專利名稱：真菌堿性絲氨酸蛋白酶及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶及其制備方法和應用，屬生物技術領域。
目前用于堿性蛋白酶的生產(chǎn)菌和研究對象主要是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)及短小芽孢桿菌(Bacillus pumillus)(夏麟培，陳丙瑜，1989)，如我國目前使用的2709地衣芽孢桿菌和1213地衣芽孢桿菌，嗜堿性短小芽孢桿菌(Alkaliphilic Bacillus pumillus)B45，并在不斷選育新菌株。
堿性蛋白酶主要應用于加酶洗滌劑，在制革、絲綢等工業(yè)也有廣泛的用途。一些科學家也進行了利用降解酶來進行防治線蟲病害的試驗，降解酶可望線蟲生防的熱點之一。
本發(fā)明從絲狀真菌粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)GR87菌株(已于2002年10月9日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.0807)中分離得到一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶，是首次報道該類真菌產(chǎn)堿性蛋白酶。我們將獲得的純蛋白酶命名為Lmz1，通過對其性質(zhì)的鑒定，確定其在洗滌行業(yè)和線蟲生物防治領域有應用前景。
本發(fā)明的真菌堿性絲氨酸蛋白酶，具有如下特性1.pH效應在45℃時將此蛋白與生色蛋白質(zhì)Azocoll溫育12小時，在pH5-13范圍內(nèi)均有活性；此蛋白酶在45℃時，與生色蛋白質(zhì)Azocoll反應10分鐘的最適pH為11-12。
2.溫度效應此蛋白酶在pH7.4(采用Tris-HCl緩沖液體系)時在75℃與生色蛋白質(zhì)Azocoll反應10分鐘仍具有最高活性的35％，最適溫度為55-60℃。
3.分子量通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得的分子量為31,000±2000Da。
4.等電點通過等電聚焦電泳測得的等電點為10.5。
5.抑制劑效應該堿性蛋白酶能被苯甲磺酰氟(PMSF)特異性抑制，說明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。
該酶的制備方法為真菌培養(yǎng)上清液的冰凍干燥濃縮，濃縮物溶于含2M硫酸銨的高鹽磷酸緩沖液(pH7)后上疏水相互作用層析柱，將洗脫峰超濾濃縮后上凝膠過濾層析柱進行脫鹽和精細純化，即可獲得純化的堿性蛋白酶。
此蛋白酶不僅能水解普通蛋白質(zhì)和肽，而且能降解線蟲體壁中的膠原蛋白。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，將粉紅粘帚霉Gliocladium roseum GR87菌株，經(jīng)試管培養(yǎng)后，接種于液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，然后過濾菌絲體獲得粗酶液。采用硫酸銨分級沉淀，沉淀溶于PBS(pH7.0)緩沖液，應用快速液相蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)對酶進行分離和純化。
將GR87菌絲體或孢子接種到試管培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)配方為CMA，22℃下培養(yǎng)3-4天，獲得試管種。將斜面試管種接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基(命名為LMZ)的配方為0.1％明膠，0.1％酵母浸出粉，0.9％蛋白胨，0.05％硫酸銨，0.001％FeSO4·7H2O，0.05％MgSO4·7H2O，1.129％Na2HPO4·12H2O，1.238％NaH2PO4·2H2O，蒸餾水定容至1升，pH為6.5，22℃下?lián)u床(轉速150rpm)培養(yǎng)時間8天，然后過濾菌絲體獲得粗酶液。采用硫酸銨分級沉淀，沉淀溶于PBS(pH7.0)緩沖液，應用快速液相蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)對酶進行分離和純化。
產(chǎn)生該真菌堿性蛋白酶的微生物之一的粘帚霉屬的微生物粉紅粘帚霉GR87具有以下的真菌學特性(1)形式粘帚霉(2)分生孢子梗有兩種，a，主分生孢子梗，輪狀分枝，長100-200um，瓶梗3-4輪，大小為17-30×3um，分生孢子頭狀分散；b，次分生孢子梗，部分在菌落中心形成，聚集成掃帚狀，瓶梗緊緊壓縮成4-7輪，大小為10-18×2-3um。
(3)分生孢子直立于氣生菌絲或浸沒菌絲上。橢圓形，無色，壁光滑，大小為10-12×3-4um，分生孢子粘著形成覆瓦狀的柱或不規(guī)則的粘層塊，上述兩種分生孢子梗上產(chǎn)生的分生孢子延長，稍不對稱，頂端偏斜，圓形，基部稍突出，無色，壁光滑，大小為5-7×3-4um。
(4)菌落形態(tài)特征在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(20％麥芽，20％瓊脂)上于20℃，生長10天其菌落直徑可達2.4-3.5cm，顆粒狀至氈狀，白色、粉紅色或橙紅色。
粉紅粘帚霉GR87菌株蛋白酶生產(chǎn)力改進的突變體可以作為產(chǎn)生本發(fā)明蛋白酶的真菌。制備這類突變體的方法，可以是常規(guī)的方法，例如利用紫外輻射或者誘變劑(如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG))對原始菌株進行人工誘導突變后，將培養(yǎng)物接種到液體沙氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4到6天后取上清液點入含有酪蛋白的蛋白酶檢測平板上，根據(jù)所產(chǎn)生的水解圈的大小，通過選擇大水解圈篩出具有更好生產(chǎn)力的突變體，而且可以通過在合適的宿主細胞中利用基因擴增改進生產(chǎn)力，用與合適的自我復制DNA偶聯(lián)的本發(fā)明蛋白酶的基因轉化所說的宿主細胞。
本發(fā)明的真菌堿性絲氨酸蛋白酶可應用于防治植物寄生線蟲的生防，也可作為洗滌劑和去污劑生產(chǎn)的添加用酶的應用。本發(fā)明產(chǎn)品具有酶活力高，酶學性質(zhì)特征優(yōu)越等優(yōu)點。
表1PH 345678910111213活性(％)0258 63 71 77 77 8390100 85實施例5堿性蛋白酶溫度及耐受性測定將40uL酶液加入500uLTris/HCl(pH7.4)緩沖液中，在不同溫度的水浴鍋里與2.5mg生色蛋白質(zhì)Azocoll保溫30分鐘，用蛋白/核酸定量儀測量520nm處的吸光度值以定量酶Lmz1在不同溫度下的酶活(以60℃條件下的活性為100％)，結果如表2?？梢钥闯?，該酶的適宜溫度為60℃，而且能耐較高溫度，在75℃時保溫30分鐘活性仍高于30％。
表2溫度(℃) 4 25374555606575活性(％) 1330809092100 9535實施例6抑制劑對酶活力的影響實驗為了研究抑制劑對酶Lmz1活力的影響，我們選擇了四種抑制劑PMSF(苯甲磺酰氟)、EDTA、SSI(枯草桿菌蛋白酶類抑制劑)、CI(膠原蛋白酶抑制劑)。將5uL的抑制劑和20uL酶Lmz1混合后與2.5mg生色蛋白質(zhì)Azocoll在45℃保溫30分鐘，然后用蛋白核酸定量儀測量520nm處的吸光度值以定量酶活，結果如表3?？梢钥闯觯撁富颈籔MSF完全抑制了，說明該酶為絲氨酸蛋白酶。
表3抑制劑 濃度活性沒有抑制劑 100EDTA 0.5M98PMSF 10mM0.8SSI10mM33CI 10uM39
權利要求
1.一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶，其特征在于該真菌堿性絲氨酸蛋白酶來源于真菌粉紅粘帚霉，其中1.1粉紅粘帚霉Gliocladium roseum GR87菌株已于2002年10月9日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.08071.2酶的pH11-12，溫度為55-60℃，分子量為31,000±2000Da，等電點為10.5，蛋白酶活力能被PMSF特異性抑制。
2.一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶的制備方法，按常規(guī)酶制備方法制備，其特征在于液體培養(yǎng)基的配方為0.1％明膠、0.1％酵母浸出粉、0.9％蛋白胨、0.05％硫酸銨、0.001％FeSO4·7H2O、0.05％MgSO4·7H2O、1.129％Na2HPO4·12H2O、1.238％NaH2PO4·2H2O、蒸餾水定容至1升，pH為6.5。
3.一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶的應用，其特征在于該真菌堿性絲氨酸蛋白酶可作為制備防治病原線蟲的生物制劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌堿性絲氨酸蛋白酶及其制備方法和應用，屬生物技術領域。該真菌堿性絲氨酸蛋白酶來源于微生物粉紅粘帚霉(Gliocladium roseum)GR8，該菌株已于2002年10月9日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.0807；粉紅粘帚霉GR87菌株通過液體發(fā)酵后提取純化堿性絲氨酸蛋白酶。該酶能降解線蟲體壁的蛋白質(zhì)，具有殺線蟲活性，可應用于植物寄生線蟲生物防治領域。也可作為洗滌劑和去污劑生產(chǎn)的添加用酶，應用于洗滌劑和去污劑的生產(chǎn)上。本發(fā)明產(chǎn)品具有酶活力高，對線蟲固定效果好，酶學性質(zhì)特征優(yōu)越等優(yōu)點。
文檔編號A01N63/00GK1456668SQ0311793
公開日2003年11月19日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權日2003年5月21日
發(fā)明者張克勤, 趙明蓮, 羅宏 申請人:云南大學