專利名稱：鑒定在不同鹽濃度中快速生長(zhǎng)的魚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能最佳生長(zhǎng)魚類的選擇。更具體講，本發(fā)明涉及能在不同鹽濃度的水中最佳生長(zhǎng)的魚類(特別是羅非魚)的選擇方法。最具體講，本發(fā)明涉及利用羅非魚催乳素基因中的多態(tài)性，根據(jù)基因型，選擇能在不同的咸水中最佳生長(zhǎng)的魚類并繁殖它們。
背景技術(shù)：
羅非魚是世界最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，包括天然生長(zhǎng)于非洲的各種魚種，通常是淡水魚種(羅非屬，Cichlidae科)。羅非魚類似于北美洲太陽魚，一種可長(zhǎng)至20磅(9分斤)的鰳。羅非魚種是普及性水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，因?yàn)樽鳛槭澄锼鼈円子陲曫B(yǎng)和收獲，它們生長(zhǎng)迅速，抗病，樂吃豐富的海藻和zooplankton。結(jié)果，早期埃及文明以來羅非魚已用于溫水水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)，現(xiàn)已引入許多淡水動(dòng)植物棲息地。此外在咸水中羅非魚也生長(zhǎng)良好。但各品系對(duì)咸水的耐受性有所不同。例如，世界某些地區(qū)優(yōu)選在海灣或稍咸的水中飼養(yǎng)羅非魚，但不是所有的個(gè)體魚在這些條件下都生長(zhǎng)良好。事實(shí)上，羅非魚對(duì)鹽的耐受和在不同鹽濃度水中的生長(zhǎng)反應(yīng)有很大的不同。因此，選擇或預(yù)測(cè)哪些個(gè)體在何種鹽濃度水中生長(zhǎng)最好一直是困難的并將會(huì)繼續(xù)有某種難度的。
已進(jìn)行多項(xiàng)研究致力于更快地養(yǎng)殖大羅非魚的方法。對(duì)于食用動(dòng)物，生產(chǎn)者們均尋找選擇和在較短時(shí)間培養(yǎng)較大動(dòng)物的方法。已不同程度地研究了生長(zhǎng)激素對(duì)大多數(shù)類型的食用魚，包括羅非魚的作用。此外進(jìn)行了水溫、鹽濃度和雜交實(shí)驗(yàn)。然而除試驗(yàn)和失誤外，目前的方法不能鑒定在不同鹽濃度水中生長(zhǎng)的羅非魚品系。
關(guān)於激素，知道最多的是關(guān)於肽激素在魚滲透壓調(diào)節(jié)中的作用。催乳素是GH/Prl基因家族的一個(gè)成員，其“淡水適應(yīng)能力”是通過降低鰓中的Na+-K+ATP酶活性而提高血漿滲透壓。
羅非魚腦垂體產(chǎn)生兩種催乳素，它們由不同的基因Prl1和Prl2所編碼，分子量(分別為24和20KD)和氨基酸殘基數(shù)(分別為188和177個(gè))均不相同。這兩種催乳素的氨基酸序列大約70％相同，看來具有不同的滲透壓調(diào)節(jié)作用和親體細(xì)胞作用。以往實(shí)驗(yàn)提示，當(dāng)此魚進(jìn)入更咸的環(huán)境中時(shí)，其催乳素mRNA和催乳素的血漿水平降低，催乳素Prl1的此種效應(yīng)尤其顯著。
羅非魚Prl1的啟動(dòng)子與大鼠催乳素的啟動(dòng)子共享有非規(guī)范(canonical)元件，二啟動(dòng)子在假定的垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子Pit-1結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)散布著兩個(gè)(CA)n微衛(wèi)星(重復(fù)性核苷酸短序列)(見


圖1)。Naylor and Clark(Naylor L.H.and ClarkeE.M.Nucleic Acids Res 18159501601，1990)證明大鼠中這些重復(fù)序列形成了體外左手Z-DNA并表達(dá)了Prl1。目前，對(duì)此魚個(gè)體中的微衛(wèi)星和非編碼微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變異通常認(rèn)為是中性的和缺乏功能意義，除非可能與某些遺傳性疾病有關(guān)，一般不作長(zhǎng)度研究，盡管教課書解釋說這種非編碼單序列以中性方式進(jìn)化。然而最近報(bào)道表明，事實(shí)上真核基因組中與高突變相關(guān)聯(lián)的二核苷酸微衛(wèi)星的豐富程度和位置提示此微衛(wèi)星在基因調(diào)節(jié)中可能有潛在和廣泛的作用。
因此，理想的是有一種簡(jiǎn)單的方法，可根據(jù)基因型的不同來監(jiān)定和選擇能在不同鹽濃度條件下最佳生長(zhǎng)的魚(如羅非魚)。這種方法將不需要對(duì)魚生長(zhǎng)環(huán)境/水產(chǎn)養(yǎng)殖條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也不需要給魚補(bǔ)充生長(zhǎng)刺激劑或其它人造物質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明總體上涉及提供一種可靠的方法來選擇和繁殖能在不同鹽濃度水中最佳生長(zhǎng)的魚。在本發(fā)明開發(fā)過程中，申請(qǐng)人簡(jiǎn)單地采用了天然系統(tǒng)來評(píng)價(jià)二核苷酸微衛(wèi)星變異、基因表達(dá)量的差異和對(duì)差別懸殊環(huán)境生理反應(yīng)之間的相關(guān)性。申請(qǐng)人的工作事實(shí)上提供了第一手體內(nèi)證據(jù)，證明魚個(gè)體中微衛(wèi)星長(zhǎng)度上的差異可能的確影響到基因表達(dá)，這種表達(dá)的差異伴有生理意義。
因此，本發(fā)明基本的實(shí)施方式優(yōu)選利用魚個(gè)體催乳素1啟動(dòng)子DNA的單序列重復(fù)伸展區(qū)(微衛(wèi)星)長(zhǎng)度的差異，來選擇能在各種鹽濃度條件下最佳生長(zhǎng)的魚個(gè)體。本發(fā)明包括在不同鹽濃度條件下最佳生長(zhǎng)的魚個(gè)體的選擇方法。根據(jù)催乳素基因型選擇魚以在特定的鹽水中培養(yǎng)繁殖。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，羅非魚催乳素1(prl1)啟動(dòng)子中的單序列重復(fù)多態(tài)性(微衛(wèi)星)與差異蛋白(differencesin)prl1的表達(dá)和在“受鹽攻擊的”或“受鹽影響的”魚類的生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)。此發(fā)現(xiàn)提示，此二核苷酸微衛(wèi)星可能代表了調(diào)節(jié)進(jìn)化的基因異變的一種尚未意識(shí)到的來源。與教課書解釋的非編碼微衛(wèi)星長(zhǎng)度的變異缺乏功能意義不一致。在本發(fā)明開發(fā)中，申請(qǐng)人據(jù)理認(rèn)為其它魚種中可能發(fā)現(xiàn)類似于大鼠中形成Z-DNA和表達(dá) 的微衛(wèi)星重復(fù)序列的調(diào)節(jié)作用(Naylor L.H.andClarke E.M.Nucleic Acids Res 181595-1601，1990)，即使一般認(rèn)為微衛(wèi)星長(zhǎng)度變異缺乏功能意義。本發(fā)明中申請(qǐng)人研究了羅非魚prl1啟動(dòng)子中微衛(wèi)星長(zhǎng)度是否可能有調(diào)節(jié)作用，微衛(wèi)星長(zhǎng)度的個(gè)體差異是否影響prl1體內(nèi)表達(dá)，是否可能引起已知的羅非魚鹽耐受性的差異和在不同濃度鹽水中生長(zhǎng)的差異？事實(shí)上，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)羅非魚催乳素啟動(dòng)子中DNA單序列重復(fù)伸展區(qū)長(zhǎng)度的差異的確引起了垂體產(chǎn)生的催乳素量的變化。催乳素表達(dá)的這種個(gè)體差異與魚個(gè)體在不同鹽濃度條件下的不同生長(zhǎng)速度相關(guān)聯(lián)。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)羅非魚微衛(wèi)星長(zhǎng)度的個(gè)體差異的確影響到prl1的體內(nèi)表達(dá)，并引起已知的鹽耐受性和生長(zhǎng)的差異。知道基因型/鹽濃度的最佳組合從而產(chǎn)生了本發(fā)明的方法，用此方法可以高得多的生長(zhǎng)速度和較少的培養(yǎng)時(shí)間獲得上市規(guī)格的羅非魚。本發(fā)明方法中，測(cè)定魚的prl1基因型，選出具有所需基因型的魚，在特定的鹽水中飼養(yǎng)此基因型的魚達(dá)到最佳生長(zhǎng)。一旦發(fā)現(xiàn)和選出所需基因型的魚，繁殖此魚，產(chǎn)生的后代都具有所需的基因型，它們能在飼養(yǎng)魚的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中最佳生長(zhǎng)。
因此本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單和花費(fèi)少的根據(jù)魚的催乳素基因型選擇能在各種鹽濃度水中快速生長(zhǎng)的魚個(gè)體的方法。
本發(fā)明還利用羅非魚催乳素基因中的多態(tài)性和小魚在不同鹽水(從淡水到完全海水)中生長(zhǎng)速度之間的遺傳連系，來選擇能在各種鹽濃度的水中繁殖和最佳生長(zhǎng)的魚個(gè)體。
本發(fā)明還提供實(shí)現(xiàn)所選魚個(gè)體在各自基因型最適鹽水中極大提高生長(zhǎng)速率的方法。事實(shí)上，根據(jù)魚個(gè)體的催乳素基因型和鹽水濃度組合的最佳選擇，如果將魚個(gè)體培養(yǎng)在與其基因型相適應(yīng)的鹽濃度水中，其生長(zhǎng)速率與在與該魚個(gè)體基因型不相容的鹽水中相比，有兩倍差異。
此外，本發(fā)明還提供選擇繁殖使其所有后代prl1基因型與給定的或選擇的(當(dāng)?shù)乜傻玫降?，或水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)選擇的、構(gòu)建的和維持的)鹽水環(huán)境最相容的魚的方法。
附圖簡(jiǎn)要說明
圖1(現(xiàn)有技術(shù))是羅非魚prl1啟動(dòng)子區(qū)域的示意圖。按照Swennen等.DNA and Cell Biol.11a；673-684，1992的方法鑒定推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(如Pit1)。
圖2a-f說明不同鹽水處理對(duì)prl1不同表達(dá)和魚重量的影響。
發(fā)明詳述本發(fā)明的最基本的實(shí)施方式，是一種可根據(jù)魚的催乳素基因型選擇魚(優(yōu)先揀選羅非魚)，然后在與其催乳素基因型相容的鹽水環(huán)境中飼養(yǎng)和繁殖以獲得最佳生長(zhǎng)的方法。
如人們注意到的那樣，過去的實(shí)驗(yàn)提出，當(dāng)羅非魚移到更咸的環(huán)境時(shí)催乳素1和2的mRNA水平及其催乳素血清水平均下降，催乳素1的這種效應(yīng)更顯著。因此，申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例都涉及了催乳素1，但本發(fā)明的方法并不僅僅限于催乳素1。
在本發(fā)明開發(fā)時(shí)，申請(qǐng)人起初注意力集中在最靠近prl1轉(zhuǎn)錄區(qū)起始處(約200堿基對(duì)bp)的微衛(wèi)星。申請(qǐng)人將莫桑比克的Oreochromis(咸水適應(yīng))雌魚與尼羅河Oreochromis(淡水適應(yīng))雄魚交配，后者攜帶有17個(gè)重復(fù)單元(CA31 vs CA14)不同的微衛(wèi)星等位基因。莫桑比克雌魚為長(zhǎng)等位基因(CA31)純合性，尼羅河雄魚為長(zhǎng)與短等位基因雜合性。見
圖1羅非魚prl1啟動(dòng)子區(qū)示意圖。此200bp的CAn是實(shí)施例中所述的區(qū)域。
選擇F個(gè)體魚飼養(yǎng)的F2代有三種基因型短等位基因純合子(“SS”)、長(zhǎng)等位基因純合子(“LL”)和雜合子(“SL”)。將同一批卵孵出的75條F2代魚在分開的200升罐中用三種鹽水(從淡水每一千升水NaCl為0ppt、16ppt到海水的32ppt)飼養(yǎng)。使二周齡魚苗適應(yīng)此環(huán)境3天并繼續(xù)飼養(yǎng)直到魚重平均15克(約6個(gè)月)。在同一罐鹽水中培養(yǎng)所有三種基因型的魚。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死所有的魚、區(qū)別性別和稱重。收集垂體，-20℃保存在RNAlater(Ambion)中直到提取RNA。采用Taqman探針(PE Biosystems)以b-肌動(dòng)蛋白作為參比品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)了F2代魚垂體(cDNA制品)中的Prl表達(dá)。用引物表達(dá)軟件(Prlmer Express，version 1.5 AppliedBiosystems)為各cDNA設(shè)計(jì)了引物和探針。探針的結(jié)合位點(diǎn)位于內(nèi)含子和外顯子邊界以防止擴(kuò)增基因組DNA。用熒光在3’端標(biāo)記探針。在GeneAmp 5700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行40輪PCR95℃15秒，55℃30秒，60℃1分鐘，監(jiān)測(cè)熒光。
測(cè)定熒光超過接近本底的閾值時(shí)臨界循環(huán)數(shù)。接照公式2B-r“‘CT-P’1CT測(cè)定Prl1相關(guān)基因的表達(dá)，其中CT是臨界循環(huán)數(shù)。實(shí)時(shí)PCR引物和探針序列如下正向引物，CCCATCAACGAACTGTTCGA(SEQ.ID.NO.1)；反向引物，GCATGATCACCCTGCCTATAGG(SEQ.ID.NO.2)；探針CTCACCCAGGAGCTGGACTCTCACTTCCCTC(SEQ.ID.NO.3)。
如Lee W.J.and Kocher T.D.羅非魚催乳素基因組微衛(wèi)星圖，Anim.Genet.2968-69，1998(其內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn))所述，或prl1cDNA中能鑒別親代等位基因的aSac H RFLP測(cè)定了F2代魚個(gè)體的基因型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道Sacll方法。用單向ANOVA和適當(dāng)?shù)膆oc后多項(xiàng)比較檢驗(yàn)評(píng)價(jià)基因型和鹽水環(huán)境之間的差異。
結(jié)果在所有鹽水環(huán)境中雌魚都比雄魚大，但prl1表達(dá)與雄魚沒有差別。一般，魚的平均體重隨鹽水濃度增加而增加(p＝8.4×10-6)。0ppt時(shí)各基因型表達(dá)有差異(p＝0.006)。SS魚表達(dá)prl1大約為SL魚的兩倍，為L(zhǎng)L魚的大約7倍。這些結(jié)果見圖2a。圖2a-f所示均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。
16ppt時(shí)各基因型魚之間表達(dá)有差異(p＝0.0005)，但與淡水中所見方式幾近相反，LL基因型魚表達(dá)prl1為SS和SL基因型魚的兩倍，如圖2b所示。然而，顯然，16ppt時(shí)LL型魚幾乎比其它基因型魚小兩倍，見圖2d所示；而在0ppt時(shí)SS魚最小，見圖2c。
然而，三種基因型魚在32ppt時(shí)無論prl1表達(dá)或魚重都沒有差異。32ppt時(shí)所有基因型的魚都生長(zhǎng)得很好，這些數(shù)據(jù)沒顯示，但可參見圖2f，32ppt時(shí)三種基因型魚的體重。
所有基因型都測(cè)到存在基因型與環(huán)境之間的顯著相互作用。對(duì)于所有基因型，prl1表達(dá)和魚重均隨鹽水處理而不同。SS的表達(dá)為p＝1.5×10-5，魚重為p＝0.03；SL的表達(dá)為p＝3.8×10-6，魚重為p＝0.008；LL的表達(dá)為p＝0.0008，魚重為p＝0.06。SS和SL基因型魚顯示0-16 ppt時(shí)prl1的表達(dá)顯著降低(10倍以上)。對(duì)于LL基因型魚此反應(yīng)幾乎看不出來，如圖2e所示。
各基因型魚在不同鹽水中生長(zhǎng)很好，如圖2f所示，各基因型魚平均增長(zhǎng)與不同鹽水中prl1的平均表達(dá)率呈反相關(guān)。
SS的r2＝0.957，SL的r2＝0.971，LL的r2＝0.530。然而，圖2e和2f顯示各基因型魚對(duì)外部鹽濃度的反應(yīng)中有不同的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。在天然魚群中這些“交叉相互作用”是遺傳變異在波動(dòng)的環(huán)境中適應(yīng)性維持的第一手證據(jù)。
換句話說，在某些基因型魚比其它基因型魚生長(zhǎng)更佳的條件下所有三種基因型魚都能在淡水至海水的鹽濃度條件下生長(zhǎng)。不同基因型魚可利用同一基因適應(yīng)不同的環(huán)境。這與申請(qǐng)人最初的研究相關(guān)，支持微衛(wèi)星中的非功能性變異可能的確具有非常重要的功能。
Alexander Rich等(Nordheim，A.and Rich，A；Proc Natl.Acad.Sci.USA801821-1825，1983)在大約20年前提出改變嘌呤和嘧啶的可能性，可能影響到基因的表達(dá).。此提議和申請(qǐng)人驚人的結(jié)果提示，不同長(zhǎng)度的重復(fù)序列可能誘導(dǎo)啟動(dòng)子構(gòu)型發(fā)生變化，使其結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的能力不同。有很好的證據(jù)表明，羅非魚在對(duì)血漿滲透壓的反應(yīng)中prl1的表達(dá)受到調(diào)節(jié)，可能通過與Pit-1的相互反應(yīng)。長(zhǎng)prl1微衛(wèi)星等位基因可能起著絕緣體作用，限制增強(qiáng)子(如淡水)和阻抑子(如海水)接近Pit-1位點(diǎn)。
因?yàn)镕2代魚不是分離的不同微衛(wèi)星等位基因的同基因系，不可能正式排除申請(qǐng)人提出的，等位基因存在與由某種原因引起的未測(cè)出的多態(tài)性的連鎖不平衡這種可能性。然而，SS和LL魚中1.2kb prl1啟動(dòng)子序列揭示在已知的調(diào)節(jié)元件結(jié)合位點(diǎn)中沒有一致的替代.事實(shí)上發(fā)現(xiàn)在起始密碼子上游800bp第二單一重復(fù)序列中此區(qū)域有其它序列差異。在此重復(fù)序列中SS基因型魚(GT14)具有比LL基因型魚(GT39)更短的等位基因。
綜合在一起，SS魚prl1啟動(dòng)子中的二個(gè)微衛(wèi)星長(zhǎng)度不到LL魚中相應(yīng)序列的一半。此結(jié)果表明陽性協(xié)方差的模式與其它有骨魚的資料相反。有可能這些單一重復(fù)序列彼此相互作用引起轉(zhuǎn)錄變化。
雖然其他人提出，微衛(wèi)星可能具有功能作用，申請(qǐng)人的結(jié)果提供了體內(nèi)的第一手證據(jù)，證明魚個(gè)體中微衛(wèi)星長(zhǎng)度的差異可能影響到基因表達(dá)，并且這種表達(dá)差異伴有生理意義。這些結(jié)果與教課書說的二核苷酸微衛(wèi)星變異缺乏功能意義相反。
Prl1表達(dá)和魚重量負(fù)相關(guān)較難解釋。Pit-1可激活不同垂體細(xì)胞系的催乳素和生長(zhǎng)激素，這些激素對(duì)魚的滲透壓調(diào)節(jié)具有拮抗作用。申請(qǐng)人的資料不能分辨生長(zhǎng)效應(yīng)是否通過滲透性調(diào)節(jié)差異或GH-表達(dá)促生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄性抑制所介導(dǎo)。
從進(jìn)化角度看，如上所述，申請(qǐng)人的結(jié)果與教課書說的二核苷酸微衛(wèi)星變異缺乏功能意義相反。這些基因座進(jìn)化很快，成為真核生物基因組的遍在性成分。優(yōu)先見于非編碼DNA中，二核苷酸重復(fù)序列提供了一種改變個(gè)體中基因產(chǎn)物的量而不改變蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列的工具。微衛(wèi)星與轉(zhuǎn)錄因子長(zhǎng)目錄和環(huán)境調(diào)節(jié)基因的相關(guān)性，提示微衛(wèi)星在基因表達(dá)的精細(xì)規(guī)模調(diào)節(jié)中具有潛在作用。雖然申請(qǐng)人沒能確定調(diào)節(jié)羅非魚鹽濃度耐受性的確切機(jī)制，但申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星變異和鹽水耐受之間的連系，這使申請(qǐng)人得以開發(fā)一種簡(jiǎn)單、花費(fèi)少的根據(jù)魚的催乳素基因型選擇能在不同鹽濃度水中快速生長(zhǎng)的魚個(gè)體的方法。
因此，本發(fā)明的方法包括確定或選擇培養(yǎng)魚的環(huán)境鹽濃度，測(cè)定要繁殖的至少一條雄魚和至少一條雌魚的催乳素(prl1)基因型，繁殖具有所需基因型的至少一條雄魚和至少一條雌魚以產(chǎn)生具有已知可預(yù)測(cè)基因型的魚后代，并在所選擇的鹽水環(huán)境中培養(yǎng)這些后代。
例如，如果淡水更易得到又便宜，可在淡水環(huán)境中飼養(yǎng)在淡水中生長(zhǎng)最好的魚(即SL和LL魚)是理想的，并選出來繁殖。如果當(dāng)?shù)毓┧俏⑾趟?8ppt-16ppt范圍)或更易得到，理想的基因型選擇是SS或SL魚。
按照Lee and kocher方法(1998)進(jìn)行魚的基因型分析，此文內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)中，或如上述通過prl1cDNA中的a Sac II RFLP進(jìn)行魚的基因型分析。簡(jiǎn)言之，在類似于人毛發(fā)DNA測(cè)定的方法中，從剪下的魚鰭(魚鰭的組織碎片)中抽提分型用的魚DNA。
用PCR擴(kuò)增催乳素1等位基因，在丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)。分型方法是該領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的?；蚍中驮囼?yàn)所用的引物和探針見以上SEQ.ID.NO1-3所述，也參見Lee and Kocher 1998。
一旦發(fā)現(xiàn)適合繁殖的魚，可將其用作貯備以建立均一的魚群，它們都具有所選擇的所需基因型，最適合在所選鹽水中最佳最快生長(zhǎng)。
此外，本方法提供了一種便宜的建立最適合特定生長(zhǎng)環(huán)境鹽水條件的魚群的方法，因?yàn)橐坏┌l(fā)現(xiàn)了適合繁殖的魚，建立各魚群要做的事只是進(jìn)行基因型測(cè)定步驟。一旦選出和飼養(yǎng)合適的魚，其所有的后代都具有所需的基因型，在所選的鹽水中將會(huì)旺盛繁殖。因?yàn)樗械聂~后代是已知的基因型，可選擇任何一條魚用于繁殖建立具有已知基因型的新魚群，而無須測(cè)定用于建立新繁殖貯備群的各條魚的基因型.。
雖然以上描述和實(shí)施例公開了本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，例如羅非魚和催乳素1，但本發(fā)明并不限于具體實(shí)施方案所述的范圍。上述實(shí)施方案意圖是簡(jiǎn)明扼要說明本發(fā)明的各個(gè)方面，及本發(fā)明范圍內(nèi)功能等同的方法和成分。例如，可采納本發(fā)明的方法用于其它種類的魚，特別是用于飼養(yǎng)其它食用魚如鮭魚或海鳊。本發(fā)明的方法和原理也可用于其它基因，如催乳素2。因此除了本文所示和所述外，可對(duì)本發(fā)明作某些改良和修飾，但這些不背離本發(fā)明以上所述和所附權(quán)利要求書的精神和范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員從以上所述和附圖中會(huì)明白這種精神和范圍。這類修改都落在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表<110>新罕布什爾州立大學(xué)(Universiry of New Hampshire)J.T.斯特利爾曼(Streelman，J Todd)<120>鑒定在不同鹽濃度中快速生長(zhǎng)的魚的方法<130>9815/62185<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>羅非魚<400>1gcatgatcac cctgcctata gg 22<210>2<211>21<212>DNA<213>羅非魚<400>2cccatacaac gaactgttcg a 21<210>3<211>31<212>DNA<213>羅非魚<400>3ctcacccagg agctggactc tcacttccct c 3權(quán)利要求
1.一種飼養(yǎng)和繁殖最佳大小的魚的方法，其特征在于，包括測(cè)定至少一條雄魚和至少一條雌魚的催乳素基因型；飼養(yǎng)各具有已知和選擇的催乳素基因型的至少一條雄魚和至少一條雌魚；產(chǎn)生具有所選基因型的后代魚；在鹽濃度與所述后代魚催乳素基因型相容的水中繁殖所述后代魚。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述催乳素基因是催乳素1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述魚是羅非魚。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述催乳素基因型選自短等位基因的純合子型、長(zhǎng)等位基因的純合子型和短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
5如權(quán)利要求4所述的方法，其中與淡水最相容的所述催乳素基因型是長(zhǎng)等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中與微咸水最相容的所述催乳素基因型是短等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一條雄魚和至少一條雌魚的所述催乳素基因型的測(cè)定方法是抽提各條魚的至少一個(gè)剪下的鰭的DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述DNA，并在丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)擴(kuò)增的DNA。
8.一種培養(yǎng)最佳大小魚的方法，其特征在于，包括測(cè)定至少一條魚的催乳素基因型；將所述至少一條魚的所述催乳素基因型與鹽水濃度相匹配，此鹽水濃度與所述催乳素基因型的至少一條魚的最佳生長(zhǎng)相容；并在所述相容性鹽水中培養(yǎng)所述至少一條魚。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述催乳素基因是催乳素1。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述魚是羅非魚。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述催乳素基因選項(xiàng)自短等位基因的純合子型、長(zhǎng)等位基因的純合子型和短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中與淡水最相容的所述催乳素基因型是長(zhǎng)等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中與微咸水最相容的所述催乳素基因型是短等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述至少一條魚的所述催乳素基因型的測(cè)定方法是抽提所述至少一條魚的至少一個(gè)剪下的鰭的DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述DNA，并在丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)擴(kuò)增的DNA。
15.一種確定魚的最佳鹽濃度生長(zhǎng)條件的方法，其特征在于，包括測(cè)定至少一條魚的催乳素基因型。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述催乳素基因是催乳素1。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述魚是羅非魚。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述催乳素基因型選自短等位基因的純合子型、長(zhǎng)等位基因的純合子型和短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中與淡水最相容的所述催乳素基因型是長(zhǎng)等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中與微咸水最相容的所述催乳素基因型是短等位基因的純合子型，或短與長(zhǎng)等位基因的雜合子型。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述至少一條魚的所述催乳素基因型的測(cè)定方法是抽提至少一條魚的至少一個(gè)剪下的鰭的DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述DNA，并在丙烯酰胺凝膠上顯現(xiàn)擴(kuò)增的DNA。
22.一種建立已知基因型的魚群的方法，其特征在于，包括測(cè)定至少一條雄魚和至少一條雌魚的催乳素基因型；根據(jù)其催乳素基因型選出要繁殖的雄魚和雌魚；繁殖具有選定的催乳素基因型的雄魚和雌魚，以產(chǎn)生具有已知催乳素基因型的后代魚。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述催乳素基因是催乳素1。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述魚是羅非魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了選擇能在各種鹽濃度的水中繁殖和最佳生長(zhǎng)的魚的方法。根據(jù)魚的催乳素1基因型選擇能在特定鹽濃度水中生長(zhǎng)的魚。羅非魚催乳素1(prl 1)啟動(dòng)子中的單序列重復(fù)多態(tài)性(微衛(wèi)星)與prl 1表達(dá)的差異和“受鹽攻擊的”或“受鹽影響的”魚類的生長(zhǎng)差異相關(guān)聯(lián)。此發(fā)現(xiàn)提示二核苷酸微衛(wèi)星可能代表一種調(diào)節(jié)進(jìn)化遺傳變異的潛在來源，與教課書解釋的非編碼微衛(wèi)星長(zhǎng)度變異缺乏功能意義不一致。因此本發(fā)明方法包括測(cè)定或選擇魚生長(zhǎng)環(huán)境的鹽濃度；測(cè)定要繁殖的至少一條雄魚和至少一條雌魚的催乳素基因型；繁殖具有所需基因型的雄魚和雌魚，以產(chǎn)生具有已知和可預(yù)測(cè)基因型的魚后代；在與魚的基因型相容的鹽水環(huán)境中培養(yǎng)魚。
文檔編號(hào)A01K67/02GK1575343SQ02821303
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2002年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月27日
發(fā)明者J·斯特利爾曼, T·科切 申請(qǐng)人:新罕布什爾州立大學(xué)