專利名稱：黃花杓蘭種子制備與快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及植物黃花杓蘭(Cypripedium flavum)種子的制備與快速篩選方法。
背景技術(shù)：
杓蘭屬(Cypripedium)是蘭科重要的觀賞屬之一，杓蘭花色艷麗，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋狀，故有“拖鞋蘭”之稱，具有很高的觀賞和開發(fā)價值。黃花杓蘭(C.flavum)是中國特有的蘭科花卉植物，是中國杓蘭屬花卉植物中唯一的黃花種類。黃花杓蘭具有淡黃或金黃色的花朵，唇瓣內(nèi)有紫色小斑點，花大，有幽香，觀賞價值極高，深得歐美國家蘭花愛好者的喜愛。在國際市場上，杓蘭的一年生幼苗售價約5-30美元，成年開花植株為25-300美元。美麗奇特的觀賞性狀及不菲的市場價值導致了無節(jié)制的濫采濫挖，加上自身繁殖和生長緩慢的生理特性，杓蘭屬植物野生資源已近枯竭。近年來歐美國家通過種子萌發(fā)技術(shù)獲得一些杓蘭種類的實生苗，但生產(chǎn)主體多為業(yè)余愛好者，栽培和繁育的種苗有限，未形成規(guī)?；敝场＿@和優(yōu)質(zhì)種子制備技術(shù)、種子無菌萌發(fā)率低，萌發(fā)整齊度差等技術(shù)瓶頸尚未解決有直接的關(guān)系。目前杓蘭幼苗繁育在國際上常采用野生植株的果實作為種子來源，由于受生長環(huán)境因素如傳粉媒介、病蟲害或植株生理狀態(tài)等的影響以及常常遭受人為采集、放牧破環(huán)因素的影響，杓蘭結(jié)實率及種子活力穩(wěn)定性很差，有時可能結(jié)實率高，種子活力也好，但大多數(shù)時候是顆粒無收，根本不能保障獲得規(guī)?；a(chǎn)所需的高質(zhì)量種子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，針對種子制備的關(guān)鍵問題，提供了符合黃花杓蘭幼苗規(guī)?；旆毙枰膬?yōu)質(zhì)種子制備和篩選方法。該方法可獲得生產(chǎn)幼苗所需的高質(zhì)量的種子，同時對生產(chǎn)所用的種子質(zhì)量進行早期檢測和篩選，避免盲目生產(chǎn)造成的資源浪費，大大節(jié)約生產(chǎn)成本，具有重要的實際意義。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案黃花杓蘭種子制備與快速篩選方法，選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢好的黃花杓蘭開花植株，花開后第2-3天進行人工異花授粉，授粉120天后采收果實取出種子，浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗溫育72小時，選取胚活力70％以上的種子作為幼苗快繁的材料。
上述方法TTC溶液的配制采用先稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水中，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻，避光保存。
上述方法當種子取出后，置于濾紙中間，折疊，將濾紙浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗溫育72小時，然后將濾紙取出用清水沖洗約1分鐘。
所說的種子胚活力＝胚紅數(shù)/種子有胚率×100％。
具體地，本發(fā)明的方法先選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢好的黃花杓蘭開花植株，花開后第2-3天進行人工異花授粉，授粉120天后采收果實取出種子，置于濾紙中間，折疊，將濾紙浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水中，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻即可，種子在25℃黑暗溫育72小時后，將濾紙取出用清水沖洗約1分鐘，選取胚活力70％以上的種子作為幼苗快繁的材料，種子胚活力的計算方法是胚紅數(shù)/種子有胚率×100％。


圖1為胚活力和萌發(fā)率的相關(guān)性示意圖。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例1先選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢好的黃花杓蘭開花植株，花開后第2-3天進行人工異花授粉，授粉120天后采收果實取出種子，置于濾紙中間，折疊，將濾紙浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水中，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻即可，種子在25℃黑暗溫育72小時后，將濾紙取出用清水沖洗約1分鐘，選取胚活力70％以上的種子作為幼苗快繁的材料，種子胚活力的計算方法是胚紅數(shù)/種子有胚率×100％。具體地，采用下述步驟和方法
1、材料與方法1.1優(yōu)質(zhì)種子制備選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢良好的黃花杓蘭(Cypripedium flavum)開花植株，于開花后第2天分別進行人工自花授粉和人工異花授粉。授粉120天后采收果實(果實已完全成熟)，以蒴果體積、單果種子數(shù)量、種子有胚率、種子活力(TTC法)和進行無菌萌發(fā)獲得的種子萌發(fā)率等衡量種子質(zhì)量的優(yōu)劣，并以此確定培育優(yōu)質(zhì)種子最佳的授粉方式。
授粉時間采用異花授粉方式于花開前3天，花開后1-3天，花開后4-6天，花開后7-9天，花開10天后五個時段進行人工授粉。授粉120天后采收果實(果實已完全成熟)，以蒴果體積、單果種子數(shù)量、種子有胚率、種子活力(TTC法)和進行無菌萌發(fā)獲得的種子萌發(fā)率等等衡量種子質(zhì)量的優(yōu)劣，并以此確定培育優(yōu)質(zhì)種子最佳的授粉時間。
1.2優(yōu)質(zhì)種子快速篩選(TTC快速篩選法)步驟一TTC溶液的配制稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水中，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻，避光保存?zhèn)溆谩?br> 步驟二種子胚活力測定在需要測量種子活力的黃花杓蘭蒴果中取出300粒左右的種子置于干凈濾紙(3cm×3cm)中間，折疊成1cm2的方形紙塊。將濾紙浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗溫育72小時。將濾紙取出置于自來水中沖洗1分鐘，展開濾紙后在解剖鏡下統(tǒng)計種子胚變紅情況種子胚活力＝胚紅數(shù)/種子有胚率×100％步驟三胚活力測定方法的驗證在經(jīng)TTC法檢測種子活力的黃花杓蘭蒴果中隨機選取25個，取出部分種子無菌播種于培養(yǎng)基表面(方法另文報道)，經(jīng)3個月的培養(yǎng)后統(tǒng)計種子萌發(fā)率，種子萌發(fā)率＝萌發(fā)數(shù)/種子有胚率×100％，其結(jié)果和TTC法檢測的種子活力進行對比。以此驗證TTC快速篩選法的可行性。
2、結(jié)果與討論2.1授粉方式對黃花杓蘭種子質(zhì)量的影響在黃花杓蘭花開后第2天分別進行人工自花授粉和人工異花授粉，并將結(jié)果和自然結(jié)實的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行對比。實驗結(jié)果表明，人工授粉結(jié)實率達100％，顯著高于自然授粉率(2.0％)；自花授粉方式在結(jié)實率、蒴果體積、單果種子數(shù)和有胚率等項指標上與異花授粉方式所得結(jié)果基本相同，但種子胚活力則遠低于異花授粉方式；自然結(jié)實的結(jié)實率和種子活力等指標最低(見表一)。種子胚活力和萌發(fā)率是種子質(zhì)量中很重要的指標，因此，人工異花授粉方式優(yōu)于人工自花授粉方式。
表一授粉方式對黃花杓蘭種子質(zhì)量的影響

表二授粉時間對黃花杓蘭種子質(zhì)量的影響

2.2授粉時間對黃花杓蘭種子質(zhì)量的影響黃花杓蘭花期約15天。分別在花開前3天，花開后1-3天，花開后4-6天，花開后7-9天，花開10天后五個時段進行人工異花授粉，花粉植株和授粉植株的花期同步。實驗結(jié)果表明，花開后1-3天授粉方式在結(jié)實率、蒴果體積、單果種子數(shù)、有胚率、種子胚活力和萌發(fā)率等各項指標上均為優(yōu)；花開前植株不具備授粉能力；花開后10天植株授粉能力銳減(見表二)。實際生產(chǎn)中應(yīng)在花開后1-3天內(nèi)進行人工異花授粉。
2.3 TTC法測得黃花杓蘭種子胚活力和種子萌發(fā)率具正相關(guān)性隨機采用25個黃花杓蘭蒴果的種子分別進行TTC法種子胚活力測試和種子無菌萌發(fā)。結(jié)果表明采用TTC方法測得的種子胚活力和種子萌發(fā)率具有正相關(guān)關(guān)系，TTC法測量活力高的種子，在無菌萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)率也高，反之亦然(見圖1)。測量得到的胚活力數(shù)值略高于種子萌發(fā)率，表明具有活力但活力弱的種子不一定都能萌發(fā)，但這并不防礙采用TTC活力測試法來衡量種子萌發(fā)率的可行性。該方法的采用可以對生產(chǎn)所用的黃花杓蘭種子質(zhì)量進行早期檢測和篩選，避免不必要的生產(chǎn)造成的資源浪費，大大節(jié)約生產(chǎn)成本。
在黃花杓蘭種子無菌規(guī)?；庇酌绲纳a(chǎn)中，獲得具有穩(wěn)定數(shù)量和質(zhì)量的種子是生產(chǎn)成功至關(guān)重要的前提要求。上述的實驗結(jié)果表明，本研究結(jié)果能滿足此生產(chǎn)要求。綜上，可看出本發(fā)明的優(yōu)益效果在于1、采用本發(fā)明所述的授粉方式和授粉時間，大大提高植株結(jié)實率，可達100％，能保證獲得足夠的生產(chǎn)幼苗所需高質(zhì)量的種子?？朔瞬捎米匀唤Y(jié)實種子量少，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)需要的缺點。
2、采用本發(fā)明的種子活性篩選法對生產(chǎn)所用的種子質(zhì)量進行早期檢測和篩選，避免盲目生產(chǎn)造成的資源浪費，大大節(jié)約生產(chǎn)成本。在生產(chǎn)當中，該技術(shù)的應(yīng)用將產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益，具有重要的實際意義。
3、本研究采用的方法具有易于操作、快捷靈敏的特點，使黃花杓蘭幼苗規(guī)模化快繁得以實現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.黃花杓蘭種子制備與快速篩選方法，其特征在于選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢好的黃花杓蘭開花植株，花開后第2-3天進行人工異花授粉，授粉120天后采收果實取出種子，浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗溫育72小時，選取胚活力70％以上的種子作為幼苗快繁的材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于TTC溶液的配制采用先稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻，避光保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于種子取出后，置于濾紙中間，折疊，將濾紙浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗溫育72小時，然后將濾紙取出用清水沖洗約1分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于種子胚活力＝胚紅數(shù)/種子有胚率×100％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于選擇3年內(nèi)未結(jié)實，植株粗壯，生長態(tài)勢好的黃花杓蘭開花植株，花開后第2-3天進行人工異花授粉，授粉120天后采收果實取出種子，置于濾紙中間，折疊，將濾紙浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先稱量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常溫下溶于蒸餾水中，同時加入0.5ml的吐溫-20，定容為100ml，配制成1％的TTC溶液，搖勻即可，種子在25℃黑暗溫育72小時后，將濾紙取出用清水沖洗約1分鐘，選取胚活力70％以上的種子作為幼苗快繁的材料，種子胚活力＝胚紅數(shù)/種子有胚率×100％。
全文摘要
黃花杓蘭(Cypripedium flavum)是中國特有的蘭科花卉植物，具有極高的觀賞和開發(fā)價值。黃花杓蘭的種子細小，數(shù)量巨大，一個蒴果的種子量可達4萬粒，利用種子進行無菌萌發(fā)是目前杓蘭幼苗快繁的主要途徑。種子的質(zhì)量是杓蘭幼苗規(guī)?；旆背晒Φ谋Ｕ希捎谧匀粻顟B(tài)下黃花杓蘭自然結(jié)實率低(0.1－3％)，受植株生理狀態(tài)和環(huán)境變化的影響，自然結(jié)實的種子質(zhì)量難以穩(wěn)定，不能保證種子無菌萌發(fā)的需要。本發(fā)明針對這一必須解決的技術(shù)問題，提供了一種黃花杓蘭優(yōu)質(zhì)種子培育與快速篩選方法。該方法為實現(xiàn)工廠化快繁而設(shè)計，具有穩(wěn)定獲得充足生產(chǎn)所用，質(zhì)量優(yōu)良的種子，種子質(zhì)量檢測快速，節(jié)約生產(chǎn)成本的優(yōu)點。
文檔編號A01H5/10GK1593107SQ200410040180
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者胡虹, 黃家林, 嚴寧 申請人:中國科學院昆明植物研究所