專利名稱：注射鳥卵的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對含有胚的卵進行操作的一些方法，并且特別涉及到向含有鳥胚的卵中引入物質(zhì)或者從中取出物質(zhì)的方法。
背景技術：
有許多的應用需要對含有早期鳥胚的卵進行注射。例如，可能需要向一種早期胚，例如胚盤(blastoderm)中遞送某種物質(zhì)。例如，在家禽業(yè)中可能需要對早期胚進行卵內(nèi)操作以向發(fā)育中的胚內(nèi)引入某種外源核酸分子(即產(chǎn)生一種轉基因鳥類)或者引入某種外源細胞(即產(chǎn)生一種嵌合(chimeric)鳥類)。
類似地，經(jīng)過改進的向含有早期胚的卵內(nèi)進行注射的方法還可被用于從卵中取出樣品，該樣品包括胚物質(zhì)和胚外物質(zhì)。進一步，其它的應用可能需要在含有胚的卵內(nèi)插入某種傳感裝置以從中收集信息。
目前對含有早期胚的鳥卵進行操作的方法可能不甚理想，這是因為這些方法導致了不可接受的低孵化率。據(jù)認為孵化率降低是在卵殼上產(chǎn)生開口、向卵中引入氣泡、胚外膜或者胚本身的損傷或者這些因素綜合的結果。
因此，在本領域中需要經(jīng)過改進的操作含有早期胚的鳥卵的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種對含有胚，特別是早期胚的鳥卵進行操作的方法，該方法對胚的損傷較低，提高了存活率和孵化率。相應地，本發(fā)明提供了一些改進的方法，這些方法用于向含有胚，特別是早期胚(例如胚盤)的鳥卵中，插入或者植入多種裝置(例如遞送裝置、取樣裝置和/或檢測器裝置等等)，該方法可在受操作的胚中引起較低水平的致病率和致死率。本發(fā)明的方法在向鳥進行疫苗、維生素、促生長激素和生長因子、酶、細胞因子、核酸和/或細胞的卵內(nèi)遞送的方法中特別有用。例如，該方法可用于產(chǎn)生一種嵌合鳥類(即含有外源細胞)或者轉基因鳥類(即含有外源核酸序列)。本發(fā)明的方法還可用于卵內(nèi)收集鳥的樣本或者信息，例如，用于性別篩選、測定胚活力和/或獲取該胚遺傳特征的信息的方法。
本發(fā)明的方法可在單一的卵內(nèi)或者多個卵內(nèi)進行。進一步，本發(fā)明的方法可以手工操作、自動操作或者半自動操作。
相應地，作為第一個方面，本發(fā)明提供了一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個小開口；通過卵殼上的開口伸入一種裝置；以該裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入裝置之前基本完好；將該裝置從卵中收回。
所述裝置可以為，例如，遞送裝置、取樣裝置或者檢測器裝置。在優(yōu)選的情況下，在卵殼上的開口被產(chǎn)生于該卵鈍端的氣室之上。
作為進一步的方面，本發(fā)明提供了一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括以下步驟將鳥卵的鈍端在預定的位置上定向，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在該卵的鈍端于氣室之上在卵殼上引入一個小開口；在卵殼的小開口之下的外殼膜中引入一個小的開口；通過卵殼以及外殼膜上的開口伸入遞送裝置；以該遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并且將該物質(zhì)沉積于胚盤中的某個位置或者緊鄰于該位置；將遞送裝置從卵中收回。在特定的實施方案中，卵被定向于大體向上的位置。
作為更進一步的方面，本發(fā)明提供了一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個小開口；通過卵殼上的開口伸入取樣裝置；以該取樣裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入取樣裝置之前基本完好；以取樣裝置從卵中取出樣品；將該取樣裝置從該卵中收回。
作為更進一步的方面，本發(fā)明提供了一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個小開口；通過卵殼上的開口伸入檢測器裝置；以該檢測器裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入檢測器裝置之前基本完好；以檢測器裝置檢測卵內(nèi)的信息；將該檢測器裝置從卵中收回。
如下文所詳述的，本發(fā)明可有利地被用于任何一種需要對含有早期胚(例如胚盤)的鳥卵的內(nèi)容物進行操作或者從中獲得信息的應用。特別地，本發(fā)明可被用于產(chǎn)生轉基因胚或者嵌合胚或者進行任何基于染色體或者DNA的測定(例如，性別篩選或者評估胚的遺傳特征)?；蛘?，本發(fā)明可用于從含有早期胚的鳥卵中取出任何胚的或胚外的體液或組織的樣本。另外，或者在替代的情況下，本發(fā)明可用于從卵或者胚中獲取信息，該方法可與遞送或者取樣方法聯(lián)合使用。
本發(fā)明的這些或者其它方面在下文中更為詳盡地描述。
附圖簡述


圖1為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明對卵進行操作的方法。
圖2為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案在注射之前制備鳥卵的方法。
圖3為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案在注射之前對胚進行定向或者定位的方法。
圖4為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案在卵內(nèi)引入一個開口的方法。
圖5為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案在注射之前測定胚的位置的方法。
圖6為一個流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案在卵內(nèi)插入某種裝置的方法。該裝置可為，例如遞送裝置、取樣裝置或者檢測器裝置，或這些裝置的組合。
圖7所示為來自于開口(windowed)的卵的兩日齡胚的照片。各組中(a)代表性的參照胚，來自于無開口卵。(b-h)實驗性胚，來自于開口卵。實驗性胚同參照相比較在發(fā)育階段和形態(tài)學上實際上是相同的。
圖8所示為對經(jīng)過2天培養(yǎng)的受體胚的體節(jié)(somite)中熒光標記細胞(綠色)的檢測。
圖9為一系列的顯微照片，所示為在X期鳥胚中的細胞死亡的原位檢測。所有的照片均來自于X期雞胚的明區(qū)(area pellucida)的中央?yún)^(qū)域。頂排中顯示的胚(組a-d)是在亮視野光下所拍攝，中排(組e-h)所示為在外加熒光照射(epifluorescence illumination)下使用若丹明濾鏡組(filter-set)所拍攝的相同視野。底排(組i-l)所示為上部兩排的數(shù)碼合并，以此來展示胚盤中的細胞死亡的精確定位。熒光像素計數(shù)(底排)顯示了來自數(shù)字化熒光成像的紅色像素的數(shù)目，從而實現(xiàn)了細胞死亡數(shù)量的定量比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明將在此參考附圖進行描述，在這些附圖中展示了優(yōu)選的實施方案。然而，本發(fā)明可以以不同的形式實現(xiàn)并且不應被解釋為受限于本文所提出的實施方案。提供這些實施方案是使本發(fā)明的公開徹底而完整，并且完全地向本領域技術人員傳達了本發(fā)明的范圍。
應當注意，在本發(fā)明的一些備選的實施方案中，
圖1-6的流程圖的單元(block)中所提示的功能可以不按照所提示的順序出現(xiàn)。例如，連續(xù)的兩個或者多個單元實際上可以基本上同時進行或者這兩個或者多個單元在某些情況下可以按照相反(或者不同)的次序進行實施。進一步，在本發(fā)明的特定的實施方案中，
圖1-6所展示的功能可以平行進行或者依次進行。更進一步，在其它的實施方案中，特定的單元可以被完全省去。
除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語所具有的含義同本發(fā)明所屬的領域的普通技術人員的通常理解的相同。本發(fā)明的說明書所使用的術語僅僅為了描述特定的實施方案，該術語并不意味著對本發(fā)明進行限定。
本發(fā)明的說明書和所附權利要求的描述中所使用的單數(shù)形式“一個/一種(a或an)”和“該(the)”也包括復數(shù)形式，除非上下文明確地指出并非如此。
本文所提及的所有的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻在此全文引為參考。
本文使用的術語“鳥類”和“鳥類對象”包括任何鳥類的雄性和雌性，但主要包括出于商業(yè)目的而被飼養(yǎng)用于產(chǎn)卵、肉食或者作為寵物的家禽。因此，術語“鳥類”或者“鳥類對象”特別包括雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋等等。雞和火雞是優(yōu)選的鳥類對象，雞最為優(yōu)選。或者，該鳥類或者鳥類對象為瀕危鳥種。
本發(fā)明提供了對含有鳥胚的卵進行操作的經(jīng)改進的方法。“進行操作”或者“操作”意指在該卵的卵殼、外殼膜和內(nèi)殼膜上產(chǎn)生開口并且向其中植入或者插入某種物質(zhì)或者裝置。
本文所使用的“早期胚”指的是從產(chǎn)卵(胚盤期)直至原生殖細胞(PGC)遷移的大致發(fā)育階段的鳥胚。對于雞胚，“早期胚”一般約為胚20期(H&H)或者更早的胚。雞胚的發(fā)育階段在本領域為人所熟知，例見，The Atlas of Chick Development，R.Bellairs & M.Osmond，eds.，Academic Press，1998。在特定的實施方案中，早期雞胚約為4期到約18期的胚，或者約為12期到約17期(H&H)的胚，或者，在替代的情況下約為13期到約15期(H&H)的胚(例如，用于PGC的遞送)。根據(jù)下文所述，在其它的特定實施方案中，早期胚為胚盤期的胚。
本文所使用的術語“胚盤”在本領域中具有被充分了解的含義。一般來說，在本發(fā)明的實踐中，胚盤包括從產(chǎn)卵之時到原腸胚形成終了的胚。胚盤有時在本領域中使用替代性的名稱“germinal disc”或者“embryonic disc”。胚盤可被描述為在早期胚分裂時形成的平整的細胞盤，并且該細胞盤維持至原腸胚形成的結束。產(chǎn)卵之時可見該胚盤有兩個主要的區(qū)域，中央位置的明區(qū)和位于周邊的暗區(qū)(areaopaca)(The Atlas of Chick Development，R.Bellairs & M.Osmond，eds.，Academic Press，1998)。對于雞胚，典型特征的胚盤為從產(chǎn)卵之時(即，IX期或者X期EG&K)到約為XIII期(EG&K)的胚。在本發(fā)明的特定實施方案中，該雞胚為約VIII期到XIII期(EG&K)的胚，或者，在替代的情況下為約IX期到約XII期(EG&K)的胚。在其它的實施方案中，該雞胚為約X期到約XI期(EG&K)的胚。在另外的實施方案中，該雞胚為約X期(EG&K)的胚。
目前所應用的對含有早期胚的卵進行操作的方法可能并不能滿足商業(yè)目的，這是因為這些方法可能導致不可接受的高水平的致病率和致死率。在特定的實施方案中，該鳥胚可以是轉基因的(即含有一個外源核苷酸序列)。
用裝置注射或者插入“緊鄰”于胚或者胚盤指的是該裝置被正好注射入或者插入于早期胚或者胚盤的上方、下方或者附近或者其附近的結構，例如，在該早期胚或者胚盤的約10、8、5、3、2或者1mm或者更小的范圍內(nèi)。術語“緊鄰”于該胚盤包括用某種裝置注射或者插入于該胚的胚下腔、介于暗區(qū)和卵黃膜之間、介于明區(qū)和卵黃膜之間和/或加入明區(qū)和暗區(qū)之間。
本文所使用的術語“注射”和“進行注射”包括將某種裝置(典型情況下為延伸裝置)插入卵或者胚中的方法，包括將某種物質(zhì)遞送入或者散布于卵或者胚中的方法、從卵或者胚中取出某種物質(zhì)(即樣品)的方法和/或將檢測器裝置插入卵或者胚中的方法。
術語“嵌合鳥類”或者“嵌合胚”分別指的是某種“受體鳥類”或者胚，這種鳥類或者胚含有來自于被稱為“供體”的另一種鳥類或者胚的細胞(即體細胞和/或配子細胞)。所產(chǎn)生的嵌合鳥類或者胚在典型的情況下應同時含有來自于受體和供體的細胞。在特定的實施方案中，該嵌合鳥類中可以有至少約5％、10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多的體細胞來自于供體。類似地，在另一個實施方案中，基本上所有的體細胞來自于供體。在另一個實施方案中，嵌合鳥類或者胚中至少有一部分配子(例如，至少約5％、10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多)來自于該供體。在另一個特定的實施方案中，基本上所有的配子來自于該供體。
術語“轉基因鳥類”和“轉基因胚”在本文中的使用同這些術語在本領域中的一般理解相一致。轉基因鳥類或者轉基因胚在一個或者多個細胞中含有外源的核酸序列。該外源核酸可來自于不同的物種(例如，鳥類、哺乳類、昆蟲、細菌、原生動物、酵母、真菌、病毒)或者來自同物種。例如，可以引入來自同物種的野生型編碼序列或者突變形式的編碼序列的額外拷貝。根據(jù)下文的詳述，該外源核酸可編碼多肽、反義RNA或者其它非翻譯的RNA。該外源核酸一般被穩(wěn)定地轉化入該轉基因鳥類或者胚的一個或者多個細胞，例如，通過穩(wěn)定整合入基因組或者引入被該宿主細胞穩(wěn)定維持的游離型結構體。
本文所使用的術語“預定位置”指的是卵內(nèi)的一個固定位置或者深度(例如，該卵可被置于一個預定朝向并且將該裝置在固定點插入該卵的固定深度)。在備選的實施方案中，注射可根據(jù)從卵中所獲得的信息而進行，例如，根據(jù)胚(例如胚盤)的位置或者其中的區(qū)室、該卵中的卵黃膜等等(例如，所需的區(qū)室的位置可以使用傳感器或者探針而測定并且根據(jù)該信息而插入該裝置)。
術語“基本完好”在用于描述該卵殼或者殼內(nèi)膜或者殼外膜時意指其上無明顯的穿孔或者裂縫。術語“基本完好”在用于描述殼內(nèi)膜時意指意指內(nèi)殼膜上無明顯的穿孔或者裂縫。典型情況下，內(nèi)殼膜唯一的可見部分位于在卵殼上形成的窗口或者開口之下，并且根據(jù)開口下的這一暴露部分對內(nèi)殼膜的情況進行測定。
美國專利5,897,998(Speksnijder)描述了一種用于對鳥卵的內(nèi)含物進行操作的方法，該操作通過在該卵殼上與其長軸平行的位置產(chǎn)生一個開口而進行，其中該開口被開在該卵頂側的卵殼上。隨后將一滴液體加于卵殼的開口上“從而使該開口被完全覆蓋”(美國專利5,897,998；摘要)。隨后切除底下的膜并且將某種溶液通過殼上的開口微注射進該卵，并且封緘該開口。
本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過一滴液體將裝置插入卵是不必要的。進一步，如果滴注該液體，不需要如美國專利5,897,998所述將暴露的膜以及該卵殼中的開口完全覆蓋。進一步，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可通過在將該裝置插入卵之前保持內(nèi)殼膜基本完好而改善經(jīng)操作的胚的存活。
為進行闡示，在向鳥卵引入物質(zhì)的一個優(yōu)選和示例性的方法中，該卵被定向于一個預定的位置，在該卵的殼中制造了一個小的開口從而使內(nèi)殼膜在注射之前維持基本完好。將一個遞送裝置伸入卵殼上的開口并且使用遞送裝置(例如，微量移液器或者微注射針頭)刺穿內(nèi)殼膜，并且通過遞送裝置釋放物質(zhì)并將該物質(zhì)沉積于卵內(nèi)的所需位置。該物質(zhì)一般以約1到10微升(典型情況下低于5或者10微升)體積的預定劑量進行釋放。需遞送的體積不是關鍵，只要該體積并不過度地傷害胚并且被有效地遞送便可。
在卵殼上的“小開口”指的是一種開口，該開口小得足以對發(fā)育中的胚不造成過度傷害并且可在需要的情況下被封緘或者閉合。在特定的實施方案中，在卵殼上的“小開口”直徑可約為35mm或者更低，例如，直徑約為10mm到30mm或者約為15mm到25mm。在另一個實施方案中，該“小開口”在直徑上低于約10mm，低于約5mm或者低于約3mm、2mm或者甚至低于1mm。
在典型的情況下，遞送裝置應從卵中被收回，除非該遞送裝置是一種留在卵內(nèi)的可移植的裝置。一般情況下，在卵上的開口被封緘，除非再向其上引入開口之前對卵殼使用了一種自封材料(即，一種封閉劑)。接受操作的卵可隨后被置于保溫器中或者進行保存直至孵化或者其它任何所需的終點。
在卵殼上的開口可被在任何適當?shù)奈恢蒙现瞥?，例如在卵上接近赤道軸的一側或者位于該卵任意一端。在一個特定的優(yōu)選的實施方案中，卵殼上的開口被引入于該卵的鈍端的氣室之上。根據(jù)該實施方案，在外殼膜上也引入了小的開口。通過氣室而同外殼膜相分離的內(nèi)殼膜在注射之前保持基本完好。內(nèi)殼膜被遞送裝置刺穿并且通過其將某種物質(zhì)釋放進入該卵的所需位置。
在外殼膜上的“小開口”與上文關于卵殼上的小開口的描述基本相同。
本領域中的技術人員應意識到，無論卵是水平置放、豎直置放或者成一個角度置放，早期胚(例如胚盤)在典型情況下應定位于該卵的最上部位的區(qū)域或其附近。由此，在該卵殼上的開口一般應被制成于位于早期胚(胚盤)的預期位置附近的卵最上部，除非進行了測定而將該胚位置定于該卵內(nèi)的其它位置。
在特定的實施方案中，在卵殼中的開口被制成于該卵的頂側位置(即，沿著該卵的長軸)。根據(jù)該實施方案，該卵在典型的情況下應被定向于一個大體上水平的位置，即，使長軸同水平的傾斜角度低于約45度。在特定的實施方案中，以卵的長軸為準該卵同水平的傾斜角度低于約30、20、15、10或者5度。在其它的實施方案中，該卵被置于一個基本水平的位置，即，該卵沿其長軸基本上無傾斜(例如，同水平的傾斜低于約5％或者10％)。
當裝置被注射入該卵的側面時，該裝置一般應同時插入于內(nèi)殼膜和外殼膜之中。在其它的特定實施方案中，該膜可在將開口制成于卵殼之上時被取出。在另一個特定的實施方案中，在將裝置通過內(nèi)殼膜插入之前在外殼膜上制出小開口，在該情況下內(nèi)殼膜在將裝置通過其插入之前保持基本完好。
在特定的優(yōu)選的實施方案中，以該卵的長軸為準卵被定向于豎直位置，該卵的鈍端被定向于大體上朝上的位置。“大體上朝上的位置”指的是該卵被豎直定位并且長軸同豎向的傾斜角度低于約45度。在特定的實施方案中，以該卵的長軸為準該卵同豎向的傾斜角度低于約30、20、15、10或者5度。在其它的實施方案中，卵被置于一個基本直立的位置，即，該卵沿其長軸基本上無傾斜(例如，同豎向的傾斜低于約5％或者10％)。根據(jù)該實施方案，該卵總體上的傾斜使得早期胚(例如胚盤)被定位于該卵鈍端的氣室之下。
卵殼膜中的開口可被制成于一個預定的位置(例如，位于卵的鈍端的中央或者位于卵的鈍端氣室的中央)，或者可被制成于一個由早期胚(例如胚盤)的位置所決定或者至少部分決定的位置。
本發(fā)明還可被有利地用于向早期胚中或者從早期胚中進行卵內(nèi)的物質(zhì)遞送或者取出(如上描述)。在特定的實施方案中，早期胚為胚盤(亦如上述)。同樣優(yōu)選的情況還有，早期胚處于卵中的氣室可檢測的階段。
物質(zhì)可被釋放于胚(例如胚盤)本身之中(例如，于明區(qū)或者暗區(qū)之中)?；蛘?，物質(zhì)可被釋放于早期胚附近(例如，正在其上、其下或者鄰近)，其同胚(例如胚盤)的距離在約10、8、5、3、2或者1mm之內(nèi)或者更近。根據(jù)這一實施方案，物質(zhì)可被釋放于胚的胚下腔、介于暗區(qū)和卵黃膜之間、介于明區(qū)和卵黃膜之間和/或加入明區(qū)和暗區(qū)之間。在本發(fā)明的另一個實施方案中，物質(zhì)被釋放于卵黃心和/或釋放入潘德而氏核。
遞送PGC的方法在本領域中是已知的，并且一般通過將PGC注射進入胚的血管(例如背動脈)中或者注射進外胚膜中任何一條足夠大的血管(例見，專利出版物WO99/06533；University of Massachusetts)而進行實施。類似地，可從胚的血管中或者從PGC期胚的外胚膜的血管中進行血樣的收取。
在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一種向含有早期胚(例如胚盤)以及氣室的鳥卵中遞送某種物質(zhì)的方法，該方法包括將卵定向以使卵的鈍端處于一個預定的位置(例如，如前所定義處于一個大體向上的位置)，在卵的鈍端于氣室之上向卵殼以及外殼膜中引入一個小開口，該情況下內(nèi)殼膜保持基本完好的狀態(tài)，通過在卵殼和外殼膜上的開口伸入一種遞送裝置，以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，以及通過該遞送裝置將某種物質(zhì)釋放進入胚盤或者其附近。
在外殼膜上形成開口以及刺穿內(nèi)殼膜的步驟可通過將裝置穿過此兩種膜而在基本上同步實施。在特定的實施方案中，一個開口應首先被制成于外殼膜上，并且隨后該裝置應被插透內(nèi)殼膜以在其上產(chǎn)生開口。類似地，卵殼中的開口可在外殼膜上開口的形成之前形成(例如，首先將一個開口穿入卵殼并隨后開口被穿入外殼膜)或者基本上同時形成(即作為單一步驟)。
根據(jù)上文所述，在優(yōu)選的情況下穿過內(nèi)殼膜的注射并不是通過將一個液滴沉積在內(nèi)殼膜上而完成。在那些通過液體進行注射的實施方案中，在優(yōu)選的情況下該液體為一種水性液體(例如，一種白蛋白溶液)并且僅僅有小體積(例如，二至十微升)沉積于內(nèi)殼膜上。
本領域的技術人員將會意識到，本發(fā)明的方法可在多個鳥卵上實施，例如，在商業(yè)化的家禽作業(yè)中實施。當本發(fā)明的方法在多個鳥卵上實施時，可以在禽群整體水平上觀察到提高的孵化率和降低的發(fā)病率，盡管經(jīng)受卵內(nèi)操作的個體鳥類中仍然存在一定的發(fā)病率和致死率。
在優(yōu)選的情況下，接受操作的卵中的孵化率至少約為40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者更高。同樣優(yōu)選的情況下，接受操作的卵中的孵化率類似于在未經(jīng)操作(例如，未在殼中產(chǎn)生開口，等等)的參照卵中所觀察到的孵化率，或者孵化率同參照卵相比較的減少低于約25％、15％、10％、5％、3％、2％或者甚至1％。
在特定的實施方案中，本發(fā)明可被用于向含有早期胚(例如，胚盤)的卵中遞送某種物質(zhì)或者向早期胚本身遞送某種物質(zhì)。任何物質(zhì)均可通過本發(fā)明的實施方案進行注射，包括細胞、疫苗、多肽、生長刺激物、原生培養(yǎng)物，例如競爭性排它培養(yǎng)基(competitive exclusionmedia)、抗生素、異源核苷酸序列(包括基因轉移載體)、維生素和/或標記物，例如染料等等，但不限于這些。這些物質(zhì)可單獨注射或者聯(lián)合注射(例如，抗生素可被包括入其它物質(zhì)的遞送之中)。作為另一個闡示性的例子，一種染料或者其它標記物可被包括于其它的物質(zhì)之中進行注射以提供一種測定該遞送是否達到所需位置的方法。
本文所使用的“多肽”包括蛋白質(zhì)和肽。用于向卵或者胚本身中遞送的多肽包括抗體、抗原(例如，用于免疫化)、生長因子、激素以及其它生長或者性能增強性多肽、酶、細胞因子等等。
“生長或者性能增強”指的是生長速度、動物體的最終體積、投入產(chǎn)出比(feed to gain ratio)、卵產(chǎn)量、肉產(chǎn)量等等有所提高。
疫苗有機體包括死亡、活體或者減毒的病毒、細菌、原生動物和真菌，包括這些不同的有機體的多種生活期在內(nèi)。
該方法還可被有利地應用于向發(fā)育中的胚內(nèi)引入所需的核苷酸序列(在優(yōu)選的情況下，核苷酸序列被穩(wěn)定地轉化進入胚細胞)，即，用于產(chǎn)生一種轉基因的鳥類(如前所述)。本領域的技術人員將會意識到，讓所產(chǎn)生的轉基因鳥類的每個細胞均含有該轉基因是不必要的。核苷酸序列可以為DNA或者RNA，并且序列可編碼任何目的多肽或者可編碼非翻譯RNA(例如，反義RNA或者核酶)。在核苷酸序列編碼多肽的實施方案中，多肽可為一種報告多肽(例如，諸如綠色熒光蛋白或者堿性磷酸酶這樣的酶)、一種治療性多肽、一種免疫源性多肽(即，用于接種疫苗)、一種生長或者性能增強性多肽，等等。
可以使用本領域所已知的任何載體和方法將核苷酸序列引入胚。例如，可以使用病毒載體(例如，反轉錄病毒)或者DNA載體以攜帶目的外源核苷酸序列。在特定的實施方案中，病毒載體不被用于將核苷酸序列引入胚。向細胞中進行病毒轉導和裸露的DNA載體的引入(例如，使用脂質(zhì)體或者電穿孔)的方法在本領域中是已知的。用于卵內(nèi)電穿孔的裝置包括BTX ECM 2001電穿孔裝置(www.genetronics.com)。
在其它的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明被用于將一種“外源”或者“供體”細胞引入受體胚(即，用于產(chǎn)生一種嵌合胚并且根據(jù)情況產(chǎn)生嵌合鳥類，如上文所定義)。供體細胞可以是一種轉基因細胞或者具有任何其它用于向胚中進行引入的目的特征。如前所述，供體細胞在典型情況下應為一種鳥類細胞。
在特定的實施方案中，受體胚和供體細胞來自于相同的鳥種。或者，供體細胞可來自于一種與受體胚不同的鳥種(例如，將一種火雞細胞送入一種雞胚)。作為進一步的備選，胚和供體細胞可來自于相同的鳥種，但來自于不同的品種(breed)或者品系(strain)(例如，雞的兩種不同的品種或者品系)。受體或者供體細胞可來自一種頻危的鳥種。
進一步，供體細胞還可來自于表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類。在典型的情況下，表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類被用作為育種禽群以產(chǎn)生具有所需性狀的譜系。本發(fā)明有利地實現(xiàn)了對來自于單個表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類的細胞的直接轉移從而一步便產(chǎn)生了多個“后代”，而非通過連續(xù)傳代擴展品系的傳統(tǒng)方法，該傳統(tǒng)方法可導致一些所需性狀的消褪或者喪失。這些表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類可在任何所需的性狀(例如，在商業(yè)上重要的性狀)上有所改善或者具有優(yōu)越性，包括，增高的肌肉產(chǎn)量、減少的脂肪成分、改善的疾病抗性、不同的體積(例如，較小的鳥類)、羽毛減少的降低或者不同的羽毛組成，和/或不同的雄鳥比例，但不限于這些。
在典型的情況下，供體細胞將選自胚盤細胞、干細胞、培養(yǎng)的干細胞、胚胎干細胞、原生殖細胞以及胚生殖細胞。
在一些實施方案中，在引入供體細胞之前使受體胚中的細胞受損是需要的。使胚細胞受損的方法為本領域的技術人員所已知。使胚受損的適當?shù)姆椒ò?，去?從受體胚中取出細胞)、機械傷害(例如，撕裂)、伽瑪照射、微波、軟X-射線、化學處理(例如，氨氣)、熱、激光處理和/或低溫冷凍等等，但不限于這些。在特定的實施方案中，放射照射、加熱、化學處理以及軟X-射線可被用于全卵。在其它的實施方案中，紫外照射、微波、熱、激光處理、低溫處理、機械傷害和去核可被用于通過卵殼上的開窗對胚進行損傷。
胚的受損程度可通過本領域中所知的任何方法進行測定，例如，通過染料，特別是熒光染料，該方法選擇性地對死亡細胞(例如，碘化丙啶)或者凋亡細胞(例如，Hoeschst 333342染料)進行染色。或者，可對本領域已知的指示死亡或者凋亡狀態(tài)的mRNA轉錄本或者多肽進行檢測。
因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生嵌合鳥類的方法，該方法包括的步驟有，將一個小的開口引入卵殼中，通過在卵殼上的開口伸入一種遞送裝置，以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在被插入遞送裝置之前保持基本完好，在足以產(chǎn)生嵌合胚的條件下通過遞送裝置釋放一種供體細胞，并將供體細胞沉積在胚盤之上或其附近(如上所述)，從卵之中收回遞送裝置，并且將嵌合胚溫育直至孵化以產(chǎn)生嵌合鳥類。
這些細胞向胚盤之中的成功遞送和/或嵌合體的產(chǎn)生可通過本領域的已知方法進行估測。例如，可以使供體細胞接觸某種染料(例如，熒光染料諸如羧基熒光素-二乙酸-琥珀酰酯)、金顆粒，或者任何本領域中已知的可以在細胞向受體胚的遞送之后被檢測到的其它標記物?；蛘撸w細胞可以攜帶特定的表位或者核酸序列，這些表位或者核酸序列可以使用抗體或者標準核酸檢測方法進行檢測以對供體細胞或其后代在胚盤、胚或者所產(chǎn)生的鳥類中的存在進行鑒定。另外，在替代的情況下，供體細胞可攜帶某種或者某些基因，該基因產(chǎn)生一種特定的表型性狀，該表型性狀可容易地在胚或者孵化后的鳥體中進行檢測(例如，羽色)。
本發(fā)明的上文說明主要涉及將某種物質(zhì)遞送入卵或者早期胚(例如，胚盤)的方法。對卵進行注射的方法還可以被用于將一種取樣裝置插入于卵之中以從該卵(例如，如上文所述，從胚中)之中收取物質(zhì)(即樣品)或者對來自卵的信息進行檢測(例如，來自胚)。
在一個實施方案中，可將某種取樣裝置插入于卵之中以從其中收取樣本。樣本可取自于卵的外胚部分(例如，卵黃或者白蛋白)。例如，可從白蛋白中收取樣品以測定微生物污染(例如，沙門氏菌)在其中的存在與否。在其它的實施方案中，樣品取自于早期胚(例如，胚盤)，例如明區(qū)、暗區(qū)和/或胚下腔。在本發(fā)明的實施方案中，樣本含有胚盤細胞。在典型的情況下將對樣品進行收取以獲得來自其中的信息。例如，樣品的收取可同性別鑒定或者測定胚的活力的方法聯(lián)合使用。為加以說明，可從胚中收取含有細胞的樣品，并且根據(jù)本領域的技術人員所知對這些細胞進行分析(在典型的情況下進行于從卵中的收取之后)以測定性別染色體或者染色體上的性別特異性序列。樣品還可被用于任何其它的基于DNA的分析，例如，用于測定某種特定的目的基因或者等位基因在胚中的存在。
在另一個實施方案中，可將一種檢測器裝置插入卵以檢測其中(即，來自卵和/或來自胚)的信息。檢測器可被插入于卵中的一個胚外位置(例如，卵黃或者氣室)?；蛘邫z測器可被置于胚的明區(qū)或者暗區(qū)之中或者胚下腔中。
檢測器裝置可被用于收集信息，這些信息包括，胚的大小、胚的位置、胚的發(fā)育階段、胚的性別和/或胚的活力，但不限于這些。在優(yōu)選的情況下，檢測器裝置獲得的信息涉及胚和胚下腔的位置。信息可由同檢測器相聯(lián)結的儀器(例如，計算機或者其它數(shù)據(jù)處理器)進行捕獲。
對于特定的實施方案，卵接受了鑒定，從中收取了樣品或者使用檢測器對信息進行檢測。涉及樣品或者由檢測器所獲得的信息可同卵的標識一起保存。示例性的檢測器裝置在下文中進行更為詳盡的討論。
圖1-6為展示本發(fā)明的特定實施方案的流程圖。
如
圖1中所顯示，根據(jù)本發(fā)明的對含有早期胚(例如，胚盤)的鳥卵進行注射的一個特定的實施方案包括的步驟有，在注射之前對卵進行準備1000，將胚在卵中進行定位2000，將一個開口引入卵之中3000，對胚的位置進行定位4000，以及將一種裝置插入卵內(nèi)的所需位置之中5000。
如圖2中所顯示，卵可根據(jù)情況在注射之前進行準備。卵的表面，至少是注射位置周圍，受到了消毒處理以降低微生物污染1200(例如，使用酒精或者其它消毒溶液)，卵可進一步在一個預定位置進行定向1300(例如，使卵的鈍端處于大體朝上的位置)。在特定的實施方案中，對卵在注射前進行貯存1100。在典型的情況下，對卵進行貯存的時間足以輔助將胚定位或者“定向”于卵內(nèi)所需的位置，但不足以對胚產(chǎn)生不可接受的致病或者致死發(fā)生率。為進行說明，卵可被貯存六小時、十二小時、二十四小時或者更長。只要活力不受到不適當?shù)膿p害或者胚的發(fā)育不超過適于本發(fā)明的時間點，則貯存時間沒有特定的限制。這些卵在注射前可被貯存長達約30或者甚至約60天。在本發(fā)明的實施方案中，卵在注射前可被貯存約30天或更短，約14天或更短，約10天或更短，或約7天或更短。在其它的特定的實施方案中，卵在注射之前被貯存約1、2、3、4、5、7、8、10、14或21天；或者約1-21天、約1-14天、約1-7天、約1-4天、約4-8天或者約6-12天。
一般情況下，對卵進行貯存的條件(例如，溫度)應不促進卵內(nèi)的胚的發(fā)育或者可避免超過所需的發(fā)育階段(例如，胚盤期)的發(fā)育。本領域中的技術人員應會意識到，在貯存期間可發(fā)生一些細胞分裂；但是，總體上胚的發(fā)育在貯存期間被暫時中止或者明顯地延遲。
在貯存期間，卵可被定向于一個水平或者豎直位置(以長軸為準)，或者處于一定的角度。在特定的實施方案中，卵被貯存的方向與注射所使用的相同。進一步，卵可被維持于一個固定的位置(例如，在裝置中)，在該位置中側向(side to side)移動以及繞長軸的轉動都受到限制或者受阻。
在特定的實施方案中，如上文所述，胚可進一步在對胚的注射之前受損。
如前文所指出，在注射之前對胚進行定向或者定位是理想并且有利的，特別是對于對卵進行注射的自動或者半自動方法。對于圖3，如上所述，卵可在注射2100之前進行貯存以促進胚盤定位于卵黃的頂端中心表面。在替代的情況下，或者與此同時，可對卵進行振動(agitate)(例如，進行搖晃)2200、轉動2300、離心2400和/或旋轉2500以輔助胚的定向。在替代或者進一步的情況下，卵的內(nèi)容物可受到溫度條件的變化，變化通過加熱2600(例如，加熱至溫度介于約55°F或者約60°F到低于約75°F、80°F或者95°F之間)或者降溫2700。根據(jù)上文所討論，本領域的技術人員將會意識到，卵被應用于足夠溫和的加熱處理(時間×溫度)從而使胚并不發(fā)育超過所需的階段。作為進一步的替代性或者進一步的處理，卵可受到化學處理(例如，使用氨氣處理白蛋白)2800以輔助胚定向于所需位置。另外，或者在替代的情況下，卵周圍的空氣濕度可受到控制2900(例如，高于或者低于約75％)。
在特定的實施方案中，這些卵受到導致白蛋白稀薄(即，破裂卵中穩(wěn)固程度的喪失或者減低的Haugh單位)的處理(例如，化學或者機械處理)。據(jù)信較稀的白蛋白輔助胚盤定位于卵黃頂部中心表面。或者，來自較老的禽群的卵和/或較大的卵可被用于本發(fā)明的方法。由較老的產(chǎn)卵禽只產(chǎn)生的卵以及較大的卵均更有可能具有相對較稀的白蛋白。
氨氣在文獻中已經(jīng)被報道可導致白蛋白的稀薄。卵可被暴露于任何可導致胚盤定位于所需位置的適當水平的氨氣。適當濃度的氨氣可低于約100、150、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000或者3 500、4000、5000、6000、7000或者8000mg/kg或者更高，在足夠的時間內(nèi)使用(例如，約0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5或者6小時)。在特定的實施方案中，這些卵在相對較短的期間(例如，約0.5到1小時)被暴露于相對較高水平的氨氣(例如，約2000到4000mg/kg)。在其它的實施方案中，卵在約0.5到2小時的期間被暴露于低劑量的氨氣，濃度為約250-1000或者500-1500mg/kg。
在特定的實施方案中，一些手段的聯(lián)合被用于幫助該胚盤定位或者定向于卵黃的頂部中央表面。例如，在一個特定的實施方案中，該卵在約65℃到約75℃之下被貯存了約2到7天，同時在貯存期間轉動該卵。進一步，被選用與這一處理的卵可為較大的卵和/或來自較老產(chǎn)卵禽只的卵。
對于圖4，一個小的開口被引入卵殼3300以及外殼膜3400。盡管這些步驟被分別實施，它們也可以基本上同時實施，特別是在自動或者半自動的方法中。作為進一步的備選步驟，可對位于卵鈍端的氣室的位置進行測定3100，該步驟在典型情況下在向卵殼內(nèi)引入開口之前進行。作為進一步備選的步驟，可在卵殼3200中產(chǎn)生開口之前或者之后對其使用一種密封劑，從而使在卵殼內(nèi)的開口基本上自行封閉。在替代的情況下，或者進一步的情況下，可在使用裝置刺穿內(nèi)殼膜之前或者之后對內(nèi)殼膜使用密封劑。
在本發(fā)明的一些實施方案中，裝置將以預定的深度和位置被插入卵。在其它的實施方案中，裝置將根據(jù)卵中的特定區(qū)室或者結構的位置插入卵，例如，根據(jù)卵中的胚或者胚下腔。胚或者胚下腔的位置的測定可與注射(或者取樣)同時進行或者在此之前進行。對胚進行定位的優(yōu)選方法示于圖5。對于手動或者半自動注射方法，胚可簡單地通過在卵殼上的開窗進行觀察(使用或者不使用放大裝置)4200。卵可進一步被旋轉4100以使胚進入視野。可通過以特定波長的光(例如藍色)通過卵殼上的開口對卵內(nèi)部進行直射或者通過加入反差劑(例如，一種著色或者熒光染料)而增強胚和背景的反差。使用本領域中所已知的工藝，早期胚的觀察還可以通過對雌雞喂以可以影響卵黃顏色(例如，成為紫色陰影或者黃色的不同陰影)的食料或者化合物。
在其它的實施方案中，特別是在自動或者半自動注射方法中，涉及胚或者其它區(qū)室在卵中的位置的信息可以使用檢測器裝置進行檢測4300。檢測器裝置在下文詳細討論，可以是侵入性或者非侵入性裝置。然而，在典型的情況下，某種裝置將被插入卵殼和外殼膜的開口中以收集同測定胚在卵內(nèi)的位置相關的信息。檢測步驟可基本上同遞送和/或取樣步驟同時進行。或者，這些步驟可以依次進行。用于同步進行卵內(nèi)注射和檢測的裝置在美國專利No.6,244,214(Hebrank)中有所描述。
根據(jù)上文描述并且如圖6所示，內(nèi)殼膜在通過其插入某種裝置之前被維持于基本完好的狀態(tài)(如上所述)。一個小開口被制成于內(nèi)殼膜中5100，典型情況下該開口位于胚之上方或著其附近。在典型的情況下，開口通過刺穿內(nèi)殼膜而制成，過程通過將某種裝置穿過內(nèi)殼膜進行插入而完成。裝置可為遞送裝置5200，取樣裝置5300，或者檢測器裝置5400。在一些實施方案中，裝置可含有檢測器、遞送和/或取樣功能。
在一些實施方案中，向卵殼和外殼膜中引入開口的步驟以及根據(jù)情況進行的刺穿內(nèi)殼膜的步驟被同步實施，即，在一個步驟中進行。但是，在典型的情況下，開口將作為一個單獨的步驟被引入卵殼，這是因為根據(jù)本發(fā)明所使用的裝置基于其功能(例如，微注射針頭)可能會具有過細的直徑而不能刺透卵殼。類似地，盡管本發(fā)明可通過同時穿過外殼膜和內(nèi)殼膜的注射而實施(特別是在對卵的側面進行注射的情況下，此二種膜融合于該處)，當對卵的鈍端進行注射時這些步驟一般將會分開實施。
本文所描述的注射方法可是完全手動、完全自動或者半自動。例如，如
圖1所示，卵的準備步驟和對胚進行定位的步驟可更能適于手工方法。在卵殼和外殼膜中引入開口的步驟、定位胚并且插入裝置的步驟可以是手工步驟，但在優(yōu)選的情況下為自動步驟。
在優(yōu)選的實施方案中使用了一種多位點的注射或者取樣裝置，例如，根據(jù)美國專利No.6,032,612的描述(Williams等)。其它的優(yōu)選的遞送或者取樣裝置包括在美國專利No.5,136,979(Paul等)；美國專利No.4,681,063和4,903,635(Hebrank)；以及美國專利No.4,040,388、4,469,047、4,593,646(Miller)中描述的裝置。
在進一步的一個實施方案中，一種進一步含有一種檢測器的注射裝置被用于在向卵中進行注射(用于取樣和/或向卵或者胚中遞送物質(zhì)的目的)之前或者與之同時收集有關胚(例如，胚盤)或者其它區(qū)室的位置的信息，注射器根據(jù)美國專利No.6,244,214(Hebrank)中的描述。
檢測步驟的時機取決于方法的具體目的和待檢測的項目，以及用于注射的材料或者被收取的樣本的性質(zhì)。一般情況下，檢測步驟可在遞送或者取樣步驟之前、之后或者同時進行。
電子傳感器、光學傳感器、化學傳感器、溫度傳感器、聲傳感器、壓力傳感器或者其它用于檢測物理或者化學參數(shù)的裝置可在實施本發(fā)明的這一方面中內(nèi)用作為檢測手段或者檢測器。檢測器或者傳感器可聯(lián)至注射裝置的外壁，或者對于電子檢測器以及在裝置有導電的金屬材料而非絕緣或者多聚物材料制成的情況下，注射裝置的外壁本身可作為檢測器，其中具有適當?shù)碾娐放c之相聯(lián)。檢測器可以是一個或者兩個(或多個)電極，這些電極由一種不導電的注射裝置攜帶或者裝在一種導電的注射裝置的絕緣部分之上。應會受到認可的是，出于感受在卵解剖結構中的深度或者位置的目的，多個不同的物理或者化學參數(shù)可被感知或者檢測，只要這些參數(shù)為該卵是否應被注射或者是否已經(jīng)達到了特定的深度或者位置提供了有用的指示信息。
傳感器可被置于注射裝置的頂端，或者位于其外壁上的預定位置，以及/或者離開注射裝置的頂端。
生物傳感器可被用于實施本發(fā)明。已知多種生物傳感器。例見，美國專利No.5,804,453、5,770,369、5,496,701、4,682,895、5,646,039、5,587,128和4,786,396。
當使用電子傳感器時，可能需要提供第二個電極同第一個電極進行操作聯(lián)結。在使用兩個電極的情況下，它們可同時與注射裝置相聯(lián)，或者一個與注射裝置相聯(lián)而另一個通過卵殼上的同一開口另行插入。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二個電極同卵的外部相接觸。一個電信號可通過此二電極，并且檢測這兩個電極之間傳導的存在與否。當?shù)诙姌O簡單地同卵的外部相接觸時，信號在優(yōu)選的情況下為交流電信號，從而使第二電極同卵的內(nèi)容物電容性耦聯(lián)(capacitively couple)。在優(yōu)選的情況下，各個卵(或者容有多個卵的平板)在使用電子檢測器進行檢測之前被置于一種導電材料的頂部(例見，涉及導電聚氨酯泡沫的美國專利No.5,591,482)。
當使用電子檢測器對諸如胚下腔這樣的充液區(qū)室的位置進行感測時，電子檢測器對進入液體區(qū)室的探頭的進入進行感測，并且由此而用作為深度檢測器(術語“深度檢測器”在此包括“位置感測器”)。在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測器和/或相聯(lián)的注射裝置的移動在檢測器和/或裝置進入?yún)^(qū)室時被中斷。通過該方式，注射裝置可在剛好刺透胚下液后并且完全刺透該腔之前停止前進。
光學傳感器可包括光導纖維，并且可同注射裝置的外壁部分相聯(lián)?？赏ㄟ^第二個光導纖維提供一個光源，第二光導纖維與該裝置同時插入卵，或者將一個外部照明源照在該卵之上。光傳導或者透射特征可被用于測定胚或者胚下腔的位置。光還可以檢測某種顏色標記物，該標記物用于生理測量、疾病測量或者性別測量。
化學傳感器可以以生物傳感器領域中的技術人員所知的任何形式進行提供。例如，可以通過來自Becton Dickinson MicrobiologySystems，Cockeysville，美國馬里蘭的BBL脂質(zhì)體技術或者根據(jù)美國專利NO.4,703,017和4,743,560中的描述而提供一種化學傳感器。當這些組件被裝配于注射裝置之上時，這樣一種分析的結果可根據(jù)上文通過使用光導纖維而讀出。其它的化學分析可通過電化學檢測而實施。這樣的傳感器可被用于，例如，測定卵之中的胚的位置或者性別。以及用于檢測卵中的可能的微生物感染。
化學傳感器可為裝配于注射裝置上的pH傳感器，pH測量被用于檢測可能的微生物污染、將死卵和活卵區(qū)分等等。還可以使用檢測不同陽離子或陰離子種類的離子特異性電極，如下文所進一步描述。離子和pH探頭通過存在于卵的多種區(qū)域和區(qū)室的生物液體的化學性質(zhì)的差異而感測卵內(nèi)區(qū)室間的移動。
溫度傳感器可被用于將活卵同死卵進行區(qū)分或者用于根據(jù)溫度對胚和/或胚下腔進行定位，或者用于卵的性別分選。
聲傳感器可被用作為被動或者主動傳感器(即，同聲信號源相聯(lián)，例如同卵外部相接觸的轉導器)以檢測深度、將可孵卵和不可孵卵加以區(qū)分、測定胚或者胚下腔的位置，等等。
通過多種工藝可植入一種位置或者深度傳感器。同氣室膜的電接觸可被用于控制裝置相對卵的預定區(qū)室的刺穿，例如，相對于氣室膜下的預定深度，或者被用于確保在胚下腔內(nèi)、在胚內(nèi)或者任何其它位置的更為精準的注射，等等?；蛘?，可以使用一種壓力傳感器感測深度，傳感器估測該裝置在卵內(nèi)的區(qū)室之間(例如，從氣室到胚；從胚到胚下腔；等等)進行移位的期間的壓力變化。感應該傳感器的位置的一個適當?shù)姆椒▽Π鼑搨鞲衅鞯穆呀橘|(zhì)加諸于傳感器上的壓力進行測量。例如，可使用注射裝置或者充滿空氣或者液體的中空管，對將氣體或者液體注入包圍著位于傳感器中的出口的介質(zhì)所需的壓力進行測量。所需的釋放壓力在出口從充氣區(qū)室(例如，氣室)移動到充液區(qū)室時有所提高；當出口從充液區(qū)室移入胚時再度提高。壓力的變化可通過放在卵外部的壓力測量裝置進行測量。
光傳感器可同外部光源或者由裝置所攜帶的光源進行聯(lián)合使用，從而對裝置是否位于諸如氣室這樣的充氣區(qū)室、諸如胚下腔或者卵黃這樣的充液區(qū)室或者諸如胚這樣的細胞區(qū)室進行區(qū)分。
傳感器可以是用于檢測卵之中的細菌污染或者其它微生物污染的診斷傳感器，這些污染的例子如，大腸桿菌、沙門氏菌或者單核細胞增多性李斯特菌對卵的污染。診斷型傳感器可通過任何適當?shù)氖侄伪恢踩耄诘湫颓闆r下為一種化學傳感器或者生物傳感器。對被污染卵的檢測可被用于觸發(fā)一個信號以用于隨后對被污染卵同未污染卵進行分選。
多個傳感器可同裝置進行連接。例如，在需要對卵的微生物污染進行檢測、測定卵中的結構的位置的情況下，或者在需要對卵進行性別分選的情況下，提供兩種不同的或者各異類型的數(shù)據(jù)以提供所需條件的更為精準的指示可能是有利的。
檢測步驟可通過從卵中收取樣本放入一個處理系統(tǒng)進行實施，在處理系統(tǒng)中進行了隨后的分析。例如，一個液體樣本可被收取并且進行分析以從其中獲得所需的信息，獲得信息的方式與用于處理小液體樣本的分析系統(tǒng)的方式(例如，在該系統(tǒng)中樣品通過液體處理線內(nèi)的氣障而被分離)相同。在該情況下，提供一種用于鑒定進行了樣本收取的卵的方法是優(yōu)選的，例如，通過提供硬件、軟件或者硬件和軟件的綜合以用于對這些卵和各個卵的相對位置進行計數(shù)。并且同取樣的時間相關聯(lián)并且將這樣的信息進行短期或者長期存儲直至該信息在所需的方式下被使用(例如，用于排除某種特定的卵、用于間別鳥的性別并且進行性別分選、或者用于提供關于被注射的卵的質(zhì)量和其它一些信息的龐大數(shù)據(jù)庫)。
應意識到，本發(fā)明可提供一種途徑以對被注射的卵的大量信息進行記錄和存儲。例如，可獲得種群信息以用于質(zhì)量控制程序、或者用于對卵的先期處理進行修正、或者修正選擇孵化程序。在這些情況下，被注射卵的表示可以成為該卵同特定批次卵的聯(lián)系，而不僅僅是其作為該批次卵中的特定個體的標識。
因此，本發(fā)明提供了對含有早期胚(例如，胚盤)的鳥卵進行操作的方法，以及對胚本身進行操作的方法。本發(fā)明可被用于，例如，從卵中收集信息、從卵中收取樣本，和/或向卵遞送物質(zhì)。
已對本發(fā)明進行了描述，可參考具體的實施例例示本發(fā)明，這些實施例僅僅用于例示性的目的，非意味著對本發(fā)明的限定。
實施例1下文為一種示例性的方法，該方法用于將液體或者細胞通過卵的鈍端對受體雞胚盤進行卵內(nèi)注射。
1.通過以100％乙醇進行擦拭對E0日的卵的整個卵的表面進行表面消毒。
2.對光檢查該卵以對氣室進行定位。使用鉛筆在殼的表面標記該氣室的位置。
3.通過將殼dremeling away而在卵的鈍端(在氣室的中心)制出小開窗(小開口)。小心保持外殼膜的完好。
以下所有的步驟在優(yōu)選的情況下在層流凈化罩(laminar hood)或者干凈的房間內(nèi)進行實施4.在外殼膜通過殼上的開窗暴露的情況下，再度使用70％的乙醇對卵的鈍端以及周圍區(qū)域進行消毒。
5.使用鑷子和解剖刀(#11刀刃；Personna Medical)小心地除去外殼膜，同時小心不要在膜上留下鋸齒狀邊緣。
6.胚盤可見于氣室膜(即內(nèi)殼膜)下，為環(huán)狀結構。
7.使用玻璃微移液吸頭(或針頭)刺穿氣室膜并且注射進入胚盤的胚下腔液。約3-5微升液體(含有100g/ml的青霉素-鏈霉素)被注射。使用Sutter P-30推進器推進微移液吸頭；溫度-800，Pull-950。
8.注射之后，將經(jīng)過剪切以適應開窗的防水膠帶(Johnson &Johnson，1英寸寬)粘貼其上并且壓入位置。
9.硅樹脂(GE Silicone II，干凈)封膠隨后被灑在膠帶的整個表面上，其重點在于封緘膠帶的邊緣。
10.在將這些卵轉入溫育器中之前，將硅樹脂干燥約30-45分鐘。
實施例2進行了一系列的實驗，以評估實施例1的手工注射對于將液體或者細胞卵內(nèi)注射入受體雞胚盤(約為X期)的胚下腔的應用。供體細胞也來自于X期的雞胚盤。在一些情況下，受體胚在注射前受損。在早期的實驗中，一小滴(幾微升)的白蛋白溶液被滴于胚盤上方的內(nèi)殼膜上并且通過白蛋白液滴而刺穿該膜而進行了注射。在較晚的實驗中，該步驟被省去。這些卵在處理之前不經(jīng)保存或者保存4-8天。
對參照卵和經(jīng)操作的卵的孵化率進行了測定。成功的嵌合體的產(chǎn)生率也經(jīng)受了評估。結果示于表1之中。
表1
a 縮寫R×R＝Rhode Island Red Cross；BPR＝Barred Plymouthb HyVac和Bovans是Leghorn雞品系實施例3對胚進行物理損傷的特定方法，例如紫外(UV)照射或者激光切除，可通過卵殼和殼膜上的開窗進行實施。我們已經(jīng)開發(fā)了一種方法用于在卵的側面產(chǎn)生開窗、將其封緘、并且將卵在標準條件下進行溫育(99F，滾動)，這樣使高百分比(＞90％)的胚在兩天內(nèi)正常發(fā)育(圖7)。該方法可被用于估測在胚發(fā)育的兩天之中的損傷效率和嵌合體的產(chǎn)生。進一步，該方法可被用于對卵的側面的注射。
簡而言之，該卵受到如下的處理1.在60F、75％得濕度下貯存這些卵0-7天，長軸平置(on their longaxis)，從而將胚盤定位于卵側面的中心位置。
2.使用sharpie pen對朝上的位置進行標記。
3.貯存之后，在卵的側面的筆標記位置上鉆出7-mm的洞。
4.除去殼。通常內(nèi)殼膜和外殼膜保持完好，并且將這些膜也除去。
5.對胚盤進行鑒定，胚盤在卵殼上被制出的開口附近或者直接位于其下。僅僅在胚盤直接位于開口之下的情況下卵才被用于這一特定的實驗，這樣可允許多種損傷處理的應用，例如UV光照。
6.將洞保持開放5-10分鐘。
7.使用GE Silicon II和J&J防水膠帶將洞封緘。
8.將Silicon干燥約30分鐘。
9.將這些卵置于溫育器中，鈍端朝上，洞在其側，并且在99F下溫育兩天，每3小時轉動一次。
10.從卵中收集胚以用于照相。
代表性的參照和受處理胚的照片示于圖7之中。
實施例4一種對胚盤細胞在受體胚中的整合進行監(jiān)測的方法被開發(fā)出來。該方法適用于對新鮮分離自任何鳥類或者品系的胚盤細胞進行追蹤，并且應可容易地應用于對其它細胞的整合進行監(jiān)測，例如胚性干細胞。概括該方法，新鮮分離的胚盤細胞在注射之前被暴露于羧基螢光素二乙酸琥珀酰酯(CFDA SE)。CFDA SE為一種氨基反應化合物，該化合物在同細胞內(nèi)蛋白質(zhì)進行反應之后熒光升高。一旦該化合物摻入胚盤細胞，這些細胞可以通過熒光顯微鏡在受體胚中進行監(jiān)測。
在下文所示的實驗中，以CFDA SE對新鮮分離的胚盤細胞進行標記并將其微注射入X期胚盤，微注射通過穿過在卵鈍端的內(nèi)殼膜的注射而進行(如
圖1所描述)。當在溫育兩天之后通過顯微鏡進行觀察時，在多種組織中發(fā)現(xiàn)了熒光標記的供體細胞。圖8顯示了整合入溫育兩天的受體胚的體節(jié)中的被標記的供體細胞，從而產(chǎn)生了一個嵌合體胚。對于使用遺傳修飾細胞以對供體細胞在早期胚中的整合進行跟蹤，熒光染料標記可為一種吸引人的備選或者互補手段。
實施例5為對雞嵌合體的產(chǎn)生進行優(yōu)化，可對受體胚進行‘損傷’或者預處理以使這些胚更易接受供體細胞。被最廣泛接受的損傷方法涉及到將供體卵暴露于600rad的γ射線照射之下。為對供體胚上的各種處理效果進行估測，我們已經(jīng)開發(fā)了一些工藝以對受體胚盤中的細胞死亡進行原位測定。
為對死亡細胞進行原位鑒定，我們已經(jīng)對使用碘化丙啶(PI)進行的染色標記進行了估定，該試劑為一種熒光DNA染料，該染料主要對于死亡細胞是可透過的。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過對脆弱的胚盤進行的最小量的操作和洗滌，PI有效地標記了死亡細胞。這些細胞可被鑒定并且通過熒光顯微鏡進行照像，并且通過數(shù)字成像分析測定細胞死亡的相對量(見圖9)。死亡細胞在胚盤中的精確位置也可通過數(shù)字成像分析進行確定(見圖9)。據(jù)我們所知，這是第一次在活體鳥胚中對細胞死亡進行原位測量。
在該實驗中，PI標記工藝被用于未受處理的、經(jīng)物理損傷的和經(jīng)熱處理的胚。未經(jīng)處理的胚盤(圖9，第一欄)表現(xiàn)出低水平的背景細胞死亡。在本實驗中造成的物理損傷(第二和第三欄)是胚盤的分離過程所導致的非故意的損傷。注意細胞死亡精確地定位于胚盤內(nèi)的撕傷周圍區(qū)域(圖9，組j和k)。熱處理(在水浴中55C保溫15分鐘)基于先前的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明這樣的處理完全阻止了孵化。根據(jù)本實驗所示(圖9，第四欄)，孵化上的減低有可能是緣于胚盤中極高水平的細胞死亡。熒光像素計數(shù)(圖9，底排)可被用于定量測量以及在各種處理之間比較細胞死亡的數(shù)量。
凋亡細胞(與死亡細胞對比)的檢測也可通過使用熒光染料Hoechst 333342進行測定，染料對活體和凋亡細胞進行區(qū)分染色。凋亡和/或死亡細胞的測量可被用于測定受體胚受損的程度。
實施例6以下研究被用于測定胚盤在卵中的位置和直徑，卵在商業(yè)孵化所貯存條件下進行貯存。在一周的基礎上對來自單一禽群的白來亨雞卵(Bovans)進行測量；該禽群被研究至其產(chǎn)卵循環(huán)的結束。收到卵后，這些卵在60F和75％的相對濕度下保存于平板上6或7天，保存方式類似于這些卵在商業(yè)孵卵場所中的貯存。每周測量平板上的59個卵。對于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.24，有3.05％的胚離中心太遠難以看到。
另外對一種Hy-Ling W-36白來亨雞禽群進行了研究。這些卵在產(chǎn)后最多48小時被收取。這些卵在60F和75％的相對濕度下保存6或7天。對于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.86mm，有3.96％的胚離中心太遠難以看到。
在對胚盤位置進行測量時還對這些胚盤的直徑進行了測量，包括明區(qū)的直徑在內(nèi)。在商業(yè)孵化所貯存條件下的結果見下表2。這些卵被保存了7天，這些胚被典型地認作為X期胚。
表2
實施例7為測定胚是否可通過調(diào)整貯存條件而被動地進行定位而進行了一些實驗。這些卵或者根據(jù)商業(yè)條件在平板上貯存(參照)，或者在一種被稱為“固定器(fixture)”，該固定器使卵保持于固定的豎直位置(鈍端向上)，其中基本上防止了側向移動和繞垂直軸的轉動。
在進行中的使用Bovan禽群的研究中(這些母雞處于其產(chǎn)卵的第69周；它們產(chǎn)卵高達約70周，無換羽)，總共2,766枚卵于60F和75％RH下在平板或者固定器中貯存7天(30枚卵貯存于平板中，30枚卵貯存于固定器中，在31周中每周均進行)，在一臺Acu-Gage光學CoordinateMeasuring Machine(CMM)中對這些卵進行測量，該裝置具有一個藍色光纖光源以增強胚盤的對比度?；谒占臄?shù)據(jù)，在平板上保存7天的卵的胚盤平均離心距離為5.24mm。對于在固定裝置中保存7天的卵，該離心距離改善至平均4.58mm，該裝置固定卵以使卵的長軸豎直。在保存于平板上的卵中，3.05％的胚離中心太遠難以看到，而對在保存于固定器的卵中，僅僅2.53％離心太遠。來自于Elizabethtown，Pennsylvania的Hy-Line W-36卵也接受了測量?？傆?,649枚卵被測量，其中這些卵在60F和75％的相對濕度下保存6或7天。對于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.86mm，有3.96％的胚離中心太遠難以看到。對在固定器中進行保存以使其長軸豎直的卵，其離心距離略為好一些，平均為5.31mm，并且4.81％的胚離中心太遠難以看到。
對這些數(shù)據(jù)(Bovans，23-69周；Hy-Line，26-42周)進行了統(tǒng)計分析以確定在固定器中固定卵是否可以影響胚盤的位置。來自不育或者受損的卵的數(shù)據(jù)被排除在外。如果胚盤離中心太遠以致難于測量則使用13.716作為該值。使用協(xié)方差分析，該分析將位置作為因變量并且固定保存裝置(在固定器或者卵平板中)，該分析針對禽種分別進行。同在平板上相比較，在固定器中進行貯存對胚盤位置的影響見下表3，該影響是全部禽群年齡的匯總。
表3
在固定器中進行貯存的效果對于Bovans(P≤0.001)以及Hy-Line(P≤0.004)是顯著的；貯存于固定器中的卵使得胚盤顯著地距中心更為接近。
對貯存于固定器中的卵的數(shù)據(jù)組進行了分析以測定是否胚盤離心位置同禽群年齡和/或卵重量相關聯(lián)。進行了協(xié)方差分析，該分析以位置為因變量并且固定禽群，以卵重量作為共變量(covariate)。以禽種劃分該分析。Bovans卵顯示出很明顯(P≤0.001)的禽群年齡對貯存于固定器中的卵的影響，而Hy-Line并未顯示出胚盤位置同禽群年齡之間的相關性(P≥0.05)。
不出所料，卵重量隨著禽群年齡有所提高；對于卵重量同胚盤離卵中心的距離觀察到了相反的關系。Bovan數(shù)據(jù)組顯示卵重量為顯著的共變量(P≤0.05)；而卵重量對于Hy-Line卵并非顯著的共變量。卵重量在Hy-Line分析中不是顯著的共變量的原因可能是禽群年齡并未超出42周，因此卵重量可能還未成為影響因素。盡管Bovan數(shù)據(jù)組的回歸分析顯示出卵重量同胚盤位置的顯著關聯(lián)，據(jù)顯示低于1％的胚盤位置變化可被解釋由卵重量造成(R2＝0.007)。
上述實驗的參照組由貯存于平板紙上的卵組成。這些平板為一些存放卵的紙板；這些卵在置于這些平板紙上時可繞其垂直軸相對自由地移動。孵化場所使用塑料平板。在這些平板上卵繞其垂直軸僅僅具有受限水平的移動。為測定在塑料平板及紙板上貯存卵和在固定器中貯存卵的影響，在60F，75％RH下，在塑料平板或者紙平板上以及固定器中將Bovan卵貯存6天。如下表4所示，在貯存于塑料平板的卵中，胚盤離心位置有所降低，但在貯存于固定器的卵中，胚盤離心距離有很大改善。
表4
實施例8進行了一些研究以測定不同貯存時間對胚盤位置的影響。先前的一項研究表明，貯存7天(60F以及75％相對濕度)的卵在胚盤的位置上顯示出相對于0天的卵的明顯改善(從0天的距中心9.71mm改善至7天的5.61mm，在0.0001水平上具有顯著意義)，并且將卵貯存10天沒有進一步明顯改善胚盤位置。
白蛋白濃度被認為是影響胚盤位置的變量之一；較濃的白蛋白限制了卵黃的轉動。白蛋白以Haugh單位進行測量。在一個分立實驗中，對不同時間長度進行了白蛋白濃度的測量。對來自55周齡的禽群的Bovan卵進行了稱重并且在平板上貯存0、3、6、10、13或17天后測定Haugh單位。隨著貯存時間的增加，白蛋白重量或者Haugh單位表現(xiàn)出明顯的降低。
進行了一個實驗以測定貯存時間以及白蛋白濃度對于胚盤離中心位置的影響。對來自于37周齡禽群的Hyline卵進行了稱重，并且在60F以及75％相對濕度下在固定器中貯存(鈍端朝上)2、6、9、12或15天。保存6天的組被稱為參照組。進行了以胚盤位置為因變量，貯存時間(天數(shù))固定的協(xié)方差分析。另一獨立分析中，Haugh單位被作為因變量，貯存時間作為固定變量。隨后通過SNK分析對各個貯存時間的平均胚盤位置或平均Haugh單位進行比較。如下文表5所示，胚盤距中心位置隨著貯存時間的增加而顯著地減少，12天和15天的平均位置明顯低于2天，6天和9天居中(6天的平均位置實際上低于9天，12天低于15天)。進一步，Haugh單位也隨著貯存時間而降低，表現(xiàn)出比胚盤位置更為明顯的影響。
表5
總體上，使白蛋白稀薄表現(xiàn)得允許了卵黃更為自由的轉動，并且由此而使胚盤的定位更為接近固定于鈍端朝上的豎直位置的卵的“上止點(top dead center)”。
實施例9還進行了一些研究以測定在貯存期間調(diào)節(jié)卵的朝向對胚盤的影響。對側向擺放7天的卵進行的初步實驗并未改善胚盤定位。但是，這些實驗的實施通過將這些卵置于平板表面并且允許它們在側向自由地朝向而進行。
在本研究中，這些卵在不同的位置上根據(jù)實施例7中的描述貯存于固定器中以測定對胚盤定位的影響，該固定器限制了側向移動和滾動。該固定器將這些卵保持于固定的水平或者豎直位置。對這些卵進行貯存的不同的朝向以及進行胚盤位置測量時這些卵的朝向如下1.側置(Bovan和Hy-Line W-36)，并且側置測量。
2.倒置(即，鈍端朝下)3天(Hy-Line W-36)，隨后鈍端朝上3-4天，并且鈍端朝上測量。
3.倒置(即，鈍端朝下)6-7天并且鈍端朝上測量(Bovan)。
4.倒置(即，鈍端朝下)6-7天并且倒置測量(Hy-Line W-36)。
結果概括于表6之中。
表6
卵的側置貯存對于各個類型的卵并未產(chǎn)生顯著改善的結果；盡管胚盤距離有所降低，離中心太遠的胚盤數(shù)量也有增加。將卵倒置貯存3天獲得了顯著意義，但實際上增加了胚盤距卵中心的距離(p≤.057)。對倒置貯存的卵進行的合適一端朝上或者倒置測量均產(chǎn)生了顯著性差異，但較大提高了胚盤到卵中心的距離，對Bovan和Hy-Line W-36均是如此。
實施例10貯存溫度和相對濕度對胚盤位置的影響也受到了研究。溫度據(jù)信是影響白蛋白性質(zhì)(即，濃度)的重要因素，白蛋白性質(zhì)隨之可影響卵黃的移動或者移動性，并因此而影響胚盤的位置。初步實驗表明，在較高溫度下對卵進行貯存可能輔助將胚盤朝向卵黃表面中心進行“定向”。
來自47周齡禽群的Hyline卵在60(商業(yè)孵化場所條件)或者70華氏度(15.5或者21.1攝氏度)進行7天的貯存。胚盤距70度下貯存的卵中心的位置低于在60度下保存的卵(在p＝.063 approachedsignificance)。
在后續(xù)的研究中，探討了卵貯存期間的溫度和相對濕度條件的多種排列組合對胚盤位置的影響。對根據(jù)實施例7的描述貯存于固定器中6-7天的卵使用了溫度和相對濕度的不同組合，以60華氏度和70％相對濕度作為參照處理。對一些不同的處理條件進行了評估1.正常溫度(60F)，而相對濕度(75％)被降至50％(Hy-Line W-36卵)。
2.最初5天為正常溫度(60F)和相對濕度(75％)，隨后在貯存的最后2天提高溫度至80度(75％RH)(Bovan)。
3.正常溫度(60F)，但相對濕度被設為90％(Hy-Line W-36)。
4.溫度被設為70F，相對濕度被設為50％(Hy-Line W-36)。
5.溫度被設為70F，相對濕度正常(Hy-Line W-36)。
6.溫度被設為70F，相對濕度被設為90％(Bovan和Hy-Line W-36)。
7.溫度被設為80F，相對濕度正常(Hy-Line W-36)。
結果概括于下文表7之中；
表7
簡而言之，70F的溫度在所有的情況下表現(xiàn)出對胚盤定位的改善，并且對于除Hy-Line W-36卵在90％的相對濕度之外的所有情況，在p≤0.05之下具有顯著性。僅僅相對濕度的變化對于胚盤的位置鮮有影響(注意在所有的情況下，若不考慮顯著性，參照組具有較高的胚盤距中心距離)。Haugh單位的結果類似，同參照條件相比，該單位對于所有的處理組均有所降低(注意并未就正常溫度和90％相對濕度的研究進行Haugh單位的收集)。Haugh數(shù)據(jù)顯示出比胚盤位置數(shù)據(jù)更高的顯著性意義，而僅僅正常溫度和50％相對濕度組并未顯示出顯著性效果。
實施例11對外部環(huán)境進行調(diào)節(jié)是影響胚盤位置的一種方法。卵對氨氣的暴露已被證明使白蛋白變稀。Benton和Brake(2000)已經(jīng)證明，同參照相比(0mg/kg)，卵對高水平的NH3(2747和6052mg/kg)進行一小時的暴露表現(xiàn)出白蛋白高度(height)的明顯降低，伴之以白蛋白pH的提高。由于白蛋白高度的降低同白蛋白流動性的增加正相關，因此對NH3處理是否將胚盤定位到接近于卵中心的位置進行估測。
在第一個實驗中，來自38周齡的Hyline禽只的卵(卵類型W36；禽群標識PL2506)被收取并且在60°F和75％RH下維持1天。18枚卵(三批共54枚卵)依其水平軸被置于玻璃干燥器(直徑250mm，具蓋)(Fisher Scientific)中的一個瓷平板之上。將一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)或者雙蒸水(參照)倒入干燥器中。14.8M的NH4OH溶液據(jù)估計可釋放出6052mg/kg的NH3(Benton和Brake，2000)。將這些卵在各自水平的NH3中暴露1小時。隨后將卵取出，并且對胚盤位置、白蛋白高度和pH進行測量。結果見表8
表8
這些結果顯示，NH3處理導致了白蛋白pH同其各自的參照相比的明顯提高。在NH3處理組中白蛋白高度較低(即，較低的Haugh單位值)，這顯示了白蛋白的稀薄。
在另一個實驗中，在對氨氣進行暴露之后對這些卵進行了貯存。對這些卵(68周齡的Bovans)使用兩種濃度的NH3(2747和142mg/kg的NH3)。參照被暴露于0mg/kg的NH3?？傆?0枚卵被用于NH3處理，48枚卵被用于參照。對一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)進行了一系列稀釋以產(chǎn)生2747和142mg/kg的NH3。對于參照，雙蒸水(1L)被倒入了干燥器。將這些卵在各自水平的NH3中暴露1小時。隨后將卵取出，置于固定器中且無轉動或者側向移動，并且在60F和75％RH下貯存6天。6天的貯存之后進行測量以測定胚盤位置、白蛋白高度和pH。結果示于下文表9
表9
同參照相比，在以2747mg/kg的NH3進行處理的卵中的胚盤距中心位置同卵鈍端上止點更為接近。有趣的是，這些卵的pH同參照相近。NH3處理和參照卵在Haugh單位上無差異。同參照相比，較低濃度的NH3(142mg/kg)在受測參數(shù)上無變化。
對以2747mg/kg的NH3處理組的胚所觀察到的變化之一是，這些卵具有“經(jīng)過烹制的”外觀并且看起來不似活體。因此，以高水平的氨氣進行的處理可用作為使胚受損的方法。
實施例12對多種方法進行了評估以測定是否胚盤可被主動地“定向于”卵中心。
離心重力據(jù)信在胚定位于卵的最上部位置中起著重要的作用。離心是產(chǎn)生人工重力或者增加重力的質(zhì)量力的一種途徑。為測定離心導致的較大的力是否可改善胚的位置進行了研究。
對來自于27周齡禽群的Hyline卵進行了稱重，如實施例7所述將其置于固定器中，并且貯存共計7天。在貯存的第5天，將這些卵置于Sorval RC 5C離心筒中并且在50rpm下旋轉3分鐘，該過程中這些卵保持于固定器中，其長軸同整個旋轉中的人工重力平行。隨后將這些卵再貯存2天，并且隨后對胚盤據(jù)亂中心的位置進行測量。未注意到胚盤位置由于離心有明顯變化。
在進一步的研究中，對卵(Hy-Line)進行了稱重，在固定器中貯存5天，在300rpm(Beckman Allegra 6KR centrifuge)下旋轉30分鐘并且隨后在進行胚盤位置測量之前貯存1天。使用以位置作為因變量，離心固定的協(xié)方差分析。如下文表10中所示，在胚盤位置上無顯著性差異，并且事實上經(jīng)離心的卵所表現(xiàn)出的胚盤位置距中心略遠。
表10
轉動在卵貯存期間進行轉動對胚盤朝向卵頂部中心的定向的影響受到了評估。在60F，75％RH下將卵置于Hovabator轉動器之中6-7天。該轉動器使卵進行與豎向呈正負45度的運動，一個從0至+45度到0至-45度并回到0度的完整循環(huán)耗時4小時。未處理卵在平板(紙板)上貯存用于比較(以同轉動器中的卵相比)。結果示于下文表11
表11
協(xié)方差分析表明，對于Bovan或者Hy-Line卵，處理組之間的結果均無顯著性，盡管轉動卵的平均離中心距離較低。
旋轉在貯存期間對卵進行旋轉對于胚盤朝向卵頂部中心的定向的影響受到了評估。根據(jù)實施例7將卵貯存于固定器中并且同未經(jīng)旋轉但也在固定器中進行貯存的卵進行比較。對本試驗，將這些卵貯存5天，在300rpm下旋轉30分鐘，并且隨后在進行胚盤位置測量之前貯存一天。旋轉組所具有的胚盤距中心位置略有提高，盡管距中心太遠以致難于觀察的的胚盤百分比略有改善。結果見下文表12
表12
協(xié)方差分析表明，處理組內(nèi)的結果無顯著性差異，盡管旋轉卵的平均離中心距離略低。
振蕩探索了在貯存期間對卵進行振蕩對于胚盤朝向卵上止點的定向。根據(jù)實施例6將卵貯存于固定器中，并且同未經(jīng)振蕩但也在固定器中進行貯存的卵進行比較。
對于上述的不同處理，在進行胚盤位置測量的同時還對胚盤的直徑進行了測量。結果表明對于任何處理胚盤大小均無變化。
盡管通過以明確和理解為目的進行說明和例示對本發(fā)明進行了較詳細的描述，很明顯特定的變化和改動可在權利要求及其等效物的范圍內(nèi)進行實施。
權利要求
1.一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個預定位置；向卵殼引入一個小開口；將一種裝置通過卵殼上的小開口伸入；以該裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入裝置之前基本完好；以及從卵中收回該裝置。
2.權利要求1的方法，其中裝置為一種遞送裝置，并且所述方法在所述刺穿步驟后進一步包括通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并且將該物質(zhì)沉積在卵內(nèi)的步驟。
3.權利要求1的方法，其中裝置為一種取樣裝置，并且所述方法在所述刺穿步驟后進一步包括從卵中取出樣本的步驟。
4.權利要求1的方法，其中裝置為一種檢測器裝置，并且所述方法在所述的刺穿步驟后進一步包括以檢測器裝置檢測來自卵內(nèi)部的信息的步驟。
5.權利要求1的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個預定位置。
6.權利要求1的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至胚盤位置或其緊鄰位置。
7.權利要求6的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
8.權利要求1的方法，該方法進一步包括使胚盤受損的步驟。
9.權利要求1的方法，其中卵朝向大體上水平的位置，并且卵殼中的小開口被引入于卵的朝上一面。
10.權利要求1的方法，其中卵在處理之前被貯存。
11.權利要求1的方法，該方法在向卵殼中引入小開口的步驟之前進一步包括對卵殼使用封閉劑的步驟，其中小開口被引入于卵殼上使用了封閉劑的位置。
12.權利要求1的方法，其中胚盤為XIII期(EG & K)或者更早期的胚盤。
13.權利要求12的方法，其中胚盤為VIII期到XIII期(EG & K)的胚盤。
14.權利要求12的方法，其中胚盤為X期(EG & K)的胚盤。
15.權利要求1的方法，其中卵選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋的卵。
16.權利要求15的方法，其中卵為雞卵。
17.權利要求15的方法，其中卵為火雞卵。
18.權利要求1的方法，其中胚盤含有異源核酸。
19.權利要求1的方法，該方法進一步包括將胚盤定位于所需位置的步驟。
20.權利要求19的方法，其中所述的定位步驟所包括的方法選自(a)振動卵，(b)加熱卵，(c)將卵保持于固定位置，(d)對卵進行化學處理，以及(e)(a)到(d)的任何組合。
21.權利要求1的方法，該方法進一步包括測定胚盤或其區(qū)室的位置的步驟。
22.權利要求21的方法，其中所述的測定步驟包括對胚盤進行可視化。
23.權利要求21的方法，其中所述的測定步驟包括使用一種檢測器裝置測定胚盤或其區(qū)室的位置。
24.權利要求1的方法，該方法進一步包括對卵殼上的小開口進行封緘的步驟。
25.權利要求1的方法，該方法進一步包括在外殼膜上引入一個小開口的步驟，并且其中所述的伸入步驟包括將遞送裝置通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入。
26.權利要求1的方法，該方法進一步包括將卵進行溫育直至孵化的步驟。
27.權利要求2的方法，其中裝置為一種多注射遞送裝置。
28.權利要求2的方法，其中在卵中進行沉積的物質(zhì)包括多肽。
29.權利要求28的方法，其中多肽選自抗體、激素、生長因子、酶和細胞因子。
30.權利要求2的方法，其中在卵中進行沉積的物質(zhì)包括核苷酸序列。
31.權利要求30的方法，其中核苷酸序列是使用一種方法引入胚盤的，該方法選自病毒載體、脂質(zhì)體和電穿孔。
32.權利要求30的方法，其中核苷酸序列編碼一種多肽或者一種反義核酸。
33.權利要求2的方法，其中在卵中進行沉積的物質(zhì)包括抗生素。
34.權利要求2的方法，其中在卵中進行沉積的物質(zhì)包括供體細胞。
35.權利要求34的方法，其中供體細胞為鳥類細胞。
36.權利要求35的方法，其中供體細胞選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋的細胞。
37.權利要求35的方法，其中供體細胞所來自的鳥類不同于胚盤的物種。
38.權利要求34的方法，其中供體細胞為轉基因細胞。
39.權利要求34的方法，其中供體細胞選自胚盤細胞、干細胞、培養(yǎng)的干細胞、胚胎干細胞、原生殖細胞、胚生殖細胞以及上述細胞的任何組合。
40.權利要求34的方法，其中胚盤為雞胚盤并且供體細胞為雞細胞。
41.權利要求40的方法，其中胚盤和供體細胞來自雞的不同品種或者品系。
42.權利要求3的方法，其中從卵中取出的樣本含有胚下腔液。
43.權利要求3的方法，其中從卵中取出的樣本含有胚盤細胞。
44.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為電子傳感器。
45.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為光學傳感器。
46.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為化學傳感器。
47.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為溫度傳感器。
48.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為聲傳感器。
49.權利要求4的方法，其中檢測器裝置為壓力傳感器。
50.一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個預定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上引入一個小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個遞送裝置；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在遞送裝置通過其插入之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并將物質(zhì)沉積在胚盤位置或其緊鄰位置；以及從卵中收回遞送裝置。
51.權利要求50的方法，其中定向步驟包括將卵的鈍端置于大體朝上的位置。
52.權利要求50的方法，其中在卵殼的鈍端的小開口被引入于一個預定的位置。
53.權利要求52的方法，其中預定位置基本上位于氣室的中央。
54.權利要求50的方法，其中在卵殼和外殼膜中引入小開口的步驟基本上同步進行。
55.權利要求50的方法，該方法進一步包括在所述的釋放步驟之前測定胚盤的位置的步驟。
56.權利要求50的方法，其中遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
57.一種對多個鳥卵進行注射的方法，該方法所包括的步驟有使多個鳥卵朝向預定位置，其中各卵均含有胚盤；將一個小開口引入各個卵的卵殼；將一種遞送裝置通過各個卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿各個卵的內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并將物質(zhì)沉積在各個卵的胚盤位置或其緊鄰的位置；以及從各個卵中收回該裝置。
58.權利要求57的方法，該方法進一步包括對多個卵進行溫育直至孵化的步驟。
59.權利要求58的方法，其中所產(chǎn)生的孵化率至少約為50％。
60.權利要求58的方法，其中所產(chǎn)生的孵化率至少約為65％。
61.一種產(chǎn)生嵌合鳥類的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個預定位置；將一個小開口引入卵的卵殼；將一種遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放鳥類供體細胞并將供體細胞沉積在胚盤中或其緊鄰的位置，該步驟在足以產(chǎn)生嵌合胚的條件下進行；以及從卵中收回遞送裝置，對嵌合胚進行溫育以孵化產(chǎn)生嵌合鳥類。
62.權利要求61的方法，其中遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
63.一種產(chǎn)生轉基因鳥類的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個預定位置；將一個小開口引入卵的卵殼；將一種遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放含有一種核苷酸序列的物質(zhì)并將該物質(zhì)沉積在胚盤中或其緊鄰的位置，該步驟在足以產(chǎn)生轉基因胚的條件下進行；以及從卵中收回遞送裝置，對轉基因胚進行溫育以孵化產(chǎn)生轉基因鳥類。
64.一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個預定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上的卵殼引入一個小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個取樣裝置；以取樣裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在取樣裝置通過其插入之前基本完好；以取樣裝置從胚盤中收取樣本；以及從卵中收回取樣裝置。
65.一種對鳥卵進行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個預定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上的卵殼引入一個小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個檢測器裝置；以檢測器裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在檢測器裝置通過其插入之前基本完好；以檢測器裝置檢測來自卵內(nèi)部的信息；以及從卵中收回檢測器裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了改善的方法用于對含有胚的鳥卵進行注射，優(yōu)選的情況下該卵含有早期胚(例如胚盤)。本發(fā)明的方法可被用于向卵中遞送物質(zhì)、從卵中取樣和/或向卵內(nèi)插入檢測器裝置以從中收集信息。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明被用于向胚進行物質(zhì)的卵內(nèi)遞送。在其它的優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明被用于在卵內(nèi)產(chǎn)生嵌合或者轉基因鳥胚。
文檔編號A01K45/00GK1568366SQ02820305
公開日2005年1月19日 申請日期2002年8月7日 優(yōu)先權日2001年8月13日
發(fā)明者N·梅德杜, M·M·布蘭德, S·沃爾菲, J·H·赫蘭克, D·馬哈托 申請人:恩布里克斯公司