專利名稱：一種快速棉花轉(zhuǎn)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于新植物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棉花轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng)域。
目前棉花的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有以下幾類方法一是利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花的下胚軸(1987，Umbek，et al)，二是利用花粉管通道法(1981黃駿麒等)轉(zhuǎn)化棉花，三是基因槍轟擊愈傷組織轉(zhuǎn)化棉花(1990，F(xiàn)iner，et al)。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花下胚軸主要存在的問題有一是從下胚軸到植株再生需要的時間較長，一般要8個月以上，二是利用農(nóng)桿菌侵染下胚軸，會影響愈傷的獲得，同時獲得的轉(zhuǎn)化塊也較少。利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化棉花則存在轉(zhuǎn)化頻率低重復(fù)性不好，并且轉(zhuǎn)化體也有限。利用基因槍轟擊愈傷組織則嵌合體較多，且轉(zhuǎn)化的外源基因多拷貝居多易導(dǎo)致基因沉默，遺傳穩(wěn)定性差，而且實驗成本高。
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的不足，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷轉(zhuǎn)化棉花，既結(jié)合了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的優(yōu)點，又克服了周期長，轉(zhuǎn)化體少的缺點，因而可以提高棉花轉(zhuǎn)基因育種的效率。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)棉花轉(zhuǎn)基因的方法，利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)棉花下胚軸獲得愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，以所得到的胚性愈傷組織作為根癌農(nóng)桿菌感染受體，通過選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷，然后再生植株，經(jīng)分子檢測，獲得抗衰老轉(zhuǎn)基因棉花。
所述的農(nóng)桿菌和胚性愈傷組織的共培養(yǎng)溫度為16-26℃。
利用0.01％的HgCl2對農(nóng)桿菌感染的胚性愈傷組織處理5-10min，可一次性脫除農(nóng)桿菌，而胚性愈傷組織的生長不會受到影響。
附圖及其說明附


圖1，是本發(fā)明的愈傷組織生長狀態(tài)圖；附圖2，是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因愈傷PCR檢測結(jié)果；圖中，1Marker(GenrulerTM 100BP DNAladder)；2～11轉(zhuǎn)化愈傷克隆；12陰性對照；13質(zhì)粒附圖3，是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因材料Southern雜交結(jié)果，圖中DNA經(jīng)Xab I酶切，以SAG12基因-擴增片段560bp作標記探針。泳道1Mark(λDNA/HindIII)；2陰性對照；3陽性對照；4～7轉(zhuǎn)化植株以下結(jié)合說明書及附圖對本發(fā)明作進一步描述1、農(nóng)桿菌活化菌株經(jīng)菌落篩選后，在LB液體培養(yǎng)基活化12小時，然后接種LB固體培養(yǎng)基上，在28℃暗培養(yǎng)兩天，然后將其刮入加有20mg/L的乙酰丁香酮(AS)MGL(每升含5g胰化蛋白胨，5gNaCl，0.1gMgSO4.7H2O，0.25g KH2PO4，5g甘露醇，1.16g甘氨酸鈉)培養(yǎng)基中，240rpm振蕩培養(yǎng)2小時，用MSB液體培養(yǎng)基稀釋到含菌量為108～1010個/L左右.(OD600＝0.4～0.8)2、取活性高的胚性愈傷，放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮菌液，浸泡5-10min，同時抽真空一次，過程中搖動瓶子數(shù)次，倒干菌液，用滅菌吸水紙吸干表面，然后接入共培養(yǎng)基中，置于16-26℃，暗培養(yǎng)兩天，此時在培養(yǎng)基接觸外植體的部分可見少量菌液。
3、抗性材料的篩選將共培養(yǎng)處理的愈傷附加500mg/L頭孢霉素(或利用氯化汞脫菌，見后)和50mg/L的卡那霉素選擇培養(yǎng)基上，繼代2-3次；之后將卡那霉素抗性愈傷繼代和懸浮培養(yǎng)。
4、植株再生，將胚狀體轉(zhuǎn)移入分化培養(yǎng)基，再生成苗后將再生苗移入成苗培養(yǎng)基中。
5、轉(zhuǎn)基因苗的鑒定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得先用卡拉霉素2％的溶液涂抹新生葉片作初步篩選，再作PCR檢測，最后進行Southern分析。
利用上述方法本發(fā)明已成功地獲得抗衰老轉(zhuǎn)基因棉花Coker201(ipt)，鄂抗3號(ipt)和YZ1(ipt)。其中YZ1為一種超雞腳葉陸地棉品系。
本發(fā)明的效果1、利用胚性愈傷組織作為感染受體能夠大幅度提高棉花轉(zhuǎn)化效率，是其他方法所不能比擬的。
2、轉(zhuǎn)化的周期大大縮短，通常情況下獲得轉(zhuǎn)基因植株需要一年或更長時間，本發(fā)明可在6個月內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化體可大幅度增加。這樣能夠把T-DNA插入轉(zhuǎn)化變?yōu)楝F(xiàn)實，從而能夠創(chuàng)造大量的插入突變體為功能基因組的研究準備了技術(shù)平臺。
3、利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷在半年內(nèi)能夠得到上千個轉(zhuǎn)化體，在同樣的工作量下，比介導(dǎo)下胚軸在一年內(nèi)拿到的轉(zhuǎn)化體效率高200倍左右，比基因槍法和花粉管介導(dǎo)法要高400倍左右。
4、利用低濃度HgCl2處理，可一次性脫除農(nóng)桿菌，而胚性愈傷仍能恢復(fù)生長，這不但解決了其他抗生素多次抑制農(nóng)桿菌的生長導(dǎo)致影響愈傷組織的后期分化，而且也節(jié)省了昂貴的抗生素，具有一定的經(jīng)濟價值。
利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因棉花。利用此方法把異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入受體棉花Coker201、鄂抗3號和YZ1品種，獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，具體步驟如下1轉(zhuǎn)化受體狀態(tài)的選擇愈傷組織的生理狀態(tài)對于高效轉(zhuǎn)化非常重要?？偟膩碚f，分生組織及伴有活躍細胞分裂的外植體對農(nóng)桿菌的侵染最敏感，即生長和分裂旺盛的細胞是接受外源DNA的感受態(tài)。愈傷組織日生長量一定程度上可反應(yīng)細胞的分裂速度。選擇生長較一致的自然分散、顏色鮮黃的胚性愈傷組織0.3g轉(zhuǎn)入D1分化培養(yǎng)基中，共設(shè)5個處理，每一處理設(shè)3次重復(fù)，隔3天稱1個處理的愈傷鮮重，愈傷生長速度(g/d)＝(愈傷生長量-愈傷初始量)/生長天數(shù)。
當繼代12天時，愈傷生長速度最快(
圖1)。因此繼代10～12天的處于活躍分裂狀態(tài)的顆粒狀、淡黃色、疏松愈傷組織是轉(zhuǎn)化的良好受體。試驗結(jié)果也證明，繼代10天的愈傷轉(zhuǎn)化效率(80.3％)比20天的轉(zhuǎn)化效率(62.8％)高。2菌液濃度對轉(zhuǎn)化率的影響就瞬時表達效果來看，菌液濃度越高其轉(zhuǎn)化效率也越高，但是菌液濃度過高在培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌較難抑制，容易再度污染愈傷(表1)，而且農(nóng)桿菌濃度過高容易產(chǎn)生大量的有毒物質(zhì)而導(dǎo)致受體細胞的死亡，因此并不是農(nóng)桿菌菌液濃度越高，則抗性愈傷率越高。實驗結(jié)果(表1)也表明0.3～0.5O.D.濃度的菌液侵染愈傷組織能獲得較高的抗性愈傷率(見表1所示)。
表1 菌液濃度對抗性愈傷率的影響Table 1 The effect of Agrobacterium concentrationon frequeucy of resistant-callus菌液濃度 處理 污染 抗性 抗性愈傷 共培養(yǎng)后瞬時(OD值) 愈傷塊數(shù) 愈傷塊數(shù) 愈傷塊數(shù) 率(％)表達效果0.1 801 13 16.25低0.3 150 5 117 78.00高0.5 170 18136 80 高1.0 906915 16.67100％1.5 110 8319 17.27100％注污染愈傷塊數(shù)指農(nóng)桿菌沒抑制住而再度污染愈傷組織3抗性愈傷組織的篩選共培養(yǎng)后，采用HgCl2處理，可以徹底消除農(nóng)桿菌，從而避免了使用抗生素脫菌，見表3所示。利用HgCl2代替昂貴的頭孢霉素或羧芐青霉素是可行的，并且脫菌干凈，以后很少再返菌，是一種較好的脫菌劑。
表2 利用HgCl2脫菌及愈傷的恢復(fù) 抗性愈傷組織的選擇是整個轉(zhuǎn)化實驗的關(guān)鍵之一，有效的篩選不但可以減少轉(zhuǎn)化體的丟失，而且可以大大減輕后期分子檢測時的工作量。
將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，每三周繼代一次。愈傷組織剛轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上時，大多數(shù)愈傷都有點變褐，但發(fā)褐的愈傷中嵌合著少量淡黃的愈傷。因此第一輪選擇一般不淘汰。在第二輪選擇時，淘汰完全褐化的愈傷塊。并將繁殖的克隆進行第三輪選擇后，進行液體選擇15天(Km為100mg/L)。在懸浮培養(yǎng)時每個細胞都與選擇培養(yǎng)基中的高濃度Km充分接觸，這樣可以嚴格淘汰嵌合體。
因此前幾輪篩選不宜過嚴。待轉(zhuǎn)化愈傷繁殖成克隆時進行嚴格篩選后就可不加選擇壓，這樣有利于胚狀體分化成苗。4抗性愈傷組織DNA的分子檢測結(jié)果圖2是用啟動子SAG12特異引物擴增的結(jié)果。從圖可以看出，未轉(zhuǎn)化對照沒有擴增帶，而10個轉(zhuǎn)化克隆和質(zhì)粒均擴增出一條大小約560bp的特異帶，說明外源SAG12基因已經(jīng)整合進細胞的基因組中。Southern的結(jié)果(圖3)進一步證明了PCR分析的結(jié)論，4個克隆愈傷組織和質(zhì)粒均有陽性信號出現(xiàn)，而對照沒有。
權(quán)利要求
1.一種棉花轉(zhuǎn)基因的方法，利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)棉花下胚軸獲得愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，其特征在于，利用所得到的胚性愈傷組織作為農(nóng)桿菌感染受體，通過選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷，然后再生植株，經(jīng)分子檢測，獲得抗衰老轉(zhuǎn)基因棉花。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，農(nóng)桿菌和胚性愈傷組織的共培養(yǎng)溫度為16-26℃。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，利用0.01％的HgCl2對農(nóng)桿菌感染的胚性愈傷組織處理5-10min，可一次性脫除農(nóng)桿菌，而胚性愈傷組織的生長不會受到影響。
全文摘要
本發(fā)明屬于棉花轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng)域。其特征是，利用組織培養(yǎng)誘導(dǎo)棉花下胚軸獲得愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，以所得到的胚性愈傷組織作為農(nóng)桿菌感染受體，通過選擇培養(yǎng)基篩選獲得抗性愈傷，然后再生植株，經(jīng)分子檢測，獲得抗衰老轉(zhuǎn)基因棉花。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明能夠大幅度提高棉花轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化的周期大大縮短，可在6個月內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化體可大幅度增加。已成功獲得抗衰老轉(zhuǎn)基因(ipt)棉花Coker201(ipt)、鄂抗3號(ipt)和YZ
文檔編號A01H4/00GK1404723SQ0113108
公開日2003年3月26日 申請日期2001年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者張獻龍, 聶以春, 陳妹幼, 吳家和 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)