專利名稱：楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利屬于生物工程、生物遺傳工程技術(shù)，涉及一種楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
楊樹是退耕還林的主要樹種之一，具有適應(yīng)地域廣，生長速度快，成活率高、種植簡單等特點。國內(nèi)外均將其作為綠化環(huán)保的首要樹種，用于防風(fēng)固沙、保上留肥、防止土壤沙化。歐美許多發(fā)達(dá)國家運用轉(zhuǎn)基因等先進(jìn)手段對楊樹進(jìn)行改良研究。歐美楊107屬黑楊歐美楊雜交品種，起源于意大利，1984年引入我國，是從17個國家引進(jìn)的331個無性系中選育出來的6個新品種之一。特性特征是樹干高大通直、樹皮灰色較粗、分枝角度小、樹冠窄、側(cè)枝細(xì)、葉片小而密、滿冠；雌株。速生，胸徑年平均生長量3.5～5cm，樹高平均生長量3.5M，3～4年伐可作紙漿材及中小徑民用材，7～8年主伐可作于徑材。于徑通直、材質(zhì)優(yōu)良，其纖維長度和木材密度均優(yōu)于I-214楊等普通楊樹，是紙漿材和板材的優(yōu)良樹種，纖維長度1145μm，木材密度0.395，形率為0.66。樹冠窄，抗風(fēng)能力強(qiáng)，不易風(fēng)倒、風(fēng)折?？共∠x害，對光肩星天牛具有明顯抗性?？购?，最低溫-31℃可安全越冬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為增加楊樹對榆毒蛾幼蟲和天幕毛幼蟲的殺蟲活性，加快楊樹生長速度，降低主要病蟲害造成的損失，提高林木經(jīng)濟(jì)價值，提供一種楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)。
本發(fā)明楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)內(nèi)容簡述本發(fā)明楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)，其特征在于是以楊樹優(yōu)良品種歐美楊107(Populus×euramericana cl.“74/76”)為試材，采用楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)進(jìn)行了組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的外植體再生體系、進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，確定了葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗；試驗選用的材料為1、菌種和質(zhì)粒含Bt基因的植物表達(dá)載pCUBVgb轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404；
2、植物材料歐美楊107(Populus×euramericana cl.“74/76”)；3、供試?yán)ハx榆毒蛾(Leucoma candida Staudmder)幼蟲和天幕毛蟲幼蟲；4、主要化學(xué)試劑Km (卡那霉素)、Cb (羧芐青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR擴(kuò)增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA；5、培養(yǎng)基(1)、農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏( Beet Extract)5g/L；酵母提取物((YeastExtract)5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；固體則加入1.4％瓊脂，以1mol/LNaOH調(diào)pH值為7.2；(2)、植物組織培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度激素，配置各種培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；共培養(yǎng)培養(yǎng)基莖段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L葉片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L篩選分化培養(yǎng)基莖段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；葉片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg5mg/L+250mg/LCb；生根培養(yǎng)基MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；各培養(yǎng)基均含3％蔗糖和0.7％瓊脂，PH值為5.8，抗生素抽濾滅菌，其它成分高壓滅菌；楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)方法為1、潮霉素臨界濃度的確定設(shè)計6個潮霉素的濃度梯度0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在楊樹不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段，切成0.5cm大小，置于培養(yǎng)基中，一個月后觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；2、菌液的準(zhǔn)備(1)、菌種的活化從甘油管中挑取含有植物植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液劃線于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒溫箱中，過夜培養(yǎng)形成單菌落；(2)、菌液的培養(yǎng)從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于10mlYEB液體培養(yǎng)基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震蕩培養(yǎng)過夜，次日早晨取過夜培養(yǎng)的菌液0.8～1ml加至20ml新鮮的不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3～5h，至菌液濃度OD600＝0.3～0.5時，8000rpm離心5min，沉淀用MS液懸浮，并稀釋20～30倍即可用于轉(zhuǎn)化；3、葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹利用葉盤法(Horsch，1985)對楊樹進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，室溫下不斷搖動使外植體與菌液充分接觸10min，取出后用無菌濾紙吸去表面多于的菌液，放入鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25℃下暗培養(yǎng)2～3d，然后轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；4、菌液濃度及侵染時間對轉(zhuǎn)化效果的影響(1)、菌液濃度的影響取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD600值為0.1、0.3、0.5、0.8的農(nóng)桿菌菌液中侵染10min，觀察不同的菌液濃度對轉(zhuǎn)化效果的影響；(2)、侵染時間的影響取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD600值為0.3、0.5、的農(nóng)桿菌菌液中侵染10、20、30、40min，觀察不同侵染時間對轉(zhuǎn)化效果的影響；5、轉(zhuǎn)化植株的獲得經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養(yǎng)基上，在溫度為25～28℃，光/暗周期為16/8h的條件下培養(yǎng)兩周后，逐漸有抗性芽產(chǎn)生，將抗性芽同外植體一起繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，當(dāng)抗性芽長至2cm左右時，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；6、轉(zhuǎn)化植株的鑒定(1)、潮霉素抗性鑒定取轉(zhuǎn)化植株的葉片和非轉(zhuǎn)化對照植株的葉片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培養(yǎng)基上，觀察其分化狀況；將轉(zhuǎn)化芽與非轉(zhuǎn)化芽分別接種于含有Hyg7mg/L的繼代培養(yǎng)基中觀察其生長情況；(2)、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測質(zhì)粒DNA的提取挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5mlYEB液體培養(yǎng)基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)，28℃震蕩培養(yǎng)過夜，將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm離心3min，收集菌體；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na2，PH80)，以牙簽懸浮菌體，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，輕輕顛倒混勻，冰浴10～15min；10000rpm離心5min，上清用等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)反復(fù)抽提2～3次；水相轉(zhuǎn)入新管，加入兩倍體積的無水乙醇，混勻后于-20℃放置30min，10000rpm離心8min，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中；植物總DNA的提取取適量新鮮的植物葉片，置于研缽中加液氮迅速研磨成粉末，將研碎的樣品轉(zhuǎn)入無菌離心管中，立即加入400ulSDS提取緩沖液(100mM NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)輕輕混勻粉末，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)顛倒混勻，10000rpm離心4min，重復(fù)抽提2～3次，直至中間蛋白質(zhì)層看不見為止；吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，-20℃放置30min，有DNA沉淀產(chǎn)生；1000rpm離心5min沉淀DNA，去盡上清液，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中總DNA的PCR擴(kuò)增以轉(zhuǎn)化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合情況；擴(kuò)增引物為5′端引物5′-GGTAATGGTAACGCCATGCTCCTT 3′3′端引物5′-CCAGTTACTGCAACACTCGAGGCT 3′PCR反應(yīng)系統(tǒng)在0.5ml滅菌離心管中加入10×PCRbuffer 2ul4×dNTP(2mM)2ulPrimer1(10pmol/u1) 2ulPrimer2(10pmol/ul) 2ulTaq酶(1u/ul)1ul模板DNA(約25ng) 2ulD2H2O9ul總體積 20ul上封10ul石蠟油，按以下條件進(jìn)行35個循環(huán)94℃(denaturing)1min60℃(annealing) 30S72℃(exteuding) 1.5min反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測結(jié)果同時以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的107楊DNA的PCR產(chǎn)物為陰性對照；7、轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性測定將30頭一齡幼蟲放入瓶口封閉的玻璃瓶中，在20℃±2℃的人工氣候箱中飼養(yǎng)，每隔兩天換葉片一次，同時檢查昆蟲的死亡數(shù)并鑒別蟲齡；將存活的幼蟲稱重、計算幼蟲死亡率、校正死亡率、幼蟲平均體重；采用下列公式計算 8、轉(zhuǎn)基因植株苗其生長與形態(tài)觀察選擇抗蟲性強(qiáng)、中等、無顯著抗蟲性的轉(zhuǎn)基因系號，以及未轉(zhuǎn)基因(CK)等的嫩枝扦插小苗高20cm，栽植在苗圃試驗地上，每個系號40株、生長120天高生長停止后，逐株測定苗高；各系號選出最大值的5株，求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行檢驗，同時觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態(tài)。
本發(fā)明以楊樹優(yōu)良品種歐美楊107(Populus×euramericana cl.“74/76”)為試材，采用楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)進(jìn)行了組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的外植體再生體系、進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，確定了葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗，得到了20余萬株轉(zhuǎn)基因苗。2002年8月12-13日通過了遼寧省科學(xué)技術(shù)廳組織的科學(xué)技術(shù)成果鑒定，專家評定采用本發(fā)明可培育轉(zhuǎn)基因抗蟲及耐干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)沙的速生楊樹，可應(yīng)用于國家三北防護(hù)林建設(shè)以及綠化環(huán)保、防風(fēng)固沙等公用事業(yè)以及林紙一體化建設(shè)項目。轉(zhuǎn)基因楊比較一般楊樹具有抗蟲害、速生、纖維含量高等優(yōu)越性，在造林綠化、防止土地沙化等方面有廣闊的市場前景。
具體實施例方式
本發(fā)明楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)于2000年6月～2002年6月，進(jìn)行了上述實驗研究，由于用于基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌帶有抗潮霉素的基因，因此以潮霉素為篩選試劑來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，為了確定107楊對潮霉素的抗性，進(jìn)行了葉片及莖段對潮霉素抗性的臨界濃度的試驗，將均勻一致的葉片及莖段分另別置于含0、3、5、7、10、15mg/L的分化培養(yǎng)基上，觀察葉片及莖段對一系列濃度梯度潮霉素的反應(yīng)，培養(yǎng)30天后進(jìn)行統(tǒng)計，得出潮霉素臨界濃度的確定。Hyg(mg/L) 葉片表現(xiàn)狀況 莖段表現(xiàn)狀況0 深綠色，分化出大量綠色不定芽 深綠色，分化出大量綠色不定芽3 頭部失綠，出芽 深綠色，大量不定芽5 葉片變黃，部分壞死，不出芽 淡黃色，出芽7 葉片變黃，大部分壞死 莖段變黃，大部分壞死10 整個葉片枯死狀 整個莖段枯死狀15 整個葉片枯死狀 整個莖段枯死狀實驗證明外植體對潮霉素非常敏感，低濃度的潮霉素即抑制外植體不定芽的分化。在不含潮霉素的對照培養(yǎng)基，兩種外植體都產(chǎn)生大量綠色叢生芽。隨著潮霉素濃度的增大，引起外植體變黃，進(jìn)一步壞死，不定芽發(fā)生有多到少到完全不出芽。葉片在含Hyg3mg/L的分化培養(yǎng)基上，產(chǎn)生少量不定芽，但不定芽的顏色淡黃，隨著培養(yǎng)時間的延長，不定芽多數(shù)死亡，當(dāng)濃度為5mg/L時，葉片全部變黃，部分壞死，不能分化出芽，因此Hyg5mg/L為葉片不定芽的臨界濃度。莖段在含Hyg3mg/L的培養(yǎng)基上，可正常分化出大量不定芽，當(dāng)濃度為5mg/L時，莖段誘導(dǎo)不定芽的數(shù)量下降，并且芽的顏色多為淡黃色，繼續(xù)培養(yǎng)很難成活，當(dāng)Hyg的濃度大于7mg/L時，莖段大部分壞死，不能分化出芽，因此Hyg7mg/L可作為莖段不定芽發(fā)生的臨界濃度。
我們于2002年7月已在鞍山東四方臺生產(chǎn)基地栽植15000株實驗苗。將于2003年底在新疆栽植30萬畝，用于林紙一體化原材料基地建設(shè)，預(yù)計抗蟲及速生可比一般楊樹創(chuàng)利3億元人民幣。
權(quán)利要求
1.一種楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)，其特征在于是以楊樹優(yōu)良品種歐美楊107(Populus×euramericana cl.“74/76”)為試材，采用楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)進(jìn)行了組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的外植體再生體系、進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，確定了葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗；試驗選用的材料為(1)、菌種和質(zhì)粒含Bt基因的植物表達(dá)載pCUBVgb轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404；(2)、植物材料歐美楊107(Populus×euramericana cl.“74/76”)；(3)、供試?yán)ハx榆毒蛾(Leucoma candida Staudinder)幼蟲和天幕毛蟲幼蟲；(4)、主要化學(xué)試劑Km(卡那霉素)、Cb(羧芐青霉素)、Hyg(潮霉素)、Rif(利福霉素)；PCR擴(kuò)增引物、Taq酶、dNTP、buffecr、λDNA(5)、培養(yǎng)基(1)、農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YEB)蛋白胨(Peptone)5g/L；蔗糖(Sucrose)1g/L；牛肉膏(Beet Extract)5g/L；酵母提取物((Yeast Extract)5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；固體則加入1.4％瓊脂，以1mol/LNaOH調(diào)pH值為7.2；(2)、植物組織培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度激素，配置各種培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg7mg/L；共培養(yǎng)培養(yǎng)基莖段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L；葉片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L；篩選分化培養(yǎng)基莖段MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+Hyg7mg/L+250mg/LCb；葉片MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+Hyg 5mg/L+250mg/LCb；生根培養(yǎng)基MS+0.02mg/LIBA+Hyg5mg/L+Cb250mg/L；各培養(yǎng)基均含3％蔗糖和0.7％瓊脂，PH值為5.8，抗生素抽濾滅菌，其它成分高壓滅菌；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)，其特征在于楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)方法為(1)、潮霉素臨界濃度的確定設(shè)計6個潮霉素的濃度梯度0(CK)、3、5、7、10、15mg/L，在楊樹不定芽分化培養(yǎng)基中加入上述濃度的潮霉素，取生長健壯的無菌苗葉片及莖段，切成0.5cm大小，置于培養(yǎng)基中，一個月后觀察分化情況確定葉片及莖段對潮霉素的抗性濃度；(2)、菌液的準(zhǔn)備①、菌種的活化從甘油管中挑取含有植物植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液劃線于YEB平板上，(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)置于28℃恒溫箱中，過夜培養(yǎng)形成單菌落；②、菌液的培養(yǎng)從平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種于10mlYEB液體培養(yǎng)基(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rif50ug/ml)中，28℃180～200rpm震蕩培養(yǎng)過夜，次日早晨取過夜培養(yǎng)的菌液0.8～1ml加至20ml新鮮的不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3～5h，至菌液濃度OD600＝0.3～0.5時，8000rpm離心5min，沉淀用MS液懸浮，并稀釋20～30倍即可用于轉(zhuǎn)化(3)、葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹利用葉盤法(Horsch，1985)對楊樹進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化，取生長健壯的無菌苗葉片和莖段，切成0.5～1cm大小，投入到用MS液懸浮稀釋的菌液中，室溫下不斷搖動使外植體與菌液充分接觸10min，取出后用無菌濾紙吸去表面多于的菌液，放入鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25℃下暗培養(yǎng)2～3d，然后轉(zhuǎn)入選擇分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)、菌液濃度及侵染時間對轉(zhuǎn)化效果的影響①、菌液濃度的影響取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD600值為0.1、0.3、0.5、0.8的農(nóng)桿菌菌液中侵染10min，觀察不同的菌液濃度對轉(zhuǎn)化效果的影響；②、侵染時間的影響取楊樹無菌苗的莖段作為外植體，分別在OD600值為0.3、0.5、的農(nóng)桿菌菌液中侵染10、20、30、40min，觀察不同侵染時間對轉(zhuǎn)化效果的影響；(5)、轉(zhuǎn)化植株的獲得經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片及莖段外植體在芽選擇分化培養(yǎng)基上，在溫度為25～28℃，光/暗周期為16/8h的條件下培養(yǎng)兩周后，逐漸有抗性芽產(chǎn)生，將抗性芽同外植體一起繼續(xù)進(jìn)行選擇培養(yǎng)，當(dāng)抗性芽長至2cm左右時，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；(6)、轉(zhuǎn)化植株的鑒定①、潮霉素抗性鑒定取轉(zhuǎn)化植株的葉片和非轉(zhuǎn)化對照植株的葉片，切成0.5～1cm大小，放置含有Hyg5mg/L的分化培養(yǎng)基上，觀察其分化狀況；將轉(zhuǎn)化芽與非轉(zhuǎn)化芽分別接種于含有Hyg7mg/L的繼代培養(yǎng)基中觀察其生長情況；②、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測質(zhì)粒DNA的提取挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5mlYEB液體培養(yǎng)基中(含Km50ug/ml、Str50ug/ml、Rit50ug/ml)，28℃震蕩培養(yǎng)過夜，將菌液倒入1.5mlEppendorf管中，8000rpm離心3min，收集菌體；倒掉上清液，沉淀中加入10ul溶液1(50mM葡萄糖、25mMTris-Hcl，PH8.0，10mMEDTA-Na2，PH8.0)，以牙簽懸浮菌體，冰浴5～10min；加入200ul溶液2(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，輕輕顛倒混勻，冰浴10～15min；10000rpm離心5min，上清用等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)反復(fù)抽提2～3次；水相轉(zhuǎn)入新管，加入兩倍體積的無水乙醇，混勻后于-20℃放置30min，10000rpm離心8min，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中；植物總DNA的提取取適量新鮮的植物葉片，置于研缽中加液氮迅速研磨成粉末，將研碎的樣品轉(zhuǎn)入無菌離心管中，立即加入400ulSDS提取緩沖液(100mM NaCL，50mMEDTA，0.5％SDS，50mMTris，PH7.4)輕輕混勻粉末，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)顛倒混勻，10000rpm離心4min，重復(fù)抽提2～3次，直至中間蛋白質(zhì)層看不見為止；吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，-20℃放置30min，有DNA沉淀產(chǎn)生；1000rpm離心5min沉淀DNA，去盡上清液，沉淀吹干后溶于適量TE緩沖液中；總DNA的PCR擴(kuò)增以轉(zhuǎn)化植株中提取的植物總DNA為模板，用PCR儀檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的整合情況；擴(kuò)增引物為5′端引物5′-GGTAATGGTAACGCCATGCTCCTT 3′3′端引物5′-CCAGTTACTGCAACACTCGAGGCT 3′PCR反應(yīng)系統(tǒng)在0.5ml滅菌離心管中加入10×PCRbuffer2ul4×dNTP(2mM) 2ulPrimer1(10pmol/ul) 2ulPrimer2(10pmol/ul) 2ulTaq酶(1u/ul) 1ul模板DNA(約25ng) 2ulD2H2O 9ul總體積 20ul上封10ul石蠟油，按以下條件進(jìn)行35個循環(huán)94℃(denaturing) 1min60℃(annealing) 30S72℃(exteuding) 1.5min反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測結(jié)果；同時以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的107楊DNA的PCR產(chǎn)物為陰性對照，(7)、轉(zhuǎn)基因植株抗蟲活性測定將30頭一齡幼蟲放入瓶口封閉的玻璃瓶中，在20℃±2℃的人工氣候箱中飼養(yǎng)，每隔兩天換葉片一次，同時檢查昆蟲的死亡數(shù)并鑒別蟲齡；將存活的幼蟲稱重、計算幼蟲死亡率、校正死亡率、幼蟲平均體重；采用下列公式計算 (8)、轉(zhuǎn)基因植株苗其生長與形態(tài)觀察選擇抗蟲性強(qiáng)、中等、無顯著抗蟲性的轉(zhuǎn)基因系號，以及未轉(zhuǎn)基因(CK)等的嫩枝扦插小苗高20cm，栽植在苗圃試驗地上，每個系號40株、生長120天高生長停止后，逐株測定苗高；各系號選出最大值的5株，求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行檢驗，同時觀察生長正常的一年生和兩年生苗木的干形、分角、葉片形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程、生物遺傳工程技術(shù)，涉及一種楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)。其特征在于是以楊樹優(yōu)良品種歐美楊107為試材，采用楊樹轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)進(jìn)行了組培再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的外植體再生體系、進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，確定了葉片及莖段外植體對潮霉素抗性的臨界濃度、獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，組培快繁了大量轉(zhuǎn)基因楊樹苗；本發(fā)明可培育轉(zhuǎn)基因抗蟲及耐干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)沙的速生楊樹，應(yīng)用于國家三北防護(hù)林建設(shè)以及綠化環(huán)保、防風(fēng)固沙等公用事業(yè)以及林紙一體化建設(shè)項目。轉(zhuǎn)基因楊具有抗蟲害、速生、纖維含量高等優(yōu)越性，在造林綠化、防止土地沙化等方面有廣闊的市場前景。
文檔編號A01H4/00GK1398511SQ0213285
公開日2003年2月26日 申請日期2002年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者王寶全 申請人:遼寧生生生物技術(shù)股份有限公司