專利名稱：脅迫－誘導(dǎo)的啟動子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲自水稻的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子及其使用方法。
現(xiàn)有技術(shù)植物具有耐受機制以應(yīng)付自然界中不同類型的環(huán)境脅迫，例如脫水、高溫、冷凍或鹽脅迫。近年來，因為已在分子水平上闡明了脅迫耐受機制，因此可以利用生物技術(shù)的方法生產(chǎn)了脅迫耐受植物。例如，業(yè)已表明當(dāng)細胞暴露于脅迫條件下，細胞中會誘導(dǎo)產(chǎn)生脅迫蛋白，例如LEA蛋白、水通道蛋白或能夠作用于可混溶溶質(zhì)的合酶，從而保護細胞免于上述脅迫的影響。因此，已有研究嘗試過將大麥LEA蛋白的基因或煙草解毒酶的基因、作用于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如，糖、脯氨酸或甜菜堿)的合酶的基因等導(dǎo)入到宿主植物中。也有嘗試過利用編碼擬南芥(Arabidopsis thaliana)w-3脂肪酸脫氫酶的基因、藍綠藻D9-脫氫酶的基因，或類似的細胞膜脂類修飾酶的基因的研究。在上述研究中，一個基因與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接并導(dǎo)入植物中。但是，重組植物的脅迫耐受水平不穩(wěn)定，并且導(dǎo)入基因的表達水平也很低。因此，這些都無法應(yīng)用于實際應(yīng)用中。
另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，脅迫耐受機制與幾種基因關(guān)系錯綜復(fù)雜(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Plant Physiol.1997年10月；115(2)327-334頁)。相應(yīng)地，已有研究嘗試了將編碼轉(zhuǎn)錄因子并且同時激活上述幾種基因表達的基因連接到一個組成型啟動子上并導(dǎo)入植物中，從而增強植物的脅迫耐受力(Liu等，The Plant Cell，1998，101391-1406)。但是，當(dāng)幾種基因同時激活時，宿主植物的能量被導(dǎo)向于基因產(chǎn)物的合成或由基因產(chǎn)物產(chǎn)生的胞內(nèi)代謝。相應(yīng)地，植物自身生長變得延緩或生長矮小。
相反地，本發(fā)明人從擬南芥中分離出編碼與脅迫應(yīng)答元件結(jié)合并且特異性激活該元件下游基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的基因DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B(JP專利公開(未審查申請)No.2000-60558)。他們報道在一個植物中導(dǎo)入與一個脅迫誘導(dǎo)的rd-29A啟動子連接的基因能夠產(chǎn)生不影響植物生長的脅迫耐受植物(JP專利公開(未審查申請)No.2000-116260)。
所述rd-29A啟動子獲自雙子葉植物擬南芥。其也能夠在單子葉植物中起作用，但是活性水平較低。相應(yīng)地，在單子葉植物中具有高水平活性的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子已經(jīng)成為很多研究的目標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一種在象水稻這樣的單子葉植物中能有效發(fā)揮作用的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子并提供一種利用該啟動子的新的環(huán)境脅迫耐受植物。
本發(fā)明人進行了集中的研究以求達到上述目的。結(jié)果，他們從水稻基因組中已成功地分離了一種強脅迫-誘導(dǎo)的啟動子。他們還發(fā)現(xiàn)單子葉植物的環(huán)境脅迫耐受力通過使用該啟動子可得到顯著提高。從而完成了本發(fā)明。
具體而言，本發(fā)明涉及一種獲自水稻的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子。更具體地，該啟動子由DNA(a)或(b)組成(a)由SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，與能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交、并表達脅迫-誘導(dǎo)的啟動子活性的DNA。
于此所用的術(shù)語“脅迫”是指脫水脅迫、低溫脅迫或鹽脅迫。
本發(fā)明提供了一種包含上述啟動子的重組載體。在根據(jù)本發(fā)明的啟動子的控制下，該載體可包含其它結(jié)構(gòu)基因或者調(diào)節(jié)基因。特別優(yōu)選的是，該載體包含用于增強脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因。
用于增強脅迫耐受性的優(yōu)選的結(jié)構(gòu)基因的實例包括，P5CS基因，其是一種脯氨酸合成的關(guān)鍵酶(Yoshiba Y.等.，1999，BBRC 261)，和用于肌醇半乳糖苷合成的AtGol S3基因(Taji T.等.，2002，Plant J，29417-426)。
用于增強脅迫耐受性的優(yōu)選的調(diào)節(jié)基因的例子包括，擬南芥來源的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因(JP專利公開(未審查的申請)No.2000-60558)，水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因(JP專利申請No.2001-358268，Dubouzet等.，Plant J.出版中)，以及NCED基因，其是一種植物激素ABA生物合成的關(guān)鍵酶(Iuchi S.等.，2001，Plant J.27325-333)。
特別優(yōu)選擬南芥來源的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因和水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因。最優(yōu)選水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因。
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入到合適的宿主中而獲得。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入到一種宿主植物中而獲得。在這種情況下，該宿主植物優(yōu)選是單子葉植物，該單子葉植物優(yōu)選是水稻。
通過將本發(fā)明的啟動子導(dǎo)入到植物中，本發(fā)明進一步提供了一種用于增強植物脅迫耐受力的方法。本發(fā)明的啟動子表現(xiàn)出強的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子活性，該活性從未在單子葉植物中被觀察到，因此本發(fā)明的啟動子更適于增強單子葉植物的脅迫耐受力。
附圖簡述


圖1表示當(dāng)實施各種脅迫時，對a0022(LIP9)Northern分析的結(jié)果。
圖2表示a0022(LIP9)其啟動子區(qū)的核苷酸序列。
圖3表示GUS表達構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，其中Tg7代表g7終止子，HPT代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，Pnos代表Nos啟動子，以及Tnos代表Nos終止子。
圖4是一個顯示當(dāng)實施脫水脅迫時，通過導(dǎo)入不同的連接到GUS基因的啟動子制備的轉(zhuǎn)基因煙草或水稻的GUS活性的圖。
圖5是一個顯示當(dāng)實施鹽脅迫時，通過導(dǎo)入一種連接到GUS基因的LIP9啟動子制備的轉(zhuǎn)基因水稻的GUS染色結(jié)果的圖。
圖6顯示了通過Northern方法分析導(dǎo)入的基因和靶基因(LIP9(a0022)，WSI724(a0066)，和salT(a2660))在轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中表達水平的結(jié)果，其中“a，”“b，”和“c”各自分別代表一種轉(zhuǎn)基因植物品系。
圖7表示a0066(WSI724)其啟動子區(qū)的核苷酸序列。
圖8是一個顯示當(dāng)實施脫水脅迫時，通過導(dǎo)入一種連接到GUS基因的WSI724啟動子制備的轉(zhuǎn)基因水稻的GUS活性的圖，其中右邊的條代表當(dāng)實施脫水脅迫時的GUS活性，左邊的條代表對照。
圖9是一個顯示當(dāng)實施脫水脅迫時，通過導(dǎo)入一種連接到GUS基因的WSI724啟動子制備的轉(zhuǎn)基因水稻的GUS染色結(jié)果的照片。
該說明書包括公開于日本專利申請No.2003-80847的說明書的部分或全部內(nèi)容，其是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
發(fā)明的實施方案本發(fā)明的啟動子是一種水稻來源的啟動子，其特異性地由諸如低溫、脫水或鹽脅迫的環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)。
1.本發(fā)明啟動子的鑒定本發(fā)明的啟動子可鑒定如下。比較被實施脅迫和沒有被實施脅迫的植物，以及首先，篩選以顯著差異水平表達的基因(脅迫-誘導(dǎo)的基因)。隨后，基于基因組信息，篩選被認定為基因啟動子的序列。
以下描述了本發(fā)明啟動子的鑒定過程。
1.1mRNA的制備首先，制備用于篩選脅迫-誘導(dǎo)的基因的mRNA。
mRNA的來源可以是植物的局部，例如，葉子、莖、根或花朵，或者是植物整體?？蛇x擇地，可使用由播種到例如GM培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基或#3培養(yǎng)基這樣的固體培養(yǎng)基上并無菌生長而獲得的植物。其來源可以是愈傷組織或是無菌生長的植物的培養(yǎng)細胞。
在該篩選過程中，觀察給予脅迫的植物和沒有給予脅迫的植物之間基因表達水平的差異。因此，有必要為每種植物來制備mRNA。實施脅迫的適宜方法取決于所利用的植物類型。通常，脫水脅迫能夠通過2-4星期不給植物澆水來實施。低溫和冷凍脅迫能通過在15至-10℃下培養(yǎng)植物1-10天來實施。鹽脅迫能通過在100-600mM NaCl中培養(yǎng)植物1小時-7天來實施。例如，就水稻來說，將溶液培養(yǎng)的水稻暴露于低溫脅迫(10至-4℃)，鹽脅迫(150-250mM NaCl中)和脫水脅迫(干燥的狀態(tài))中。
用液氮凍融給予脅迫和沒有給予脅迫的植物，并在研臼中研磨，等等。從所產(chǎn)生的研磨材料中，采用乙二醛法、硫氰酸胍和氯化銫法，氯化鋰和尿素法、蛋白酶K和脫氧核糖核酸酶法，或類似的方法，提取粗RNA組分。接著，從該粗RNA組分中，可以通過采用寡dT-纖維素、攜帶多U-瓊脂糖的瓊脂糖2B親和柱的方法或類似方法，或者分批的方法，能獲得poly(A)+RNA(mRNA)。如果需要，獲得的mRNA可以通過蔗糖密度梯度離心或類似的方法進一步分級分離。
1.2脅迫-誘導(dǎo)的基因的篩選脅迫-誘導(dǎo)的基因的篩選是基于被給予脅迫和沒有被給予脅迫的植物基因表達水平差異的比較。用于基因表達水平比較的方法沒有特別的限制，且可使用方法的具體例子包括傳統(tǒng)方法，例如RT-PCR、實時PCR、扣除、差異顯示、示差雜交以及交叉雜交。
利用諸如基因芯片以及cDNA微陣列的固相樣品的方法特別適用于實施篩選過程，因為該方法能夠同時定性并定量檢測幾千到幾萬個基因的表達。
(1)cDNA微陣的制備在篩選過程中使用的cDNA微陣列沒有特殊的限制，只要將單子葉植物(如水稻)的cDNA，即啟動子的檢測靶點，點在其上即可?？梢岳矛F(xiàn)有的微陣列，或可使用常規(guī)方法制備點陣(如，The Plant Cell(2001)1361-72，Seki等)。
當(dāng)制備cDNA微陣列時，首先應(yīng)制備目的植物的cDNA文庫。可通過常規(guī)方法構(gòu)建cDNA文庫，使用方法(1)制備的mRNA作為模板。要被點加的cDNA無特殊限制，只要其來源于單子葉植物。從隨后基因組數(shù)據(jù)庫分析簡化的觀點考慮，來源于像水稻這樣具有高級基因組分析的單子葉植物是優(yōu)選的。植物可在正常狀態(tài)下(未處理)。然而，優(yōu)選暴露于像脫水、鹽或低溫這樣的脅迫下的植物。
當(dāng)建立cDNA文庫時，首先利用一個商售的試劑盒(如，ZAP-cDNA合成試劑盒，Stratagene)進行mRNA的反轉(zhuǎn)錄和單鏈cDNA的合成。然后，利用合成的單鏈cDNA作為模板合成雙鏈cDNA。隨后，將一個含有合適限制酶切位點的連接物添加到所合成的雙鏈cDNA上，然后將該雙鏈cDNA插入到λ噬菌體載體的克隆位點上。利用商售試劑盒(如，Gigapack III Gold包裝提取物(Stratagene))在體外對合成的DNA進行包裝，使之感染E.coll宿主，再進行擴增。因此可獲得目的cDNA文庫。
一旦制備了cDNA文庫，就用PCR擴增該cDNA或其具有高度特異性的區(qū)域(如，在3’端的不包含重復(fù)序列的UTR區(qū))以產(chǎn)生要被固定在微陣列上的探針。當(dāng)通過重復(fù)該過程獲得所有目的基因的探針時，可利用商售點樣器(如，由Amersham制造的)將這些探針點加到載玻片上。這樣就獲得了目的cDNA微陣列。
(2)基因表達水平的檢測當(dāng)標記有合適試劑的樣品mRNA(或cDNA)在微陣列上與cDNA探針雜交時，可通過cDNA微陣列獲得的信號強度檢測基因表達水平。一般而言，基因的表達水平優(yōu)選確定為與合適的對照可比較的一個值，或是考慮到微陣列上點加的cDNA探針數(shù)量上的差異，在兩個要被比較的樣品之間的表達水平的比率。就本發(fā)明篩選過程而言，來自未實施脅迫(沒有處理)的植物的mRNA作為對照，則獲自實施脅迫的植物的mRNA的相對表達水平可通過它們的比例關(guān)系而得到測定。
檢測按如下進行。對照和樣品的mRNAs(或其cDNA)用不同的熒光染料(如Cy3和Cy5)進行標記，并與陣列上的cDNA探針雜交。例如，從實施脅迫的植物中提取mRNA并在Cy5標記的dCTP存在下進行反轉(zhuǎn)錄以制備Cy5標記的cDNA。隨后，從未實施脅迫(未被處理)的植物中提取mRNA，并用同樣的方法制備Cy3標記的cDNA。將相等數(shù)量的Cy5標記的cDNA(樣品)和Cy3標記的cDNA(對照)混合，然后將產(chǎn)物與陣列上的cDNA雜交。Cy3可用于標記樣品，Cy5可用于標記對照物?？蛇x擇地，也可使用其它合適的標記反應(yīng)物。
利用熒光信號探測器讀取所獲得的熒光強度并隨后轉(zhuǎn)化為數(shù)值。該數(shù)值等同于樣品的基因表達水平相對于對照的比率。任選地，對于每個樣品將掃描儀讀取的熒光強度進行誤差調(diào)整或方差歸一化。在每種樣品中都普遍表達的基因如管家基因的基礎(chǔ)上，可進行歸一化。此外，確定用于可靠性的閾值界限以除去低相關(guān)性數(shù)據(jù)。
(3)脅迫誘導(dǎo)基因的篩選基于陣列分析結(jié)果，脅迫誘導(dǎo)基因被指定為在實施脅迫和未實施脅迫的植物中以顯著差異水平表達的基因。于此所用的術(shù)語“顯著差異”是指，例如，在1000或者更高的強度水平上，兩種植物之間的差異在3倍或3倍以上。
(4)通過Northern印跡法分析表達對如上所選擇的基因進一步進行Northern分析及類似的分析。因此，證實了基因表達水平增加與脅迫耐受水平增強相關(guān)。例如，將植物暴露于以如上所描述的方式進行的如鹽、脫水、溫度的不同水平的脅迫下。然后，從植物中提取RNA并通過電泳分離。將所分離的RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并與特異于該基因的標記的cDNA探針雜交。如此，其表達水平可得到檢測。
如果所選基因表達水平以脅迫依賴方式增加，可確定該基因是脅迫誘導(dǎo)的。從水稻cDNA文庫篩選的脅迫誘導(dǎo)基因的例子包括本發(fā)明的a0022(LIP9SEQ ID NO2)和a0066(WSI724SEQ ID NO8)。a0022和a0066是固定在微陣列上的cDNA的標識號。
1.3啟動子序列的篩選(1)基因數(shù)據(jù)庫的篩選隨后，利用檢測軟件(如Blast)，在現(xiàn)有的基因數(shù)據(jù)庫(如，DDBJ數(shù)據(jù)庫)中尋找脅迫-誘導(dǎo)的基因的啟動子序列。至于像水稻這樣的植物，其基因組大部分已被破譯，可利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫尋找所有控制特異性脅迫誘導(dǎo)基因的啟動子序列。來自高度同源于脅迫-誘導(dǎo)的基因(cDNA)的基因組基因的上游區(qū)域中被認作啟動子的區(qū)域選擇作為啟動子序列。例如，基于脅迫誘導(dǎo)基因的基因組信息，將假定為這些基因的一個起始密碼子位點的上游大約1到2kb區(qū)域推測為一個啟動子區(qū)域。
在一些常用的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子的序列中，所含有的順式(cis)元件與啟動子活性相關(guān)，例如脫水應(yīng)答元件(DRE)、脫落酸應(yīng)答元件(ABRE)以及低溫脅迫應(yīng)答元件。當(dāng)一個脅迫-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至順式元件時，激活了前述啟動子，在啟動子控制下的脅迫-耐受-給予基因被允許得到表達。相應(yīng)地，如果尋找到包含在上游區(qū)域的順式元件，該區(qū)域很有可能是脅迫-誘導(dǎo)的啟動子。
因此，獲得了高度同源于前述a0022(LIP9SEQ ID NO2)的基因的基因組信息，并從該基因的上游1.1kb區(qū)域中篩選到一個推測的LIP9啟動子序列(SEQ ID NO1)。類似地，從高度同源于a0066(WSI724SEQ ID NO8)的基因的上游區(qū)域中篩選到一個推測的WSI724啟動子序列(SEQ ID NO10)。
(2)脅迫-誘導(dǎo)的啟動子功能的確定隨后，通過脅迫實施時啟動子活性的改變來確定所推測的啟動子序列的功能。
最初，基于上文所推測的啟動子序列制備引物。使用基因組DNA作為模板進行PCR，克隆啟動子。隨后，將一個報告基因連接到啟動子下游以產(chǎn)生一個報告質(zhì)粒。然后，將所產(chǎn)生的報告質(zhì)粒導(dǎo)入到植物中，接著研究對植物(優(yōu)選其T2代)實施脅迫時報告基因的表達。報告基因的例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶(如，GUSpBI121，Clontech)、熒光素酶基因以及綠熒光蛋白基因。優(yōu)選GUS，因為其活性可通過數(shù)值來顯示且其表達可通過染色進行肉眼觀察。
1.4本發(fā)明的啟動子基于上述，發(fā)現(xiàn)水稻基因組來源的LIP9啟動子序列(SEQ ID NO1)是一種脅迫-誘導(dǎo)的啟動子，它們以脫水-、低溫-或鹽脅迫-依賴方式得到高表達。
如上所述，LIP9啟動子為所有類型的脅迫所特異性誘導(dǎo)。其結(jié)構(gòu)和功能特征描述如下。
1)LIP9啟動子在其結(jié)構(gòu)中包含與脫水脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的2個DRE順式元件(圖2)。
2)在允許OsDREB1基因(日本專利申請?zhí)?001-358268)過表達的植物中，LIP9的表達水平是高的，所述OsDREB1基因是一種水稻來源的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)合DRE順式元件并激活位于其下游基因的轉(zhuǎn)錄。
3)LIP9啟動子包含與OsDREB1蛋白結(jié)合的DRE序列。因此，推測對于OsDREB基因的過表達而言，LIP9啟動子是最適合的。
此外，WSI724基因是OsDREB基因的靶點。該推測是基于WSI724啟動子在其結(jié)構(gòu)中包含2個DRE序列這樣的事實所作出，也是基于當(dāng)實施脅迫時a0066的表達譜而作出的(該表達譜是通過脫水、鹽以及低溫脅迫所誘導(dǎo)的，以及低溫的誘導(dǎo)速率是低于脫水和鹽的)。
本發(fā)明的啟動子并不限于由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA。本發(fā)明的脅迫-誘導(dǎo)的啟動子包括，在嚴謹條件下，能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA，只要該DNA具有脅迫誘導(dǎo)啟動子的活性。在“嚴謹條件”下，是指雜交在30-50％甲酰胺中，于37℃至50℃，在6xSSC中進行，優(yōu)選在50％甲酰胺，于42℃，在6xSSC中進行。
2.重組載體本發(fā)明的重組載體包括本發(fā)明的啟動子。該載體可包括其它功能性結(jié)構(gòu)基因或本發(fā)明的啟動子下游的調(diào)節(jié)基因。優(yōu)選的基因?qū)嵗ㄓ糜谠鰪娒{迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因。術(shù)語“功能性”指在本發(fā)明啟動子控制下，其它結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因適宜表達的一種狀態(tài)。
由增強脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因編碼一種蛋白，該蛋白在增強植物對于像脫水、低溫或鹽脅迫的環(huán)境脅迫耐受中發(fā)揮作用。這些蛋白的實例包括LEA蛋白；水通道蛋白；作用于可混溶溶質(zhì)的合酶；煙草解毒酶；作用于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如，糖、脯氨酸或甜菜堿)的合酶；編碼擬南芥w-3脂肪酸脫氫酶和藍綠藻D9-脫氫酶的基因，它們是細胞膜脂類修飾酶；P5CS，其是一種脯氨酸合成的關(guān)鍵酶；以及用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因。
用增強脅迫耐受性的調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)脅迫-誘導(dǎo)的啟動子活性以及用于產(chǎn)生脅迫耐受性的基因的表達，從而增強植物中的脅迫耐受性。這樣的調(diào)節(jié)基因例子包括擬南芥來源的轉(zhuǎn)錄因子，例如DREB1A、DREB2A、DREB1B和DREB1C基因(JP專利公開(未審查的申請)號.2000-60558)；水稻來源的轉(zhuǎn)錄因子，例如OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A基因轉(zhuǎn)錄因子(日本專利申請?zhí)?001-358268)；以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的關(guān)鍵酶。
當(dāng)本發(fā)明的啟動子包含一個特異性順式元件時，結(jié)合該順式元件并增強其啟動子活性的轉(zhuǎn)錄因子的基因特別優(yōu)選地連接于該啟動子的下游。
如上所述，本發(fā)明的LIP9啟動子其結(jié)構(gòu)中包含2個DRE序列。因此，優(yōu)選將DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)連接到LIP9啟動子下游。最優(yōu)選OsDREB基因。
因為WSI724啟動子也包含2個DRE序列，因此推測其是OsDREB的靶點，優(yōu)選將DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)連接到WSI724啟動子下游。最優(yōu)選OsDREB基因。
通過連接(插入)本發(fā)明的啟動子或啟動子和其它調(diào)節(jié)基因或結(jié)構(gòu)基因到(至)合適的載體上，構(gòu)建得到本發(fā)明載體以致其具有功能性。要被插入啟動子的載體沒有特殊限制，只要其能夠在宿主中復(fù)制即可。例如，質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA或類似可被使用的。質(zhì)粒DNA包括用于大腸桿菌(E.coli)宿主的質(zhì)粒，例如，pBR322、pBR325、pUC118和pUC119；用于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)宿主的質(zhì)粒，例如pUB110和pTP5；用于酵母宿主的質(zhì)粒，例如，YEp13、YEp24和YCp50；以及用于植物細胞宿主的質(zhì)粒，例如，pBI221和pBI121。噬菌體DNA包括λ噬菌體和類似的噬菌體。此外，也可使用動物病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒載體，或也可使用昆蟲病毒載體，例如桿狀病毒載體。
通過用合適的限制酶切割純化的DNA并接著插入到用于連接的合適載體的限制性酶切位點或多克隆位點，可將本發(fā)明的啟動子插入到載體中。
如果需要，本發(fā)明的重組載體可包含一個剪接信號、poly(A)添加信號、選擇標記、核糖體結(jié)合序列(SD序列)等等。選擇性標記的實例為二氫葉酸還原酶基因、氨芐青霉素耐受基因，新霉素耐受基因等等。
3.轉(zhuǎn)基因植物可通過將本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主中以便啟動子活性能夠表達來制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。宿主并無具體限制，只要本發(fā)明的啟動子能在其中起作用即可。宿主優(yōu)選為植物，特別優(yōu)選為象水稻這樣的單子葉植物體。
當(dāng)植物或植物細胞用作為宿主時，例如，使用從水稻、玉米、小麥、擬南芥，煙草或胡蘿卜確立的細胞或制備自這些植物的原生質(zhì)體。用于將重組載體導(dǎo)入植物的方法包括Abel等的方法，該方法利用了聚乙二醇(Abel，H.等，Plant J.5421-427，1994)，以及電穿孔。
4.脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物(1)制備轉(zhuǎn)基因植物將用于增強耐受脅迫性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因?qū)胫参?，使之置于本發(fā)明的啟動子的控制之下。從而，能夠制備得到對環(huán)境脅迫耐受性增強了的功能性轉(zhuǎn)基因植物，所述環(huán)境脅迫是例如低溫、冷凍或脫水的脅迫。特別優(yōu)選的宿主植物的實例是單子葉植物。
用于將本發(fā)明的啟動子等導(dǎo)入宿主植物的方法包括間接導(dǎo)入法例如農(nóng)桿菌感染法以及直接導(dǎo)入法例如粒子槍法、聚乙二醇法、脂質(zhì)體法和顯微注射法。迄今為止，使用農(nóng)桿菌感染法從象水稻這樣的單子葉植物制備得到轉(zhuǎn)基因植物是很困難的。但是，加入乙酰丁香酮可使農(nóng)桿菌感染水稻。因此，使得農(nóng)桿菌感染法可用于單子葉植物。
本發(fā)明下文中將描述用農(nóng)桿菌制備轉(zhuǎn)基因植物。
要被導(dǎo)入植物的重組載體可通過下述方法制備而成用合適的限制性酶對包含本發(fā)明的啟動子和用于增強脅迫耐受的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因的DNA進行切割，如有必要，在切割后的DNA上連接一合適的接頭，然后將該DNA插入可用于植物細胞宿主的克隆載體中。二元載體型質(zhì)粒，如pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH和pBIG，或中間載體型質(zhì)粒如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200可用作為克隆載體。
當(dāng)使用二元載體型質(zhì)粒時，目的基因要插入到二元載體的兩鄰接序列(LB、RB)之間。所得到的重組載體在大腸桿菌中擴增。然后通過凍融、電穿孔等方法將擴增后的重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58(Agrobacterium rumefaciens C58)、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等中。將所得到的農(nóng)桿菌用用于轉(zhuǎn)化植物。
在本發(fā)明中，除上述方法外，還可用三元偶聯(lián)法(Nucleic AcidsResearch，128711，1984)來制備要導(dǎo)入植物中的農(nóng)桿菌。具體而言，將包括目的基因的含質(zhì)粒大腸桿菌、輔助性含質(zhì)粒大腸桿菌(如pRK2013)以及農(nóng)桿菌混合并在含利福平和卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。因此，可得到待感染到植物體中的結(jié)合子農(nóng)桿菌。
對于在植物體內(nèi)表達外源基因等而言，應(yīng)該將植物終止子等置于結(jié)構(gòu)基因的下游?？捎糜诒景l(fā)明的終止子序列的具體實例包括花椰菜花葉病毒來源的和胭脂氨酸合成酶基因來源的終止子。終止子不限于上述的終止子，只要已知它們在植物體中能夠發(fā)揮作用即可。
為了有效地篩選目的轉(zhuǎn)基因細胞，優(yōu)選使用可有效篩選的標記基因?？捎眠x自下列基因的一個或多個基因作為篩選標記卡那霉素耐受(NPTII)基因、可賦予植物對抗生素潮霉素耐受性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(htp)基因、可賦予雙丙氨膦耐受性的膦絲菌素?；D(zhuǎn)移酶(bar)基因等。本發(fā)明的啟動子和篩選標記基因可一起插入到同一載體中?？蛇x擇地，它們可各自插入不同的載體中。
如果用上述方法制備的農(nóng)桿菌感染植物，那么就可制得目的轉(zhuǎn)基因植物。
將該轉(zhuǎn)基因植物播種在含足量抗生素的培養(yǎng)基上，然后篩選獲得含目的啟動子和基因的植物。將篩選得到的植物轉(zhuǎn)移到含BonsolNo.1、黑土或類似成分的罐中，并進行進一步的培養(yǎng)。通常來說，基因都是以類似的方式導(dǎo)入宿主植物的基因組中。但是，由于導(dǎo)入的基因在基因組上的位置不同，會使得導(dǎo)入基因的表達情況隨之變化。這種現(xiàn)象稱之為“位置效應(yīng)”。通過使用來自導(dǎo)入基因的DNA片段作為探針通過Northern印跡法對轉(zhuǎn)基因植物進行分析，有可能篩選出那些其中導(dǎo)入基因更高表達的轉(zhuǎn)基因植物。
(2)脅迫耐受性的確認轉(zhuǎn)基因植物及其后代中是否整合了本發(fā)明所述啟動子或結(jié)構(gòu)基因和/或用于增強脅迫耐受性的調(diào)節(jié)基因，可以采用下述方法對其確認從這些植物的細胞及組織中提取DNA，并用本領(lǐng)域常規(guī)方法PCR或Southern分析對導(dǎo)入的基因進行檢測。
基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達水平及表達器官可以通過下述方法分析從植物細胞及組織中提取RNA，通過本領(lǐng)域常規(guī)方法RT-PCR或Northern分析檢測導(dǎo)入的基因的mRNA?？蛇x擇地，導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過使用抗該產(chǎn)物的抗體或類似物經(jīng)Western印跡法進行直接分析。
已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明所述啟動子的轉(zhuǎn)基因植物對于環(huán)境脅迫的耐受性可以通過下述方法評估將該轉(zhuǎn)基因植物栽培在一裝有土壤的罐中，所述土壤中含有蛭石、珍珠巖、Bonsol等或用溶液培養(yǎng)植物，將該植物暴露于不同類型的環(huán)境脅迫下，然后檢測植物的存活情況。環(huán)境脅迫包括低溫、脫水及鹽脅迫。例如，對脫水脅迫的耐受性可通過讓植株無水生長2-4周，然后檢測其存活情況來評價。對低溫和冷凍脅迫的耐受性可以通過讓植物在15至-10℃下生長1-10天，在20-35℃下生長2天-3周，然后測定其存活比率來評價。對鹽脅迫的耐受性可通過，例如，讓植物在100-600mM NaCl中生長1小時-7天，在20-35℃下生長1-3周，然后測定存活比率來評價。因此，使用本發(fā)明的啟動子能顯著增強脅迫耐受性而不阻礙植物的生長(特別是單子葉植物)。
(3)優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物的實例本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物的實例是通過將包含連接LIP9或WSI724啟動子下游的功能性O(shè)sDREB基因的載體導(dǎo)入象水稻或小麥這樣的單子葉植物中所制備的一種植物。因為LIP9啟動子包含2個DRE區(qū)域，因此OsDREB基因可通過與順式元件結(jié)合以有效地發(fā)揮脅迫耐受的作用。同樣地，WSI724啟動子包含2個DRE區(qū)域，因此，可增加OsDREB基因的表達水平并增強植物的脅迫耐受性。
實施例根據(jù)下列實施例，本發(fā)明得到更詳細的描述，但是，本發(fā)明的技術(shù)范圍不為此所限。
脅迫-誘導(dǎo)的水稻基因的鑒定使用cDNA微陣列及Northern分析搜索脅迫-誘導(dǎo)的水稻基因。
1.水稻cDNA微陣列的制備將在培養(yǎng)液中生長2-3周的水稻種子(Nihonbare)經(jīng)受脫水、鹽或低溫脅迫。通過室溫下空氣干燥來實施脫水脅迫，通過在250mMNaCl溶液中培養(yǎng)實施鹽脅迫，通過在4℃下培養(yǎng)實施低溫脅迫。將已用每一種脅迫處理過的水稻用液氮冷凍。通過硫氰酸胍及氯化銫法從冷凍樣品中提取總RNA，并用寡聚(dt)-纖維素柱制備mRNA。利用所得到的mRNA作模板用HybriZAP-2.1雙雜交cDNA Gigapack克隆試劑盒(Stratagene)合成cDNA，并將得到的cDNA插入并克隆到HybriZAP-2.1噬菌粒載體的EcoRI-XhoI切割位點上。使用GigapackIII Gold包裝提取物(Stratagene)包裝該噬菌粒DNA。所得到的含cDNA的λ噬菌體顆粒被用于感染宿主大腸桿菌，然后擴增這些噬菌體顆粒，并隨后以噬菌體懸液方式回收這些噬菌體。
對cDNA克隆的核苷酸序列進行測序以篩選出約1500個單獨的克隆。通過PCR擴增所篩選的克隆并用GTMASS系統(tǒng)(Nippon Laserand Electronic Laboratory)將其印在聚-L-賴氨酸-包被的顯微載玻片(型號S7444，Matsunami)上。然后，通過UV交聯(lián)將克隆固定以制備水稻cDNA微陣列(The Plant Cell，2001，1361-72Seki等)。
2.微陣列分析以與上文相同的方法對水稻植株實施脫水、鹽或低溫脅迫或用100μM脫落酸處理(5小時或10小時)，分別從這些植株以及未受脅迫的水稻植株(未經(jīng)處理)中提取mRNA。以來自未經(jīng)處理水稻植株的mRNA作為對照，并用來自已經(jīng)各種脅迫或脫落酸處理的水稻植株的mRNA作為樣品。通過用Cy3和Cy5雙重?zé)晒鈽擞浀姆椒ㄟM行cDNA微陣列分析。作為微陣列分析的結(jié)果，強度為1000或更高的基因以及具有表達水平比對照高3倍的基因被選作為侯選的脅迫-誘導(dǎo)的基因。因此，a0022(LIP9SEQ ID NO2)和a0066(WSI724SEQ ID NO8)被選作為脅迫-誘導(dǎo)的基因。
3.通過Northern雜交進行表達分析通過Northern雜交分析上文中所選擇的基因的特征性表達。首先，將水稻植株暴露于脫落酸、脫水、低溫、鹽或水脅迫，然后每隔0、1、2、5和10小時從施加了脅迫的水稻中完成取樣。脫落酸、脫水、低溫或鹽脅迫分別以與1中相同的方法施加，用將植株浸沒于純水中的方法施加水脅迫。從每一樣本中制備總RNA，進行電泳，并通過Northern方法觀察每一基因的表達。結(jié)果見
圖1。
由
圖1清楚可見，a0022基因的表達受脫落酸、脫水、低溫、或鹽脅迫誘導(dǎo)。具體而言，其表達為脫落酸、脫水或鹽脅迫所快速誘導(dǎo)。相反地，其表達為低溫脅迫所緩慢誘導(dǎo)?；谑┘用{迫時的表達譜(該表達譜是通過脫水、鹽和低溫脅迫所誘導(dǎo)的，低溫誘導(dǎo)速率較脫水和鹽誘導(dǎo)為慢)，a0066基因是OsDREB的靶點。
啟動子序列的篩選1.水稻基因組數(shù)據(jù)庫的篩選使用Blast，從DDBJ水稻基因組數(shù)據(jù)庫中搜索實施例1中被選作為脅迫-誘導(dǎo)基因的a0022(LIP9SEQ ID NO2)的cDNA的同源位點。結(jié)果，在觀察到同一性的基因中，位于該基因從起始密碼子上游向5’端方向的1.1kb序列選作為啟動子序列(SEQ ID NO1)。對a0066(WSI724SEQ ID NO8)也進行了類似的搜索，篩選到其啟動子序列(SEQ ID NO10)。
圖2顯示了LIP9啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)。由圖2清楚可見，LIP9其結(jié)構(gòu)中包含2個DRE順式元件((A/G)CCGAC)。圖7顯示了WSI724啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)。也發(fā)現(xiàn)該WSI724啟動子其結(jié)構(gòu)中包含2個DRE順式元件((A/G)CCGAC)。
2.克隆以所篩選到的啟動子序列為基礎(chǔ)，設(shè)計引物，利用水稻基因組DNA作為模板進行PCR，并進行克隆。引物序列和PCR所使用的條件如下用于LIP9啟動子的引物序列正向引物5’-CACGAAGCTTTCATCAGCTATTCATCAA-3’(SEQ ID NO3)反向引物5’-CCGGATCCTCGATCGATGGATTCAGCTA-3’(SEQ ID NO4)用于WSI724啟動子的引物序列正向引物5’-CCATTGGATCCAGCCGTGGAAGTCCAAC-3’(SEQ ID NO11)反向引物5’-GCCGGGGATCCTTGGCGCCTCTCTCTCT-3’(SEQ ID NO12)PCR條件95℃持續(xù)1分鐘，55℃持續(xù)1分鐘，68℃持續(xù)2分鐘，30個循環(huán)。
LIP9啟動子抗脅迫活性(1)制備轉(zhuǎn)基因植物用玉米的泛蛋白啟動子取代pBIG29APHSNot的啟動子位點以制備G-ubi質(zhì)粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi質(zhì)粒并連接到以同樣方式切割的LIP9啟動子的片段上。將已整合入LIP9啟動子的質(zhì)粒用BamHI-EcoRI切割并連接到從pBI221(Clontech)中用BamHI-EcoRI以同樣方式切割得到的Gus基因上，以制備GUS-表達構(gòu)建體G-LIP9GUS(圖3)。通過電穿孔將質(zhì)粒G-LIP9GUS導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，培養(yǎng)后用10％甘油洗滌，從而制備得到農(nóng)桿菌EHA105(G-LIP9GUS)。以下列方式用該農(nóng)桿菌EHA105(G-LIP9GUS)感染水稻來制備目的轉(zhuǎn)基因植物。
將水稻種子浸沒在70％乙醇中1分鐘，然后浸沒在2％次氯酸鈉中1小時消毒。接著用無菌水洗滌消毒后的種子，每種種子各取9粒播種在N6D固體培養(yǎng)基(每升中含3.98g CHU[N6]基礎(chǔ)鹽混合物(Basal Salt Mixture)(Sigma)、30g蔗糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2，878mg L-脯氨酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D以及4g Gellite，pH5.8)平板上，然后培養(yǎng)24天。如此，愈傷組織得到誘導(dǎo)。將大約20顆種子所形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的N6D固體培養(yǎng)基上，然后再培養(yǎng)3天。
將農(nóng)桿菌EHA105(G-LIP9GUS)分別在含100mg/l利福平和含20mg/l卡那霉素的5ml YEP培養(yǎng)基(每升中含細菌培養(yǎng)用蛋白胨10g、細菌培養(yǎng)用酵母提取物10g、NaCl 5g、MgCl2·6H2O 406mg，pH7.2)中在28℃下培養(yǎng)24小時。用含20mg/l乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基(每升中含10mg MnSO4·5H2O、3mg H3BO3、2mg ZnSO4·7H2O、250μgNa2MoO4·2H2O、25μg CuSO4·5H2O、25μg CoCl2·6H2O、750μg KI、150mg CaCl2·2H2O、250mg MgSO4·7H2O、40mg Fe-EDTA、150mgNaH2PO4·2H2O、1mg煙酸、10mg鹽酸硫胺素、1mg鹽酸吡哆醇、100mg肌醇、176.7mg L-精氨酸、7.5mg甘氨酸、900mg L-谷酰胺、300mg天冬氨酸和3g KCl，pH5.2)稀釋該農(nóng)桿菌至O.D.660值為0.1。由此，制備得到20ml農(nóng)桿菌懸液。
隨后，將農(nóng)桿菌懸液加入培養(yǎng)了3天后的愈傷組織，然后混合1分鐘。接著，將該愈傷組織放置在消毒后的紙巾上以去除多余的農(nóng)桿菌懸液，然后在其上已放置了消毒后的濾紙的2N6-AS固體培養(yǎng)基(每升中含3.98g CHU[N6]基礎(chǔ)鹽混合物、30g蔗糖、10g葡萄糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D、10mg乙酰丁香酮以及4gGellite，pH5.2)上培養(yǎng)，于黑暗處在25℃下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后，用含有500mg/l羧芐青霉素的3％蔗糖水溶液徹底洗滌該培養(yǎng)產(chǎn)物直至該產(chǎn)物無污斑。將洗滌后的培養(yǎng)產(chǎn)物在含500mg/l羧芐青霉素和10mg/l潮霉素的N6D培養(yǎng)基上再培養(yǎng)1周。然后，將所得到的培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到含500mg/l羧芐青霉素和50mg/l潮霉素的N6D固體培養(yǎng)基上再培養(yǎng)18天。然后，把該愈傷組織轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基(每升含4.6g Murashige和Skoog植物鹽混合物(Plant Salt Mixture)(NihonPharmaceutical Co.，Ltd)、30g蔗糖、30g山梨醇、2g酪蛋白氨基酸、100mg肌醇、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、2mg NAA、2mg激動素、250mg羧芐青霉素、50mg潮霉素以及8g瓊脂糖，pH5.8)。每隔一周將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進行再分化。將那些芽體長到約1cm長的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到無激素培養(yǎng)基(每升含4.6g Murashige和Skoog植物鹽混合物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd)、30g蔗糖、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、50mg潮霉素以及2.5g Gellite，pH5.8)。將那些在無激素培養(yǎng)基上生長到約8cm的植物體轉(zhuǎn)移到裝有合成顆粒狀盆用土壤(Bonsol No.1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)的盆中讓轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生種子。
類似地，將rd29A啟動子(Nature Biotechnology1999，17287-291)、35S啟動子或salT啟動子(SEQ ID NO5)連接到GUS基因上游以得到構(gòu)建體。將所得到的構(gòu)建體導(dǎo)入水稻和/或煙草中。
該salT啟動子是一種通過以與LIP9啟動子相同的方法進行篩選，分離自水稻基因組的脅迫誘導(dǎo)啟動子。固定在微陣列上salT啟動子cDNA的ID號為a2660。盡管salT啟動子在其結(jié)構(gòu)中并不包含特定的順式序列，但證實了其表達是受脫落酸、脫水、低溫或鹽脅迫所誘導(dǎo)的(日本專利申請?zhí)?002-377316)。
(2)啟動子抗脫水脅迫活性將所獲得的GUS-表達轉(zhuǎn)基因水稻的T2代用溶液培養(yǎng)2周，并以與實施例1相同方式暴露于脫水脅迫。
就表達GUS的轉(zhuǎn)基因煙草而言，讓從T1代植株再生得到的植株在植物生長錐體中生長3-5周，將生長的葉片一分為二。其中一半作為對照測定，另一半在室溫下空氣干燥，然后暴露于脫水脅迫下。
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解導(dǎo)致熒光強度的變化，據(jù)此來分析轉(zhuǎn)基因水稻和煙草的GUS活性。圖4顯示了在施加脫水脅迫時導(dǎo)入不同啟動子的轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性。
由圖4清楚可見，脅迫-誘導(dǎo)的salT或LIP9啟動子在單子葉植物，即水稻，中的活性水平比rd29A啟動子要高。具體而言，LIP9啟動子的活性大約比salT啟動子高兩倍。雖然，LIP9啟動子也在雙子葉植物煙草中表現(xiàn)出脅迫-誘導(dǎo)的啟動子活性，但是其活性較水稻為弱。
(3)啟動子抗鹽脅迫活性隨后，將其中已導(dǎo)入LIP9啟動子-GUS構(gòu)建體的水稻整個植株浸沒入鹽水中，接著進行GUS染色。結(jié)果，整個植株都被染色(圖5)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)LIP9啟動子在施加了鹽脅迫的植株的所有部位中都能夠發(fā)揮作用。
WSI724啟動子抗脅迫活性以與實施例3相同的方式使用WSI724啟動子制備轉(zhuǎn)基因水稻，并研究其脅迫應(yīng)答。
(1)制備轉(zhuǎn)基因植物用玉米的泛蛋白啟動子取代pBIG29APHSNot的啟動子位點以制備G-ubi質(zhì)粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi質(zhì)粒并連接到以同樣方式切割的WSI724啟動子的片段上。用BamHI切下WSI724啟動子的PCR片段并平端化，連接到pBIG載體位點上，用SamI切割該載體以制備GUS-表達構(gòu)建體(WSI724GUS)。隨后，通過電穿孔將WSI724GUS導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，培養(yǎng)后用10％甘油洗滌，從而制備得到農(nóng)桿菌EHA105(WSI724GUS)。用該農(nóng)桿菌EHA105(WSI724GUS)感染水稻來制備目的轉(zhuǎn)基因植物。
(2)啟動子抗脫水脅迫活性基于4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解所導(dǎo)致熒光強度的改變，以與實施例3相同的方式將GUS-表達轉(zhuǎn)基因水稻暴露于脫水脅迫中以測試其GUS活性。結(jié)果，在已施加脫水脅迫的轉(zhuǎn)基因水稻葉子中觀察到的GUS活性(在這里葉子已被切下并允許放置24小時)高于在對照的葉子中所觀察到那些(在這里上述葉子已被切下并接著馬上冷凍)。對已施加脫水脅迫(持續(xù)24小時)的轉(zhuǎn)基因水稻進行GUS染色，在根和葉子中都觀察到了GUS活性。
導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因水稻的基因的表達，LIP9基因和WSI724基因以與實施例3相同的方式制備轉(zhuǎn)基因植物。通過在玉米泛蛋白啟動子或35S啟動子的控制下，將OsDREB1A基因(SEQ ID NO6)或DREB1C基因(SEQ ID NO8)導(dǎo)入水稻中以制備轉(zhuǎn)基因植物。通過Northern方法分析已導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物的REB1C基因的mRNA水平以及LIP9(a0022)、WSI724(a0066)和salT(a2660)的mRNA水平，認為其表達為導(dǎo)入的基因所改變。
OsDREB1A基因(SEQ ID NO6)、DREB1C基因(SEQ ID NO8)、LIP9基因(a0022，SEQ ID NO2)、WSI724基因(a0066，SEQ IDNO8)以及salT基因(a2660，SEQ ID NO9)被作為探針(將涉及序列表中SEQ ID NOs6和7的編碼區(qū)序列作為探針)。作為對照，其中僅轉(zhuǎn)化了載體的水稻以相同的方式進行分析。
在含有30mg/ml潮霉素的0.1％苯菌靈(Benlate)溶液中篩選轉(zhuǎn)基因植物5天。然后，將植物轉(zhuǎn)移至含有Bonsol No.1的罐中并培養(yǎng)12天。以相同方法培養(yǎng)野生型水稻。提取每一植物的總RNA并進行電泳。以與實施例1相同的方式通過Northern方法分析每一基因的表達。結(jié)果示于圖6中，其中“a”、“b”和“c”分別代表一種轉(zhuǎn)基因植物品系。
在已導(dǎo)入OsDREB1A和DREB1C基因的轉(zhuǎn)基因水稻中，在啟動子區(qū)域具有DRE序列的LIP9基因的表達被發(fā)現(xiàn)得到誘導(dǎo)。相反，發(fā)現(xiàn)在啟動子區(qū)域沒有DRE序列的salT基因的表達與導(dǎo)入的基因(OsDREB1A或DREB1C)的表達不一致。同樣，在啟動子區(qū)域包含DRE序列并被推測是OsDREB靶點的WSI724基因的表達與為這些轉(zhuǎn)基因植物所誘導(dǎo)的LIP9一樣。
LIP9或WSI724啟動子包含DRE序列，且觀察到在OsDREB1A基因過表達的轉(zhuǎn)基因植物中LIP9或WSI724基因的表達水平是高的。LIP9和WSI724被認為是包括OsDREB1A的OsDREB基因的靶基因。因此，推測對于OsDREB基因過表達而言，LIP9和WSI724啟動子是最適合的。
pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A的制備按下述方法制備G-ubi和G35S-ShΔ。首先，用BamHI切割pBIG質(zhì)粒(Nucleic Acids Research 18203，1990)，平端化，并連接，從而刪除該BamHI切割位點。然后，用HindIII和EcoRI切割該質(zhì)粒。將得到的片段和一個通過相同方式切割pBE2113Not質(zhì)粒得到的長約1.2kb的片段連接，從而制備得到pBIG2113Not質(zhì)粒。
隨后，用HindIII和BamHI切割pBIG2113Not，并與以相同方式切割rd29A啟動子得到的一個片段(約0.9kb，Nature Biotechnology17287-291，1999)連接，從而制備出pBIG29APHSNot質(zhì)粒。接著，用HindIII和SalI切割該pBIG29APHSNot質(zhì)粒，然后與玉米的泛蛋白基因(Ubi-1)啟動子的一個片段(約2.0.kb，Plant Molecular Biology18675-689，1992)或者一個其中含有p35S-shΔ-stop的CaMV 35S啟動子和玉米蔗糖合成酶基因(Sh1)一部分內(nèi)含子的片段(約1.6kb，Proceeding National Academy of Science USA 9615348-15353，1999)連接，這些片段是以同一方式切割得到的。從而，制得G-ubi質(zhì)粒和G35S-ShΔ質(zhì)粒。
用BamHI切割上述的pBE2113Not、G-ubi和G35S-ShΔ，并用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)與同樣切割得到的編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子的OsDREB1A基因片段連接。用以此得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因大腸桿菌后，從中純化出質(zhì)粒pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A。隨后，測定它們的核苷酸序列，并篩選具有結(jié)合至有義方向的OsDREB1A基因的那些。
將含有質(zhì)粒pBE35SOsDREB1A的大腸桿菌DH5α、含有輔助質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌HB101和農(nóng)桿菌C58混合并在LB瓊脂培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)24小時。刮下所產(chǎn)生的克隆并懸于1ml LB培養(yǎng)基中。將該懸液(10μl)加到含100mg/l利福平和20mg/l卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中，并于28℃培養(yǎng)2天，從而獲得接合子農(nóng)桿菌C58(pBE35SOsDREB1A)。通過電穿孔，將G-ubiOsDREB1A質(zhì)粒和G35S-ShΔOsDREB1A質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，并在培養(yǎng)后用10％甘油洗滌。因此，獲得了農(nóng)桿菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和農(nóng)桿菌EHA105(G35S-ShΔOsDREB1A).
于此引證的所有出版物、專利和專利申請其全文并入本文作為參考。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種脅迫-誘導(dǎo)的啟動子，該啟動子可以在單子葉植物中發(fā)揮功效。該啟動子包含DRE序列。如果OsDREB基因或類似基因被連接以致其在該啟動子控制之下并導(dǎo)入植物中，因此，可制備得到具有潛在的脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因單子葉植物，如水稻。
序列表的獨立文本SEQ ID NO3-人工序列描述引物SEQ ID NO4-人工序列描述引物SEQ ID NO11-人工序列描述引物SEQ ID NO12-人工序列描述引物序列表<110>Japan International Research Center for Agricultural SciencesIncorporated Administrative Agency，National Agriculture and Bio-orientedResearch Organization<120>脅迫-誘導(dǎo)的啟動子及其使用方法<130>PH-2004-PCT<140>
<141>
<150>JP 2003-80847<151>2003-03-24<160>12<170>Patent In 2.1版<210>1<211>1066<212>DNA<213>水稻<220>
<223>發(fā)明人Shinozaki，Kazuko；Katsura，Koji；Ito，Yusuke<400>1tcatcagcta tcatcaaagc gaaggaaaga aagaaaaata aaaggaaaag aactggctgg 60aaattagaga agccccggac gactcgatct gggggtggca aattaatcag tgtgatcaac 120agggataact tatcccgtcc gaccaaatcc accaaccaaa ccaagacccg atttgttagg 180ctgtgaaaga cggatcagtg ggaccctgat ctacggaccc catatgtcac cgtccaggtc 240tctggatctc tcccgtcgtc ctaatcagac accgcgcgcg cggtgccgtc gctctcgagc 300cgtgtcccgc tcccaactcg tcacaaaagc gatcacagac tcttccttcc tctgctggga 360gagaagaaaa attggccgcg atgatgccga taaagaggaa aaagggatga gaatccgatg 420gaaaaaaact gatgttaatc tatcgctact gctgcgcact aagacgaatc gtatccgaac 480aagaaacgct tacgttactg ttcctaaatg gatcgctccg ctcatcactt aaccaaaaat 540cgattaggaa attgacggac agcgacgccc gaagccaagt gtctcgtcgc gtaggcgtcg 600aggcctcgaa gcagagggag cggagaggcg gacgcgccgc ccacgcctcc tctccctcgg 660tgacacggcc gtctggctcc acatggcgcc gacctctccc gatgcgtcca cccgtcccga 720ggcaccgcca cgtcggaacc agccggccgc cccacgcgat tgccgacacg cgtcgcggcg 780ccactggctc acccgctgcc tgcctctgcc tgccccccat ctcgtcgcca tttcccgccc 840acgcttcttg tcctcgcgtc gcctacgcgt acgtacgata caaacgccgc acctttcgat 900
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<223>人工序列描述引物<400>3cacgaagctt tcatcagcta ttcatcaa 28
<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4ccggatcctc gatcgatgga ttcagcta 28<210>5<211>1608<212>DNA<213>水稻<400>5caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440
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<221>CDS<222>(69)..(782)<400>6CACACTCGAG CAGAGCAAAT ACAGTTCAGG AATCAGGAGC AAGCAGAAAC ACACACACAA 60ATCCGAAG ATG TGC GGG ATC AAG CAG GAG ATG AGC GGC GAG TCG TCG GGG 110Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly1 5 10TCG CCG TGC AGC TCG GCG TCG GCG GAG CGG CAG CAC CAG ACG GTG TGG 158Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp15 20 25 30ACG GCG CCG CCG AAG AGG CCG GCG GGG CGG ACC AAG TTC AGG GAG ACG 206Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr35 40 45AGG CAC CCG GTG TTC CGC GGC GTG CGG CGG AGG GGC AAT GCC GGG AGG 254Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg50 55 60TGG GTG TGC GAG GTG CGG GTG CCC GGG CGG CGC GGC TGC AGG CTC TGG 302Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp65 70 75CTC GGC ACG TTC GAC ACC GCC GAG GGC GCG GCG CGC GCG CAC GAC GCC 350Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala80 85 90GCC ATG CTC GCC ATC AAC GCC GGC GGC GGC GGC GGC GGG GGA GCA TGC 398Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys95 100 105 110
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<220>
<221>CDS<222>(167)..(1171)<400>7gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt175Met Ala Val1tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg5 10 15aaa agg aaa tct aga agt aga ggt gac ggt act act gtg gct gag aga 271Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg20 25 30 35tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr40 45 50aag aag agg aaa gta cct gcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys55 60 65ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg70 75 80caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg85 90 95ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala100 105 110 115tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg120 125 130ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser135 140 145cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys150 155 160aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu165 170 175ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751
Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val180 185 190 195aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt 799Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser200 205 210gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa 847Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu215 220 225acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt 895Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly230 235 240tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt 943Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe245 250 255gat gtc gat gag ctt cta cgt gac cta aat ggc gac gat gtg ttt gca 991Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp Val Phe Ala260 265 270 275ggc tta aat cag gac cgg tac ccg ggg aac agt gtt gcc aac ggt tca 1039Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala Asn Gly Ser280 285 290tac agg ccc gag agt caa caa agt ggt ttt gat ccg cta caa agc ctc 1087Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu Gln Ser Leu295 300 305aac tac gga ata cct ccg ttt cag ctc gag gga aag gat ggt aat gga 1135Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp Gly Asn Gly310 315 320ttc ttc gac gac ttg agt tac ttg gat ctg gag aac taaacaaaac 1181Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn325 330 335aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca caacgactgt tgattctcta 1241tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt ttcttgttat aaaggtgaac 1301tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa ctatagtttg ttagtctgct 1361tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa caacaggaat gaataataca 1421cacttgtaaa aaaaaa<210>8<211>353<212>DNA<213>水稻<400>8gctagcagag tagcaatcca ttccgatcca tcaaatttct cttgagaccg tagagagaga 60gagaggcgcc aaccatggcc ggcatcatcc acaagatcga ggagaagctc cacatgggcg 120
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<223>人工序列描述引物<400>11ccattggatc cagccgtgga agtccaac28<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>12gccggggatc cttggcgcct ctctctct28
權(quán)利要求
1.一種水稻來源的啟動子，由下列DNA(a)或(b)組成(a)由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，與能與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交并表達脅迫-誘導(dǎo)的啟動子活性的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的啟動子，其中所述脅迫是脫水脅迫、低溫脅迫或鹽脅迫。
3.一種包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中含有用于增強脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因，以致在根據(jù)權(quán)利要求1或2的啟動子控制下其具有功能性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中所述用于增強脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因選自一種脯氨酸合成的關(guān)鍵酶P5CS基因，用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因，擬南芥來源的轉(zhuǎn)錄因子DREB基因，水稻來源的轉(zhuǎn)錄因子OsDREB基因和，一種參與ABA合成的酶NCED基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中所述用于增強脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因是水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因。
7.一種轉(zhuǎn)基因植物，其通過將根據(jù)權(quán)利要求3至6任一的載體導(dǎo)入宿主中而獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述宿主是一種植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述宿主是一種單子葉植物。
10.一種通過將權(quán)利要求1或2的啟動子導(dǎo)入植物中以增強植物脅迫耐受性的方法。
全文摘要
該發(fā)明提供了一種在象水稻這樣的單子葉植物中能有效發(fā)揮作用的脅迫－誘導(dǎo)的啟動子，以及使用該啟動子的環(huán)境脅迫耐受植物。該啟動子來自水稻并由下列DNA(a)或(b)組成(a)由如SEQ ID NO1或10所示的核苷酸序列組成的DNA；或(b)在嚴謹條件下，能與由SEQ IDNO1或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA互補的核苷酸序列組成的DNA雜交并表達脅迫－誘導(dǎo)的啟動子活性的DNA。上述環(huán)境脅迫耐受植物具有導(dǎo)入其中的上述啟動子。
文檔編號A01H5/00GK1795267SQ20048001431
公開日2006年6月28日 申請日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者筱崎和子, 桂幸次, 伊藤裕介 申請人:獨立行政法人國際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心, 獨立行政法人農(nóng)業(yè)·生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究機構(gòu)