病情指數(shù)，評價防治效果。黃瓜根結線蟲病情指數(shù)下降73.2％，黃瓜枯萎病株發(fā)病率減少70.4％。防治效果分別達73.2％。防治的黃瓜植株生長旺盛，根系發(fā)達，未防治的對照區(qū)根結發(fā)生嚴重，根系生長脆弱。(見表3)表3.PL89可濕性粉劑防治黃瓜根結線蟲病和枯萎病小區(qū)試驗



圖1為PL89(CGMCC No.1109)菌落形態(tài)圖。
PL89(CGMCC No.1109)如圖1所示，菌落厚、扁平、淡紫色、擴展，后期產(chǎn)生同心環(huán)紋。
具體實施例方式
為了充分公開本發(fā)明的一種淡紫擬青霉新菌株及其利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，現(xiàn)結合實施例加以說明。
實施例一液體培養(yǎng)法；
采用深層發(fā)酵，在100升發(fā)酵罐中，裝入70升的3％蝦殼粉液體培養(yǎng)基，經(jīng)0.05mpa滅菌0.5小時，冷卻至室溫后，接入3～4升PL89(CGMCC No.1109)液體種子，培養(yǎng)溫度28～30℃，通氣量為1.5M2/h，攪拌速度150r/min，經(jīng)48小時后終止培養(yǎng)。培養(yǎng)液可以作為液固兩相培養(yǎng)法的種子，也可以直接作為液體殺蟲劑，供大田生產(chǎn)使用；或者用草炭粉配制成土壤添加劑。土壤添加劑的制備方法是，按每升培養(yǎng)液用1～1.2kg的草炭粉作為載體吸附，自然晾干后成為孢子量為1.5×108個/g～3×108個/g土壤添加劑，再包裝成為產(chǎn)品，供大田生產(chǎn)使用。
實施例二液固兩相培養(yǎng)法；干料組份為麩皮70％、100目蝦殼粉10％、谷殼20％。在每百公斤干料中加水80公斤，裝袋后，121℃濕熱滅菌1小時得固體培養(yǎng)基。采用PL89(CGMCC No.1109)液體種子，按每升液體種子接種含干料2kg的固體培養(yǎng)基，淺盤開放式培養(yǎng)。淺盤鋪放接種后的固體培養(yǎng)基的厚度為4cm，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)5天后，自然風干，經(jīng)氣流粉碎機粉碎，100目過篩，用滑石粉作為載體配制成孢子量為20×108個/g～30×108個/g的可濕性粉劑，然后包裝成為產(chǎn)品，供大田生產(chǎn)使用。
PL89(CGMCC No.1109)殺線蟲可濕性粉劑的施用方法1、可濕性粉劑1kg與干細砂土5～7kg混合拌勻后，于移栽前撒施種植穴內，每穴含可濕性粉劑4～5g，然后將作物苗移栽于穴內定植。2、在作物苗定殖后線蟲侵染前，將可濕性粉劑1kg與50kg清水充分攪拌，然后每穴澆施可濕性粉劑溶液0.25kg。
PL89(CGMCC No.1109)土壤添加劑的施用方法于移栽前撒施種植穴內，每穴施土壤添加劑5～10g，然后將作物苗移栽于穴內定植。
PL89(CGMCC No.1109)液體殺蟲劑的施用方法在作物苗定植后線蟲侵染前，將每公斤液體殺蟲劑用50kg清水稀釋，然后每穴澆施液體殺蟲劑溶液0.25kg。
權利要求
1.一種淡紫擬青霉新菌株，其特征在于該新菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus-89，簡稱PL89)CGMCC No.1109。
2.根據(jù)權利要求1所述的PL89(CGMCC No.1109)，其特征在于可以在蝦殼和水配制的培養(yǎng)基上生長。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的PL89(CGMCC No.1109)，其特征在于具有耐堿性，適宜在pH7～11的培養(yǎng)基上生長。
4.一種利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，其特征在于以所述的PL89(CGMCC No.1109)為生產(chǎn)菌株，采用液體培養(yǎng)法制備殺線蟲劑，即在水中加入50～200目蝦殼粉1％～5％(重量百分率，以下類同)，直接熱力滅菌制成液體培養(yǎng)基；然后在每升液體培養(yǎng)基中接入PL89(CGMCC No.1109)的孢子150×108～200×108個，在24～40℃、150～180r/min條件下培養(yǎng)48～72h，制成培養(yǎng)液。
5.一種利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，其特征在于采用液固兩相培養(yǎng)法制備殺線蟲劑，包括以下步驟(1)干料組份麩皮40～70％，50～200目蝦殼粉10～20％，谷殼或草粉20～30％；(2)固體培養(yǎng)基配制在每百公斤干料中加水80～100公斤，裝瓶或裝袋后，121℃濕熱滅菌1～2小時；(3)培養(yǎng)取所述液體培養(yǎng)法得到的PL89(CGMCC No.1109)培養(yǎng)液，調整成孢子濃度為1.5×108個/ml～3×108個/ml的液體種子，按每升液體種子接種含干料1～2kg的固體培養(yǎng)基，淺盤開放式培養(yǎng)；淺盤鋪放接種后的固體培養(yǎng)基，其厚度為3～5cm，培養(yǎng)溫度28～35℃，培養(yǎng)時間4～8天。
6.根據(jù)權利要求4所述的一種利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，其特征在于所得培養(yǎng)液按每升用1～1.2kg的草炭粉作為載體吸附，自然晾干。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，其特征在于用滑石粉作為載體。
全文摘要
一種淡紫擬青霉新菌株及其利用蝦殼制備殺線蟲劑的方法，所述的淡紫擬青霉新菌株(Paecilomyces lilacinus－89，簡稱PL89)，具有耐堿、耐熱、抗污染、生長快、產(chǎn)幾丁質酶能力強等優(yōu)點。以PL89為生產(chǎn)菌株，利用蝦殼制備殺線蟲劑，具有工藝簡單、培養(yǎng)時間短、產(chǎn)孢子量大等優(yōu)點。蝦殼的價格低廉、作為培養(yǎng)基既有豐富的營養(yǎng)，又可以大幅度降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品具有殺線蟲、防枯萎、促進作物生長等作用。
文檔編號A01N63/04GK1673349SQ20051004214
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權日2005年3月7日
發(fā)明者張紹升 申請人:福建農林大學