專利名稱：一種防治惡性雜草水花生的菌株、菌劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種防治惡性雜草水花生的菌株、菌劑及應(yīng)用，屬于生物防治領(lǐng)域。專用于水花生的安全防除，所得到的生物藥劑為一種新的高效除草劑。在農(nóng)藥污染嚴重的今天提供了一種很好的化學農(nóng)藥替代品。
背景技術(shù)：
水花生，學名空心蓮子草(Alternantliera philoxeroidesGriseb)，又名喜旱蓮子草，是莧科(Amaranthaecae)蓮子草屬(Alternamthera)多年生宿根草本植物。水花生于20世紀30年代末引種至我國，由于水花生生命力強，適應(yīng)于水生和陸生環(huán)境，生長繁殖迅速，而且有人為的引種擴散，因此水花生在我國的的滋生蔓延速度很快，目前在我國以長江中下游為主的廣大地區(qū)的分布非常廣泛，成為該地區(qū)的主要惡性雜草，也是外來危險生物對我國入侵的重要代表性生物。
水花生的營養(yǎng)生長非常旺盛，根系發(fā)達，地上部分繁茂，主要在農(nóng)田(包括水田和旱田)、空地、魚塘、溝渠、河道等環(huán)境中生長為害。水花生在農(nóng)田中生長與作物爭光、水、肥以及空間，造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降；在田埂和田間水花生成片生長還會影響農(nóng)事操作；在魚塘等水生環(huán)境中生長繁殖會影響沉水植物的光合作用，導致水中溶解氧含量降低；腐爛后污染水質(zhì)，水體中生物耗氧量升高，使魚蝦等水產(chǎn)生物窒息；腐爛后水中有機質(zhì)含量的增加會促使微生物的滋生，對水產(chǎn)生物產(chǎn)生毒害；水花生在魚塘中的層積還會影響水產(chǎn)捕撈；在河道和溝渠中的生長會堵塞水道、限制水流、增加沉積，對水上運輸和農(nóng)田灌溉造成極為不利影響；水花生在路邊、公用綠地、居民區(qū)等地生長蔓延，嚴重影響了環(huán)境的美觀和衛(wèi)生。因此分布廣泛，危害嚴重的水花生已成為當前亟待研究和解決的問題。
水花生的根系非常發(fā)達，根系屬不定根系，不定根可進一步發(fā)育為肉質(zhì)貯藏性根，即宿根。根直徑1cm左右。莖長可達1m以上，莖桿呈蛛網(wǎng)狀縱橫交錯。莖上生節(jié)，節(jié)能生根。水花生的花一般不能結(jié)實，而靠營養(yǎng)器官進行無性繁殖，夏季將1-2節(jié)無根無葉的莖桿泡入水中，3-4天后即可產(chǎn)生側(cè)枝。春季溫度適宜時，旱地肉質(zhì)貯藏根上可生長10余個不定芽。水花生抗逆性強。當冬季溫度降至0℃時，其水面或地上部分已凍死，但水中和地下的根莖仍保持活力，春季溫度回升至10℃時，越冬的水下或地下根莖即可萌發(fā)；在貧瘠的土壤中經(jīng)30天35℃以上的高溫和伏旱能照常生長；機械翻耕后莖的切段在土中能繼續(xù)生長繁殖；莖段曝曬1-2天仍能存活；未經(jīng)腐熟或未被家畜消化的莖段進入農(nóng)田后會造成再次侵染。
水花生的環(huán)境適應(yīng)能力很強，適應(yīng)于水生和陸生的環(huán)境。旱生條件下葉片較水生條件下葉片的長寬度略小，厚度略厚，葉色較深，葉片與莖之間的夾角較小，葉片較挺立。旱生條件下水花生葉片角質(zhì)層增厚，氣孔下陷，柵欄組織分層且細胞排列緊密，水生條件下葉片角質(zhì)層薄，柵欄組織僅有一層細胞且細胞較大，排列疏松。水花生靠地下(水下)根莖越冬，利用營養(yǎng)體進行無性繁殖，并且具有與環(huán)境條件相適應(yīng)的生長發(fā)育特點和形態(tài)結(jié)構(gòu)，這些是水花生能迅速生長蔓延的主要原因，同時也為水花生的防除增加了難度。
由于水花生的嚴重危害，各國的科學家對水花生的防除進行了大量研究。目前的防除方法主要可以分成物理除草、化學除草和生物防治三種方法。物理方法由于費時費力，成本太高，效果不理想；60年代后，美國、澳大利亞等許多國家一直在探索水花生的化學防除技術(shù)，篩選出適合于不同環(huán)境、效果好、對目標作物安全的除草劑，如草甘瞵、敵草腈、百壟通、甲黃隆、施它隆等。但是目前的化學藥劑只在短時間內(nèi)對地上部分有效，無法除根，而且大量除草劑的使用對環(huán)境的污染非常嚴重，導致很多的經(jīng)濟和社會問題。生物防治的出現(xiàn)給人們提供了新的希望。目前的生物防治包括采用水花生的天敵昆蟲和病原菌進行防除。迄今為止，主要用于水花生防除的天敵昆蟲是曲紋葉甲，但是該昆蟲只對地上部分有一定的效果，而且在我國廣大地區(qū)不能越冬，因此效果非常有限；應(yīng)用水花生的病原菌為水花生的生物防治提供了一個非常有潛力的防除途徑。Barreto(1999)首次對巴西5個洲應(yīng)用的兩種新的水花生致病真菌蓮子草假隔鏈格孢(Nimbya alternantherae)和蓮子草尾孢菌(Cercospora alternantherae)進行報道，以巴西和澳大利亞兩種生物型的水花生作為防治目標，結(jié)果表明蓮子草假隔鏈格孢表現(xiàn)出較好的除草效果，是一種有潛力的生防真菌；向梅梅等分離到對水花生有抑制作用的蓮子草假隔鏈格孢(Nimbya alternantherae)；萬佐璽等人發(fā)現(xiàn)鏈隔孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)的毒素對水花生有很強的致病作用。但是由于病原菌對水花生的防治效果受環(huán)境、劑型以及病原本身寄主范圍等因素的影響，目前還沒有由于水花生生物防治的成熟的商品化產(chǎn)品。篩選寄生?；詮?、致病力強、耐儲藏運輸、對環(huán)境適應(yīng)力強的水花生病原菌，對控制惡性雜草水花生的危害具有重要的意義，也具有極大的市場前景。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是提供一種防治惡性雜草水花生的菌株、菌劑及應(yīng)用，找到一種對水花生有較好致病及致死能力的生物藥劑，對農(nóng)田環(huán)境惡性雜草水花生防除效果達到95％以上。可以減少化學農(nóng)藥對環(huán)境的污染。
技術(shù)方案一種防治惡性雜草水花生的菌株，其特征在于菌株WNJ01，屬于一種鐮刀菌，F(xiàn)usarium spp.，病原菌無小型分生孢子，大型分生孢子3-5分隔，孢子大小為43.2×5.16(μm)，末端圓或尖，具有明顯的足胞；在PDA/PSA上菌落粉紅色，生長速率為0.475cm/d；25℃、PH值為11的PSA培養(yǎng)基為其最適的生長條件。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏日期2003/4/18，保藏號CGMCC No.0922；該菌株寄生?；詮姟h(huán)境安全、對水花生地上地下部分都有較好防除效果。
生防菌劑的制備將分離的鐮刀菌菌株WNJ01轉(zhuǎn)移到PDA平板上，在25℃、黑暗中培養(yǎng)5天后，沿菌落邊緣切取1×1mm菌絲塊20塊，轉(zhuǎn)移到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、黑暗中振蕩(80rpm)培養(yǎng)10天后，測定培養(yǎng)液中分生孢子的濃度，將孢子濃度調(diào)整到107個孢子/ml，與室溫下保存?zhèn)溆?。上述防治惡性雜草水花生生防菌劑的應(yīng)用將菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％(v/v)吐溫80，在傍晚濕度比較大時，將菌液按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上。
有益效果本發(fā)明所提供的一種防治惡性雜草水花生的菌株、菌劑及其用法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和積極效果1、本發(fā)明中分離得到的鐮刀菌菌株具有寄生專化性強、環(huán)境安全、對水花生地上地下部分都有較好防除效果的特點。
2、使用本發(fā)明中分離得到的鐮刀菌為基礎(chǔ)制備的水花生真菌除草劑對水花生的防治，約3-10天后，水花生植株地上部分完全腐爛，地下部分也腐爛，對農(nóng)田環(huán)境惡性雜草水花生防除效果達到95％以上。
目前對惡性雜草水花生的防治主要方法是化學除草劑化學農(nóng)藥使它隆、芐黃隆、甲黃隆等；物理防除主要采用人工打撈的方法；以蟲治草利用天敵昆蟲曲紋葉甲；以上方法中化學除草有大量的農(nóng)藥殘留，對生態(tài)環(huán)境污染嚴重，而且只能防除水花生的地上部分，而水花生防除中最大的問題就是地下部分生長量大，對環(huán)境污染嚴重；物理防除需要大量的人力和物理，效率很低，而且也不能除掉地下部分；用于以蟲治草的曲紋葉甲也只能取食水花生的葉片，而且在我國廣大地區(qū)，該昆蟲無法越冬，并沒有應(yīng)用價值；而本發(fā)明中分離得到的鐮刀菌為基礎(chǔ)制備的水花生真菌除草劑對水花生的防治具有速度快、高度?；?、環(huán)境安全、無污染，而且可以殺死水花生危害最嚴重的地下部分。因此與現(xiàn)有的防治方法相比，本研究所獲得的除草劑具有更為廣闊的應(yīng)用前景。
3、對環(huán)境安全生防菌對不同植物具有生物安全性。試驗證明對其他植物材料分別為小麥、水稻、棉花、黃瓜、蘿卜、小青菜、馬唐、牛筋草均具有生物安全性。圖4。


圖1生防菌株的產(chǎn)孢細胞；圖2生防菌株的足細胞；圖3不同濃度生防菌對水花生的致死效果(施用3天后)圖4生防菌對不同植物的生物安全性，AII為水花生，其他植物材料分別為小麥、水稻、棉花、黃瓜、蘿卜、小青菜、馬唐、牛筋草具體實施方式
病原菌的分離從自然發(fā)病的水花生植株莖基部，采用70％(質(zhì)量比，下文同)酒精進行表面消毒后，從病健交界處切取2mm×2mm的水花生組織，置于PDA培養(yǎng)基上，在25℃、黑暗中培養(yǎng)2天后，從組織邊緣有真菌菌絲長出，按照柯赫氏法則，將純培養(yǎng)的菌絲體重新回接到健康的水花生上，確定該分離物就是水花生的病原菌。經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)鑒定，本研究所分離的病原菌為一種鐮刀菌，F(xiàn)usarium spp.，(圖1，圖2)命名為WNJ01，保藏地址中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京)CGMCC，保藏日期2003/4/18，保藏號CGMCC No.0922；該菌株寄生專化性強、環(huán)境安全、對水花生地上地下部分都有較好防除效果；生防菌劑的制備將分離的鐮刀菌菌株WNJ01轉(zhuǎn)移到PDA平板上，在25℃、黑暗中培養(yǎng)5天后，沿菌落邊緣切取1×1mm菌絲塊20塊，轉(zhuǎn)移到PDA液體培養(yǎng)基中，于25℃、黑暗中振蕩(80rpm)培養(yǎng)10天后，測定培養(yǎng)液中分生孢子的濃度，將孢子濃度調(diào)整到107個孢子/ml，與室溫下保存?zhèn)溆谩?br> 施用方法將以上菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％吐溫-80溶液，在傍晚濕度比較大時，將菌液按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上，約3天后，水花生植株地上部分完全腐爛，7天后，地下根部完全腐爛。圖3。
實施例1 陸地水花生的防除水花生的生存環(huán)境包括陸地和水域兩種環(huán)境。將本發(fā)明所提供的菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％吐溫80，在傍晚濕度比較大時，將菌液按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上，1天后，水花生嫩葉上出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，約5天后，水花生植株地上部分完全腐爛，10天后，地下根部完全腐爛，對農(nóng)田環(huán)境惡性雜草水花生防除效果達到95％以上。
實例2 水域河道中水花生的防除將本發(fā)明所提供的菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％吐溫80，在傍晚或清晨，按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上，1天后，水花生嫩葉上出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，約4天后，水花生植株地上部分完全腐爛，約10天后，水中根部完全腐爛，對農(nóng)田環(huán)境惡性雜草水花生防除效果達到95％以上。
實施例3 幼苗期水花生的防除由于成株期水花生的生物量非常大，防除后容易造成水體富營養(yǎng)化，因此在幼苗期進行防除對環(huán)境保護更有利。在春天，4月份，水花生出苗后30天內(nèi)，株高10cm左右的水花生植株，將本專利所提供的菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％吐溫80，在傍晚，按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上，1天后，水花生嫩葉上出現(xiàn)明顯的褐色壞死斑，約3天后，水花生植株地上部分完全腐爛，約7天后，地下部分也腐爛，對農(nóng)田環(huán)境惡性雜草水花生防除效果達到95％以上。
實施例4 環(huán)境安全性試驗將本生防菌分別接種不同農(nóng)作物和其他植物，5天后觀察該菌劑對不同植物的生物安全性，結(jié)果是，接種5天后，除了水花生被完全殺死外，其他植物材料小麥、水稻、棉花、黃瓜、蘿卜、小青菜、馬唐、牛筋草等均不被本菌劑侵染。圖4。
權(quán)利要求
1.一種防治惡性雜草水花生的菌株，其特征在于菌株WNJ01，屬于一種鐮刀菌，F(xiàn)usarium spp.，病原菌無小型分生孢子，大型分生孢子3-5分隔，孢子大小為43.2×5.16(μm)，末端圓或尖，具有明顯的足胞；在PDA/PSA上菌落粉紅色，生長速率為0.475cm/d；25℃、PH值為11的PSA培養(yǎng)基為其最適的生長條件。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏日期2003/4/18，保藏號CGMCC No.0922；該菌株寄生?；詮姟h(huán)境安全、對水花生地上地下部分都有較好防除效果。
2.用權(quán)利要求1所述一種防治惡性雜草水花生的菌株所制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述一種防治惡性雜草水花生的菌株所制備生防菌劑的應(yīng)用，將菌劑稀釋100倍，至105個孢子/ml，加入2％(v/v)吐溫80，在傍晚濕度比較大時，將菌液按照每10m2施用300mL的用量噴灑到水花生上。
全文摘要
本發(fā)明是一株水花生生物防治菌株、菌劑及應(yīng)用，它屬于生物防治領(lǐng)域，專用于水花生的安全高效防除。菌株WNJ01，屬于一種鐮刀菌，F(xiàn)usarium spp.，保藏號CGMCCNo.0922；該菌株具有寄生?；詮姟h(huán)境安全、對水花生地上地下部分都有較好防除效果的特點；菌劑對所測試的作物均不致病。在農(nóng)藥污染嚴重的今天是一種很好的替代品?？蛇M行噴霧使用，使用真菌孢子濃度為105個孢子/ml。使用5－10天殺死靶標惡性雜草水花生95％以上。圖1為不同濃度水花生生防菌劑對水花生的防除效果。
文檔編號A01N63/00GK1491563SQ0314613
公開日2004年4月28日 申請日期2003年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者王源超, 鄭小波, 鄭燕梅, 張正光 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學