專利名稱：玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有廣譜殺蟲活性的玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種(Streptomyceroseoviolaceus var.roseoruber var.sp.nov.)，還涉及該玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲害防治中的廣泛應(yīng)用，其所造成的環(huán)境污染及公害也日趨嚴(yán)重。且化學(xué)農(nóng)藥的殘留造成的食物鏈中農(nóng)藥的蓄積不易控制，導(dǎo)致了大量藥源性疾病，降低了人們的生活質(zhì)量，損害了人民群眾的健康。在農(nóng)業(yè)出口創(chuàng)匯方面，農(nóng)藥殘留也降低了我國農(nóng)副產(chǎn)品的競爭能力。同時大量化學(xué)農(nóng)藥的使用導(dǎo)致部分有害生物出現(xiàn)抗藥性，不僅增加綜合治理的實施難度，而且也嚴(yán)重妨礙可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。上述化學(xué)農(nóng)藥所帶來的嚴(yán)重后果已廣為世人關(guān)注，也引起各國政府和科學(xué)家的高度重視。1990年，美國環(huán)保局撤消了對59種化學(xué)農(nóng)藥的登記，歐盟制定了減少化學(xué)農(nóng)藥的戰(zhàn)略計劃，一些國家規(guī)定直接食用的蔬菜等園藝作物不準(zhǔn)使用化學(xué)農(nóng)藥。1992年，世界糧農(nóng)組織召開生物農(nóng)藥全球大會，提出生物農(nóng)藥要占二十一世紀(jì)農(nóng)藥銷售量的60％。因此20世紀(jì)90年代全世界化學(xué)農(nóng)藥的銷售不斷下降，而可大規(guī)模生產(chǎn)，高效，無公害的微生物農(nóng)藥迅速發(fā)展并占有越來越多的份額。我國政府已將生物農(nóng)藥列為“中國21世紀(jì)議程”的優(yōu)先項目。
微生物殺蟲劑是來源于微生物的殺蟲劑，分自身和代謝產(chǎn)物兩大類，屬于天然產(chǎn)物。前者如蘇云金桿菌、病毒、真菌、線蟲，后者如Avermectin(阿維菌素)、Tracer(菜喜)等。蘇云金桿菌殺蟲劑防治害蟲取得很大成功，阿維菌素防治斑潛蠅等害蟲的卓越效果也引起廣泛關(guān)注。1997年，美國DowElanco公司推出由放線菌產(chǎn)生的Tracer，該產(chǎn)品毒性低，殺蟲活性高，殺蟲譜寬，被譽為殺蟲劑領(lǐng)域的重磅炸彈，又一次顯示了微生物殺蟲劑的巨大威力。
目前，已從微生物次級代謝產(chǎn)物中篩選到抗生素等生物活性物質(zhì)近萬種，其中大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的已達(dá)百種左右，經(jīng)濟(jì)效益可觀。但其中60％是由放線菌產(chǎn)生的。從放線菌中篩選的殺蟲抗生素如瀏陽霉素(Polynactin)，阿維菌素(Avermectin)等的基礎(chǔ)研究和商品化開發(fā)都已取得了令人睹目的成績。
生物源農(nóng)藥得到了全面的開發(fā)和廣泛的應(yīng)用，但其研究、開發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用都還存在一些突出的問題和困難，困撓著我國生物源農(nóng)藥的發(fā)展。如生物源農(nóng)藥擊倒速度慢，有效期短，相對殺蟲譜較窄，短期內(nèi)對害蟲種群控制力不強(qiáng)，不能迅速降低害蟲蟲口密度。相對殺蟲譜較窄，不利于一藥多治，如在蔬菜地出現(xiàn)多種害蟲時，便顧此失彼，力不從心，應(yīng)用推廣存在一定難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜殺蟲活性的玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種，具有殺蟲活性高，殺蟲譜寬，安全，從而開發(fā)出一種高效、低毒的微生物殺蟲劑。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種制備玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的制備方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施將從土壤中分離的一株放線菌，分別用兩種培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵液及其提取物通過棉鈴蟲和甜菜夜蛾兩種蟲害模型進(jìn)行生物活性篩選，其水相和脂相樣品對甜菜夜蛾有很強(qiáng)的殺死作用，對棉鈴蟲作用微弱，其脂相提取樣品還對菜青蟲、小菜蛾、松毛蟲、蚜蟲、孑孓表現(xiàn)一定的殺蟲活性，并對蚜蟲有一定的忌避作用。因此該菌的發(fā)酵樣品可用于農(nóng)作物及森林的有害生物的綜合防治中，確保農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收及可持續(xù)發(fā)展的重要保障，并且與提高生物多樣性和保護(hù)環(huán)境，確保人畜健康息息相關(guān)。結(jié)合表型分類(形態(tài)和生理生化特征)，化學(xué)分類和分子分類等多種方法對該株放線菌進(jìn)行多相分類，結(jié)果表明該菌屬于鏈霉菌屬的新種，因該放線菌是從大理采集的土壤中分離，所以將其命名為玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種(Streptomyce roseoviolaceus var.roseoruber var.sp.nov.該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M201030)。
其步驟是1、將所采集的土樣經(jīng)120℃干熱預(yù)處理1小時，可減少真菌、細(xì)菌的數(shù)量，增加孢子放線菌的出現(xiàn)率。
2、將經(jīng)預(yù)處理的土樣用無菌水稀釋到一定濃度，涂布在分離培養(yǎng)基1和分離培養(yǎng)基2上，在28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，3-7日挑選單菌落，在38號培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
3、分離的純菌株分別用KN-1和KN-2培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液的水相和脂相樣品都用于生物篩選，這樣就不會造成活性物質(zhì)的漏篩。
4、發(fā)酵液即為水相樣品，發(fā)酵液用乙酸乙酯提取的樣品為脂相樣品。
5、將水相樣品或脂相樣品與人工飼料，靶標(biāo)昆蟲卵塊混合培養(yǎng)，分別于1天，2天，4天觀察卵塊的孵化情況、蟲體的大小及蟲子的死亡情況。
6、樣品有活性的菌株結(jié)合表型分類(形態(tài)和生理生化特征)，化學(xué)分類和分子分類等多種方法對其進(jìn)行多相分類。
7、篩選模型。
玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的性質(zhì)根據(jù)上述實施方法，得到一株有殺蟲活性的放線菌，經(jīng)多相分類鑒定為鏈霉菌屬玫瑰紫鏈霉菌的變種，命名為玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種(Streptomyceroseoviolaceus var.roseoruber var.sp.nov.)，該菌株于是2001年8月30日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC NO.M201030。
1、玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的殺蟲活性該菌株用兩種發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)得到的水相及脂相樣品對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera簡寫為Ha)有較強(qiáng)的殺死作用，對甜菜夜蛾(Spodptera exiaua，簡寫為Se)殺死作用高效，結(jié)果如下。


2.玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的性質(zhì)(1)形態(tài)特征菌株用ISP5培養(yǎng)基埋片培養(yǎng)15天后，用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察菌絲的形態(tài)和孢子形態(tài)，表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明該菌株的基絲生長發(fā)育良好，多分枝，不形成橫隔也不斷裂。氣絲豐富，短孢子絲成叢或成簇，輪生或?qū)ι跉饨z上，頂端成鉤狀。孢子絲鏈分化為孢子，孢子圓形或橢圓形(0.2-0.5×0.2-0.3um)，表面光滑。
(2)在各種培養(yǎng)基上的特征28℃培養(yǎng)接種后，分別于第7、15、30天觀察三次，以《The ISCC-NBS COLOR CHARTS Standard samples NO2106》(Kelly，1964)色譜作為顏色描述的標(biāo)準(zhǔn)。
①察氏瓊脂(Czapeks agar)氣生菌絲 生長好，淺粉紅色營養(yǎng)菌絲 深紅色可溶性色素 無②甘油—門冬酰胺瓊脂(ISPNO5)氣生菌絲 生長中等，淺粉紅色營養(yǎng)菌絲 深紅色可溶性色素 無③無機(jī)鹽—淀粉瓊脂(ISPNO4)氣生菌絲 生長差，灰白色營養(yǎng)菌絲 深粉紅色可溶性色素 無④酵母膏—麥芽膏瓊脂(ISPNO2)氣生菌絲 生長好，灰白色營養(yǎng)菌絲 淺桔黃色可溶性色素 無⑤燕麥片瓊脂(ISPNO3)氣生菌絲 生長中等，桔紅色營養(yǎng)菌絲 深紅色可溶性色素 無⑥鈴薯浸脂瓊脂氣生菌絲 生長好，淺粉紅色營養(yǎng)菌絲 桔紅色可溶性色素 無(3)生理生化特征①明膠液化+(有黑色褐色素)②牛奶凝固+牛奶胨化-③淀粉水解+④硫化氫產(chǎn)生+⑤色素產(chǎn)生+(4)碳源利用很好利用D-果糖，D-阿拉伯糖，D-肌醇，甘油及甘露醇較好利用木糖不利用L-鼠李糖，蔗糖及棉籽糖(5)細(xì)胞化學(xué)組分純細(xì)胞壁中LL-DAP及meso-DAP均含有，并含有Asp及Gly；其全細(xì)胞壁水解物含半乳糖；少量葡萄糖，核糖，阿拉伯糖。
(6)16SrDNA序列①測序試劑盒Big DyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit(PERKIN ELMER)；②測序分析儀器ABIPRSMTM377 DNA Sequencer。③測序引物KMS098PBlr(5’-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)；KMS098PDr(5’-TAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)；KMS098PDr(5’-GGGTTGCGCTCGTTG-3’)；KMS098PCr(5’-TCTGCGCATTTCACCGCTAC-3’).④序列，共計1503bpccgttcgacgagctcagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatacaaccaccggccgcatggtctggtggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtagaagctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggttgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcactaggtgtgggcaacattccacgttgtccgtgccgcagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacgtctggagacaggcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcccgtgttgccagcaggcccttgtggtgctggggactcacgggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgcgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgo
agatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccccttgtggggagggagctgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagc本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果(1)設(shè)計的生物篩選方法具有快速，靈敏，樣品量小，重復(fù)性好等優(yōu)點，適于大規(guī)模初篩；(2)本研究選擇鱗翅目的兩種主要危害昆蟲(棉鈴蟲和甜菜夜蛾)為靶標(biāo)昆蟲，具有農(nóng)業(yè)上的重要性，既有經(jīng)濟(jì)意義也有市場需求，有利于產(chǎn)品將來的開發(fā)、生產(chǎn)及推廣；(3)該生物篩選模型將生測樣品與人工飼料，靶標(biāo)昆蟲卵塊混合培養(yǎng)，分別于1天，2天，4天觀察，可得到樣品的殺卵、殺蟲、抑制、忌避等多種毒力學(xué)數(shù)據(jù)和毒力學(xué)信息，這些生物測定的反饋信息對農(nóng)藥分子的設(shè)計與結(jié)構(gòu)優(yōu)化，對促進(jìn)開發(fā)新的作用機(jī)制的合理性生物農(nóng)藥具有指導(dǎo)意義；(4)生物篩選直接以活體昆蟲為材料，比離體測定方法更直觀，更接近實際。
4、玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的脂相提取物對棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲、小菜蛾、松毛蟲，蚜蟲，孑孓都表現(xiàn)一定的殺蟲活性，對棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲、小菜蛾、松毛蟲作用高效，對蚜蟲有一定的忌避作用。
具體實施例方式
1.菌種的分離和培養(yǎng)分離前將土樣用120℃高溫干熱處理一小時，然后采用兩種分離方法進(jìn)行預(yù)處理1)6％酵母浸汁加入5umol磷酸緩沖液中，在40℃處理20分鐘；2)用6％酵母浸汁，0.1％SDS，2mgNA(萘啶酸)處理。分離培養(yǎng)基采用營養(yǎng)瓊脂，分別加入20ppmNA或50ppm重鉻酸鉀作為選擇抑制劑，在28℃培養(yǎng)，3-7日挑選特殊形態(tài)無污染的單菌落，最后在38號培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
(1)分離培養(yǎng)基1可溶性淀粉1％，酪素0.03％，硝酸鉀0.2％，7水硫酸鎂0.005％，氯化鈉20％，磷酸氫二鉀0.2％，碳酸鈣0.002％，硫酸鐵0.001％，水78％，pH7.0；培養(yǎng)溫度28℃。
(2)分離培養(yǎng)基2(ISP5)L-天門冬酰胺0.1％，甘油1％，磷酸氫二鉀0.1％，微量鹽溶液1毫升，復(fù)合維生素0.000375％，氯化鈉15％，水84％，pH＝7.0-7.4，培養(yǎng)溫度28℃。
(3)38號培養(yǎng)基酵母浸膏0.4％，葡萄糖0.4％，麥芽浸膏0.5％，維生素B10.0001％，維生素B60.0001％，核黃素0.0001％，煙酸0.0001％，苯丙氨酸0.0001％，生物素0.0001％，丙氨酸0.03％，水98.7％，pH7.2，培養(yǎng)溫度28℃。
2.菌種的搖瓶發(fā)酵將分離的純菌株分別用KN-1和KN-2培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，搖瓶裝量為100ml，搖床轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間為7天，取樣涂片顯微鏡觀察，無污染且菌株生長良好的發(fā)酵液用于提取。
(1)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基KN-1豆粕2％，蛋白胨0.2％，葡萄糖2％，淀粉0.5％，酵母膏0.2％，磷酸氫二鉀0.05％，硫酸鎂0.05％，碳酸鈣0.2％，氯化鈉0.4％，pH7.8.
(2)搖瓶發(fā)酵掊養(yǎng)基KN-2葡萄糖1％，可溶性淀粉1％，豆粕2.5％，酵母膏0.3％，氯化鈉0.2％，碳酸鈣0.5％，pH7.0.
3.發(fā)酵液的提取取5ml發(fā)酵液(親水性物質(zhì))用于生物測定；剩余的發(fā)酵液全部移入50ml體積的離心管中，5000rpm離心10分鐘，棄上清，下層菌絲體加入25ml乙酸乙酯后用細(xì)胞搗碎機(jī)勻漿，密封管口，室溫下浸泡12小時后5000rpm離心10分鐘使之分層，將有機(jī)相(上層)移入50ml玻璃杯中，在真空干燥箱中蒸發(fā)乙酸乙酯，再加入5ml甲醇使提取物溶解。取0.6ml甲醇溶解液于Eppendorf管中，其余4.4ml溶解液移入5ml離心管中一并干燥蒸發(fā)甲醇，Eppendorf管中的樣品(疏水性物質(zhì))用于生物測定，離心管中的樣于-20℃貯存。
4.生物測定將疏水性樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解后用蒸餾水稀釋至一定濃度作為生測樣品，親水性樣品(發(fā)酵液)直接作為生測樣品。將待生測樣品與試蟲人工飼料混合，將一定量標(biāo)靶昆蟲的卵塊或初孵幼蟲放入其中，其間觀察供試?yán)ハx的反應(yīng)癥狀(卵塊孵化，存活，取食，個體大小等)，并分別于生測4天后檢查死亡率及活蟲的大小，并與對照比較。
權(quán)利要求
1.一種玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種，其特征在于玫瑰鏈霉菌玫瑰紅變種Streptomyce roseoviolaceus var.roseoruber var.sp.nov.CCTCC NO.M201030。
2.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種的制備方法，包括下列步驟A、將采集的土樣經(jīng)120℃干熱預(yù)處理1小時；B、將經(jīng)預(yù)處理的土樣用無菌水稀釋濃度，涂布在分離培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，3-7日挑選單菌落，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)；C、分離的純菌株分別用KN-1和KN-2培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液的水相和脂相樣品用于生物篩選，不造成活性物質(zhì)的漏篩；D、發(fā)酵液為水相樣品，發(fā)酵液用乙酸乙酯提取樣品；E、將水相樣品或脂相樣品與人工飼料，靶標(biāo)昆蟲卵塊混合培養(yǎng)；F、樣品有活性的菌株結(jié)合表型分類、化學(xué)分類和分子分類；G、篩選模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玫瑰紫鏈霉菌玫瑰紅變種及制備方法，玫瑰鏈霉菌玫瑰紅變種Streptomyce roseoviolaceusvar.roseoruber var.sp.nov.CCTCC NO.M201030。將土樣經(jīng)干熱預(yù)處理，用無菌水稀釋濃度，涂布在分離培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基上，在恒溫箱中倒置培養(yǎng)，挑選單菌落，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離的純菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液的水相和脂相樣品用于生物篩選，再將水相樣品與人工飼料、靶標(biāo)昆蟲卵塊混合培養(yǎng)。本發(fā)明具有快速、靈敏、樣品量小、重復(fù)性好，具有殺蟲活性高，殺蟲譜寬，安全，對棉鈴蟲、甜菜夜蛾、菜青蟲、小菜蛾、松毛蟲作用高效。
文檔編號A01N63/00GK1443843SQ0211558
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者謝天鍵, 劉華梅, 楊和文, 張述, 謝翔, 季琦曄 申請人:武漢東湖高新集團(tuán)股份有限公司