專利名稱：殺蟲蛋白的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參考本申請(qǐng)是1999年8月20日提交的美國流水號(hào)09/378,088的部分延續(xù)中請(qǐng)。
背景技術(shù)：
鞘翅目是一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲，每年都引起嚴(yán)重的作物損失。鞘翅目昆蟲的例子有玉米根蟲和苜蓿象鼻蟲(alfalfa weevil)。
苜蓿象鼻蟲—紫苜蓿葉象(Hypera postica)及其近親埃及苜蓿葉象(Hypera brunneipennis)是在美國種植的苜蓿的最重要的昆蟲害蟲，1984年有290萬英畝遭到感染。每年花費(fèi)合計(jì)2千萬美元用于控制這些害蟲。埃及苜蓿葉象是美國西南部的主要種類，它在炎熱的夏天在此夏蟄(即夏眠)。在所有其它方面，它與在美國其它地區(qū)占優(yōu)勢(shì)的苜蓿象鼻蟲是一樣的。
幼蟲階段是象鼻蟲生活史中最具破壞性的階段。通過取食苜蓿的生長(zhǎng)芽尖，幼蟲引起葉片的骨骼化、矮化、降低植物生長(zhǎng)、并最終降低產(chǎn)量。嚴(yán)重的感染可以毀滅整個(gè)苜蓿條。同樣取食葉片的成蟲引起額外的、但是較小的損傷。
每年美國有大約1千萬英畝的玉米感染玉米根蟲物種復(fù)合體。玉米根蟲物種包括北方玉米根蟲—長(zhǎng)角葉甲(Diabrotica barberi)、南方玉米根蟲—黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctata howardi)、和西方玉米根蟲—玉米幼芽根葉甲(D.virgifera virgifera)。這些葉甲物種居于土壤中的幼蟲取食玉米的根，引起倒伏。倒伏最終降低了玉米產(chǎn)量，并常常導(dǎo)致植株的死亡。成年甲蟲通過取食玉米穗絲降低了授粉，并由此對(duì)玉米單株產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。另外，葉甲屬的成蟲和幼蟲還攻擊葫蘆類農(nóng)作物(黃瓜、甜瓜、南瓜等等)、和商業(yè)性生產(chǎn)的許多蔬菜和田間農(nóng)作物，以及家園種植物。
已通過諸如輪作和高水平氮的應(yīng)用等刺激不定根系生長(zhǎng)的耕作方法，部分致力于對(duì)玉米根蟲的控制。然而，化學(xué)殺蟲劑嚴(yán)重依賴于確保實(shí)現(xiàn)期望的控制水平，殺蟲劑結(jié)合或摻入到土壤中。使用一些化學(xué)殺蟲劑的相關(guān)問題是環(huán)境污染和處理的昆蟲種群中的抗性發(fā)展。
土壤微生物蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)，是一種形成芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，其特征為含有伴孢晶體蛋白質(zhì)內(nèi)含物，在顯微鏡下表現(xiàn)為獨(dú)特形狀的晶體。B.t.的某些菌株產(chǎn)生對(duì)特定目的害蟲有毒的蛋白質(zhì)。已經(jīng)分離得到某些B.t.毒素基因，并進(jìn)行了測(cè)序，而且已經(jīng)生產(chǎn)了基于重組DNA的B.t.產(chǎn)品并批準(zhǔn)使用。另外，通過基因工程技術(shù)，正在發(fā)展將這些B.t.內(nèi)毒素投遞到農(nóng)業(yè)環(huán)境中的新方法，包括用內(nèi)毒素基因?qū)⒅参锝?jīng)基因工程改造成具有昆蟲抗性的應(yīng)用，和將穩(wěn)定的完整微生物細(xì)胞作為B.t.內(nèi)毒素投遞載體的應(yīng)用(F.H.Gaertner和L.KimTIBTECH 6S4-S7)。由此，分離的B.t.內(nèi)毒素基因日益具有商業(yè)價(jià)值。
B.t.殺蟲劑的商業(yè)性使用最初被限制于小范圍的鱗翅目(毛蟲)害蟲。蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克亞種(B.thuringiensis subsp.kurstaki)的芽孢和晶體制備物，作為針對(duì)鱗翅目害蟲的商業(yè)性殺蟲劑，已經(jīng)使用了許多年。例如，蘇云金芽孢桿菌庫爾斯塔克HD-1變種(B.thuringiensis var.kurstaki HD-1)可產(chǎn)生對(duì)許多鱗翅目昆蟲的幼蟲有毒的結(jié)晶狀δ-內(nèi)毒素。
在最近幾年中，然而，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對(duì)更廣范圍的害蟲具有特異性的B.t.殺蟲劑。例如其它B.t.物種即以色列亞種和粉菌變種(a.k.a.B.t.M-7，a.k.a.B.t.san diego)，已經(jīng)分別商業(yè)性應(yīng)用于控制雙翅目和鞘翅目昆蟲(F.H.Gaertner“殺蟲蛋白的細(xì)胞投遞系統(tǒng)活的和死的微生物”，《農(nóng)作物保護(hù)劑的受控投遞》，R.M.Wilkins編，Taylor and Francis，紐約和倫敦，第245-255頁，1990)。還可以參閱T.L.Couch(1980)“蘇云金芽孢桿菌以色列變種的蚊子致病性”，工業(yè)微生物學(xué)的發(fā)展(Developments inIndustrial Microbiology)，2261-76；C.C.Beegle(1978)“蟲生細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用”，工業(yè)微生物學(xué)的發(fā)展，2097-104；A.Krieg、A.M.Huger、G.A.Langenbruch、W.Wchnetter(1983)Z.ang.Ent.96500-508描述了據(jù)報(bào)導(dǎo)對(duì)兩種鞘翅目甲蟲(Colorado potato beetle，馬鈴薯葉甲[Lepinotarsa decemlineata]和藍(lán)毛臀螢葉甲[Agelastica alni])有活性的蘇云金芽孢桿菌粉菌變種(Bacillus thuringiensis var.tenebrionis)。
最近，已經(jīng)鑒定了B.t.新亞種，而且已經(jīng)分離得到了負(fù)責(zé)有活性的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的基因(H.Hfte，H.R.Whiteley微生物學(xué)回顧(Microbiological Reviews)52(2)242-255)。Hfte和Whiteley將B.t.晶體蛋白質(zhì)基因分成四個(gè)主要種類CryI(鱗翅目特異的)、CryII(鱗翅目和雙翅目特異的)、CryIII(鞘翅目特異的)、和CryIV(雙翅目特異的)。已經(jīng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了對(duì)其它害蟲有特異毒性的株系(J.S.Feitelson、J.Payne、和L.Kim生物技術(shù)(Bio/Technology)10271-275)。
Hfte和Whiteley對(duì)晶體蛋白質(zhì)的1989年命名和分類方案，是基于推導(dǎo)的氨基酸序列和毒素的宿主范圍。該方案覆蓋了14種不同類型的毒素基因，分成五個(gè)主要種類。隨著更多的毒素基因被發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有類似序列的基因卻具有明顯不同的殺蟲特異性，因此該方案逐漸變得不適用。已有人提出一種改進(jìn)的基于氨基酸同一性的命名方案(Crickmore等人無脊椎動(dòng)物病理學(xué)會(huì)，第29屆年會(huì)，第3次國際蘇云金芽孢桿菌研討會(huì)，University of Cordoba，西班牙，9月1-6日，摘要)。除了cytA和cytB(仍作為單獨(dú)的一類)外，所有毒素基因都保留了助記符“cry”。第一級(jí)的羅馬數(shù)字換成了阿拉伯?dāng)?shù)字，去掉了第三級(jí)中的括號(hào)。目前的界線表示大約95％(第三級(jí))、75％(第二級(jí))、和48％(第一級(jí))的序列同一性。除了提到的例外情況，許多原始名字得到了保留，但有些被重新分類。還可以參閱N.Crickmore、D.R.Zeigler、J.Feitelson、E.Schnepf、J.Van Rie、D.Lereclus、.J.Baum、和D.H.Dean(1998)“蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白質(zhì)命名法修改”，微生物學(xué)及分子生物學(xué)回顧(Microbiology and Molecular Biology Reviews)第62卷807-813；和Crickmore、Zeigler、Feitelson、Schnepf、Van Rie、Lereclus、Baum、和Dean，“蘇云金芽孢桿菌毒素命名法”(1999)http//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html。該系統(tǒng)使用免費(fèi)的軟件程序CLUSTAL W和PHYLIP。PHYLIP程序包中的NEIGHBOR應(yīng)用程序采用算術(shù)均值(UPGMA)算法。
在已發(fā)表的文獻(xiàn)中，描述了B.t.晶體蛋白質(zhì)基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)(H.E.Schnepf、H.R.Whiteley美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)782893-2897)。美國專利4,448,885和美國專利4,467,036都公開了B.t.晶體蛋白質(zhì)基因在E.coli中的表達(dá)。
美國專利4,797,276和4,853,331公開了可以在多種環(huán)境中用于控制鞘翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌粉菌變種(a.k.a.M-7，a.k.a.B.t.san diego)。美國專利4,918,006公開了具有針對(duì)雙翅目的活性的B.t.毒素。美國專利4,849,217公開了具有針對(duì)苜蓿象鼻蟲的活性的B.t.隔離群。美國專利5,208,077公開了具有針對(duì)鞘翅目的活性的B.t.隔離群。美國專利5,643,987公開了具有針對(duì)玉米根蟲的活性、來自PS80JJ1的130kDa毒素。與本發(fā)明相關(guān)的WO 94/40162描述了對(duì)玉米根蟲有毒的蛋白質(zhì)新種類。美國專利5,151,363和4,948,734公開了具有針對(duì)線蟲的活性的某些B.t.隔離群。
美國專利6,083,499和WO 97/40162公開了“二元毒素”。本發(fā)明與球形芽孢桿菌(Bacilius sphaericus)產(chǎn)生的殺蚊毒素是截然不同的。參閱EP 454 485；Davidson等人(1990)“球形芽孢桿菌的殺蚊子幼蟲蛋白質(zhì)的相互作用”，加拿大微生物學(xué)雜志(Can.J.Microbiol.)36(12)870-878；Baumann等人(1988)“編碼球形芽孢桿菌2362和2297的51.4和41.9kDa蛋白質(zhì)的殺蚊毒素基因的序列分析”，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1702045-2050；Oei等人(1992)“經(jīng)純化的球形芽孢桿菌二元毒素及其刪除衍生物與致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)腸道的結(jié)合功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的說明”，普通微生物學(xué)雜志(Journal of General Microbiology)138(7)1515-1526。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于控制非哺乳動(dòng)物害蟲的新的物質(zhì)和方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于控制鞘翅目(coleopteran)害蟲的物質(zhì)和方法。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，此處所述的物質(zhì)和方法被用于控制玉米根蟲，最優(yōu)選玉米幼芽根葉甲。本發(fā)明的殺蟲蛋白還可以控制鱗翅目(lepidopteran)害蟲，包括歐洲玉米螟(European cornborer)和棉鈴蟲(Helicoverpa zea)。
本發(fā)明有利的提供了多核苷酸及其編碼的殺蟲蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種40-50kDa蛋白和一種10-15kDa蛋白是一起使用的，它們組合在一起具有殺蟲作用。由此，本發(fā)明的兩類蛋白質(zhì)可以稱為“二元毒素”。如此處所用，術(shù)語“毒素”或“殺蟲蛋白”包括這兩類蛋白質(zhì)任何一類。一起使用40-50kDa的蛋白質(zhì)和10-15kDa的蛋白質(zhì)是優(yōu)選的，而非必須的。此處所述的一類多核苷酸序列編碼全長(zhǎng)分子量為大約40-50kDa的蛋白質(zhì)。在特殊的實(shí)施方案中，這些蛋白質(zhì)的分子量為大約43-47kDa。本發(fā)明的第二類多核苷酸編碼大約10-15kDa的殺蟲蛋白。在特殊的實(shí)施方案中，這些蛋白質(zhì)的分子量為大約13-14kDa。應(yīng)當(dāng)明確的是，這兩類毒素/基因都是本發(fā)明的一個(gè)方面。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的40-50kDa的蛋白質(zhì)是與10-15kDa的蛋白質(zhì)組合使用的。由此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用于增加和/或促進(jìn)其它蛋白質(zhì)毒素的活性。
本發(fā)明包括了編碼所述40-50kDa或10-15kDa毒素的多核苷酸、編碼全長(zhǎng)毒素保留了殺蟲活性(優(yōu)選當(dāng)組合使用時(shí))的一部分或片段的多核苷酸、和同時(shí)編碼兩類毒素的多核苷酸。此處還公開了融合蛋白(40-50kDa蛋白和10-15kDa蛋白融合在一起)及其編碼多核苷酸的新的范例。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明有用的B.t.毒素包括可以由此處公開的新的B.t.隔離群獲得的毒素。應(yīng)當(dāng)明確的是，例如當(dāng)40-50kDa和10-15kDa毒素一起使用時(shí)，一種毒素可以由一種隔離群獲得，而另一種毒素可以由另一種隔離群獲得。
本發(fā)明還包括了例示性B.t.隔離群和毒素的變體的使用，這些變體具有與特定例示性B.t.隔離群和毒素基本相同的鞘翅目活性特性。這些隔離群變體包括例如突變體。產(chǎn)生突變體的方法在微生物學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的。紫外線和化學(xué)誘變劑(諸如亞硝基胍)被廣泛用于此目的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一種本發(fā)明的分離多核苷酸的植物或植物細(xì)胞。優(yōu)選的，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在目的害蟲取食的組織中表達(dá)殺蟲蛋白。
或者，本發(fā)明的B.t.隔離群或表達(dá)此處所述毒素的重組微生物可以用于控制害蟲。在這方面，本發(fā)明包括了對(duì)基本完整的B.t.細(xì)胞和/或包含本發(fā)明表達(dá)毒素的重組細(xì)胞的處理，使得當(dāng)基本完整的細(xì)胞被應(yīng)用于目的害蟲的環(huán)境時(shí)其殺蟲活性得到延長(zhǎng)。經(jīng)處理細(xì)胞可以作為殺蟲毒素的保護(hù)層。
本發(fā)明的毒素是經(jīng)目的昆蟲消化后影響昆蟲中腸細(xì)胞的口服毒劑。由此，目的害蟲例如通過取食表達(dá)毒素的重組宿主細(xì)胞，接觸了對(duì)害蟲有毒的本發(fā)明蛋白質(zhì)。這導(dǎo)致對(duì)目的害蟲的控制。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了3種例示性43-47kDa殺蟲蛋白，以及這些殺蟲毒素的共有序列。
圖2顯示了PS80JJ1的14和45kDa序列(SEQ ID NO31和10)的關(guān)系。
圖3顯示了實(shí)施例23的混和研究得到的LC50值的比較。
圖4顯示了51和42kDa的球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)毒素及基因和45kDa的149B1毒素及基因的蛋白質(zhì)排列。
圖5顯示了51和42kDa的球形芽孢桿菌毒素及基因和45kDa的149B1毒素及基因的核苷酸序列排列。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO1是80JJ1的大約45kDa毒素的5個(gè)氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO2是80JJ1的大約45kDa毒素的25個(gè)氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO3是80JJ1的大約14kDa毒素的24個(gè)氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO4是149B1的大約47kDa毒素的N末端序列。
SEQ ID NO5是PS149B1經(jīng)純化的大約14kDa蛋白質(zhì)的50個(gè)氨基酸的N末端氨基酸序列。
SEQ ID NO6是167H2的大約47kDa毒素的N末端序列。
SEQ ID NO7是PS167H2經(jīng)純化的大約14kDa蛋白質(zhì)的25個(gè)氨基酸的N末端序列。
SEQ ID NO8是根據(jù)本發(fā)明使用的PS80JJ1的44.3kDa毒素編碼基因的寡核苷酸探針和PS149B1和PS167H2的正向引物。
SEQ ID NO9是根據(jù)本發(fā)明使用的PS149B1和PS167H2的反向引物。
SEQ ID NO10是大約45kDa的PS80JJ1毒素的編碼基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是大約45kDa的PS80JJ1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是大約44kDa的PS149B1毒素的編碼基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO13是大約44kDa的PS149B1毒素的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO14是大約44kDa的PS167H2毒素的編碼基因的部分核苷酸序列。
SEQ ID NO15是大約44kDa的PS167H2毒素的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO16是根據(jù)本發(fā)明用于引物設(shè)計(jì)的肽序列。
SEQ ID NO17是根據(jù)本發(fā)明用于引物設(shè)計(jì)的肽序列。
SEQ ID NO18是根據(jù)本發(fā)明用于引物設(shè)計(jì)的肽序列。
SEQ ID NO19是根據(jù)本發(fā)明用于引物設(shè)計(jì)的肽序列。
SEQ ID NO20是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO16的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO17的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO22是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO18的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO19的肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是基于SEQ ID NO22的反向互補(bǔ)鏈的反向引物。
SEQ ID NO25是基于SEQ ID NO23的反向互補(bǔ)鏈的反向引物。
SEQ ID NO26是基于PS80JJ1的44.3kDA毒素的正向引物。
SEQ ID NO27是基于PS80JJ1的44.3kDA毒素的反向引物。
SEQ ID NO28是根據(jù)本發(fā)明代表1類新毒素的一般性序列。
SEQ ID NO29是根據(jù)本發(fā)明使用的寡核苷酸探針。
SEQ ID NO30是包含14和45kDa的PS80JJ1毒素開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO31是PS80JJ1的14kDa毒素的開放閱讀框架的核苷酸序列。
SEQ ID NO32是PS80JJ1的14kDa毒素的推導(dǎo)氨基酸序列。
SEQ ID NO33是根據(jù)本發(fā)明使用的反向寡核苷酸引物。
SEQ ID NO34是包含14和44kDa的PS167H2毒素開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO35是大約14kDa的PS167H2毒素的編碼基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO36是大約14kDa的PS167H2毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO37是大約44kDa的PS167H2毒素的編碼基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO38是大約44kDa的PS167H2毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO39是包含14和44kDa的PS149B1毒素開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座的核苷酸序列。
SEQ ID NO40是大約14kDa的PS149B1毒素的編碼基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO41是大約14kDa的PS149B1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO42是大約44kDa的PS149B1毒素的編碼基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO43是大約44kDa的PS149B1毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO44是經(jīng)玉米優(yōu)化的編碼80JJ1的大約14kDa毒素的基因序列。
SEQ ID NO45是經(jīng)玉米優(yōu)化的編碼80JJ1的大約44kDa毒素的基因序列。
SEQ ID NO46是在實(shí)施例15(見下文)中使用的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO47是正向引物(見實(shí)施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO48是反向引物(見實(shí)施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO49是正向引物(見實(shí)施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO50是反向引物(見實(shí)施例16)的DNA序列。
SEQ ID NO51是來自PS131W2、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO52是PS131W2的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO53是來自PS131W2、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO54是PS131W2的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO55是來自PS158T3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO56是PS158T3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO57是來自PS158T3、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO58是PS158T3的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO59是來自PS158X10、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO60是PS158X10的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO61是來自PS185FF、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO62是PS185FF的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO63是來自PS185FF、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO64是PS185FF的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO65是來自PS185GG、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO66是PS185GG的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO67是來自PS185GG、編碼44kDa蛋白質(zhì)的BNA序列。
SEQ ID NO68是PS185GG的44kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO69是來自PS185L12、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO70是PS185L12的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO71是來自PS185W3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO72是PS185W3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO73是來自PS186FF、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO74是PS186FF的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO75是來自PS187F3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO76是PS187F3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO77是來自PS187F3、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO78是PS187F3的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO79是來自PS187G1、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO80是PS187G1的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO81是來自PS187G1、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO82是PS187G1的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO83是來自PS187L14、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO84是PS187L14的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO85是來自PS187L14、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO86是PS187L14的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO87是來自PS187Y2、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO88是PS187Y2的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO89是來自PS187Y2、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO90是PS187Y2的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO91是來自PS201G、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO92是PS201G的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO93是來自PS201HH、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO94是PS201HH的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO95是來自PS201L3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO96是PS201L3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO97是來自PS204C3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO98是PS204C3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO99是來自PS204G4、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO100是PS204G4的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO101是來自PS204I11、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO102是PS204I11的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO103是來自PS204J7、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO104是PS204J7的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO105是來自PS236B6、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO106是PS236B6的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO107是來自PS242K10、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO108是PS242K10的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO109是來自PS242K10、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO110是PS242K10的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO111是來自PS246P42、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO112是PS246P42的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO113是來自PS69Q、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO114是PS69Q的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO115是來自PS69Q、編碼44kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO116是PS69Q的44kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO117是來自KB54、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO118是KB54的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO119是來自KR1209、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO120是KR1209的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO121是來自KR1369、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO122是KR1369的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO123是來自KR589、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO124是KR589的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO125是來自KR589、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO126是KR589的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO127是經(jīng)優(yōu)化用于在玉米(Zea mays)中表達(dá)的命名為149B1-15-PO的基因的多核苷酸序列。該基因編碼可從WO97/40162中公開的PS149B1中獲得的大約15kDa毒素。
SEQ ID NO128是經(jīng)優(yōu)化用于在玉米中表達(dá)的命名為149B1-45-PO的基因的多核苷酸序列。該基因編碼可從WO97/40162中公開的PS149B1中獲得的大約45kDa毒素。
SEQ ID NO129是經(jīng)優(yōu)化用于在玉米中表達(dá)的命名為80JJ11-15-PO7的基因的多核苷酸序列。該基因是編碼大約15kDa毒素的替代基因。
SEQ ID NO130是命名為80JJ11-15-PO7的基因編碼的毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO131是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例20)使用的寡核苷酸引物(15kfor1)。
SEQ ID NO132是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例20)使用的寡核苷酸引物(45krev6)。
SEQ ID NO133是來自PS201L3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO134是PS201L3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO135是來自PS201L3、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO136是PS201L3的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO137是來自PS187G1、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO138是PS187G1的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO139是來自PS187G1、編碼44kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO140是PS187G1的44kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO141是來自PS201HH2、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO142是PS201HH2的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO143是來自PS201HH2、編碼44kDa蛋白質(zhì)的部分DNA序列。
SEQ ID NO144是PS201HH2的44kDa蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID NO145是來自KR1369、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO146是KR1369的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO147是來自KR1369、編碼44kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO148是KR1369的44kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO149是來自PS137A、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO150是PS137A的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO151是來自PS201V2、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO152是PS201V2的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO153是來自PS207C3、編碼14kDa蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO154是PS207C3的14kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO155是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例22)使用的寡核苷酸引物(F1new)。
SEQ ID NO156是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例22)使用的寡核苷酸引物(R1new)。
SEQ ID NO157是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例22)使用的寡核苷酸引物(F2new)。
SEQ ID NO158是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例22)使用的寡核苷酸引物(R2new)。
SEQ ID NO159是大約58kDa的融合蛋白。
SEQ ID NO160是編碼SEQ ID NO159的蛋白質(zhì)的融合基因。
SEQ ID NO161是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD5’。
SEQ ID NO162是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD3’rc。
SEQ ID NO163是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD5’01。
SEQ ID NO164是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD5’02。
SEQ ID NO165是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD3’03。
SEQ ID NO166是根據(jù)本發(fā)明(見實(shí)施例27)使用的引物45kD3’04。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及兩類新的多核苷酸序列以及這些多核苷酸序列編碼的新的殺蟲蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)分子量為大約40-50kDa。在此處例示的特定實(shí)施方案中，這些蛋白質(zhì)的分子量為大約43-47kDa。在第二個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲蛋白的分子量為大約10-15kDa。在此處例示的特定實(shí)施方案中，這些蛋白質(zhì)的分子量為大約13-14kDa。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，40-50kDa蛋白和10-15kDa蛋白是一起使用的，它們組合在一起具有殺蟲作用。由此，本發(fā)明的兩類蛋白質(zhì)可以稱為“二元毒素”。如此處所用，術(shù)語“毒素”包括這兩類殺蟲蛋白任何之一。本發(fā)明涉及編碼所述40-50kDa或10-15kDa毒素的多核苷酸、編碼全長(zhǎng)毒素當(dāng)組合使用時(shí)保留了殺蟲活性的部分或片段的多核苷酸、和同時(shí)編碼兩類毒素的多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些毒素對(duì)鞘翅目害蟲，更優(yōu)選玉米根蟲，最優(yōu)選玉米幼芽根葉甲有活性。鱗翅目害蟲也可以作為目標(biāo)。
此處例示了某些特定毒素。對(duì)于具有已知氨基酸序列的毒素，分子量也是已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，通過凝膠電泳測(cè)定的蛋白質(zhì)表觀分子量有時(shí)并不是真正的分子量。因此，此處提及的例如45kDa蛋白或14kDa蛋白應(yīng)當(dāng)理解為指大致那么大的蛋白質(zhì)，真正的分子量可以略有不同。
本發(fā)明不僅涉及編碼這些種類的毒素的多核苷酸，還涉及使用這些多核苷酸產(chǎn)生表達(dá)毒素的重組宿主。在其它方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大約40-50kDa毒素和本發(fā)明的大約10-15kDa毒素的組合使用，以實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲的高效控制，包括諸如玉米根蟲等鞘翅目害蟲。例如，植物的根可以表達(dá)這兩類毒素。
由此，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)，可以使用本發(fā)明的隔離群、毒素、和基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)害蟲的控制。這些方法包括例如將B.t.隔離群應(yīng)用于害蟲(或其區(qū)域)、將重組微生物應(yīng)用于害蟲(或其區(qū)域)、和用編碼本發(fā)明殺蟲毒素的基因轉(zhuǎn)化植物。根據(jù)本發(fā)明使用的微生物可以是例如蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、和/或假單胞菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生重組宿主。此處公開了這些轉(zhuǎn)化必需的物質(zhì)，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便的獲得它們。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過與此處提供的技術(shù)相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲和諸如線蟲和螨蟲等其它害蟲的控制。
此處提供的毒素和多核苷酸序列新種類根據(jù)本發(fā)明由多個(gè)參數(shù)定義。此處描述的一個(gè)毒素決定性特征是殺蟲活性。在特定的實(shí)施方案中，這些毒素具有針對(duì)鞘翅目害蟲的活性。本發(fā)明還包括具有抗鱗翅目活性的毒素。本發(fā)明的毒素和基因還可以由它們的氨基酸序列和核苷酸序列進(jìn)一步定義。每類新分子的序列可以由它們與某些例示性序列的相似性或同一性以及與某些例示性探針的雜交能力或由某些例示性引物擴(kuò)增的能力進(jìn)行鑒定或定義。此處提供的兩類毒素還可以根據(jù)它們與某些抗體的免疫反應(yīng)性和它們與通式的一致性進(jìn)行鑒定。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，編碼本發(fā)明殺蟲蛋白的基因可以通過多種方法獲得。此處例示的特定基因可以由保藏在此處所述培養(yǎng)物保藏中心的隔離群獲得。本發(fā)明的這些基因和毒素還可以例如通過使用基因合成儀進(jìn)行合成構(gòu)建。
SEQ ID NO11、43、和38提供了3種例示性45kDa毒素的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類毒素的序列符合SEQ ID NO28所示的通用序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類毒素符合
圖1所示的共有序列。
通過此處提供的教學(xué)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易的產(chǎn)生并使用此處所述多種毒素和多核苷酸序列的新種類。
根據(jù)本發(fā)明有用的微生物已經(jīng)保存于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物收藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection)(NRRL)的永久保藏中心，北方地區(qū)研究中心(NorthernRegional Research Center)，北方大學(xué)街1815號(hào)(1815 NorthUniversity Street)，Peoria，伊利諾斯61604美國。保藏菌株的培養(yǎng)物保藏編號(hào)如下
由于美國專利5,151,363和其它專利的發(fā)布，公眾可以獲得PS80JJ1隔離群。
本發(fā)明的其它方面涉及新的隔離群和可由這些隔離群獲得的毒素和基因。新的隔離群已經(jīng)進(jìn)行了保藏，并包括于上表中。這些隔離群已經(jīng)進(jìn)行了保藏，在該專利申請(qǐng)的待審期內(nèi)，保證根據(jù)37 CFR 1.14和35 U.S.C.122.授權(quán)的專利和商標(biāo)委員會(huì)所確定的人能獲取所述培養(yǎng)物。在提交了該申請(qǐng)的副本或其后續(xù)申請(qǐng)的國家中，可以按照該國專利法的要求提供所述保藏物。但是，應(yīng)當(dāng)明白保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對(duì)以侵犯由政府行為授予的專利權(quán)來實(shí)施本發(fā)明的許可。
此外，將按照微生物保藏的布達(dá)佩斯條約款項(xiàng)來保存和對(duì)公眾發(fā)放所述保藏培養(yǎng)物，即應(yīng)小心儲(chǔ)存以保證其在最近一次要求重新提供保藏物樣品后至少5年內(nèi)，以及任何情況中在保藏日后至少30年內(nèi)或公開該培養(yǎng)物的專利授權(quán)后的有效期內(nèi)存活并不被污染。由于保藏物狀況使得無法由保藏物提供樣品時(shí)，保藏者承擔(dān)替換保藏物的責(zé)任。公眾獲取所述培養(yǎng)物的所有限制在公開該培養(yǎng)物的專利被授權(quán)時(shí)去除。
下表提供了根據(jù)本發(fā)明有用的某些B.t.隔離群的特征。
表1.對(duì)鞘翅目有毒的B.t.菌株的描述培養(yǎng)物 晶體描述大致分子量(kDa) 血清型 NRRL保藏號(hào) 保藏日期PS80JJ1 多價(jià)吸附130、90、47、37、14 4a4b、sotto B-18679 90-7-17PS149B1 130、47、14 B-21553 96-3-28PS167H2 70、47、14B-23554 96-3-28本發(fā)明的其它隔離群還可以由毒素內(nèi)容物的形狀和位置進(jìn)行表征。毒素、基因、和探針本發(fā)明的多核苷酸可以用于形成完整“基因”，以在期望的宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或肽。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易看出，所附序列表中的一些多核苷酸沒有終止密碼子。同樣的，正如本領(lǐng)域已知的，本發(fā)明多核苷酸可以恰當(dāng)?shù)闹糜诟信d趣宿主中啟動(dòng)子的控制之下。
正如技術(shù)人員容易想到的，DNA通常以雙鏈形式存在。在這種排列方式中，一條鏈與另一鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在例如植物中進(jìn)行復(fù)制，所以產(chǎn)生了另外的DNA互補(bǔ)鏈。在本領(lǐng)域內(nèi)“編碼鏈”通常用來指可與反義鏈結(jié)合的鏈。mRNA由DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄得到?！坝辛x”或“編碼”鏈含有一系列密碼子(密碼子是能三個(gè)一組的閱讀從而產(chǎn)生特定氨基酸的三個(gè)核苷酸)，作為開放讀碼框(ORF)閱讀從而形成感興趣的蛋白質(zhì)或肽。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，通常DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄成mRNA的互補(bǔ)鏈，作為蛋白質(zhì)的模板。由此，本發(fā)明包括使用所附序列表中的例示性多核苷酸和/或互補(bǔ)鏈。本發(fā)明包括與例示性DNA在功能上等同的RNA和PNA(肽核酸)。
使用例如寡核苷酸探針可以鑒定并獲得本發(fā)明的毒素和基因。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列，如國際申請(qǐng)?zhí)朩O 93/16094中所述，它們可以借助恰當(dāng)?shù)臉?biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，或制成本身熒光。探針(和本發(fā)明多核苷酸)可以是DNA、RNA、或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U；用于RNA分子)，本發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)還可以含有次黃嘌呤(能夠與所有四種堿基配對(duì)的中性堿基；有時(shí)在合成探針中代替所有四種堿基混和物使用)。由此，當(dāng)此處提及合成的、簡(jiǎn)并的寡核苷酸，且一般性使用“h”時(shí)，“h”可以是G、A、T、C、或次黃嘌呤。此處使用的多義代碼與標(biāo)準(zhǔn)IUPAC的命名協(xié)定是一致的，例如，R表示A或G，Y表示C或T，等等。
正如本領(lǐng)域眾所周知的，如果探針分子和核酸樣品通過在兩種分子間形成強(qiáng)鍵而發(fā)生雜交，那么可以合理的假設(shè)探針和樣品具有實(shí)質(zhì)性的同源性/相似性/同一性。優(yōu)選的，雜交在嚴(yán)謹(jǐn)條件下通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行，例如G.H.Keller和M.M.Manak(1987)DNA探針(DNA Probes)，Stockton出版社，紐約州紐約市，第169-170頁所述。例如，如此處所述，通過用2xSSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)于室溫15分鐘進(jìn)行第一次清洗，通常進(jìn)行兩次清洗，可以實(shí)現(xiàn)高嚴(yán)謹(jǐn)條件。然后通過降低鹽濃度和/或升高溫度可以實(shí)現(xiàn)更高的嚴(yán)謹(jǐn)度。例如，上述清洗后再用0.1xSSC/0.1％SDS于室溫15分鐘進(jìn)行兩次清洗，之后用0.1xSSC/0.1％SDS于55℃ 30分鐘進(jìn)行后續(xù)清洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，這些溫度可以用于其它雜交和此處提出的清洗方案(例如SSPE可以作為鹽代替SSC)。通過向445ml水中加入50ml 20xSSC和5ml 10％SDS，可以制備2xSSC/0.1％SDS。通過混和NaCl(175.3g/0.15M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)、和1L水，并用10N NaOH調(diào)pH7.0，可以制備20xSSC。通過在50ml經(jīng)高壓滅菌的水中溶解10g SDS、稀釋至100ml、并分裝，可以制備10％SDS。
探針的檢測(cè)提供了以已知方式測(cè)定是否發(fā)生雜交的方法。這種探針分析提供了用于鑒定本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明作為探針使用的核苷酸片段可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行合成。這些核苷酸序列還可以作為PCR引物用于擴(kuò)增本發(fā)明基因。
分子的雜交特征可以用于定義本發(fā)明的多核苷酸。由此，本發(fā)明包括與此處例示的多核苷酸(諸如SEQ ID NO46-166中包括的DNA序列)可發(fā)生雜交的多核苷酸(和/或其互補(bǔ)鏈，優(yōu)選其完全互補(bǔ)鏈)。
如此處所用，用于雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)”條件指與當(dāng)前申請(qǐng)人采用的條件實(shí)現(xiàn)相同或大致相同的雜交特異性程度的條件。具體而言，Southern印跡上固定的BNA與32P標(biāo)記的基因特異性探針的雜交可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.Sambrook分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約)進(jìn)行。一般而言，可以在能夠檢測(cè)目標(biāo)序列(例如與PS80JJ1毒素基因具有同源性)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交和隨后的洗滌。對(duì)于雙鏈DNA基因探針，可以在比DNA雜合體解鏈溫度(Tm)低20-25℃的溫度下、在6xSSC/5xDenhardt氏溶液/0.1％SDS/0.1mg/ml變性DNA中、過夜進(jìn)行雜交。下面的公式描述了解鏈溫度(G.A.Beltz、K.A.Jacobs、T.H.Eickbush、P.T.Cherbas、和F.C.Kafatos酶學(xué)方法(Methods of Enzymology)，R.Wu、L.Grossman、和K.Moldave[編]Academic出版社，紐約，100266-285)。
Tm(℃)＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/雙螺旋堿基對(duì)長(zhǎng)度。
通常如下進(jìn)行洗滌(1)在1xSSPE/0.1％SDS中于室溫15分鐘洗滌2次(低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌)。
(2)在0.2xSSPE/0.1％SDS中于Tm-20℃ 15分鐘洗滌1次(中等嚴(yán)謹(jǐn)洗滌)。
對(duì)于寡核苷酸探針，可以在比雜合體解鏈溫度(Tm)低10-20℃的溫度下、在6xSSPE/5xDenhardt氏溶液/0.1％SDS/0.1mg/ml變性DNA中、過夜進(jìn)行雜交。由下面的公式確定寡核苷酸探針的TmTm(℃)＝2(T/A堿基對(duì)數(shù)目)+4(G/C堿基對(duì)數(shù)目)(S.V.Suggs、T.Mivake、E.H.Kawashime、M.J.Johnson、K.Itakura、和R.B.WallaceICN-UCLA Symp.Dev.Biol.UsingPurified Genes，D.D.Brown[編]，Academic出版社，紐約，23683-693)。
通常如下進(jìn)行洗滌(1)在1xSSPE/0.1％SDS中于室溫15分鐘洗滌2次(低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌)。
(2)在1xSSPE/0.1％SDS中于雜交溫度15分鐘洗滌1次(中等嚴(yán)謹(jǐn)洗滌)。
可由隔離群PS149B1、PS167H2、和PS80JJ1獲得的毒素經(jīng)定性分析，具有至少一項(xiàng)下列特征(本發(fā)明的新毒素可以用此處提出的這些和其它鑒定信息進(jìn)行相似的定性分析)(a)所述毒素由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自下組的核苷酸序列可發(fā)生雜交的核苷酸序列編碼編碼SEQ ID NO2的DNA、編碼SEQ ID NO4的DNA、編碼SEQ ID NO6的DNA、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、編碼SEQ ID NO11的DNA、SEQ ID NO12、編碼SEQ ID NO13的DNA、SEQ ID NO14、編碼SEQ ID NO15的DNA、編碼SEQ ID NO16的DNA、編碼SEQ ID NO17的DNA、編碼SEQ ID NO18的DNA、編碼SEQ ID NO19的DNA、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、編碼SEQ ID NO28的殺蟲部分的DNA、SEQ ID NO37、編碼SEQID NO38的DNA、SEQ ID NO42、和編碼SEQ ID NO43的DNA；(b)所述毒素與針對(duì)選自下組的蘇云金芽孢桿菌隔離群的大約40-50kDa殺蟲毒素或其片段的抗體可發(fā)生免疫反應(yīng)具有NRRLB-18679的鑒定特征的PS80JJ1、具有NRRL B-21553的鑒定特征的PS149B1、和具有NRRL B-21554的鑒定特征的PS167H2；
(c)所述毒素由核苷酸序列編碼，其中所述核苷酸序列的部分可以使用選自下組的引物對(duì)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增SEQ ID NO20和24產(chǎn)生大約495bp的片段、SEQ ID NO20和25產(chǎn)生大約594bp的片段、SEQ IDNO21和24產(chǎn)生大約471bp的片段、SEQ ID NO21和25產(chǎn)生大約580bp的片段；(d)所述毒素包含SEQ ID NO28所示氨基酸序列的殺蟲部分；(e)所述毒素包含與選自下組的氨基酸序列的殺蟲部分具有至少大約60％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO38、和SEQ ID NO43；(f)所述毒素由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與選自下組的核苷酸序列可發(fā)生雜交的核苷酸序列編碼編碼SEQ ID NO3的DNA、編碼SEQ ID NO5的DNA、編碼SEQ ID NO7的DNA、編碼SEQ ID NO32的DNA、編碼SEQID NO36的DNA、和編碼SEQ ID NO41的DNA；(g)所述毒素與針對(duì)選自下組的蘇云金芽孢桿菌隔離群的大約10-15kDa殺蟲毒素或其片段的抗體可發(fā)生免疫反應(yīng)具有NRRLB-18679的鑒定特征的PS80JJ1、具有NRRL B-21553的鑒定特征的PS149B1、和具有NRRL B-21554的鑒定特征的PS167H2；(h)所述毒素由其中部分核苷酸序列可以使用引物對(duì)SEQ ID NO29和33通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的核苷酸序列編碼；(i)所述毒素包含與選自下組的氨基酸序列具有至少大約60％同源性的氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO32的殺蟲部分、SEQ ID NO36的殺蟲部分、和SEQ ID NO41的殺蟲部分?；蚝投舅氐男揎椄鶕?jù)本發(fā)明有用的基因和毒素不僅包括具體例示的全長(zhǎng)序列，還包括這些序列的部分和/或片段(包括與全長(zhǎng)分子相比其內(nèi)部的和/或末端刪除)，及其變體、突變體、嵌合體、和融合體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以包含取代氨基酸，只要它們保留了此處具體例示的蛋白質(zhì)的特征性殺蟲活性即可?！白凅w”基因的核苷酸序列編碼與例示蛋白質(zhì)相同的毒素或具有等同的殺蟲活性的毒素。如此處所用，術(shù)語“等同毒素”指具有與例示毒素相同或基本相同的、針對(duì)目的害蟲的生物學(xué)活性的毒素。如此處所用，“基本相同的”序列指包含不顯著影響殺蟲活性的氨基酸取代、刪除、添加、或插入的序列。此定義還包括保留了殺蟲活性的片段。保留了例示毒素的殺蟲活性的片段和等同物屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
等同毒素和/或編碼這些等同毒素的基因可以使用此處提供的教學(xué)由野生型或重組B.t.隔離群和/或其它野生型或重組有機(jī)體衍生得到。
使用例如用于產(chǎn)生點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以容易的構(gòu)建基因的變體。同樣的，例如美國專利5,605,793描述了通過隨機(jī)片段化后的DNA重新裝配產(chǎn)生額外的分子多樣性的方法。變體基因可以用于產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)；重組宿主可以用于產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用商品化的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟可以產(chǎn)生全長(zhǎng)基因的片段。例如，諸如Bal31等酶或定點(diǎn)誘變可以用于由這些基因的末端系統(tǒng)切除核苷酸。同樣的，編碼活性片段的基因可以使用多種限制酶獲得。蛋白酶可以用于直接獲得這些毒素的活性片段。
有大量的方法可以用于獲取本發(fā)明的殺蟲毒素。例如，針對(duì)此處公開并要求的殺蟲毒素的抗體可以用于由蛋白質(zhì)混和物鑒定并分離其它毒素。具體而言，可以制備針對(duì)毒素中最保守且最獨(dú)特(與其它B.t.毒素相比)的部分的抗體。然后這些抗體可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、或Western印漬，用于特異性鑒定具有特征性活性的等同毒素。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟可以容易的制備針對(duì)此處公開的毒素、等同毒素、或這些毒素的片段的抗體。然后可以由微生物來源獲得編碼這些毒素的基因。
由于遺傳密碼的冗余性，多種不同的DNA序列可以編碼此處公開的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同毒素的替代DNA序列，完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。這些變體DNA序列屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
此處例示了本發(fā)明的某些毒素。既然這些毒素僅僅是本發(fā)明毒素的例示，顯然本發(fā)明包括具有與例示毒素相同或相似殺蟲活性的變體或等同毒素(和編碼等同毒素的核苷酸序列)。等同毒素與例示毒素具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性通常高于60％，優(yōu)選高于75％，更優(yōu)選高于80％，甚至更優(yōu)選高于90％，而且可以高于95％。本發(fā)明的優(yōu)選多核苷酸和蛋白質(zhì)還可以由更具體的同一性和/或相似性范圍定義。例如，與此處例示的序列相比，同一性和/或相似性可以是與本文例示序列相比為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％。除非特別說明，此處使用的兩種核酸的序列同一性和/或相似性百分?jǐn)?shù)使用Karlin和Altschul(1990)美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)872264-2268的算法，經(jīng)Karlin和Altschul(1993)美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5877修正，進(jìn)行確定。這種算法摻入了Altschul等人(1990)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)215402-410的NBLAST和XBLAST程序。用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，評(píng)分＝100，詞長(zhǎng)＝12，以獲得具有期望的序列同一性百分?jǐn)?shù)的核苷酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口排列，如Altschul等人(1997)核酸研究(Nucl.Acids Res.)253389-3402中所述使用Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，使用相應(yīng)程序(NBLAST和XBLAST)的系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)。參閱http//www.ncbi.nih.gov。評(píng)分還可以如上文背景部分所述使用Crickmore等人的方法和算法進(jìn)行計(jì)算。
毒素中負(fù)責(zé)生物學(xué)活性或涉及最終負(fù)責(zé)生物學(xué)活性的三維構(gòu)型確定的決定性區(qū)域中氨基酸同源性是最高的。在這個(gè)方面，如果某些氨基酸取代位于活性的非決定性區(qū)域，或者是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸取代，那么這些取代是可接受的，并且是可預(yù)計(jì)的。例如，氨基酸可以屬于下列類型非極性；不帶電荷、極性；堿性；和酸性。只要取代不顯著改變化合物的生物學(xué)活性，則保守取代(即一種類型的氨基酸被同類的另一種氨基酸取代)屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。表2提供了屬于各類的氨基酸范例的表。
表2.氨基酸類型 氨基酸范例非極性 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp不帶電荷、極性 Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性 Asp、Glu堿性 Lvs、Arg、His在某些情況中，也可以進(jìn)行非保守取代。決定性因素是這些取代不能顯著影響毒素的生物學(xué)活性。
如此處所用，“分離的”多核苷酸和/或“純化的”毒素指這些分子不與天然狀況下相關(guān)的其它分子相關(guān)聯(lián)；這些術(shù)語包括在植物中的使用。由此，“分離的”和/或“純化的”意味著涉及此處所述的“人為操作”。
與本發(fā)明毒素功能等同的合成基因也可以用于轉(zhuǎn)化宿主。用于產(chǎn)生合成基因的方法可以在例如美國專利5,380,831中找到。轉(zhuǎn)基因宿主可以將本發(fā)明的毒素編碼基因?qū)霃V泛的微生物或植物宿主。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，毒素基因的表達(dá)直接的或間接的導(dǎo)致殺蟲蛋白的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。當(dāng)害蟲取食轉(zhuǎn)基因/重組/經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，同時(shí)也就取食了毒素。這是引起害蟲與毒素接觸的優(yōu)選方式。結(jié)果害蟲受到了控制(殺死或虛弱)?；蛘?，合適的微生物宿主，如諸如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等假單胞菌，可以應(yīng)用于害蟲地點(diǎn)，它們將在此增殖并被目的害蟲取食。可以在延長(zhǎng)毒素活性和穩(wěn)定細(xì)胞的條件下，對(duì)含有毒素基因的微生物進(jìn)行處理。然后可以將保留了毒性活性的經(jīng)處理細(xì)胞應(yīng)用于目的害蟲的環(huán)境。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了重組植物細(xì)胞和植物。優(yōu)選的植物(和植物細(xì)胞)是玉米和/或玉蜀黍。
當(dāng)通過合適的載體將B.t.毒素基因?qū)胛⑸锼拗?，并將該宿主以活的狀態(tài)應(yīng)用于環(huán)境時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用某些宿主微生物。微生物宿主選自已知占據(jù)一種或多種感興趣農(nóng)作物的“植物圈”(葉表、葉圈、根際、和/或根表)的類型。選擇這些微生物是為了能夠在特殊環(huán)境中(農(nóng)作物和其它昆蟲棲息地)成功的與野生型微生物競(jìng)爭(zhēng)，提供表達(dá)多肽殺蟲劑的基因的穩(wěn)定維持和表達(dá)，并理想的為殺蟲劑提供免于環(huán)境降解和滅活的進(jìn)一步保護(hù)。
已知大量的微生物棲息于廣泛的重要農(nóng)作物的葉面(植物葉片表面)和/或根際(植物根部周圍的土壤)。這些微生物包括細(xì)菌、藻類、和真菌。特別感興趣的是微生物，諸如細(xì)菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、和產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)；真菌，特別是酵母，如酵母屬(Saccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、和短梗霉屬(Aureobasidium)。特別感興趣的是這些植物圈細(xì)菌物種，如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、類球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummelioti)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes entrophus)、和維涅蘭德固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和植物圈酵母物種，諸如深紅酵母(Rhodotorula rubra)、膠粘紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃色紅酵母(R.aurantiaca)、淺白隱球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隱球酵母(C.diffluens)、羅倫隱球酵母(C.laurentii)、羅氏酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、啤酒酵母(S.cerevisiae)、紅色擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香氣擲孢酵母(S.odorus)、佛地克魯維酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特別感興趣的是有色微生物。
有許多方法可以在基因穩(wěn)定維持和表達(dá)的條件下將編碼毒素的B.t.基因?qū)肽康乃拗?。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的，并描述于例如美國專利5,135,867(此處引用作為參考)。細(xì)胞的處理如上所述，可以對(duì)表達(dá)B.t.毒素的B.t.或重組細(xì)胞進(jìn)行處理，以延長(zhǎng)毒素活性和穩(wěn)定細(xì)胞。形成的殺蟲微囊在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中包含B.t.毒素，該細(xì)胞結(jié)構(gòu)經(jīng)穩(wěn)定化處理并在微囊應(yīng)用于目的害蟲環(huán)境時(shí)可保護(hù)毒素。合適的宿主細(xì)胞可以包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，通常局限于那些不產(chǎn)生對(duì)高等有機(jī)體(諸如哺乳動(dòng)物)有毒的物質(zhì)的細(xì)胞。然而，當(dāng)對(duì)高等有機(jī)體有毒的物質(zhì)是不穩(wěn)定的，或者應(yīng)用水平低得足以避免任何可能的對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的毒性時(shí)，可以使用產(chǎn)生有毒物質(zhì)的有機(jī)體。作為宿主，特別感興趣的是原核生物和低等真核生物，諸如真菌。
細(xì)胞通常是完整的，并在處理時(shí)基本處于繁殖形式而非孢子形式，但是在一些情況中可以采用孢子。
微生物細(xì)胞，如含有B.t.毒素基因的微生物的處理，可以通過化學(xué)或物理的方法，或者通過化學(xué)和/或物理方法的組合進(jìn)行，只要該技術(shù)不損害毒素的特性，并且不減小細(xì)胞保護(hù)毒素的能力即可。化學(xué)試劑的范例是鹵化試劑，特別是原子編號(hào)17-80的鹵素。更具體的說，碘可以在溫和條件下應(yīng)用足夠時(shí)間以實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果。其它合適的技術(shù)包括用醛，諸如戊二醛；抗感染藥，諸如潔爾滅和氯化十六烷基吡啶鎓；醇，諸如異丙醇和乙醇；各種組織學(xué)固定劑，諸如魯戈氏碘、布安氏(Bouin)固定劑、各種酸和Helly固定劑(參閱Humason和L.Gretchen，動(dòng)物組織技術(shù)(Animal Tissue Techniques)，W.H.Freemanand Company，1967)的處理；或者物理(熱)和化學(xué)試劑組合處理，從而當(dāng)細(xì)胞施用到宿主環(huán)境時(shí)，可保護(hù)并延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的毒素的活性。物理方法的范例是諸如γ輻射和X輻射等短波輻射、冷凍、UV照射、凍干等等。美國專利4,695,455和4,695,462中公開了處理微生物細(xì)胞的方法，兩篇專利此處引用作為參考。
增強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性通常可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件的抵抗力。當(dāng)殺蟲劑以前形式使用時(shí)，選擇的細(xì)胞處理方法應(yīng)當(dāng)不抑制目的害蟲病原體將殺蟲劑前形式加工成成熟形式的過程。例如甲醛使蛋白質(zhì)交聯(lián)，而且能夠抑制多肽殺蟲劑前形式的加工過程。處理方法應(yīng)當(dāng)至少保留毒素生物利用度或生物活性的實(shí)質(zhì)性部分。
選擇用于生產(chǎn)目的的宿主細(xì)胞中特別感興趣的特征包括，易于將B.t.基因?qū)胨拗鳌⒈磉_(dá)系統(tǒng)的有效性、表達(dá)效率、殺蟲劑在宿主中的穩(wěn)定性、和存在輔助遺傳能力。作為殺蟲劑微囊使用的感興趣的特征包括，對(duì)殺蟲劑的保護(hù)質(zhì)量，諸如厚的細(xì)胞壁、色素沉著、和包涵體的細(xì)胞內(nèi)包裝或形成；在水性環(huán)境中的存活；無哺乳動(dòng)物毒性；對(duì)害蟲取食的吸引力；易于殺死和固定而不損傷毒素；等等。其它考慮包括易于配制和操作、經(jīng)濟(jì)、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、等等。細(xì)胞的培養(yǎng)包含B.t.殺蟲基因的細(xì)胞宿主可以在任何便利的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選其中DNA構(gòu)建物可提供用于選擇性培養(yǎng)基的選擇性優(yōu)勢(shì)，使得所有或基本上所有的細(xì)胞都保留B.t.基因。然后可以以傳統(tǒng)方法收獲這些細(xì)胞?；蛘撸梢栽谑斋@前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
本發(fā)明的B.t.細(xì)胞可以使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵循環(huán)完成后，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，首先從發(fā)酵液中分離B.t.孢子和晶體，從而收獲細(xì)菌。通過加入表面活性劑、分散劑、惰性載體、和其它有助于特殊目的害蟲的操作和應(yīng)用的成分，回收的B.t.孢子和晶體可以配制成濕粉、濃縮液、顆粒、或其它制劑。這些制劑和應(yīng)用步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。配制可以將配制的含有引誘劑和B.t.隔離群孢子和晶體、或包含可由此處公開的B.t.隔離群得到的基因的重組微生物的誘餌顆粒應(yīng)用于土壤。還可以將配制的產(chǎn)品作為種子覆料或根部處理或作物生長(zhǎng)周期晚期的完整植株處理應(yīng)用。植物和土壤的B.t.細(xì)胞處理可以采用濕粉、顆粒、或粉塵，與多種惰性物質(zhì)諸如無機(jī)礦物質(zhì)(葉硅酸鹽(phyllosilicate)、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、等等)或植物材料(玉米穗軸粉、稻殼、胡桃殼、等等)混合使用。制劑可以包括擴(kuò)散-增稠佐劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲添加劑、或表面活性劑。液體制劑可以是基于水的或非水的，并可采用泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化濃縮物等等形式。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，殺蟲劑濃度將由于具體制劑的性質(zhì)廣泛變化，特別是可以作為濃縮物或直接使用。殺蟲劑將以至少1％(以重量計(jì))存在，而且可以是100％(以重量計(jì))。干燥制劑通常含有大約1-95％(以重量計(jì))的殺蟲劑，而液體制劑通常是在液相中含約1-60％(以重量計(jì))。含有細(xì)胞的制劑通常含有大約102-大約104個(gè)細(xì)胞/mg。這些制劑將以每公頃大約50mg(液體的或干燥的)-1kg或更多的量施用。
通過噴、撒、灑、等等，可以將制劑應(yīng)用于害蟲環(huán)境，例如土壤和葉片上。突變體本發(fā)明隔離群的突變體可以通過本領(lǐng)域眾所周知的步驟產(chǎn)生。例如，使用甲烷磺酸乙酯(EMS)對(duì)隔離群進(jìn)行誘變，可以得到不產(chǎn)孢子的突變體。使用紫外線和亞硝基胍，通過本領(lǐng)域眾所周知的步驟也可以產(chǎn)生突變體。
有較小百分?jǐn)?shù)的不產(chǎn)孢子突變體將保持完整而且在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵期間不溶解；這些菌株稱為溶解陰性(-)。溶解陰性菌株可以，通過在搖瓶培養(yǎng)基中篩選不產(chǎn)孢子的突變體并選擇那些仍然完整并在發(fā)酵結(jié)束時(shí)含有毒素晶體的突變體，進(jìn)行鑒定。溶解陰性菌株適合于進(jìn)行細(xì)胞處理，從而得到受保護(hù)的被囊毒素蛋白質(zhì)。
為了制備上述不產(chǎn)孢子的突變體的噬菌體抗性變體，取一些噬菌體裂解液涂在瓊脂培養(yǎng)基上并干燥。然后取一些噬菌體敏感型細(xì)菌菌株直接涂在已經(jīng)干燥的裂解液上并干燥。將平板于30℃溫育。溫育2天后，可以在瓊脂上看到大量菌落。挑取這些菌落中的一些，并在瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。通過與噬菌體裂解液的交叉劃線，測(cè)試這些表觀抗性培養(yǎng)物的抗性。用噬菌體裂解液在平板上劃一條線并干燥。然后用推測(cè)的抗性培養(yǎng)物劃線，與噬菌體線交叉。于30℃溫育過夜后，抗性細(xì)菌培養(yǎng)物在與噬菌體線交叉的任何地方顯示不溶解。然后通過在瓊脂培養(yǎng)基平板上涂一層抗性培養(yǎng)物的菌苔，再一次確認(rèn)噬菌體抗性。敏感菌株也以相同方式進(jìn)行涂板，作為陽性對(duì)照。干燥后，滴一滴噬菌體裂解液在平板中央并干燥。于30℃溫育24小時(shí)后，滴加有噬菌體裂解液的區(qū)域內(nèi)抗性培養(yǎng)物顯示不溶解。
下面是例示本發(fā)明實(shí)踐步驟的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為限制。除非另有注釋，所有百分比以重量計(jì)，而所有溶劑混和比例以體積計(jì)。
實(shí)施例實(shí)施例1-本發(fā)明B.t.隔離群的培養(yǎng)B.t.隔離群或其突變體的傳代培養(yǎng)物，可以用于接種下面的培養(yǎng)基，即蛋白胨、葡萄糖、鹽培養(yǎng)基。
細(xì)菌用蛋白胨 7.5 g/l葡萄糖 1.0 g/lKH2PO43.4 g/lK2HPO44.35 g/l鹽溶液 5.0 ml/lCaCl2溶液 5.0 ml/lpH 7.2鹽溶液(100ml)MgSO4·7H2O 2.46gMnSO4·H2O 0.04gZnSO4·7H2O 0.28gFeSO4·7H2O 0.40gCaCl2溶液(100ml)CaCl2·2H2O 3.66g將鹽溶液和CaCl2溶液過濾除菌，并在接種時(shí)加到經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)基中。燒瓶于30℃在旋轉(zhuǎn)搖床上以200rpm溫育64小時(shí)。
上述步驟可以通過本領(lǐng)域眾所周知的步驟容易的放大至大發(fā)酵罐。
可以通過本領(lǐng)域眾所周知的步驟，分離在上述發(fā)酵中得到的B.t.芽孢和/或晶體。經(jīng)常使用的步驟是對(duì)收獲的發(fā)酵液進(jìn)行分離技術(shù)，如離心。實(shí)施例2-形成了孢子的蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)物對(duì)玉米根蟲的活性將PS80JJ1、PS149B1、或PS167H2在液體培養(yǎng)基中在搖瓶中培養(yǎng)至芽孢形成，并通過離心沉淀。將培養(yǎng)物沉淀重懸于水，并在上述表面施藥生物檢測(cè)(top load bioassay)中測(cè)試針對(duì)玉米根蟲的活性。通過測(cè)光密度法估計(jì)培養(yǎng)物沉淀中存在的14kDa和44.3kDa蛋白質(zhì)的量，并用于計(jì)算以LC50表述的比活性。每種天然蘇云金芽孢桿菌菌株的活性列于表3(B.t.菌株的WCRW表面施藥生物檢測(cè))。
表3.B.t.菌株的WCRW表面施藥生物檢測(cè)B.t.菌株LC50(μg/cm2)*95％CL 斜率PS80JJ1 6 4-81.5PS167H2 6 4-91.6PS149B1 8 4-12 1.8CryB細(xì)胞空白4％N/AN/A水空白 4％N/AN/A*提供了對(duì)照在高劑量下的百分比死亡率實(shí)施例3-45kDa的80JJ1蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)純化將1g 80JJ1的凍干粉懸于40ml緩沖液(含有80mM Tris-HCl pH7.8，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制劑，和40μg/ml苯丁抑制素。將懸浮液進(jìn)行離心，并棄去產(chǎn)生的上清液。將沉淀清洗5次，每次使用35-40ml上述緩沖液。如上所述，將清洗后的沉淀重懸于10ml溶液(40％ NaBr，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制劑，和40μg/ml苯丁抑制素)。并置于搖床中75分鐘。離心NaBr懸浮液，取出上清，沉淀用40％ NaBr，5mM EDTA，100μM PMSF，0.5μg/ml亮抑酶肽，0.7μg/ml胃酶抑制劑，和40μg/ml苯丁抑制素再次處理。合并上清液(40％NaBr可溶)，并用10mM cAPS pH10.0/1mM EDTA于4℃進(jìn)行透析。將透析后的提取物進(jìn)行離心，并除去產(chǎn)生的上清液。將沉淀(40％ NaBr透析沉淀)懸于5ml H2O，并離心。除去產(chǎn)生的上清液。如上所述，將清洗后的沉淀用10ml H2O再一次進(jìn)行清洗，并離心。將清洗后的沉淀懸于1.5ml H2O，其在SDS-PAGE分析中顯示主要含有3條蛋白質(zhì)條帶，表觀遷移率為大約47kDa、45kDa、和15kDa。Lowry檢測(cè)顯示，在純化的這一步，懸浮的40％ NaBr透析沉淀含有大約21mg/ml蛋白質(zhì)。
使用15％丙烯酰胺凝膠，經(jīng)SDS-PAGE(U.K.Laemlli自然(Nature)227680)分離沉淀懸浮液中的蛋白質(zhì)。然后將分離的蛋白質(zhì)在10mM CAPS pH11.0/10％ MeOH中于100V恒壓電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore公司)上。1小時(shí)后，將PVDF膜在水中簡(jiǎn)單漂洗，并在0.25％考馬斯藍(lán)R-250/50％甲醇/5％醋酸中浸泡3分鐘。將染色后的膜在40％ MeOH/5％醋酸中進(jìn)行脫色。將脫色后的膜于室溫晾干(LeGendre等人用于微量測(cè)序的蛋白質(zhì)純化的實(shí)踐指南，P.Matsudaira編，Academic出版社，紐約州紐約市)。使用自動(dòng)化氣相Edman降解法(M.W.Hunkapillar、R.M.Hewick、W.L.Dreyer、L.E.Hood酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)91399)對(duì)膜進(jìn)行測(cè)序。
氨基酸分析揭示，45kDa條帶的N末端序列如下Met-Leu-Asp-Thr-Asn(SEQ ID NO1)。
同樣分析了47kDa條帶并測(cè)定了N末端氨基酸序列，與SEQ ID NO1的5氨基酸序列相同。因此，47kDa肽和45kDa肽的N末端氨基酸序列是相同的。
此氨基酸序列還對(duì)應(yīng)于由PS80JJ1芽孢/晶體粉末的45kDa肽使用另一種純化方案得到的序列，其N末端序列如下Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Leu-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Thr-Ser-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO2).實(shí)施例4-PS80JJ1的14kDa肽的純化將0.8ml白色透析懸浮液(大約21mg/ml，含有47kDa、45kDa、和15kDa肽)溶于10ml 40％ NaBr，并加入0.5ml 100mM EDTA。大約18小時(shí)(過夜)后，得到白色不透明的懸浮液。離心收集并棄去。將上清液在Centricon-30(Amicon公司)中濃縮至終體積大約15ml。將濾出液用水通過過濾透析進(jìn)行清洗并置于冰上，最終形成乳白色懸浮液。將懸浮液進(jìn)行離心，分離并保存沉淀和上清液。然后將沉淀懸于1.0ml水(大約6mg/ml)。SDS-PAGE分析顯示，沉淀含有基本純的15kDa蛋白質(zhì)。
測(cè)定出其N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Thr-Arg-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ala-Lys-Thr-Lys-Leu(SEQ ID NO3).實(shí)施例5-蛋白質(zhì)的生物檢測(cè)透析后的80JJ1的NaBr提取物(含有47kDa、45kDa、和15kDa肽)的不溶部分制備物，在針對(duì)玉米幼芽根葉甲的生物檢測(cè)中展示顯著的毒性活性。實(shí)施例6-PS149B1的45kDa蛋白的蛋白質(zhì)純化和定性分析將P1沉淀重懸于2倍體積/單位凈重的去離子水，并加入9倍體積的40％(w/w)NaBr水溶液。這一步和所有隨后操作都在冰上或于4-6℃進(jìn)行。30分鐘后，將懸浮液用36倍體積的冷水進(jìn)行稀釋，并以25,000xg離心30分鐘，以分離沉淀和上清液。
將產(chǎn)生的沉淀重懸于1-2倍體積的水，并鋪在20-40％(w/w)NaBr梯度上，以8,000xg離心100分鐘?；厥瘴挥诖蠹s32％(w/w)NaBr的薄層(“包涵體”，或INC)，并使用截留MW 6-8kDa的透析膜在水中透析過夜。25,000×g離心回收顆粒物質(zhì)，重懸于水中，分裝，并通過Lowry法和SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。
將產(chǎn)生的上清液使用Centricon-10濃縮器濃縮3-4倍，然后使用截留MW 6-8kDa的透析膜在水中透析過夜。以25,000xg離心回收顆粒物，重懸于水，分裝，并通過Lowry法和SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。此部分稱為P1.P2。
使用15％丙烯酰胺凝膠，經(jīng)SDS-PAGE(U.K.Laemlli，見上文)分離沉淀懸浮液中的肽。然后將分離的蛋白質(zhì)在10mM CAPS pH11.0/10％ MeOH中于100V恒壓電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore公司)上。1小時(shí)后，將PVDF膜在水中簡(jiǎn)單漂洗，并在0.25％考馬斯藍(lán)R-250/50％甲醇/5％醋酸中浸泡3分鐘。將染色后的膜在40％ MeOH/5％醋酸中進(jìn)行脫色。將脫色后的膜于室溫晾干(LeGendre等人，見上文)。使用自動(dòng)化氣相Edman降解法(M.W.Hunkapillar等人，見上文)對(duì)膜進(jìn)行測(cè)序。
蛋白質(zhì)分析揭示，存在兩種主要的多肽，分子量為47kDa和14kDa。分子量是與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多肽對(duì)照進(jìn)行測(cè)量的。此方法只提供了真正分子量的估計(jì)值。來自PS149B1的47kDa條帶與來自PS80JJ1的47kDa蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上以難以區(qū)分開的方式遷移。同樣的，來自PS149B1的14kDa條帶與來自PS167H2和PS80JJ1的14kDa條帶在SDS-PAGE上也以難以區(qū)分開的方式遷移。除了這兩種估計(jì)分別在考馬斯染色物質(zhì)中占25-35％(47kDa)和35-55％(15kDa)的多肽，還存在包含那些MW估測(cè)值46kDa、130kDa、和70kDa的次要條帶。
蛋白質(zhì)分析揭示，INC部分含有MW 47kDa的單一多肽，而P1.P2部分含有MW 14kDa的單一多肽。由P1回收這些多肽的產(chǎn)率大于50％。
經(jīng)純化的來自PS149B1的47kDa蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列是Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-His-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO4).
經(jīng)純化的來自PS149B1的14kDa蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu-Asp-Gly-Gly-Arg-Trp-Arg-Thr-Ser-Pro-Xaa-Asn-Val-Ala-Asn-Asp-Gln-Ile-Lys-Thr-Phe-Val-Ala-Glu-Ser-Asn(SEQ ID NO5).實(shí)施例7-PS167H2的45kDa和14kDa毒素的氨基酸序列經(jīng)純化的來自PS167H2的45kDa蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列是Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Ile-Tyr-Glu-Ile-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn-Gly-Leu-His-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SEQ ID NO6).
經(jīng)純化的來自PS167H2的14kDa蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列是Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu(SEQ ID NO7).
這些氨基酸序列可以與由80JJ1芽孢/晶體粉末的47kDa肽得到的N末端序列(SEQ ID NO1)和由80JJ1芽孢/晶體粉末的14kDa肽得到的N末端序列(SEQ ID NO3)進(jìn)行比較。
顯然，45-47kDa蛋白質(zhì)是高度相關(guān)的，14kDa蛋白質(zhì)也是高度相關(guān)的。實(shí)施例8-蛋白質(zhì)的生物檢測(cè)進(jìn)行經(jīng)純化的來自PS149B1的蛋白質(zhì)部分針對(duì)玉米幼芽根葉甲的生物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮M合使用時(shí)展示顯著的毒性活性。事實(shí)上，這一組合使用恢復(fù)了在最初的制備物(P1)中記錄的活性。下列生物檢測(cè)數(shù)據(jù)組顯示了百分比死亡率并論證了此效果。
表4.濃度(μg/cm2) P1 INC P1.P2 INC+P1.P230088，100，9419 13 10010094，50，63 31 38 9433.3 19，19，44 38 13 5011.1 13，56，25 12 31 133.70，50，0 0 31 131.213，43，12 0 12 190.46，12，6 25 19 6實(shí)施例9-來自蘇云金芽孢桿菌PS80JJ1菌株的新的δ-內(nèi)毒素基因的分子克隆、表達(dá)、和DNA序列分析由生長(zhǎng)至600nm光密度為1.0的蘇云金芽孢桿菌(B.t.)細(xì)胞制備總細(xì)胞DNA。通過離心沉淀細(xì)胞，并重懸于原生質(zhì)體緩沖液(0.3M蔗糖/25mM Tris-Cl[pH8.0]/25mM EDTA，加入20mg/ml溶菌酶)。于37℃溫育1小時(shí)后，通過兩個(gè)凍融循環(huán)使原生質(zhì)體裂解。向完全裂解液中加入9倍體積的溶液(0.1M NaCl/0.1％ SDS/O.1M Tris-Cl)。用酚∶氯仿(1∶1)對(duì)澄清的裂解液進(jìn)行兩次抽提。加入2倍體積的乙醇沉淀核酸，并經(jīng)離心沉淀。將沉淀重懸于TE緩沖液，并加入RNA酶至終濃度50μg/ml。于37℃溫育1小時(shí)后，將溶液用苯酚∶氯仿(1∶1)和TE飽和的氯仿各提取1次。通過加入1/10體積的3M NaOAc和2倍體積的乙醇從液相中沉淀DNA。通過離心沉淀DNA，用70％的乙醇清洗，干燥，并重懸于TE緩沖液。
根據(jù)N末端肽序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了用于PS80JJ1的45kDa毒素編碼基因的寡核苷酸探針。29個(gè)堿基的寡核苷酸探針的序列是5′-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3′(SEQ ID NO8)如上所示，此寡核苷酸在四個(gè)位置是混和的。此探針用32P進(jìn)行了放射性標(biāo)記，并用于經(jīng)各種內(nèi)切核酸酶消化的PS80JJ1總細(xì)胞DNA的Southern印漬的標(biāo)準(zhǔn)條件雜交。表5所示的來自這些實(shí)驗(yàn)的代表性放射自顯影數(shù)據(jù)顯示了與44.3kDa毒素寡核苷酸探針(SEQ ID NO8)具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。表5.在Southern印漬上與44.3kDa毒素基因寡核苷酸探針(SEQ IDNO8)在標(biāo)準(zhǔn)條件下雜交的PS80JJ1細(xì)胞DNA片段的RFLP限制酶 大致片段大小(kbp)EcoRI 6.0HindIII8.3KpnI 7.4PstI 11.5XbaI 9.1在這些分析中鑒定的這些DNA片段包含PS80JJ1的45kDa毒素基因的全部或片段。正如預(yù)測(cè)的(見下文表6)，表5中雜交DNA片段的大致大小符合與其它實(shí)驗(yàn)中使用的PS80JJ1的45kDa毒素亞基因探針雜交的PS80JJ1片段子集的大小。
由經(jīng)Sau3AI部分消化的PS80JJ1 DNA構(gòu)建基因文庫。將部分限制性消化物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將9.3-23kbp的DNA片段由凝膠上切下，由凝膠片電洗脫，在Elutip-D離子交換柱(Schleicher andSchuell，Keene，NH)上進(jìn)行純化，并通過乙醇沉淀回收。將Sau3AI插入片段連接到經(jīng)BamHI消化的LambdaGem-11(Promega，Madison，WI)中。包裝重組噬菌體，并鋪在E.coli KW251細(xì)胞上。通過上述寡核苷酸探針的雜交篩選噬菌斑。將雜交噬菌體進(jìn)行噬菌斑純化，并感染E.coli KW251細(xì)胞的液體培養(yǎng)物，通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行DNA分離(Maniatis等人，見上文)。
Southern印漬分析揭示，一個(gè)重組噬菌體分離物含有的大約4.8kbp的XbaI-SacI條帶與PS80JJ1毒素基因探針發(fā)生雜交。PS80JJ1毒素基因側(cè)翼的SacI位點(diǎn)是噬菌體載體的克隆位點(diǎn)，而側(cè)翼的XbaI位點(diǎn)位于PS80JJ1 DNA插入片段內(nèi)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將此DNA限制性片段亞克隆到pBluescript S/K(Stratagene，San Diego，CA)中，用于序列分析。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pMYC2421。同樣將DNA插入片段亞克隆到pHTBlueII(一種大腸桿菌/蘇云金芽孢桿菌穿梭載體，含有pBluescript S/K(Stratagene，La Jolla.CA)和來自B.t.固有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，[D.Lereclus等人(1989)FEMS微生物學(xué)快報(bào)(FEMSMicrobiology Letters)60211-218]中產(chǎn)生pMYC2420。
根據(jù)N末端肽序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了用于PS80JJ1的14kDa毒素編碼基因的寡核苷酸探針。該28個(gè)堿基的寡核苷酸探針的序列是5′GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT AC 3′(SEQ ID NO29).
如上所示，此寡核苷酸在四個(gè)位置是混和的。此探針用32P進(jìn)行放射性標(biāo)記，并用于經(jīng)各種內(nèi)切核酸酶消化的PS80JJ1總細(xì)胞和pMYC2421DNA的Southern印漬的標(biāo)準(zhǔn)條件雜交。這些RFLP作圖實(shí)驗(yàn)證明，14kDa毒素的編碼基因位于與含44.3kDa毒素N末端編碼序列相同的基因組EcoRI片段上。
為了測(cè)試PS80JJ1毒素基因在B.t.中的表達(dá)，通過電穿孔用pMYC2420轉(zhuǎn)化無晶體(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，PurdueUniversity，West Lafayette，IN)。通過SDS-PAGE分析證明了由pMYC2420編碼的兩種大約14和44.3kDa的PS80JJ1毒素的表達(dá)。對(duì)來自重組CryB[pMYC2420]菌株MR536的毒素晶體制備物進(jìn)行檢測(cè)，顯示具有針對(duì)玉米幼芽根葉甲的活性。
使用ABI373自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件，對(duì)pMYC2421編碼的PS80JJ1毒素基因進(jìn)行測(cè)序。包含兩個(gè)開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座序列顯示于SEQ ID NO30。14kDa毒素基因的終止密碼子位于44.3kDa毒素基因起始密碼子上游(5’)121個(gè)堿基對(duì)處(圖2)。與編碼殺蟲蛋白的其它毒素基因相比，PS80JJ1的14kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列(SEQ ID NO31)、44.3kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列(SEQ ID NO10)、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO32和SEQ ID NO11)是新的。
由此，編碼PS80JJ1的14kDa毒素的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO31。PS80JJ1的14kDa毒素的推導(dǎo)氨基酸序列顯示于SEQ ID NO32。同時(shí)編碼PS80JJ1的14和54kDa毒素的核苷酸序列以及側(cè)翼序列顯示于SEQ ID NO30。這些序列的相互關(guān)系顯示于圖2。
包含質(zhì)粒pMYC2421的E.coli NM522的傳代培養(yǎng)物于1996年3月28日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRL B-21555。實(shí)施例10-來自蘇云金芽孢桿菌PS149B1和PS167H2菌株的其它新的δ-內(nèi)毒素基因的RFLP和PCR分析另外兩種對(duì)玉米根蟲有活性的菌株P(guān)S149B1和PS167H2，也產(chǎn)生包含大約14和45kDa多肽的伴孢蛋白質(zhì)晶體。使用Southern雜交和部分DNA序列分析，檢驗(yàn)了這些毒素與80JJ1毒素的相關(guān)性。如上所述由這些B.t.菌株提取DNA，并使用14kDa毒素寡核苷酸探針(SEQ ID NO29)和80JJ1的44.3kDa毒素基因編碼序列的大約800bp PCR片段進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Southern雜交。表6所示的來自這些實(shí)驗(yàn)的RFLP數(shù)據(jù)顯示了與44.3kDa毒素具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。表7所示的來自這些實(shí)驗(yàn)的RFLP數(shù)據(jù)顯示了與14kDa毒素具有序列同源性的DNA限制性片段的大小。
3種菌株都展示獨(dú)特的RFLP模式。來自PS149B1或PS167H2的雜交DNA片段包含與PS80JJ1的44.3kDa毒素具有序列同源性的完整或部分毒素基因。
3種菌株都展示獨(dú)特的RFLP模式。來自PS149B1或PS167H2的雜交DNA片段包含與PS80JJ1的14kDa毒素基因具有序列同源性的完整或部分毒素基因。
使用根據(jù)PS80JJ1的44.3kDa毒素基因序列設(shè)計(jì)的正向和反向寡核苷酸引物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增PS149B1或PS167H2中的部分毒素基因。對(duì)于PS149B1，使用了下面的引物對(duì)正向5′-ATG YTW GAT ACW AAT AAA GTW TAT GAA AT-3′(SEQ ID NO8)反向5′-GGA TTA TCT ATC TCT GAG TGT TCT TG-3′(SEQ ID NO9)對(duì)于PS167H2，使用了相同的引物對(duì)。使用ABI373自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件，對(duì)這些PCR衍生片段進(jìn)行了測(cè)序。獲得的部分基因和肽序列顯示于SEQ ID NO12-15。這些片段包含存在于B.t.菌株P(guān)S149B1或PS167H2中對(duì)玉米根蟲有活性的新毒素的部分核苷酸編碼序列和肽序列。實(shí)施例11-來自蘇云金芽孢桿菌PS149B1和PS167H2菌株的新的δ-內(nèi)毒素基因的分子克隆和DNA序列分析如關(guān)于PS80JJ1所述，由PS149B1和PS167H2菌株提取總細(xì)胞DNA。如上所述，分別在Lambda-Gem11中構(gòu)建兩種菌株經(jīng)大小分離后的Sau3A部分限制性片段的基因文庫。包裝重組噬菌體，并鋪在E.coli KW251細(xì)胞上。通過與44kDa毒素基因特異的寡核苷酸探針的雜交篩選噬菌斑。將雜交噬菌體進(jìn)行噬菌斑純化，并感染E.coli KW251細(xì)胞的液體培養(yǎng)物，通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行DNA分離(Maniatis等人，見上文)。
對(duì)于PS167H2，Southern印漬分析揭示，一個(gè)重組噬菌體分離物的大約4.0-4.4kbp的HindIII條帶與PS80JJ1的44kDa毒素基因5’寡核苷酸探針(SEQ ID NO8)發(fā)生雜交。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將此DNA限制性片段亞克隆到pBluescript S/K(Stratagene，San Diego，CA)中，用于序列分析。同樣將該片段亞克隆到高拷貝數(shù)的穿梭載體pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于蘇云金芽孢桿菌中的表達(dá)分析(見下文)。產(chǎn)生的重組的、高拷貝數(shù)的雙功能質(zhì)粒稱為pMYC2427。
使用ABI373自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件，對(duì)pMYC2427編碼的PS167H2毒素基因進(jìn)行了測(cè)序。包含兩個(gè)開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座序列顯示于SEQ ID NO34。14kDa毒素基因的終止密碼子位于44kDa毒素基因起始密碼子上游(5’)107個(gè)堿基對(duì)處(圖2)。與編碼殺蟲蛋白質(zhì)的其它已知毒素基因相比，PS167H2的14kDa毒素編碼序列(SEQ ID NO35)、44kDa毒素編碼序列(SEQ ID NO37)、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO36和SEQ ID NO38)是新的。毒素基因的排列方式與PS80JJ1的14和44kDa毒素相似，而且具有一些同源性。
包含質(zhì)粒pMYC2427的E.coli NM522的傳代培養(yǎng)物于1997年3月26日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRL B-21672。
對(duì)于PS149B1，使用PS80JJ1的40kDa寡核苷酸5’探針(SEQ ID NO8)的Southern印漬分析證明大約5.9kbp的ClaI DNA片段可發(fā)生雜交。將PS149B1基因組DNA的完全ClaI消化物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并亞克隆到pHTBlueII中。同樣將片段亞克隆到高拷貝數(shù)的穿梭載體pHT370(O.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于蘇云金芽孢桿菌中的表達(dá)分析(見下文)。產(chǎn)生的重組的、高拷貝數(shù)的雙功能質(zhì)粒稱為pMYC2429。
使用ABI自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件，對(duì)pMYC2429編碼的PS49B1毒素基因進(jìn)行了測(cè)序。包含兩個(gè)開放閱讀框架和側(cè)翼核苷酸序列的完整基因座序列顯示于SEQ ID NO39。14kDa毒素基因的終止密碼子位于44kDa毒素基因起始密碼子上游(5’)108個(gè)堿基對(duì)處(圖2)。與編碼殺蟲蛋白質(zhì)的其它已知毒素基因相比，PS149B1的14kDa毒素編碼序列(SEQ ID NO40)、44kDa毒素編碼序列(SEQ ID NO42)、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO41和SEQ ID NO43)是新的。毒素基因的排列方式與PS80JJ1和PS167H2的14和44kDa毒素相似，而且具有一些同源性。這3種毒素操縱子共同構(gòu)成殺蟲毒素新家族。
包含pMYC2429的E.coli NM522的傳代培養(yǎng)物于1997年3月26日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional ResearchCenter，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRL B-21673。實(shí)施例12-用于鑒定并克隆具有針對(duì)玉米根蟲的活性的新毒素的PCR擴(kuò)增使用Genetics Computer Group序列分析軟件Pileup，以缺口權(quán)＝3.00，缺口長(zhǎng)度權(quán)＝0.10，對(duì)來自PS80JJ1、PS149B1、和PS167H2的三種新的大約45kDa玉米根蟲活性毒素的DNA和肽序列(SEQ ID NO12-15)進(jìn)行比對(duì)。將序列比對(duì)用于鑒定保守肽序列，該序列被用于設(shè)計(jì)很可能與編碼此毒素新家族成員的基因可雜交的寡核苷酸引物。這些引物可以用于PCR擴(kuò)增這些及相關(guān)毒素基因的診斷性DNA片段。根據(jù)各種序列可能設(shè)計(jì)大量的引物，此處提供了4種作為范例。這些肽序列是
Asp-Ile-Asp-Asp-Tyr-Asn-Leu(SEQ ID NO16)Trp-Phe-Leu-Phe-Pro-Ile-Asp(SEQ ID NO17)Gln-Ile-Lys-Thr-Thr-Pro-Tyr-Tyr(SEQ ID NO18)Tyr-Glu-Trp-Gly-Thr-Glu(SEQ ID NO19).對(duì)應(yīng)的核苷酸序列是5′-GATATWGATGAYTAYAAYTTR-3′(SEQ ID NO20)5′-TGGTTTTTRTTTCCWATWGAY-3′(SEQ ID NO21)5′-CAAATHAAAACWACWCCATATTAT-3′(SEQ ID NO22)5′-TAYGARTGGGGHACAGAA-3′(SEQ ID NO23).在熱循環(huán)反應(yīng)中用于聚合酶擴(kuò)增的正向引物是根據(jù)SEQ ID NO20和21的核苷酸序列設(shè)計(jì)的。反向引物是根據(jù)SEQ ID NO22和23的反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)的5′-ATAATATGGWGTWGTTTTDATTTG-3′(SEQ ID NO24)5′-TTCTGTDCCCCAYTCRTA-3′(SEQ ID NO25).這些引物可以組合用于擴(kuò)增鑒定新玉米根蟲毒素編碼基因的下列大小的DNA片段(表8)。
表8.可用新玉米根蟲活性毒素特異的引物擴(kuò)增的診斷性DNA片段的預(yù)測(cè)大小(堿基對(duì))引物對(duì)(SEQ ID NO) DNA片段大小(bp)20+2449520+2559421+2447121+25580相似的，編碼新的玉米根蟲活性毒素的完整基因可以在熱循環(huán)反應(yīng)中使用根據(jù)開放閱讀框架側(cè)翼的DNA序列設(shè)計(jì)的引物通過聚合酶擴(kuò)增分離得到。對(duì)于PS80JJ1的44.3kDa毒素，設(shè)計(jì)并合成了這樣一對(duì)引物，用于擴(kuò)增包含完整毒素編碼序列的診斷性1613bp DNA片段。這些引物是
正向5′-CTCAAAGCGGATCAGGAG-3′(SEQ ID NO26)反向5′-GCGTATTCGGATATGCTTGG-3′(SEQ ID NO27).對(duì)于PS80JJ1的14kDa毒素的PCR擴(kuò)增，編碼N末端肽序列的寡核苷酸(SEQ ID NO29)可以與基于PS80JJ1毒素基因座中的序列的多種反向寡核苷酸引物組合使用。這樣一種反向引物是5′CATGAGATTTATCTCCTGATCCGC 3′(SEQ ID NO33).當(dāng)用于標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)時(shí)，此引物對(duì)擴(kuò)增包含完整14kDa毒素編碼序列和對(duì)應(yīng)于121個(gè)堿基的基因間隔區(qū)的一些3’側(cè)翼序列和部分44.3kDa毒素基因的診斷性1390bp DNA片段。當(dāng)與14kDa正向引物組合使用時(shí)，PCR將產(chǎn)生診斷性的322bp DNA片段。實(shí)施例13-克隆劑量應(yīng)答生物檢測(cè)將PS80JJ1毒素操縱子由pMYC2421亞克隆到pHT370中，用于與由PS149B1和PS167H2克隆的重組毒素直接比較生物活性。產(chǎn)生的重組的、高拷貝數(shù)的雙功能質(zhì)粒稱為pMYC2426。
包含質(zhì)粒pMYC2426的E.coli NM522的傳代培養(yǎng)物于1997年3月26日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRL B-21671。
為了測(cè)試PS80JJ1、PS149B1、和PS167H2毒素基因在B.t.中的表達(dá)，通過電穿孔分別用pMYC2426、pMYC2427、和pMYC2429轉(zhuǎn)化無晶體(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，Purdue University，WestLafayette，IN)。產(chǎn)生的重組菌株依次稱為MR543(CryB[pMYC2426])、MR544(CryB[pMYC2427])、和MR546(CryB[pMYC2429])。通過每種重組菌株的SDS-PAGE分析證明了大約14和44kDa兩種毒素的表達(dá)。
進(jìn)行了來自重組菌株的毒素晶體制備物針對(duì)玉米幼芽根葉甲的檢測(cè)。它們的食物用山梨酸和SIGMA pen-strep-ampho-B進(jìn)行了改良。將樣品以50μl懸浮液/cm2食物表面積的比率進(jìn)行表面施藥。生物檢測(cè)使用新生玉米幼芽根葉甲幼蟲于大約25℃進(jìn)行4天。表9列出了克隆(沉淀)的百分比死亡率和表面施藥LC50估測(cè)值。dH2O對(duì)照產(chǎn)生7％的死亡率。
通過測(cè)光密度法估計(jì)晶體制備物中存在的14kDa和44.3kDa蛋白質(zhì)的量，并用于計(jì)算以LC50表述的比活性。表10(B.t.克隆的WCRW表面施藥生物檢測(cè))列出了克隆(沉淀)的LC50估測(cè)值。
表10.B.t.克隆的WCRW表面施藥生物檢測(cè)B.t.克隆B.t.親本菌株LC50(μg/cm2)* 95％CL 斜率MR543 PS80JJ1 37 17-366* 0.79MR544 PS167H2 10 6-141.6MR546 PS149B1 8 4-121.5N/A CryB細(xì)胞空白 4％ N/A N/AN/A 水空白4％ N/A N/A*提供了高劑量下的百分比死亡率作為對(duì)照**90％CL實(shí)施例14-PS80JJ1二元毒素操縱子中14和44kDa多肽的突變分析本發(fā)明的二元毒素基因在其野生型狀態(tài)在操縱子中的排列方式通常是，14kDa蛋白質(zhì)基因首先轉(zhuǎn)錄，隨后是45kDa蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄。這些基因被相對(duì)短的非編碼區(qū)隔開。代表性O(shè)RF顯示于SEQ ID NO30、SEQ ID NO34、和SEQ ID NO39。
為了研究單個(gè)14和44.3kDa晶體蛋白質(zhì)對(duì)玉米根蟲活性的貢獻(xiàn)，在分開的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行PS80JJ1操縱子中每個(gè)基因的突變，以消除一種蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后在B.t.中表達(dá)完整基因，并測(cè)試重組蛋白質(zhì)針對(duì)玉米根蟲的活性。
首先，通過對(duì)位于開放閱讀框架的第387位堿基的EcoRI位點(diǎn)截短，進(jìn)行了pMYC2421上編碼的44.3kDa基因的突變。此截短和隨后與載體序列的連接產(chǎn)生了編碼大約24kDa假設(shè)融合蛋白的開放閱讀框架。將產(chǎn)生的編碼完整14kDa基因和截短45kDa基因的操縱子亞克隆到高拷貝數(shù)的穿梭載體pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，用于在蘇云金芽孢桿菌中的表達(dá)分析。通過電穿孔用產(chǎn)生的質(zhì)粒pMYC2424轉(zhuǎn)化無晶體(Cry-)B.t.宿主CryB(A.Aronson，Purdue University，West Lafayette，IN)。產(chǎn)生的重組菌株稱為MR541。通過MR541的產(chǎn)孢子培養(yǎng)物的SDS-PAGE分析，只檢測(cè)到了14kDa的PS80JJ1蛋白質(zhì)。只表達(dá)14kDa的PS80JJ1蛋白質(zhì)的MR541制備物在針對(duì)玉米根蟲的表面施藥生物檢測(cè)中，沒有觀察到死亡。
其次，通過在位于開放閱讀框架的第11位堿基處的Nrul位點(diǎn)插入含有所有可能的閱讀框架形式的終止密碼子的寡核苷酸接頭，進(jìn)行了pMYC2421上編碼的14kDa基因的突變。此接頭的序列是5’TGAGTAACTAGATCTATTCAATTA 3′此接頭導(dǎo)入了BglII位點(diǎn)，用于通過BglII限制性消化確認(rèn)插入。用BglII鑒定了含誘變接頭的質(zhì)粒克隆，并測(cè)序確認(rèn)。將編碼14kDa無義突變的操縱子插入片段亞克隆到pHT370中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMYC2425。通過電穿孔用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CryB，以產(chǎn)生重組B.t.菌株MR542。如SDS-PAGE分析所示，MR542的產(chǎn)孢培養(yǎng)物中只表達(dá)了44.3kDa的PS80JJ1蛋白質(zhì)。只表達(dá)44.3kDa pS80JJ1蛋白質(zhì)的MR542制備物沒有觀察到針對(duì)玉米根蟲的死亡率。實(shí)施例15-來自PS149B1的14和44.3kDa多肽在熒光假單胞菌中的單基因異源表達(dá)、純化、和生物檢測(cè)通過標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆方法，分別將來自PS149B1的14kDa和44.3kDa多肽基因插入質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌。只表達(dá)PS149B1的14kDa基因的重組熒光假單胞菌菌株稱為MR1253。只表達(dá)PS149B1的44.3kDa基因的重組熒光假單胞菌菌株稱為MR1256。
將單獨(dú)表達(dá)上述二元蛋白質(zhì)之一的MR1253和MR1256在1L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。然后將部分培養(yǎng)物離心沉淀，用溶菌酶裂解，并用DNaseI處理，以獲得半純的蛋白質(zhì)包涵體。然后通過于4℃溫和搖動(dòng)1小時(shí)，將這些包涵體溶于50mM檸檬酸鈉(pH3.3)。14kDa蛋白質(zhì)可容易的溶于此緩沖液，而44.3kDa蛋白質(zhì)部分溶解。然后將溶解部分以15,000xg離心20分鐘，并保留上清液。
通過離子交換層析進(jìn)一步純化14kDa蛋白質(zhì)。將溶解的14kDa蛋白質(zhì)結(jié)合到Econo-S柱上，并用NaCl 0-1M梯度洗脫。
然后單獨(dú)或一起(45kDa蛋白質(zhì)∶14kDa蛋白質(zhì)摩爾比1∶10)測(cè)試層析純的MR1253(14kDa蛋白質(zhì))和溶于檸檬酸鈉(pH3.3)的MR1256制備物(45kDa蛋白質(zhì))對(duì)玉米根蟲的活性。觀察到每種蛋白質(zhì)單獨(dú)的死亡率不超過背景水平(水/對(duì)照樣品)，但是，它們以上述比例組合在一起時(shí)死亡率為87％(見表11)。
實(shí)施例16-其它新的14kDa和44.3kDa毒素基因通過總B.t.基因組DNA雜交和RFLP的鑒定使用Qiagen DNEasy 96孔組織試劑盒，由每種隔離群制備總基因組DNA。在印漬之前，通過向80μ1無菌蒸餾水中加入10μl每種DNA樣品和10μl 4M NaOH，使96孔板中的DNA變性。將樣品于70℃溫育1小時(shí)，然后向每個(gè)孔加入100μl 20xSSC。將PS149B1的總基因組DNA與每組94個(gè)樣品一起溫育，作為陽性雜交對(duì)照；并將cryB一總基因組DNA與每組94個(gè)樣品一起溫育，作為陰性雜交對(duì)照。使用兩個(gè)48孔狹線印漬裝置(Hoefer Scientific)將每組96個(gè)樣品加到Magnacharge尼龍膜上，隨后用10xSSC清洗2次。將膜于80℃烘烤1小時(shí)，并在使用前保持干燥。將膜在標(biāo)準(zhǔn)甲酰胺溶液(50％甲酰胺/5x SSPE/5x Denhardt氏溶液/2％ SDS/100μg/ml單鏈DNA)中于42℃進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。將膜在兩種條件下清洗2x SSC/0.1％ SDS，42℃(低嚴(yán)謹(jǐn)度)和0.2x SSC/0.1％ SDS，65℃(中至高嚴(yán)謹(jǐn)度)。將膜用使用正向引物SEQ ID NO8和序列為SEQ ID NO46(5’-GTAGAAGCCAGAACAAGAAGGTATT3’)的反向引物由pMYC2429擴(kuò)增的PS149B1的44.3kDa基因大約1.3kbp的PCR片段進(jìn)行探查。探針使用Prime-it II試劑盒(Stratagene)和32P-dCTP進(jìn)行了放射性標(biāo)記，在Sephadex柱上純化，于94℃變性，然后加到新鮮的雜交溶液中。通過將膜暴露于X射線膠片，鑒定了包含與PS149B1探針具有同源性的基因的菌株。
通過陽性雜交反應(yīng)鑒定了下列菌株P(guān)S184M2、PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR136，KR589，PS185L12，PS185W3，PS185Z11，PS186L9，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS147U2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS198H3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS210B，PS213E8，PS223L2，PS224F2，PS236B6，PS246P42，PS247C16，KR200，KR331，KR625，KR707，KR959，KR1209，KR1369，KB2C-4，KB10H-5，KB456，KB42C17-13，KB45A43-3，KB54A33-1，KB58A10-3，KB59A54-4，KB59A54-5，KB53B7-8，KB53B7-2，KB60F5-7，KB60F5-11，KB59A58-4，KB60F5-15，KB61A18-1，KB65A15-2，KB65A15-3，KB65A15-7，KB65A15-8，KB65A15-12，KB65A14-1，KB3F-3，T25，KB53A71-6，KB65A11-2，KB68B57-1，KB63A5-3，和KB71A118-6.
使用32P標(biāo)記的探針和此實(shí)施例中上述雜交條件，進(jìn)行了總基因組DNA制備物中新毒素基因的進(jìn)一步鑒定和分類。如上所述或用QiagenGenomic-tip 20/G制備總基因組DNA，而且在Southern分析中根據(jù)用于革蘭氏陽性細(xì)菌的方案使用了基因組DNA緩沖液組(Qiagen公司，Valencia，CA)。對(duì)于Southern印漬，取大約1-2μg經(jīng)狹線印漬分析鑒定的每種菌株的總基因組DNA，用DraI和NedI進(jìn)行消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis等人)固定在支持尼龍膜上。雜交后，將膜在低嚴(yán)謹(jǐn)度(2x SSC/0.1％ SDS，42℃)下進(jìn)行清洗，并暴露于膠片。使用BioRad Chemidoc系統(tǒng)軟件估計(jì)DNA片段大小。利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性將44kDa毒素編碼基因分類。表12列出了這些分類。
實(shí)施例17-其它二元毒素基因的DNA測(cè)序設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并寡核苷酸用于擴(kuò)增經(jīng)上述149B1 PCR產(chǎn)物雜交鑒定的B.t.菌株的完整或部分14和44.3kDa基因。寡核苷酸是根據(jù)經(jīng)來自PS149B1、PS167H2、和PS80JJ1的14kDa或44.3kDa基因比對(duì)鑒定的保守序列塊設(shè)計(jì)的。這兩種基因的正向引物均設(shè)計(jì)成以ATG起始密碼子開始。反向引物設(shè)計(jì)成盡可能接近每一相應(yīng)基因的3’末端。
設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增14kDa基因的引物如下149DEG1(正向)5′-ATG TCA GCW CGY GAA GTW CAY ATT G-3′(SEQ ID NO47)149DEG2(反向)5′-GTY TGA ATH GTA TAH GTH ACA TG-3′ID NO48)這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為大約340bp。
設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增44.3kDa基因的引物如下149DEG3(正向)5′-ATG TTA GAT ACW AAT AAA RTW TAT G-3′(SEQ ID NO49)149DEG4(反向)5′-GTW ATT TCT TCW ACT TCT TCA TAH GAA G-3′(SEQ ID NO50)這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為大約1,100bp。
用于擴(kuò)增基因產(chǎn)物的PCR條件如下95℃ 1min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 1min，50℃ 2min，72℃ 2min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，1個(gè)循環(huán)。
將PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并使用Qiaexll試劑盒(Qiagen)由凝膠基質(zhì)進(jìn)行純化。使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將產(chǎn)生的純化片段連接到pCRTOPO克隆載體中。連接后，用一半連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化XL10 Gold超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。然后通過PCR使用載體引物1212和1233篩選轉(zhuǎn)化體。將包含插入片段的克隆在LB/羧芐青霉素培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使用Qiagen質(zhì)粒DNA微量制備試劑盒(Qiagen)制備質(zhì)粒。然后使用Applied Biosystems的自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件對(duì)克隆的PCR衍生片段進(jìn)行測(cè)序。SEQ ID NO51-126列出了與來自PS80JJ1和PS149B1的全型14和44.3kDa毒素相關(guān)的其它新的二元毒素基因和多肽的序列。上文的“序列簡(jiǎn)述”部分提供了這些序列的進(jìn)一步說明。
使用上述步驟(及下文注明的差異)還對(duì)來自其它3種B.t.菌株P(guān)S137A、PS201V2、和PS207C3的14kDa型毒素和基因進(jìn)行了測(cè)序。進(jìn)行了使用149 DEG1(正向)和149DEG2(反向)引物的PCR。這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為大約340bp。以下面的條件進(jìn)行PCR1. 95℃ 3min2. 94℃ 1min3. 42℃ 2min4. 72℃ 3min+5sec/循環(huán)5. 第2-4步重復(fù)29個(gè)循環(huán)將PCR產(chǎn)物使用Qia快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)進(jìn)行凝膠純化，使用TOPO-TA試劑盒(Invitrogen)將純化片段連接到pCR-TOPO克隆載體中，隨后轉(zhuǎn)化XL10-Gold超感受態(tài)E.coli細(xì)胞(Stratagene)。如上所述制備轉(zhuǎn)化體DNA。如上所述分別獲得這3種新菌株的14kDa毒素基因的序列。所附序列表提供了下列核苷酸序列和多肽序列PS137A(SEQ ID NO149和150)、PS201V2(SEQ ID NO151和152)、和PS207C3(SEQ ID NO153和154)。實(shí)施例18-PS149B1毒素轉(zhuǎn)基因和植物轉(zhuǎn)化分別設(shè)計(jì)了14和44.3kDa毒素成分經(jīng)玉蜀黍密碼子使用率優(yōu)化的合成轉(zhuǎn)基因。合成基因設(shè)計(jì)成使得鳥嘌呤和胞嘧啶密碼子使用達(dá)到植物DNA中更通常的水平。優(yōu)選的植物優(yōu)化轉(zhuǎn)基因描述于SEQ ID NO127-128。用于兩種轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域是玉蜀黍遍在蛋白啟動(dòng)子加上玉蜀黍外顯子1和玉蜀黍內(nèi)含子1(A.H.Christensen等人(1992)植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)18675-689)。用于兩種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄終止子是馬鈴薯蛋白酶抑制劑II(PinII)終止子(G.An等人(1989)植物細(xì)胞(Plant Cell)1115-122)。
使用膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)作為植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記。膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(pat)由細(xì)菌產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)(P.Eckes等人，1989)分離得到。PAT蛋白質(zhì)使膦絲菌素或其前體去甲基膦絲菌素乙?；x予對(duì)化學(xué)合成的膦絲菌素(諸如除草劑草銨膦)的耐受性。乙?；瘜㈧⒔z菌素轉(zhuǎn)變成對(duì)玉米植物不再有毒的非活性形式。草銨膦是廣譜、非全身性、非選擇性除草劑。通過將PAT摻入再生培養(yǎng)基或通過將除草劑噴灑到葉子上，可以容易的鑒定耐受草銨膦除草劑的再生玉米組織或單個(gè)玉米植株。
為了將鳥嘌呤和胞嘧啶密碼子用法修正成植物DNA中更通常的水平，制備了pat基因的合成版本。用于pat基因的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄本的CaMV啟動(dòng)子(Pietrzak等人，1986)。轉(zhuǎn)錄終止子是CaMV 35S終止子。
為對(duì)玉蜀黍組織轉(zhuǎn)化，由完整質(zhì)粒切下包含PS149B1的14和44.3kDa和pat選擇標(biāo)記編碼序列以及表達(dá)必須的調(diào)控成分的線性部分DNA。將稱為插入片段的此線性部分DNA用于轉(zhuǎn)化過程。
基本如Klein等人(1987)所述，通過微彈轟擊法，使用BioRad制造的Biolistics PDS-100He基因槍，獲得了包含PS149B1的14kDa和44.3kDa轉(zhuǎn)基因的玉蜀黍植株。將授粉后大約15天后收獲的玉米穗分離得到的未成熟胚在愈傷組織初始培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-8天。在轉(zhuǎn)化當(dāng)天，用純化DNA包被顯微鎢顆粒，并加速進(jìn)入培養(yǎng)胚，在此將插入片段DNA摻入細(xì)胞染色體。轟擊6天后，將轟擊胚轉(zhuǎn)移到含草銨膦(Bialaphos)作為選擇試劑的愈傷組織初始培養(yǎng)基中。獲得健康的抗性愈傷組織，并再次轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)大約12周。再生植株，并轉(zhuǎn)移到溫室中?？偣搏@得了436株再生植株。采集葉片樣品用于分子分析，通過PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的存在，并通過ELISA確認(rèn)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后使用玉米幼芽根葉甲對(duì)植株進(jìn)行全植株生物檢測(cè)。將陽性植株與近交系雜交，從而由最初的轉(zhuǎn)化植株獲得種子。發(fā)現(xiàn)這些植株在溫室和田間試驗(yàn)中對(duì)玉米根蟲的傷害都有抵抗力。實(shí)施例19-進(jìn)一步的生物檢測(cè)如實(shí)施例13所述，使用基本表面施藥檢測(cè)方法，檢測(cè)了來自經(jīng)實(shí)施例16鑒定的菌株的蛋白質(zhì)制備物對(duì)玉米幼芽根葉甲的活性。結(jié)果顯示于表13。

實(shí)施例20-來自蘇云金芽孢桿菌PS201L3菌株的新的二元內(nèi)毒素基因的分子克隆、表達(dá)、和DNA序列分析使用Qiagen Genomic-tip 500/G試劑盒和基因組DNA緩沖液組(Qiagen公司，Valencia，CA)，根據(jù)用于革蘭氏陽性細(xì)菌的方案，由在搖瓶培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞制備PS201L3的基因組DNA。由經(jīng)Sau3AI部分消化的PS20113 DNA構(gòu)建基因文庫。將部分限制性消化物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將9.3-23kbp的DNA片段由凝膠上切下，由凝膠片電洗脫，在Elutip-D離子交換柱(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上進(jìn)行純化，并通過乙醇沉淀回收。將Sau3AI插入片段連接到經(jīng)BamHI消化的LambdaGem-11(Promega，Madison，WI)中。使用GigapackIII XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，CA)包裝重組噬菌體，并鋪在E.coli KW251細(xì)胞上。將噬菌斑浸提到Nytran尼龍轉(zhuǎn)移膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上，并用二元毒素編碼序列的32P-dCTP標(biāo)記基因探針進(jìn)行探查。此基因探針是使用基因組PS201L3 DNA模板和寡核苷酸“15kfor1”和“45krev6”擴(kuò)增得到的大約1.0kb PCR產(chǎn)物。
用于PCR和測(cè)序的寡核苷酸的序列如下15kfor1(SEQ ID NO131) ATGTCAGCTCGCGAAGTACAC45krev6(SEQ ID NO132) GTCCATCCCATTAATTGAGGAG將膜與探針于65℃雜交過夜，然后用1xSSPE/0.1％SDS清洗3次。放射自顯影鑒定出13個(gè)噬菌斑。隨后挑取這些噬菌斑，并在1ml SM緩沖液+10μl CHCl3中浸泡過夜。將噬菌體鋪在KW251宿主細(xì)胞上進(jìn)行匯合裂解，將6塊匯合板浸泡在SM中，并用于大量噬菌體DNA制備。將純化噬菌體DNA用多種酶進(jìn)行消化，并進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳。通過Southern印漬將凝膠轉(zhuǎn)移到Nytran膜上，并用上述相同的PCR擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行探查。鑒定出大約6.0kb的雜交XbaI條帶，并亞克隆到E.coli/B.t.穿梭載體pHT370(0.Arantes、D.Lereclus基因(Gene)108115-119)中，產(chǎn)生pMYC2476。用pMYC2476轉(zhuǎn)化的XL10 Gold超感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene)命名為MR1506。隨后通過電穿孔用pMYC2476轉(zhuǎn)化無晶體CryB，并在DM3+20μg/ml紅霉素平板上于30℃進(jìn)行選擇。重組CryB[pMYC2476]稱為MR561。
MR1506的傳代培養(yǎng)物于2000年6月1日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 NorthUniversity Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRLB-30298。
通過免疫印漬法檢驗(yàn)B.t.菌株MR561中PS201L3二元毒素蛋白質(zhì)的表達(dá)。將細(xì)胞在液體NYS-CAA培養(yǎng)基+10μg/ml紅霉素中于30℃培養(yǎng)過夜。然后將培養(yǎng)物離心沉淀，將部分細(xì)胞沉淀重懸，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。當(dāng)分別用PS149B1 14kDa或44kDa特異性抗體進(jìn)行探查時(shí)，Western印漬顯示14kDa和44kDa蛋白質(zhì)。
使用ABI377自動(dòng)化測(cè)序儀進(jìn)行pMYC2476上編碼的毒素基因的DNA測(cè)序。PS201L3的14kDa基因的DNA序列顯示于SEQ ID NO133。PS201L3的14kDa毒素的推導(dǎo)肽序列顯示于SEQ ID NO134。PS201L3的44kDa基因的DNA序列顯示于SEQ ID NO135。PS201L3的44kDa毒素的推導(dǎo)肽序列顯示于SEQ ID NO136。
下表顯示了來自201L3和149B1的二元基因和蛋白質(zhì)的序列相似性和同一性。使用BESTFIT程序(GCG軟件包的一部分)進(jìn)行了這些比較。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Advances in Applied Mathematics)2482-489，1981)。
表14201L3相比149B1 ％相似性％同一性14kDa核苷酸序列- 71.114kDa肽序列 63.954.145kDa核苷酸序列- 76.145kDa肽序列 70.962.7實(shí)施例21-來自蘇云金芽孢桿菌PS187G1、PS201HH2、和KR1369菌株的新的δ-內(nèi)毒素基因的分子克隆和DNA序列分析由在Luria Bertani(LB)肉湯中生長(zhǎng)至可見光600nm光密度為0.5-1.0的蘇云金芽孢桿菌PS187G1、PS201HH2、和KR1369菌株制備總細(xì)胞DNA。使用Qiagen Genomic-tip 500/G試劑盒和基因組DNA緩沖液組(Qiagen公司，Valencia，CA)，根據(jù)用于革蘭氏陽性細(xì)菌的方案，提取DNA。分別使用PS187G1、PS201HH2、和KR1369總細(xì)胞DNA經(jīng)NdeII部分消化的插入片段在SuperCos1載體(Stratagene)中構(gòu)建了PS187G1、PS201HH2、和KR1369粘粒文庫。用包裝的粘粒轉(zhuǎn)染XL1-BlueMR細(xì)胞，以獲得羧芐青霉素和卡那霉素抗性克隆。對(duì)于每種菌株，將576個(gè)粘粒集落在96孔板中在1ml LB+100μg/ml羧芐青霉素+50μg/ml卡那霉素中于37℃培養(yǎng)18小時(shí)，并將板復(fù)制到尼龍濾膜上進(jìn)行雜交篩選。
由PS187G1、PS201HH2、或KR1369基因組DNA，使用為擴(kuò)增二元同源物設(shè)計(jì)的下列引物，擴(kuò)增得到包含大約1000bp的PS187G1、PS201HH2、或KR1369的14kDa和44kDa毒素操縱子的PCR擴(kuò)增子15kfor15′-ATG TCA GCT CGC GAA GTA CAC-3′(SEQ ID NO131)45krev65′-GTC CAT CCC ATT AAT TGA GGA G-3′(SEQ ID NO132)將DNA片段使用Qia快速提取試劑盒(Qiagen)進(jìn)行凝膠純化。將探針使用32P-dCTP和Prime-it II試劑盒(Stratagene)進(jìn)行放射性標(biāo)記，并與集落浸提濾膜一起在雜交水溶液(6x SSPE/5x Denhardt氏溶液/0.1％ SDS/0.1mg/ml變性DNA)中于65℃溫育16小時(shí)。將集落浸提濾膜用0.5x SSC/0.1％ SDS于室溫簡(jiǎn)單的清洗1次，隨后用0.5xSSC/0.1％ SDS于65℃ 10分鐘再清洗2次。然后將濾膜暴露于X射線膠片20分鐘(PS187G1和PS201HH2)或1小時(shí)(KR1369)。每種菌株選擇一個(gè)與探針強(qiáng)雜交的粘?？寺。M(jìn)行進(jìn)一步的分析。通過使用上述引物的PCR擴(kuò)增，確認(rèn)了這些粘?？寺“蠹s1000bp的14kDa和44kDa毒素基因目標(biāo)。PS187G1的粘?？寺》Q為pMYC3106；包含pMYC3106的重組E.coli XL1-Blue MR細(xì)胞稱為MR1508。PS201HH2的粘粒克隆稱為pMYC3107；包含pMYC3107的重組E.coli XL1-Blue MR細(xì)胞稱為MR1509。KR1369的粘粒克隆稱為pMYC3108；包含pMYC3108的重組E.coliXL1-Rlue MR細(xì)胞稱為MR1510。MR1509和MR1510的傳代培養(yǎng)物于2000年8月8日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)依次是NRRL B-30330和NRRL B-30331。
使用ABI377自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)和相關(guān)軟件，分別對(duì)pMYC3106、pMYC3107、和pMYC3108上編碼的PS187G1、PS201HH2、和KR1369的14kDa和44kDa毒素基因進(jìn)行測(cè)定。
PS187G1的14kDa和44kDa核苷酸和推導(dǎo)多肽序列顯示于SEQ IDNO137-140。14kDa和44kDa毒素基因序列都是完整的開放閱讀框架。與編碼殺蟲蛋白質(zhì)的其它毒素基因相比，PS187G1的14kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列、44kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列是新的。
PS201HH2的14kDa和44kDa核苷酸和推導(dǎo)多肽序列顯示于SEQ IDNO141-144。14kDa毒素基因序列是完整的開放閱讀框架。44kDa毒素基因序列是部分基因序列。與編碼殺蟲蛋白質(zhì)的其它毒素基因相比，PS201HH2的14kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列、44kDa毒素部分開放閱讀框架核苷酸序列、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列是新的。
KR1369的14kDa和44kDa核苷酸和推導(dǎo)多肽序列顯示于SEQ ID NO145-148。14kDa和44kDa毒素基因序列都是完整的開放閱讀框架。與編碼殺蟲蛋白質(zhì)的其它毒素基因相比，KR1369的14kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列、44kDa毒素開放閱讀框架核苷酸序列、和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列是新的。實(shí)施例22-包含PS149B1的14kDa和44kDa二元毒素基因的雜合基因融合物的構(gòu)建和表達(dá)設(shè)計(jì)了來自PS149B1的14kDa和44kDa基因的5’和3’末端的寡核苷酸引物。這些寡核苷酸設(shè)計(jì)用于通過SOE-PCR(“通過重疊延伸的基因剪接使用PCR剪接基因”，生物技術(shù)(Biotechniques)8528-535，1990年5月)產(chǎn)生基因融合物。兩種基因以與天然二元毒素操縱子中發(fā)現(xiàn)的相反順序融合在一起(即44kDa基因在前，14kDa基因在后)。
用于SOE-PCR的寡核苷酸序列如下F1newAAATATTATTTTATGTCAGCACGTGAAGTACACATTG(SEQ IDNO155)R1newtctctGGTACCttaTTAtgatttatgcccatatcgtgagg(SEQ ID NO156)F2newagagaACTAGTaaaaaggagataaccATGttagatactaataaag(SEQ ID NO157)R2newCGTGCTGACATAAAATAATATTTTTTTAATTTTTTTAGTGTACTTT(SEQ ID NO158)寡核苷酸“F1new”設(shè)計(jì)用于指導(dǎo)由14kDa基因5’末端的擴(kuò)增，并可與44kDa基因3’末端雜交。寡核苷酸“R1new”設(shè)計(jì)用于指導(dǎo)由14kDa基因3’末端的擴(kuò)增。此引物設(shè)計(jì)成包含2個(gè)終止密碼子，以確保翻譯的終止。它還設(shè)計(jì)成包含KpnI位點(diǎn)，用于定向克隆到熒光假單胞菌的質(zhì)粒表達(dá)載體中。寡核苷酸“F2new”設(shè)計(jì)用于指導(dǎo)由44kDa基因5’末端的擴(kuò)增。它還包含核糖體結(jié)合序列和SpeI克隆位點(diǎn)。寡核苷酸“R2new”設(shè)計(jì)用于指導(dǎo)由44kDa基因3’末端的擴(kuò)增，并可與14kDa基因5’末端雜交。
首先由PS149B1基因組DNA單獨(dú)擴(kuò)增這兩種基因；14kDa基因使用“F1new”和“R1new”，44kDa基因使用“F2new”和“R2new”。然后將產(chǎn)物加到一個(gè)PCR管中，并使用“R1new”和“F2new”一起擴(kuò)增。此時(shí)，使用Herculase TM增強(qiáng)型聚合酶混和物(Stratagene，La Jolla，CA)，退火溫度48℃，擴(kuò)增包含基因融合物的大約1.5kb DNA片段。隨后將此DNA片段用KpnI和SpeI進(jìn)行消化，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，通過電洗脫進(jìn)行純化。質(zhì)粒載體也用KpnI和SpeI進(jìn)行消化，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，通過電洗脫進(jìn)行純化，并用磷酸酶進(jìn)行處理。然后將載體和插入片段于14℃一起連接過夜。通過電穿孔用連接DNA片段轉(zhuǎn)化MB214 P.f.細(xì)胞，并在LB+30μg/ml四環(huán)素平板上培養(yǎng)過夜進(jìn)行選擇。通過診斷性PCR鑒定包含基因融合物的菌株，并測(cè)序以確認(rèn)成功的基因剪接。包含克隆基因融合物的一個(gè)代表性菌株稱為MR1607；重組質(zhì)粒稱為pMYC2475。
MR1607的傳代培養(yǎng)物于2000年8月8日保存于專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)的永久收藏中心，Regional Research Center，1815 NorthUniVersity Street，Peoria，Illinois，61604美國。編號(hào)是NRRLB-30332。培養(yǎng)MR1607，并通過SDS-PAGE和免疫印漬確認(rèn)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。當(dāng)用14kDa毒素或44kDa毒素特異性抗體對(duì)Western印漬進(jìn)行探查時(shí)，確認(rèn)有代表44kDa+14kDa融合產(chǎn)物的大約58kDa蛋白質(zhì)條帶。
58kDa融合蛋白的序列顯示于SEQ ID NO159。基因融合物的DNA序列顯示于SEQ ID NO160。實(shí)施例23-二元同源物的混和研究同源菌株的培養(yǎng)選擇了4種菌株，每種主要二元毒素家族各選一種——149B1、80JJ1、201L3、和167H2。為了減少純化各毒素蛋白質(zhì)花費(fèi)的時(shí)間，改為培養(yǎng)下列熒光假單胞菌(P.f.)克隆MR1253(149B1的14kDa)和MR1256(149B1的44kDa)。類似的，使用B.t.克隆MR541(表達(dá)80JJ1的14kDa)和MR542(80JJ1的44kDa)。將B.t.菌株如實(shí)施例1所述進(jìn)行培養(yǎng)。將沉淀用水清洗3次，并凍存于-20℃直到使用。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟在Biolafitte發(fā)酵罐中以10L批次培養(yǎng)P.f菌株。將沉淀凍存于-80℃直到使用。
毒素的提取和純化167H2、MR541、MR542、201L3的純化。使用100mM檸檬酸鈉緩沖液(pH范圍3.0-5.5)進(jìn)行細(xì)胞沉淀的提取。在典型提取中，用最初培養(yǎng)物體積的1/10-1/3體積的緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行提取。將沉淀懸于緩沖液，并置于搖床中于4℃一段時(shí)間(2.5小時(shí)-過夜)。將提取物離心，并保留上清液。對(duì)于每種菌株重復(fù)此步驟，直至每種蛋白質(zhì)獲得了至少大約10mg。使用NuPAGE Bis/Tris凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)的SDS-PAGE確認(rèn)提取物中蛋白質(zhì)毒素的存在與否。根據(jù)制造商的指示制備樣品，并加到4-12％凝膠上，然后用MES電泳緩沖液形成電泳圖譜。此步驟的例外是所有201L3樣品的樣品制備。將這些樣品用BioRad的Laemmli樣品緩沖液稀釋2倍，并于95℃加熱4分鐘，由此制備樣品。通過激光掃描凝膠測(cè)光密度法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)(Molecular Dynamics Personal Densitometer SI)。將提取物通過0.2μm濾膜進(jìn)行澄清，并保存于4℃。
MR1253和MR1256的純化。以溶解的包涵體形式制備分別對(duì)應(yīng)于149B1的14和44kDa蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)MR1253和MR1256。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟制備包涵體。將包涵體溶于1mM EDTA/50mM檸檬酸鈉pH5.3。
單一毒素167H2和201L3的純化。混和已知含有14、44kDa或其二者的所有提取物。將此混合提取物在100mM檸檬酸鈉/150mM NaCl pH4中進(jìn)行透析。透析袋購自Pierce(Snakeskin 10k MWCO)。樣品通常透析大約6小時(shí)，然后在新鮮緩沖液中再次透析過夜。
然后將提取物用Centriprep 10或Centricon Plus-20(Biomax-5，5000NMWL)離心濾器(Millipore)進(jìn)行濃縮，對(duì)14kDa和44kDa蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并進(jìn)行凝膠過濾層析。
在用于層析的制備中，將所有樣品和緩沖液經(jīng)0.2μm濾器過濾并除氣。然后將樣品加到用2倍柱床體積的分離緩沖液(100mM檸檬酸鈉/150mM NaCl pH4.0)平衡的HiPrep 26/60 Sephacryl S-100凝膠過濾柱上。樣品體積的范圍為5-10ml。使用AKTA純化儀100FPLC系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)進(jìn)行控制。于環(huán)境溫度進(jìn)行層析。層析過程中緩沖液過柱流速維持在0.7ml/min。通過監(jiān)控280nm的UV吸光值來檢測(cè)蛋白質(zhì)。收集流出液并保存于4℃。合并含有14或44kDa蛋白質(zhì)的收集液，如上所述通過SDS-PAGE檢查純度。
對(duì)于167H2樣品，檢測(cè)到兩個(gè)大且于基線很好地分開的峰。收集液的SDS-PAGE顯示每個(gè)峰對(duì)應(yīng)于一種蛋白質(zhì)毒素。
在201L3樣品中，檢測(cè)到3個(gè)很好地分開的峰和一個(gè)肩峰。SDS-PAGE揭示，第一個(gè)峰代表100kDa蛋白質(zhì)和80kDa蛋白質(zhì)。第二個(gè)峰代表44kDa蛋白質(zhì)，肩峰是40kDa蛋白質(zhì)。第三個(gè)峰是14kDa蛋白質(zhì)。將來自兩個(gè)樣品含有44kDa的部分合并，同樣合并含有14kDa蛋白質(zhì)的所有級(jí)分。
由P.f.克隆MR1253和MR1256分別獲得了149B1單個(gè)蛋白質(zhì)，因此不需要進(jìn)一步純化。類似的，80JJ1重組體MR541和MR542產(chǎn)生單個(gè)的14和44kDa蛋白質(zhì)，因此不用進(jìn)一步純化。
用于wCRW LC50生物檢測(cè)的樣品制備透析。將單個(gè)二元毒素蛋白質(zhì)樣品在6L 20mM檸檬酸鈉pH4.0中進(jìn)行透析。第一次透析進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)，然后將樣品轉(zhuǎn)移到新鮮緩沖液中并透析過夜。最后，將樣品轉(zhuǎn)移到新鮮緩沖液中并再透析幾個(gè)小時(shí)。蛋白質(zhì)樣品的來源是合并的凝膠過濾收集液(167H2、201L3)、沉淀提取物(MR541、MR542)、或包涵體沉淀提取物(MR1253、MR1256)。將所有樣品濾過0.2μm膜以除菌。
濃縮。使用Centricon Plus-20(Biomax-5，5000 NMWL)離心濾器(Millipore)將樣品濃縮。
定量。如上所述對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。為了達(dá)到LC50生物檢測(cè)的要求，用于各種組合的每種毒素蛋白質(zhì)至少需要6.3mg，濃度范圍0.316-1.36mg/ml。如果需要，如上所述將樣品濃縮，或用緩沖液(20mM檸檬酸鈉pH4.0)稀釋，并重新進(jìn)行定量。
二元混和/LC50生物檢測(cè)。對(duì)于4種菌株的每一種，將14kDa蛋白以1∶1的質(zhì)量比與每種菌株的44kDa蛋白進(jìn)行組合?；旌臀锏谋砻媸┧幜渴?0μg/cm2，203L1的14kDa蛋白質(zhì)的混和物例外，此蛋白質(zhì)混和物的表面施藥量只有44μg/cm2。作為對(duì)照，單獨(dú)施用每種蛋白質(zhì)，以及提取緩沖液(20mM檸檬酸鈉pH4.0)。還測(cè)試了天然組合(即149B1的14kDa+44kDa蛋白)。所有毒素組合和緩沖液對(duì)照針對(duì)玉米幼芽根葉甲的生物檢測(cè)都進(jìn)行了3次，而單個(gè)毒素只測(cè)試了1次。
表15(毒素組合的LC50結(jié)果)和表16(菌株潛力與149B1的比較)列出了結(jié)果。
結(jié)果還以圖的形式展示于圖3。
除了201L3，天然組合都具有針對(duì)玉米幼芽根葉甲的高度活性。然而，當(dāng)與167H2或149B1的14kDa蛋白組合時(shí)，201L3的44kDa也具有活性。其它活性組合是149B1的14kDa蛋白與80JJ1或167H2的44kDa蛋白組合，后者顯得比天然149B1混和物更有活性。單個(gè)蛋白質(zhì)或者緩沖液或水對(duì)照都沒有記錄到劑量應(yīng)答。實(shí)施例24-使用PS149B1的14kDa蛋白控制黃瓜十一星葉甲由重組熒光假單胞菌MR1253菌株分離得到包含大約50％(wt/wt)的最初在蘇云金芽孢桿菌PS149B1菌株中發(fā)現(xiàn)的14kDa δ-內(nèi)毒素的粉末。使用下列步驟評(píng)價(jià)此粉末的殺蟲活性。
將人工昆蟲食物(R.I.Rose和J.M.McCabe(1973)“用于飼養(yǎng)玉米根蟲的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)技術(shù)”，經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)66(2)398-400)以大約0.5ml/孔分散到128孔生物檢測(cè)盤(C-DInternational，Pitman，NJ)中，產(chǎn)生大約1.5cm2的表面積。將14kDa蛋白質(zhì)粉末的緩沖液(10mM磷酸鉀pH7.5)懸浮液以50μl/孔加到人工昆蟲食物的表面，并使食物表面干燥。每次測(cè)試中還包括緩沖液對(duì)照。每個(gè)孔中放入一條新生的黃瓜十一星葉甲(Diabroticaundecimpunctata howardi)，并用與盤子一起提供的蓋子將孔封閉。生物檢測(cè)于28℃持續(xù)6天，然后對(duì)每種處理的存活幼蟲作為一組進(jìn)行稱重。如下計(jì)算百分比生長(zhǎng)抑制(存活對(duì)照昆蟲體重-存活處理昆蟲體重)/對(duì)照體重×100％。計(jì)算5次測(cè)試(每種處理16只昆蟲)的生長(zhǎng)抑制，并在各次測(cè)試間平均。
結(jié)果證明14kDa蛋白質(zhì)以濃度依賴方式抑制黃瓜十一星葉甲的生長(zhǎng)。表17顯示了PS149B1的14kDa蛋白質(zhì)對(duì)黃瓜十一星葉甲的生長(zhǎng)抑制。
表17.
處理濃度(μg ai/cm2) ％生長(zhǎng)抑制14kDa蛋白質(zhì)13214kDa蛋白質(zhì)35514kDa蛋白質(zhì)978ai＝活性成分實(shí)施例25-使用PS149B1二元毒素控制歐洲玉米螟和谷實(shí)夜蛾分別由重組熒光假單胞菌MR1253和MR1256菌株分離得到包含54％的14kDa δ-內(nèi)毒素的粉末和包含37％的44kDa δ-內(nèi)毒素的粉末(最初都是在蘇云金芽孢桿菌PS149B1菌株中發(fā)現(xiàn)的)。使用下列步驟評(píng)價(jià)這些粉末的混和物的殺蟲活性。
將人工昆蟲食物(R.I.Rose和J.M.McCabe(1973)“用于飼養(yǎng)玉米根蟲的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)技術(shù)”，經(jīng)濟(jì)昆蟲學(xué)雜志(J.Econ.Entomol.)66(2)398-400)以大約0.5ml/孔分散到128孔生物檢測(cè)盤(C-DInternational，Pitman，NJ)中，產(chǎn)生大約1.5cm2的表面積。將蛋白質(zhì)粉末的緩沖液(10mM磷酸鉀pH7.5)懸浮液混和，然后以50μl/孔加到人工昆蟲食物的表面。使食物表面干燥。每次測(cè)試中還包括緩沖液對(duì)照。每個(gè)孔中放入一條新生幼蟲，并用與盤子一起提供的蓋子將孔封閉。測(cè)試用屬于鱗翅目的歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)進(jìn)行。生物檢測(cè)于28℃持續(xù)6天，然后對(duì)每種處理的存活幼蟲作為一組進(jìn)行稱重。如下計(jì)算百分比生長(zhǎng)抑制(存活對(duì)照昆蟲體重-存活處理昆蟲體重)/對(duì)照體重×100％。計(jì)算4次測(cè)試(每種處理14-16只昆蟲)的生長(zhǎng)抑制，并在各次測(cè)試間平均。
結(jié)果證明14kDa蛋白質(zhì)以濃度依賴方式抑制歐洲玉米螟和谷實(shí)夜蛾的生長(zhǎng)。表18顯示了PS149B1的蛋白質(zhì)混和物對(duì)谷實(shí)夜蛾(CEW)和歐洲玉米螟(ECB)的生長(zhǎng)抑制。
表18.
14kDa蛋白質(zhì)+44kDa蛋白質(zhì)濃度 ％生長(zhǎng)抑制(μg ai/cm2) CEWECB3.7+11 425911+33 577733+100 6189ai＝活性成分實(shí)施例26-45kDa蛋白的進(jìn)一步定性分析和用于鑒定其它多核苷酸和蛋白質(zhì)的引物設(shè)計(jì)本發(fā)明不僅包括具體例示的序列。本發(fā)明基因和毒素的部分可以用于鑒定其它相關(guān)毒素和基因。由此，本發(fā)明包括編碼包含例如所附序列表中和此處所述任何二元型蛋白質(zhì)或多肽的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸。其它實(shí)施方案包括編碼例如此處例示的蛋白質(zhì)的至少20、30、40、50、60、70、80、90、和100個(gè)連續(xù)氨基酸的多核苷酸；這些數(shù)目還類似的應(yīng)用于例示的多核苷酸的連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括由這些多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。同樣的，本發(fā)明包括包含連續(xù)核苷酸(編碼包含這些大致大小的肽的蛋白質(zhì)和多肽)的多核苷酸。
雖然差異仍然很大，與本發(fā)明毒素“最密切的”毒素被認(rèn)為是球形芽孢桿菌的51和42kDa殺蚊蛋白質(zhì)。所附圖4和圖5是51和42kDa的球形芽孢桿菌毒素和基因與45kDa的149B1毒素和基因的蛋白質(zhì)比對(duì)和核苷酸序列比對(duì)。
核苷酸比對(duì)中標(biāo)明的兩個(gè)序列塊可以用于設(shè)計(jì)引物。下文顯示了例示性PCR引物對(duì)(5’-3’方向，45kD3’rc以互補(bǔ)物顯示)。這些引物已經(jīng)成功的用于鑒定45kDa二元家族的其它成員。下文還顯示了完全冗余序列和預(yù)示的配對(duì)。
45kD5′GAT RAT RAT CAA TAT ATT ATT AC(SEQ ID NO161).
45kD3′rcCAA GGT ART AAT GTC CAT CC(SEQ ID NO162).
序列的所示形式及其反向互補(bǔ)序列都是有用的(03和04與例示的反向引物45 kD3’rc互補(bǔ))。
45kD5′01GAT GATGrTmrAk wwATTATTrC A(SEQ ID NO163).
45kD5′02GAT GATGrTmrAT ATATrATTrC A(SEQ ID NO164).
45kD3′03GGAwG krCdyTwdTm CCwTGTAT(SEQ ID NO165).
45kD3′04GGAwG kACryTAdTA CCTTGTAT(SEQ ID NO166).
關(guān)于鑒定球形芽孢桿菌毒素的方式，使用149B1的45kDa蛋白質(zhì)的BLAST(Altschul等人，1997“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序”，核酸研究(Nucleic Acids Res.)253389-3402)數(shù)據(jù)庫搜索，發(fā)現(xiàn)與42kDa的球形芽孢桿菌包涵體蛋白質(zhì)(期望得分3×1014)和51kDa的球形芽孢桿菌結(jié)晶狀包涵體蛋白質(zhì)(期望得分3×109)相匹配。
45kDa的149B1肽序列與42kDa的球形芽孢桿菌結(jié)晶狀包涵體蛋白質(zhì)的比對(duì)得出，325個(gè)殘基具有26％的同一性。比對(duì)得分比100種隨機(jī)比對(duì)的平均得分高27.2sd。45kDa的149B1肽序列與42kDa的球形芽孢桿菌結(jié)晶狀包涵體蛋白質(zhì)的相似分析得出，229個(gè)殘基具有29％的同一性。比對(duì)得分比100種隨機(jī)比對(duì)的平均得分高23.4sd。比對(duì)得分比隨機(jī)比對(duì)平均值高10sd被認(rèn)為是顯著的(D.J.Lipman和W.R.Pearson(1985)“快速和靈敏的相似性搜索”，科學(xué)(Science)2271435-1441；R.F.Doolittle(1987)of URFs and ORFsa primer onhow to analyze derived amino acid sequence，University ScienceBooks，Mill Valley，CA)。
為了參考，以相同方式比較了結(jié)構(gòu)相似的Cry1Aa、Cry2Aa、和Cry3Aa蛋白質(zhì)序列。Cry2Aa與Cry1Aa和Cry2Aa與Cry3Aa分別在214和213個(gè)氨基酸中具有29％和27％的同一性，比對(duì)得分比100種隨機(jī)比對(duì)的平均得分高32.2sd和29.5sd。149B1的45kDa蛋白質(zhì)序列與Cry2Aa蛋白質(zhì)序列的比對(duì)得出比對(duì)得分比100種隨機(jī)比對(duì)的平均得分高1sd。
還記錄了下面的比較
*根據(jù)100種隨機(jī)化為了其它比較目的和為了其它引物設(shè)計(jì)，記錄了下面的參考文獻(xiàn)Oei等人(1992)，“純化的球形芽孢桿菌二元毒素及其刪除衍生物與致倦庫蚊腸道的結(jié)合功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的闡釋”，普通微生物學(xué)雜志(Journal of General Microbiology)138(7)1515-26。
51kDa蛋白35-448有活性；45-448無活性；4-396有活性；4-392無活性。
42kDa蛋白18-370有活性；35-370無活性；4-358有活性；4-349無活性。
用經(jīng)純化和凝血酶切割的GST融合物進(jìn)行工作。用其它完整亞基進(jìn)行所有截短物的檢測(cè)。所有刪除都有一些活性損失。P51ΔC56結(jié)合但不使42內(nèi)在化。P51ΔN45不結(jié)合。只有42kDa+51kDa可內(nèi)在化。N末端和C末端無毒性的42kDa蛋白質(zhì)不能結(jié)合51kDa蛋白質(zhì)或51kDa受體復(fù)合物。
Davidson等人(1990)，“球形芽孢桿菌的殺蚊子幼蟲蛋白質(zhì)的相互作用”，加拿大微生物學(xué)雜志(Can.J.Microbiol.)36(12)870-878。由球形芽孢桿菌得到的經(jīng)SDS-PAGE純化的蛋白質(zhì)的N末端。68-74kDa復(fù)合物(未還原)中的51kDa的S29和N31及42kDa的S9。來自51kDa條帶(未還原)的51的S9和S29及42的N31。在還原凝膠中，45kDa條帶含有51kDa蛋白的S29和N31，39kDa條帶含有42kDa蛋白質(zhì)的S9。
Baumann等人(1988)，“編碼球形芽孢桿菌2362和2297的51.4和41.9kDa蛋白質(zhì)的殺蚊毒素基因的序列分析”，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1702045-2050。來自球形芽孢桿菌蛋白酶D5的41.9kDa蛋白的N末端和來自胰凝乳蛋白酶的I11；C末端跟隨胰蛋白酶的R349。鑒定到相似性增強(qiáng)的區(qū)域?qū)?yīng)于許多上述區(qū)域。相似序列塊A-D在51和42kDa蛋白質(zhì)之間。
總而言之，本發(fā)明并不想包括上文討論的球形芽孢桿菌毒素(事實(shí)上，它們被特異排除在外)。在那個(gè)方面，趨異連續(xù)序列，如上文討論的比對(duì)(圖4和圖5)中例示的，可以作為引物使用，以鑒定此處暗示但未具體例示的獨(dú)特毒素。然而，保守連續(xù)序列，如比對(duì)中所示，也可以根據(jù)本發(fā)明使用，以鑒定其它新的15/45kDa型二元毒素(對(duì)玉米根蟲和其它害蟲有活性)。實(shí)施例27-毒素基因在植物中的插入和表達(dá)本發(fā)明的一個(gè)方面是用表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化植物。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物對(duì)目的害蟲攻擊具有抵抗力。
可以將此處所述新的玉米根蟲活性基因進(jìn)行優(yōu)化，用于在其它有機(jī)體中表達(dá)。例如，經(jīng)玉蜀黍優(yōu)化的14和44kDa的PS80JJ1毒素編碼基因序列分別顯示于SEQ ID NO44和45。
使用多種本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以將此處公開的殺蟲毒素編碼基因插入植物細(xì)胞中。例如，可以獲得大量的包含E.coli的復(fù)制系統(tǒng)和可用于進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇的標(biāo)記的克隆載體，用于將外源基因插入到高等植物中。載體包括例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184、等等。相應(yīng)的，可以將B.t.毒素編碼序列插入載體的合適限制性位點(diǎn)。用產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli。將E.coli細(xì)胞在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后收獲并裂解。回收質(zhì)粒。通常進(jìn)行序列分析、限制性分析、電泳、和其它生化-分子生物學(xué)方法作為分析方法。每步操作后，可以將所用DNA序列切下，并與下一個(gè)DNA序列連接。每種質(zhì)粒序列可以克隆到相同或其它質(zhì)粒中。取決于將期望基因插入植物的方法，其它DNA序列可能是必需的。例如，如果使用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，那么必需至少連接Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA的右邊界序列，但是經(jīng)常同時(shí)連接右和左邊界序列，作為將要插入的基因的側(cè)翼區(qū)域。
使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，已經(jīng)進(jìn)行了深入研究并充分描述于EP120 516；Hoekema(1985)二元植物載體系統(tǒng)，Offset-durkkerijKanters B.V.，Alblasserdam，第5章；Fraley等人，植物科學(xué)評(píng)論(Crit.Rev.Plant Sci.)41-46；和An等人(1985)歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J)4277-287。
一旦插入的DNA已經(jīng)整合到基因組中，它在那兒將相對(duì)穩(wěn)定，并且原則上不再出來。它通常包含選擇標(biāo)記，以賦予經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以對(duì)殺生物劑或抗生素(諸如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素、或氯霉素及其它)的抗性。單獨(dú)應(yīng)用的標(biāo)記應(yīng)當(dāng)相應(yīng)的能夠選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而非不含插入DNA的細(xì)胞。
可以獲得大量的技術(shù)用于將DNA插入到植物宿主細(xì)胞中。那些技術(shù)包括使用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑用T-DNA轉(zhuǎn)化、融合、注射、biolistics(微粒轟擊)、或電穿孔、以及其它可能的方法。如果使用土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，要插入的DNA必需克隆到特殊質(zhì)粒即中間載體或二元載體中。由于中間載體包含與T-DNA中的序列同源的序列，所以它可以通過同源重組整合到Ti或Ri質(zhì)粒中。Ti或Ri質(zhì)粒還包含T-DNA轉(zhuǎn)移必需的vir區(qū)。中間載體自身在土壤桿菌中不能復(fù)制。通過輔助質(zhì)粒的方法(接合)，中間載體可以轉(zhuǎn)移到根瘤土壤桿菌中。二元載體自身可以在E.coli和土壤桿菌中復(fù)制。它們包含側(cè)翼為T-DNA右和左邊界區(qū)的選擇標(biāo)記基因和接頭或多克隆位點(diǎn)。它們可以直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(Holsters等人Mol.Gen.Genet.163181-187)。作為宿主細(xì)胞使用的土壤桿菌要包含攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)對(duì)于將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中是必需的。還可以包含其它T-DNA。這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)菌被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。植物外植體可以方便的與根瘤土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌一起進(jìn)行培養(yǎng)，從而將DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。然后由經(jīng)感染的植物材料(例如葉片、莖段、根，還有原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)，可以在合適的培養(yǎng)基(可以含有抗生素或殺生物劑用于選擇)中再生成完整植株。然后可以測(cè)試這樣得到的植物中插入DNA的存在。注射和電穿孔對(duì)質(zhì)粒沒有特殊要求。可以使用普通質(zhì)粒，諸如pUC衍生物。
經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以常規(guī)方式在植物內(nèi)生長(zhǎng)。它們可以形成種系細(xì)胞，并將性狀遺傳給后代植株。這樣的植物可以以常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)，并可以與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子或其它遺傳因子的植物雜交。產(chǎn)生的雜合體個(gè)體具有相應(yīng)的表型性狀。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用經(jīng)植物密碼子使用率優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化植物。參閱美國專利5,380,831，此處引用作為參考。同樣的，可以有利的使用編碼截短毒素的植物。截短毒素通常將編碼全長(zhǎng)毒素的大約55％-大約80％。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生用于植物的合成B.t.基因的方法。實(shí)施例28-將B.t.基因克隆到昆蟲病毒中已知有大量的病毒可感染昆蟲。這些病毒包括例如桿狀病毒和昆蟲痘病毒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，此處所述編碼殺蟲毒素的基因可以置于昆蟲病毒的基因組中，由此增強(qiáng)病毒的致病性。用于構(gòu)建包含B.t.毒素基因的昆蟲病毒的方法，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知且容易實(shí)踐的。這些步驟描述于例如A.T.Merrywwather、U.Weyer、M.P.G.Harris、M.Hirst、T.Booth、R.D.Possee(1990)普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)711535-1544)和J.W.M.Martens、G.Honee、D.Zuidema、J.W.M.van Lent、B.Visser、J.M.Vlak(1990)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environmental Microbiol.)56(9)2764-2770。
此處提及或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)中請(qǐng)、和出版物，均全文引入作為參考文獻(xiàn)，它們與本說明書的具體教導(dǎo)不相矛盾。
應(yīng)當(dāng)這樣理解，此處描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了例示目的，而且本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明可以領(lǐng)會(huì)各種修飾和變化，這些是包括在本申請(qǐng)的精神和范圍之內(nèi)及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的。
序列表<110>Mycogen公司<120>殺蟲蛋白<130>MA-703C3<140>09/378，088<141>1999-08-20<160>166<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述肽<400>1Met Leu Asp Thr Asn1 5<210>2<211>25<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>2Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu20 25<210>3<211>24<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>3Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Thr Arg His Thr Leu1 5 10 15Gln Leu Glu Ala Lys Thr Lys Leu20<210>4<211>25<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>4Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu20 25<210>5<211>50<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<220><221>不確定<222>(35)<223>未確定氨基酸<400>5Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr20 25 30Ser Pro Xaa Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu35 40 45Ser Asn50<210>6<211>25<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>6Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly1 5 10 15Leu His Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu20 25<210>7<211>25<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>7Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu20 25<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(4)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(6)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(12)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(21)<223>任何核苷酸<400>8atgntngata cnaataaagt ntatgaaat 29<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>9ggattatcta tctctgagtg ttcttg 26<210>10<211>1158<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>10atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattcg 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaaaata cctaagcata cacttataaa attgaaaaaa 1140cattatttta aaaaataa 1158<210>11<211>385<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>11Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Ash Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys370 375 380Lys385<210>12<211>834<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>12ggactatatg cagcaactta tttaagttta gatgattcag gtgttagttt aatgaataaa 60aatgatgatg atattgatga ttataactta aaatggtttt tatttcctat tgatgatgat 120caatatatta ttacaagcta tgcagcaaat aattgtaaag tttggaatgt taataatgat 180aaaataaatg tttcgactta ttcttcaaca aattcaatac aaaaatggca aataaaagct 240aatggttctt catatgtaat acaaagtgat aatggaaaag tcttaacagc aggaaccggt 300caagctcttg gattgatacg tttaactgat gaatcctcaa ataatcccaa tcaacaatgg 360aatttaactt ctgtacaaac aattcaactt ccacaaaaac ctataataga tacaaaatta 420aaagattatc ccaaatattc accaactgga aatatagata atggaacatc tcctcaatta 480atgggatgga cattagtacc ttgtattatg gtaaatgatc caaatataga taaaaatact 540caaattaaaa ctactccata ttatatttta aaaaaatatc aatattggca acgagcagta 600ggaagtaatg tagctttacg tccacatgaa aaaaaatcat atacttatga atggggcaca 660gaaatagatc aaaaaacaac aattataaat acattaggat ttcaaatcaa tatagattca 720ggaatgaaat ttgatatacc agaagtaggt ggaggtacag atgaaataaa aacacaacta 780aatgaagaat taaaaataga atatagtcat gaaactaaaa taatggaaaa atat 834<210>13<211>278<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>13Gly Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser1 5 10 15Leu Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp20 25 30Phe Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala35 40 45Ala Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ite Asn Val50 55 60Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala65 70 75 80Asn Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr85 90 95Ala Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser100 105 110Ser Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile115 120 125Gln Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro130 135 140Lys Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu145 150 155 160Met Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile165 170 175Asp Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys180 185 190Tyr Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro195 200 205His Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln210 215 220Lys Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser225 230 235 240Gly Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile245 250 255Lys Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr260 265 270Lys Ile Met Glu Lys Tyr275<210>14<211>829<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>14acatgcagca acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga 60tgatgatatt gatgactata atttaaggtg gtttttattt cctattgatg ataatcaata 120tattattaca agctacgcag cgaataattg taaggtttgg aatgttaata atgataaaat 180aaatgtttca acttattctt caacaaactc gatacagaaa tggcaaataa aagctaatgc 240ttcttcgtat gtaatacaaa gtaataatgg gaaagttcta acagcaggaa ccggtcaatc 300tcttggatta atacgtttaa cggatgaatc accagataat cccaatcaac aatggaattt 360aactcctgta caaacaattc aactcccacc aaaacctaca atagatacaa agttaaaaga 420ttaccccaaa tattcacaaa ctggcaatat agacaaggga acacctcctc aattaatggg 480atggacatta ataccttgta ttatggtaaa tgatcccaat atagataaaa acactcaaat 540caaaactact ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacaag cagtaggaag 600taatgtagct ttacgtccgc atgaaaaaaa atcatatgct tatgagtggg gtacagaaat 660agatcaaaaa acaactatca ttaatacatt aggatttcag attaatatag attcgggaat 720gaaatttgat ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aattaaacga 780agaattaaaa atagaatata gccgtgaaac caaaataatg gaaaaatat 829<210>15<211>276<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>15His Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu Met1 5 10 15Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Phe Leu20 25 30Phe Pro Ile Asp Asp Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala Asn35 40 45Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser Thr50 55 60Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn Ala65 70 75 80Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asn Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala Gly85 90 95Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Pro Asp100 105 110Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln Leu115 120 125Pro Pro Lys Pro Thr Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys Tyr130 135 140Ser Gln Thr Gly Asn Ile Asp Lys Gly Thr Pro Pro Gln Leu Met Gly145 150 155 160Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp Lys165 170 175Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr Gln180 185 190Tyr Trp Gln Gln Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His Glu195 200 205Lys Lys Ser Tyr Ala Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys Thr210 215 220Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly Met225 230 235 240Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys Thr245 250 255Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys Ile260 265 270Met Glu Lys Tyr275<210>16<211>7<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述肽<400>16Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述肽<400>17Trp Phe Leu Phe Pro Ile Asp1 5<210>18<211>8<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述肽<400>18Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr1 5<210>19<211>6<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述肽<400>19Tyr Glu Trp Gly Thr Glu1 5<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(6)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(12)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(21)<223>任何核苷酸<400>20gatatngatg antayaaytt n 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(9)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(15)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(21)<223>任何核苷酸<220><221>不確定<222>(21)<223>任何核苷酸<400>21tggtttttnt ttccnatnga n21<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(6)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(12)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(15)<223>任何核苷酸<400>22caaatnaaaa cnacnccata ttat24<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(3)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(6)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(12)<223>任何核苷酸<400>23tangantggg gnacagaa 18<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(10)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(13)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(19)<223>任何核苷酸<400>24ataatatggn gtngttttna tttg24<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(7)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(13)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(16)<223>任何核苷酸<400>25ttctgtnccc cantcnta18<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>26ctcaaagcgg atcaggag 18<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>27gcgtattcgg atatgcttgg20<210>28<211>386<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<220><221>不確定<222>(1)..(20)<223>任何氨基酸<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(88)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(96)..(97)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(101)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(105)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(114)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(117)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(120)..(121)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(127)..(129)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(131)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(139)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(147)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(150)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(153)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(158)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(160)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(163)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(168)..(170)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(172)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(181)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(189)..(190)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(205)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(209)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(212)..(213)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(215)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(220)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(222)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(225)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(227)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(230)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(237)..(238)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(247)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(249)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(260)..(261)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(269)..(270)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(276)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(281)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(285)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(291)<223>任何氨基酸<220><221>不確定<222>(294)..(386)<223>任何氨基酸<400>28Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Xaa Lys Xaa Asp Xaa Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Xaa Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Xaa Xaa Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Xaa Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Xaa Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Xaa Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Xaa85 90 95Xaa Ser Ser Tyr Xaa Ile Gln Ser Xaa Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Xaa Gly Gln Xaa Leu Gly Xaa Xaa Arg Leu Thr Asp Glu Xaa Xaa115120 125Xaa Asn Xaa Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Xaa Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Xaa Lys Pro Xaa Ile Asp Xaa Lys Leu Lys Asp Xaa Pro Xaa145 150 155 160Tyr Ser Xaa Thr Gly Asn Ile Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Xaa Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Xaa Xaa Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Xaa Lys Lys Tyr195 200 205Xaa Tyr Trp Xaa Xaa Ala Xaa Gly Ser Asn Val Xaa Leu Xaa Pro His210 215 220Xaa Lys Xaa Ser Tyr Xaa Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Xaa Xaa Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Xaa Gly Xaa Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Xaa Xaa Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Xaa Xaa Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Xaa Glu Glu Leu Lys Xaa Glu Tyr Ser Xaa Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Xaa Lys Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa290 295 300Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa305 310 315 320Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa325 330 335Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa340 345 350Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa355 360 365Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa370 375 380Xaa Xaa385<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<220><221>misc_feature<222>(2)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(8)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(14)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)<223>任何核苷酸<400>29gngaagtnca tatngaaatn aataatac28<210>30<211>2015<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>30attaatttta tggaggttga tatttatgtc agctcgcgaa gtacacattg aaataaacaa 60taaaacacgt catacattac aattagagga taaaactaaa cttagcggcg gtagatggcg 120aacatcacct acaaatgttg ctcgtgatac aattaaaaca tttgtagcag aatcacatgg 180ttttatgaca ggagtagaag gtattatata ttttagtgta aacggagacg cagaaattag 240tttacatttt gacaatcctt atataggttc taataaatgt gatggttctt ctgataaacc 300tgaatatgaa gttattactc aaagcggatc aggagataaa tctcatgtga catatactat 360tcagacagta tctttacgat tataaggaaa atttataaaa actgtatttt ttactaaaat 420accaaaaaat acatatttat tttttggtat tttctaatat gaaatatgaa ttataaaaat 480attaataaaa aaggtgataa aaattatgtt agatactaat aaagtttatg aaataagcaa 540tcttgctaat ggattatata catcaactta tttaagtctt gatgattcag gtgttagttt 600aatgagtaaa aaggatgaag atattgatga ttacaattta aaatggtttt tatttcctat 660tgataataat caatatatta ttacaagcta tggagctaat aattgtaaag tttggaatgt 720taaaaatgat aaaataaatg tttcaactta ttcttcaaca aactctgtac aaaaatggca 780aataaaagct aaagattctt catatataat acaaagtgat aatggaaagg tcttaacagc 840aggagtaggt caatctcttg gaatagtacg cctaactgat gaatttccag agaattctaa 900ccaacaatgg aatttaactc ctgtacaaac aattcaactc ccacaaaaac ctaaaataga 960tgaaaaatta aaagatcatc ctgaatattc agaaaccgga aatataaatc ctaaaacaac 1020tcctcaatta atgggatgga cattagtacc ttgtattatg gtaaatgatt caaaaataga 1080taaaaacact caaattaaaa ctactccata ttatattttt aaaaaatata aatactggaa 1140tctagcaaaa ggaagtaatg tatctttact tccacatcaa aaaagatcat atgattatga 1200atggggtaca gaaaaaaatc aaaaaacaac tattattaat acagtaggat tgcaaattaa 1260tatagattca ggaatgaaat ttgaagtacc agaagtagga ggaggtacag aagacataaa 1320aacacaatta actgaagaat taaaagttga atatagcact gaaaccaaaa taatgacgaa 1380atatcaagaa cactcagaga tagataatcc aactaatcaa ccaatgaatt ctataggact 1440tcttatttat acttctttag aattatatcg atataacggt acagaaatta agataatgga 1500catagaaact tcagatcatg atacttacac tcttacttct tatccaaatc ataaagaagc 1560attattactt ctcacaaacc attcgtatga agaagtagaa gaaataacaa aaatacctaa 1620gcatacactt ataaaattga aaaaacatta ttttaaaaaa taaaaaacat aatatataaa 1680tgactgatta atatctctcg aaaaggttct ggtgcaaaaa tagtgggata tgaaaaaagc 1740aaaagattcc taacggaatg gaacattagg ctgttaaatc aaaaagttta ttgataaaat 1800atatctgcct ttggacagac ttctcccctt ggagagtttg tccttttttg accatatgca 1860tagcttctat tccggcaatc atttttgtag ctgtttgcaa ggattttaat ccaagcatat 1920ccgaatacgc tttttgataa ccgatgtctt gttcaatgat attgtttaat attttcacac 1980gaattggcta ctgtgcggta tcctgtctcc tttat2015<210>31<211>360<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>31atgtcagctc gcgaagtaca cattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtgacatat actattcaga cagtatcttt acgattataa 360<210>32<211>119<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>32Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Val Ser Leu Arg Leu115<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>33catgagattt atctcctgat ccgc24<210>34<211>2230<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>34actatgacaa tgattatgac tgctgatgaa ttagctttat caataccagg atattctaaa 60ccatcaaata taacaggaga taaaagtaaa catacattat ttactaatat aattggagat 120attcaaataa aagatcaagc aacatttggg gttgtttttg atccccctct taatcgtatt 180tcaggggctg aagaatcaag taagtttatt gatgtatatt atccttctga agatagtaac 240cttaaatatt atcaatttat aaaagtagca attgattttg atattaatga agattttatt 300aattttaata atcatgacaa tatagggata tttaattttg ttacacgaaa ttttttatta 360aataatgaaa atgattaata aaaaatttaa tttgtataat atgtttattt tttgaaaatt 420gaatgcatat attaatcgag tatgtgtaat aaattttaat tttatggagg ttgatattta 480tgtcagcacg tgaagtacac attgatgtaa ataataagac aggtcataca ttacaattag 540aagataaaac aaaacttgat ggtggtagat ggcgaacatc acctacaaat gttgctaatg 600atcaaattaa aacatttgta gcagaatcac atggttttat gacaggtaca gaaggtacta 660tatattatag tataaatgga gaagcagaaa ttagtttata ttttgacaat ccttattcag 720gttctaataa atatgatggg cattccaata aaaatcaata tgaagttatt acccaaggag 780gatcaggaaa tcaatctcat gttacgtata ctattcaaac tgtatcttca cgatatggga 840ataattcata aaaaaatatt tttttttacg aaaataccaa aaaaattttt ttggtatttt 900ctaatataat tcataaatat tttaataata aaattataag aaaaggtgat aaatattatg 960ttagatacta ataaaattta tgaaataagt aattatgcta atggattaca tgcagcaact 1020tatttaagtt tagatgattc aggtgttagt ttaatgaata aaaatgatga tgatattgat 1080gactataatt taaggtggtt tttatttcct attgatgata atcaatatat tattacaagc 1140tacgcagcga ataattgtaa ggtttggaat gttaataatg ataaaataaa tgtttcaact 1200tattcttcaa caaactcgat acagaaatgg caaataaaag ctaatgcttc ttcgtatgta 1260atacaaagta ataatgggaa agttctaaca gcaggaaccg gtcaatctct tggattaata 1320cgtttaacgg atgaatcacc agataatccc aatcaacaat ggaatttaac tcctgtacaa 1380acaattcaac tcccaccaaa acctacaata gatacaaagt taaaagatta ccccaaatat 1440tcacaaactg gcaatataga caagggaaca cctcctcaat taatgggatg gacattaata 1500ccttgtatta tggtaaatga tccaaatata gataaaaaca ctcaaatcaa aactactcca 1560tattatattt taaaaaaata tcaatattgg caacaagcag taggaagtaa tgtagcttta 1620cgtccgcatg aaaaaaaatc atatgcttat gagtggggta cagaaataga tcaaaaaaca 1680actatcatta atacattagg atttcagatt aatatagatt cgggaatgaa atttgatata 1740ccagaagtag gtggaggtac agatgaaata aaaacacaat taaacgaaga attaaaaata 1800gaatatagcc gtgaaaccaa aataatggaa aaatatcagg aacaatcaga gatagataat 1860ccaactgatc aatcaatgaa ttctatagga ttcctcacta ttacttcttt agaattatat 1920cgatataatg gttcggaaat tagtgtaatg aaaattcaaa cttcagataa tgatacttac 1980aatgtgacct cttatccaga tcatcaacaa gctctattac ttcttacaaa tcattcatat 2040gaagaagtag aagaaataac aaatattccc aaaatatcac tgaaaaaatt aaaaaaatat 2100tatttttaaa acataattat attttgatag ctttttaaaa ataaagattg ttcaaagtaa 2160aatgaaagaa aatcttttat gaaactttaa tacaataaaa gaggaatatt ttcttataag 2220tacttccttg2230<210>35<211>372<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>35atgtcagcac gtgaagtaca cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaaaatcaat atgaagttat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacgtat actattcaaa ctgtatcttc acgatatggg 360aataattcat aa 372<210>36<211>123<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>36Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Asn Gln Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Val Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Asn Ser115 120<210>37<211>1152<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>37atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agtaattatg ctaatggatt acatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgactata atttaaggtg gtttttattt cctattgatg ataatcaata tattattaca 180agctacgcag cgaataattg taaggtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc gatacagaaa tggcaaataa aagctaatgc ttcttcgtat 300gtaatacaaa gtaataatgg gaaagttcta acagcaggaa ccggtcaatc tcttggatta 360atacgtttaa cggatgaatc accagataat cccaatcaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccacc aaaacctaca atagatacaa agttaaaaga ttaccccaaa 480tattcacaaa ctggcaatat agacaaggga acacctcctc aattaatggg atggacatta 540ataccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa acactcaaat caaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacaag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccgc atgaaaaaaa atcatatgct tatgagtggg gtacagaaat agatcaaaaa 720acaactatca ttaatacatt aggatttcag attaatatag attcgggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aattaaacga agaattaaaa 840atagaatata gccgtgaaac caaaataatg gaaaaatatc aggaacaatc agagatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggattcctca ctattacttc tttagaatta 960tatcgatata atggttcgga aattagtgta atgaaaattc aaacttcaga taatgatact 1020tacaatgtga cctcttatcc agatcatcaa caagctctat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cccaaaatat cactgaaaaa attaaaaaaa 1140tattattttt aa 1152<210>38<211>383<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>38Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly1 5 10 15Leu His Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Ala Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asn Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Pro115 120 125Asp Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Pro Lys Pro Thr Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Gln Thr Gly Asn Ile Asp Lys Gly Thr Pro Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Gln Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Ala Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Ser Val Met Lys Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ile Ser Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe370 375 380<210>39<211>2132<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>39gtatttcagg gggtgaagat tcaagtaagt ttattgatgt atattatcct tttgaagata 60gtaattttaa atattatcaa tttataaaag tagcaattga ttttgatatt aatgaagatt 120ttattaattt taataatcat gacaatatag ggatatttaa ttttgttaca cgaaattttt 180tattaaataa tgaaaatgat gaataaaaaa tttaatttgt ttattatgtt tattttttga 240aaattgaatg catatattaa tcgagtatgt ataataaatt ttaattttat ggaggttgat 300atttatgtca gcacgtgaag tacacattga tgtaaataat aagacaggtc atacattaca 360attagaagat aaaacaaaac ttgatggtgg tagatggcga acatcaccta caaatgttgc 420taatgatcaa attaaaacat ttgtagcaga atcaaatggt tttatgacag gtacagaagg 480tactatatat tatagtataa atggagaagc agaaattagt ttatattttg acaatccttt 540tgcaggttct aataaatatg atggacattc caataaatct caatatgaaa ttattaccca 600aggaggatca ggaaatcaat ctcatgttac gtatactatt caaaccacat cctcacgata 660tgggcataaa tcataacaaa taatttttta cgaaaatacc aaaaaataaa tattttttgg 720tattttctaa tataaattac aaatatatta ataataaaat tataagaaaa ggtgataaag 780attatgttag atactaataa agtttatgaa ataagcaatc atgctaatgg actatatgca 840gcaacttatt taagtttaga tgattcaggt gttagtttaa tgaataaaaa tgatgatgat 900attgatgatt ataacttaaa atggttttta tttcctattg atgatgatca atatattatt 960acaagctatg cagcaaataa ttgtaaagtt tggaatgtta ataatgataa aataaatgtt 1020tcgacttatt cttcaacaaa ttcaatacaa aaatggcaaa taaaagctaa tggttcttca 1080tatgtaatac aaagtgataa tggaaaagtc ttaacagcag gaaccggtca agctcttgga 1140ttgatacgtt taactgatga atcctcaaat aatcccaatc aacaatggaa tttaacttct 1200gtacaaacaa ttcaacttcc acaaaaacct ataatagata caaaattaaa agattatccc 1260aaatattcac caactggaaa tatagataat ggaacatctc ctcaattaat gggatggaca 1320ttagtacctt gtattatggt aaatgatcca aatatagata aaaatactca aattaaaact 1380actccatatt atattttaaa aaaatatcaa tattggcaac gagcagtagg aagtaatgta 1440gctttacgtc cacatgaaaa aaaatcatat acttatgaat ggggcacaga aatagatcaa 1500aaaacaacaa ttataaatac attaggattt caaatcaata tagattcagg aatgaaattt 1560gatataccag aagtaggtgg aggtacagat gaaataaaaa cacaactaaa tgaagaatta 1620aaaatagaat atagtcatga aactaaaata atggaaaaat atcaagaaca atctgaaata 1680gataatccaa ctgatcaatc aatgaattct ataggatttc ttactattac ttccttagaa 1740ttatatagat ataatggctc agaaattcgt ataatgcaaa ttcaaacctc agataatgat 1800acttataatg ttacttctta tccaaatcat caacaagctt tattacttct tacaaatcat 1860tcatatgaag aagtagaaga aataacaaat attcctaaaa gtacactaaa aaaattaaaa 1920aaatattatt tttaaatatt gaaattagaa attatctaaa acaaaacgaa agataattta 1980atctttaatt atttgtaaga taatcgtatt ttatttgtat taatttttat acaatataaa 2040gtaatatctg tacgtgaaat tggtttcgct tcaatatcta atctcatctc atgtattaca 2100tgcgtaatac cttcttgttc tgcttctaca ag 2132<210>40<211>372<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>40atgtcagcac gtgaagtaca cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca aatggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttttgca 240ggttctaata aatatgatgg acattccaat aaatctcaat atgaaattat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacgtat actattcaaa ccacatcctc acgatatggg 360cataaatcat aa 372<210>41<211>123<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><223>未知有機(jī)體的描述蛋白質(zhì)<400>41Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser115 120<210>42<211>1241<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<220><221>misc_feature<222>(53)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(61)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(68)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(73)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(81)<223>任何核苷酸<220><221>misc_feature<222>(18)<223>任何核苷酸<400>42wcdmtkdvrm wahkcmdndb ygtrawbmkg cwtkctgyhd cywagmawtd cvnwmhasrt 60nchhtmsnwr manrgarcrr nwrgarhatg ttagatacta ataaagttta tgaaataagc 120aatcatgcta atggactata tgcagcaact tatttaagtt tagatgattc aggtgttagt 180ttaatgaata aaaatgatga tgatattgat gattataact taaaatggtt tttatttcct 240attgatgatg atcaatatat tattacaagc tatgcagcaa ataattgtaa agtttggaat 300gttaataatg ataaaataaa tgtttcgact tattcttcaa caaattcaat acaaaaatgg 360caaataaaag ctaatggttc ttcatatgta atacaaagtg ataatggaaa agtcttaaca 420gcaggaaccg gtcaagctct tggattgata cgtttaactg atgaatcctc aaataatccc 480aatcaacaat ggaatttaac ttctgtacaa acaattcaac ttccacaaaa acctataata 540gatacaaaat taaaagatta tcccaaatat tcaccaactg gaaatataga taatggaaca 600tctcctcaat taatgggatg gacattagta ccttgtatta tggtaaatga tccaaatata 660gataaaaata ctcaaattaa aactactcca tattatattt taaaaaaata tcaatattgg 720caacgagcag taggaagtaa tgtagcttta cgtccacatg aaaaaaaatc atatacttat 780gaatggggca cagaaataga tcaaaaaaca acaattataa atacattagg atttcaaatc 840aatatagatt caggaatgaa atttgatata ccagaagtag gtggaggtac agatgaaata 900aaaacacaac taaatgaaga attaaaaata gaatatagtc atgaaactaa aataatggaa 960aaatatcaag aacaatctga aatagataat ccaactgatc aatcaatgaa ttctatagga 1020tttcttacta ttacttcctt agaattatat agatataatg gctcagaaat tcgtataatg 1080caaattcaaa cctcagataa tgatacttat aatgttactt cttatccaaa tcatcaacaa 1140gctttattac ttcttacaaa tcattcatat gaagaagtag aagaaataac aaatattcct 1200aaaagtacac taaaaaaatt aaaaaaatat tatttttaav v 1241<210>43<211>383<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>43Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr ASn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe370 375 380<210>44<211>360<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>44atgtccgccc gcgaggtgca catcgagatc aacaacaaga cccgccacac cctccagctc 60gaggacaaga ccaagctctc cggcggcagg tggcgcacct ccccgaccaa cgtggcccgc 120gacaccatca agacgttcgt ggcggagtcc cacggcttca tgaccggcgt cgagggcatc 180atctacttct ccgtgaacgg cgacgccgag atctccctcc acttcgacaa cccgtacatc 240ggctccaaca agtgcgacgg ctcctccgac aagcccgagt acgaggtgat cacccagtcc 300ggctccggcg acaagtccca cgtgacctac accatccaga ccgtgtccct ccgcctctga 360<210>45<211>1158<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>45atgctcgaca ccaacaaggt gtacgagatc tccaacctcg ccaacggcct ctacacctcc 60acctacctct ccctcgacga ctccggcgtg tccctcatgt ccaagaagga cgaggacatc 120gacgactaca acctcaagtg gttcctcttc ccgatcgaca acaaccagta catcatcacc 180tcctacggcg ccaacaactg caaggtgtgg aacgtgaaga acgacaagat caacgtgtcc 240acctactcct ccaccaactc cgtgcagaag tggcagatca aggccaagga ctcctcctac 300atcatccagt ccgacaacgg caaggtgctc accgcgggcg tgggccagtc cctcggcatc 360gtgcgcctca ccgacgagtt cccggagaac tccaaccagc aatggaacct caccccggtg 420cagaccatcc agctcccgca gaagccgaag atcgacgaga agctcaagga ccacccggag 480tactccgaga ccggcaacat caacccgaag accaccccgc agctcatggg ctggaccctc 540gtgccgtgca tcatggtgaa cgactccaag atcgacaaga acacccagat caagaccacc 600ccgtactaca tcttcaagaa atacaagtac tggaacctcg ccaagggctc caacgtgtcc 660ctcctcccgc accagaagcg cagctacgac tacgagtggg gcaccgagaa gaaccagaag 720accaccatca tcaacaccgt gggcctgcag atcaacatcg actcggggat gaagttcgag 780gtgccggagg tgggcggcgg caccgaggac atcaagaccc agctcaccga ggagctgaag 840gtggagtact ccaccgagac caagatcatg accaagtacc aggagcactc cgagatcgac 900aacccgacca accagccgat gaactccatc ggcctcctca tctacacctc cctcgagctg 960taccgctaca acggcaccga gatcaagatc atggacatcg agacctccga ccacgacacc 1020tacaccctca cctcctaccc gaaccacaag gaggcgctgc tgctgctgac caaccactcc 1080tacgaggagg tggaggagat caccaagatc ccgaagcaca ccctcatcaa gctcaagaag 1140cactacttca agaagtga 1158<210>46<211>24<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>46gtagaagcag aacaagaagg tatt 24<210>47<211>25<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>47atgtcagcwc gygaagtwca yattg25<210>48<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>48gtytgaathg tatahgthac atg 23<210>49<211>25<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>49atgttagata cwaataaart wtatg25<210>50<211>29<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>50gtwatttctt cwacttcttc atahgaatg29<210>51<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>51atgtcaggtc gagaagtaca tattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtaacatat actattcaga c 341<210>52<211>113<212>PRT<213>未知有機(jī)體<400>52Met Ser Gly Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>53<211>1103<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>53atgttagata caaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatcm 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acamctatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag actcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttacacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aac 1103<210>54<211>367<212>PRT<213>未知有機(jī)體<220><22l>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>54Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Xaa Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile355 360 365<210>55<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>55atgtcagctc gtgaagtaca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtcat 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg ggattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtaacatat acgattcaaa c 341<210>56<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>56Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly His Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Asp Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>57<211>1103<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>57atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattaca acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt taacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ttcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgnta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaac tagaagaaat aac 1103<210>58<211>367<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>58Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Leu Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Xaa Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Leu Glu Glu Ile355 360 365<210>59<211>340<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>59atgtcagcag gtgaagtaca tattgatgca aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtcat 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg ggattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacttat acaattcaaa 340<210>60<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>60Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Asp Ala Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly His Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Asp Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>61<211>340<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>61tgtcagcacg tgaagtacat attgaaataa acaataaaac acgtcataca ttacaattag 60aggataaaac taaacttagc ggcggtagat ggcgaacatc acctacaaat gttgctcgtg 120atacaattaa aacatttgta gcagaatcac atggttttat gacaggagta gaaggtatta 180tatattttag tgtaaacgga gacgcagaaa ttagtttaca ttttgacaat ccttatatag 240gttctaataa atgtgatggt tcttctgata aacctgaata tgaagttatt actcaaagcg 300gatcaggaga taaatctcat gtgacatata cgattcagac 340<210>62<211>112<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>62Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg Thr20 25 30Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu35 40 45Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser Val50 55 60Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile Gly65 70 75 80Ser ASn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val Ile85 90 95Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gln100 105 110<210>63<211>1114<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>63atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattct 1080tatgaagaac tagaacaaat tacaagggcg aatt 1114<210>64<211>371<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>64Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Leu Glu Gln Ile Thr355 360 365Arg Ala Asn370<210>65<211>360<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>65atgtcagctc gcgaagtaca cattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtgacatat actattcaga cagtatcttt acgattataa 360<210>66<211>119<212>PRT<213>未知有機(jī)體<400>66Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Val Ser Leu Arg Leu115<210>67<211>1158<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>67atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattcg 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaaaata cctaagcata cacttataaa attgaaaaaa 1140cattatttta aaaaataa 1158<210>68<211>385<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>68Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys370 375 380Lys385<210>69<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>69atgtcagcac gagaagtaca cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatctgt agcagaatca aatggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttttgca 240ggttctaata aatatgatgg acattccaat aaatctcaat atgaaattat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacttat acaattcaga c 341<210>70<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>70Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Ser Val Ala35 40 45Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>71<211>340<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>71atgtcagcag gcgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca aatggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttttgca 240ggttctaata aatatgatgg acattccaat aaatctcaat atgaaattat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtaacgtat acaattcaaa 340<210>72<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>72Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>73<211>340<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>73atgtcagctc gcgaagtwca tattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtgacatat accattcaaa 340<210>74<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>74Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>75<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>75atgtcagctc gcgaagttca tattgaaata aataataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttac cagtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggaat agaaggtatt 180atatatttta gcgtaaacgg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tccttatgta 240ggttctaata aatatgatgg ttcttctgat aaagctgcat acgaagttat tgctcaaggt 300ggatcagggg atatatctca tgtaacttat acaattcaaa c 341<210>76<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>76Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Thr Ser Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Ile Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Val65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val85 90 95Ile Ala Gln Gly Gly Ser Gly Asp Ile Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>77<211>1175<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>77atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtctggatga ttcaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120gatgaatmca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaata tattattaca 180agctatggag cgaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaagt aaatgtttca 240acgtattctc caacaaactc agtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300ataatacaaa gtgagaatgg aaaagtctta acagcaggaa taggtcaatc tcctggaata 360gtacgcttaa ccgatgaatc atcagagagt tctaaccaac aatggaattt aatccctgta 420caaacaattt cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaattcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaacaat gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020tatactctga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattca 1080tatcaagaag tacmagaaat tacaagggcg aattcttgca gatatccatc acactggcgg 1140gccggtcgag ccttgcatct agaggggccc caatt1175<210>78<211>391<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><22l>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>78Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Gly Gln Asn Asp Glu Asp Ile Asp Glu Xaa Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Val Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Pro Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asn Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Glu Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Ile Gly Gln Ser Pro Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Glu Ser Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Lys Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Ala Thr Gly Thr Ile Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Lys Arg Ala Ile Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Lys Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Glu Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Phe Gln Ile Asn Val Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Asp Thr Lys275 280 285Ile Met Lys Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Thr Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Phe Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Arg Met Glu Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Arg Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Gln Glu Val Xaa Glu Ile Thr355 360 365Arg Ala Asn Ser Cys Arg Tyr Pro Ser His Trp Arg Ala Gly Arg Ala370 375 380Leu His Leu Glu Gly Pro Gln385 390<210>79<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>79atgtcagcag gtgaagttca tattgaaata aataataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttac cagtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggaat agaaggtatt 180atatatttta gcgtaaacgg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tccttatgta 240ggttctaata aatatgatgg ttcttctgat aaagctgcat acgaagttat tgctcaaggt 300ggatcagggg atatatctca tctaacatat acaattcaaa c 341<210>80<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>80Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Thr Ser Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Ile Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Val65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val85 90 95Ile Ala Gln Gly Gly Ser Gly Asp Ile Ser His Leu Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>81<211>1410<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>81atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcatg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtctggatga ttcaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120gatgaataca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaata tattattaca 180agctatggag cgaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaagt aaatgtttca 240acgtattctc caacaaactc agtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300ataatacaaa gtgagaatgg aaaagtctta acagcaggaa taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcttaa ccgatgaatc atcagagagt tctaaccaac aatggaattt aatccctgta 420caaacaattt cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaattcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa ataggtaaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaacaac gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020tatactctga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattct 1080tatcaagaag taagccgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg 1140gtaccaagct tggcgtaatc atggtcatag stgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 1200acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 1260gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 1320tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 1380cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 1410<210>82<211>462<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>82Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Gly Gln Asn Asp Glu Asp Ile Asp Glu Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Val Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Pro Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asn Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Glu Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Ile Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Glu Ser Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Lys Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Ala Thr Gly Thr Ile Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Lys Ile Gly180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Lys Arg Ala Ile Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Lys Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Glu Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Phe Gln Ile Asn Val Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Asp Thr Lys275 280 285Ile Met Lys Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Thr Thr Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Phe Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Arg Met Glu Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Arg Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Gln Glu Val Ser Arg Ile Pro355 360 365Ala His Trp Arg Pro Leu Leu Val Asp Pro Ser Ser Val Pro Ser Leu370 375 380Ala Ser Trp Ser Xaa Phe Pro Val Asn Cys Tyr Pro Leu Thr Ile Pro385 390 395 400His Asn Ile Arg Ala Gly Ser Ile Lys Cys Lys Ala Trp Gly Ala Val405 410 415Ser Leu Thr Leu Ile Ala Leu Arg Ser Leu Pro Ala Phe Gln Ser Gly420 425 430Asn Leu Ser Cys Gln Leu His Ile Gly Gln Arg Ala Gly Arg Gly Gly435 440 445Leu Arg Ile Gly Arg Ser Ser Ala Ser Ser Leu Thr Asp Ser450 455 460<210>83<211>340<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>83tgtcagcacg tgaagtacat attgatgtaa ataataagac aggtcataca ttacaattag 60aagataaaac aaaacttgat ggtggtagat ggcgaacatc acctacaaat gttgctaatg 120atcaaattaa aacatttgta gcagaatcaa atggttttat gacaggtaca gaaggtacta 180tatattatag tataaatgga gaagcagaaa ttagtttata ttttgacaat ccttttgcag 240gttctaataa atatgatgga cattccaata aatctcaata tgaaattatt acccaaggag 300gatcaggaaa tcaatctcat gtgacatata ctattcaaac 340<210>84<211>112<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>84Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr1 5 10 15Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr20 25 30Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu35 40 45Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Ile50 55 60Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala Gly65 70 75 80Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile Ile85 90 95Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gln100 105 110<210>85<211>1114<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>85atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccacg aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gcacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatta taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcatgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggatttctta ctattacttc cttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc aaatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag ttgaagaaat aacaagggcg aatt 1114<210>86<211>371<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>86Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Arg Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Ash Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Arg Ala Asn370<210>87<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>87atgtcagctg gcgaagttca tattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtcacttat acaattcaaa c 341<210>88<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>88Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>89<211>1186<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>89atgttagata caaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggrcagaa attaagataa tggacataga aacttcagat catgatactt 1020acactcttac ttcttatcca aatcataaag aagcattatt acttctcaca aaccattctt 1080atgaagaagt agaagaaatt acaagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg 1140gatccgagct cggtaccaag cttggcgtgt caggtcaaag ggttca1186<210>90<211>392<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>90Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Gln Lys Leu Arg Trp Thr Lys Leu Gln Ile Met325 330 335Ile Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ile Gln Ile Ile Lys Lys His Tyr Tyr340 345 350Phe Ser Gln Thr Ile Leu Met Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gly Arg Ile355 360 365Pro Ala His Trp Arg Pro Leu Leu Val Asp Pro Ser Ser Val Pro Ser370 375 380Leu Ala Cys Gln Val Lys Gly Phe385 390<210>91<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>91atgtcagcag ccgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaactt a 341<210>92<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>92Met Ser Ala Ala Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>93<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>93atgtcagatc gcgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaactt a 341<210>94<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>94Met Ser Asp Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>95<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>95atgtcagcac gtgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacgattca aac353<210>96<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>96Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>97<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>97atgtcagctc gtgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgacat atacaattca aac353<210>98<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>98Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>99<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>99atgtcaggtc gcgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacgattca aac353<210>100<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>100Met Ser Gly Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>101<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>101atgtcagctc gtgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgttacgt atacaattca aac353<210>102<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>102Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu A1a His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Ash Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>103<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>103atgtcaggtc gcgaagtaga tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagcg 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atactattca gac353<210>104<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>104Met Ser Gly Arg Glu Val Asp Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>105<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>105atgtcagcac gtgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat ataccattca aac353<210>106<211>117<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>106Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Ile Gln115<210>107<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>107atgtcaggtc gcgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caagacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaaaatcaat atgaagttat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tctgacgtat acaattcaaa c 341<210>108<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>108Met Ser Gly Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Arg Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Asn Gln Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Leu Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>109<211>1114<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>109atgttagata ctaataaagt atatgaaata agtaattatg ctaatggatt acatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgactata atttaaggtg gtttttattt cctattgatg ataatcaata tattattaca 180agctacgcag cgaataattg taaggtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc gatacagaaa tggcaaataa aagctaatgc ttcttcgtat 300gtaatacaaa gtaataatgg gaaagttcta acagcaggaa ccggtcaatc tcttggatta 360atacgtttaa cggatgaatc accagataat cccaatcaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccacc aaaacctaca atagatacaa agttaaaaga ttaccccaaa 480tattcacaaa ctggcaatat agacaaggga acacctcctc aattaatggg atggacatta 540ataccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa acactcaaat caaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacaag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccgc atgaaaaaaa atcatatgct tatgagtggg gtacagaaat agatcaaaaa 720acaactatca ttaatacatt aggatttcag attaatatag attcgggaat ggaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aattaaacga agaattaaaa 840atagaatata gccgtgaaac caaaataatg gaaaaatatc aggaacaatc agagatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggattcctca ctattacttc tttagaatta 960tatcgatata atggttcgga aattagtgta atgaaaattc aaacttcaga taatgatact 1020tacaatgtga cctcttatcc agatcatcaa caagctctat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaacaag tacaagaaat aacaagggcg aatt 1114<210>110<211>371<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>110Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly1 5 10 15Leu His Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Ala Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asn Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Pro115 120 125Asp Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Pro Lys Pro Thr Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Gln Thr Gly Asn Ile Asp Lys Gly Thr Pro Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Gln Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Ala Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Glu Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Ser Val Met Lys Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Gln Val Gln Glu Ile Thr355 360 365Arg Ala Asn370<210>111<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>111atgtcagctc gtgaagtaca tattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgttacatat acaattcaga c 341<210>112<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>112Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>113<211>360<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>113atgtcagctc gcgaagtaca cattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300ggatcaggag ataaatctca tgtgacatat actattcaga cagtatcttt acgattataa 360<210>114<211>119<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>114Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Val Ser Leu Arg Leu115<210>115<211>1158<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>115atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtgaatc tcttggaata 360gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgattcagga atagataaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720acatctatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattcg 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaaaata cctaagcata cacttataaa attgaaaaaa 1140cattatttta aaaaataa 1158<210>116<211>385<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>116Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Val Gly Glu Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro115 120 125Glu Asn Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Pro Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ser Gly Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Lys Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Ser Ile Ile Asn Thr Val Gly Leu Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Thr Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser325 330 335Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys370 375 380Lys385<210>117<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>117atgtcagcac gccaacttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattctaat aaaaatcaat atgaagttat tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtgacttat acgattcaca c 341<210>118<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<220><221>不確定<222>(242)<223>推導(dǎo)的氨基酸序列中未確定<400>118Met Ser Ala Arg Gln Leu His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Asn Gln Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110His<210>119<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>119atgtcaggtc gtgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtaacgtat actattcaaa c 341<210>120<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>120Met Ser Gly Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>121<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>121atgtcaggtc gcgaagttga cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtcacatat acgattcaaa c 341<210>122<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>122Met Ser Gly Arg Glu Val Asp Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>123<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>123atgtcagcac gtgaagtaga tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgtaacgtat acgattcaaa c 341<210>124<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>124Met Ser Ala Arg Glu Val Asp Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>125<211>1103<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>125atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaagaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaac ttgaagaaat tag 1103<210>126<211>367<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>126Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Leu Glu Glu Ile355 360 365<210>127<211>369<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>127atgtccgccc gcgaggtgca catcgacgtg aacaacaaga ccggccacac cctccagctg 60gaggacaaga ccaagctcga cggcggcagg tggcgcacct ccccgaccaa cgtggccaac 120gaccagatca agaccttcgt ggccgaatcc aacggcttca tgaccggcac cgagggcacc 180atctactact ccatcaacgg cgaggccgag atcagcctct acttcgacaa cccgttcgcc 240ggctccaaca aatacgacgg ccactccaac aagtcccagt acgagatcat cacccagggc 300ggctccggca accagtccca cgtgacctac accatccaga ccacctcctc ccgctacggc 360cacaagtcc 369<210>128<211>1149<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>128atgctcgaca ccaacaaggt gtacgagatc agcaaccacg ccaacggcct ctacgccgcc 60acctacctct ccctcgacga ctccggcgtg tccctcatga acaagaacga cgacgacatc 120gacgactaca acctcaagtg gttcctcttc ccgatcgacg acgaccagta catcatcacc 180tcctacgccg ccaacaactg caaggtgtgg aacgtgaaca acgacaagat caacgtgtcc 240acctactcct ccaccaactc catccagaag tggcagatca aggccaacgg ctcctcctac 300gtgatccagt ccgacaacgg caaggtgctc accgccggca ccggccaggc cctcggcctc 360atccgcctca ccgacgagtc ctccaacaac ccgaaccagc aatggaacct gacgtccgtg 420cagaccatcc agctcccgca gaagccgatc atcgacacca agctcaagga ctacccgaag 480tactccccga ccggcaacat cgacaacggc acctccccgc agctcatggg ctggaccctc 540gtgccgtgca tcatggtgaa cgacccgaac atcgacaaga acacccagat caagaccacc 600ccgtactaca tcctcaagaa gtaccagtac tggcagaggg ccgtgggctc caacgtcgcg 660ctccgcccgc acgagaagaa gtcctacacc tacgagtggg gcaccgagat cgaccagaag 720accaccatca tcaacaccct cggcttccag atcaacatcg acagcggcat gaagttcgac 780atcccggagg tgggcggcgg taccgacgag atcaagaccc agctcaacga ggagctcaag 840atcgagtact cccacgagac gaagatcatg gagaagtacc aggagcagtc cgagatcgac 900aacccgaccg accagtccat gaactccatc ggcttcctca ccatcacctc cctggagctc 960taccgctaca acggctccga gatccgcatc atgcagatcc agacctccga caacgacacc 1020tacaacgtga cctcctaccc gaaccaccag caggccctgc tgctgctgac caaccactcc 1080tacgaggagg tggaggagat caccaacatc ccgaagtcca ccctcaagaa gctcaagaag 1140tactacttc 1149<210>129<211>357<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>129atgtccgccc gcgaggtgca catcgagatc aacaacaaga cccgccacac cctccagctc 60gaggacaaga ccaagctctc cggcggcagg tggcgcacct ccccgaccaa cgtggcccgc 120gacaccatca agacgttcgt ggcggagtcc cacggcttca tgaccggcgt cgagggcatc 180atctacttct ccgtgaacgg cgacgccgag atctccctcc acttcgacaa cccgtacatc 240ggctccaaca agtccgacgg ctcctccgac aagcccgagt acgaggtgat cacccagtcc 300ggctccggcg acaagtccca cgtgacctac accatccaga ccgtgtccct ccgcctc357<210>130<211>119<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>130Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Ser Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val85 90 95Ile Thr Gln Ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Val Ser Leu Arg Leu115<210>131<211>21<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>131atgtcagctc gcgaagtaca c 21<210>132<211>22<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>132gtccatccca ttaattgagg ag 22<210>133<211>399<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>133atgtcagcac gtgaagtaca cattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attcccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacagttca aagaaacata 360tcacgatata ccaataaatt atgttctaat aactcctaa399<210>134<211>132<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>134Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Pro Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Val Gln Arg Asn Ile Ser Arg Tyr Thr Asn Lys Leu Cys115 120 125Ser Asn Asn Ser130<210>135<211>1164<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>135atgatagaaa ctaataagat atatgaaata agcaataaag ctaatggatt atatgcaact 60acttatttaa gttttgataa ttcaggtgtt agtttattaa ataaaaatga atctgatatt 120aatgattata atttgaaatg gtttttattt cctattgata ataatcagta tattattaca 180agttatggag taaataaaaa taaggtttgg actgctaatg gtaataaaat aaatgttaca 240acatattccg cagaaaattc agcacaacaa tggcaaataa gaaacagttc ttctggatat 300ataatagaaa ataataatgg gaaaatttta acggcaggaa caggccaatc attaggttta 360ttatatttaa ctgatgaaat acctgaagat tctaatcaac aatggaattt aacttcaata 420caaacaattt cacttccttc acaaccaata attgatacaa cattagtaga ttaccctaaa 480tattcaacga ccggtagtat aaattataat ggtacagcac ttcaattaat gggatggaca 540ctcataccat gtattatggt atacgataaa acgatagctt ctacacacac tcaaattaca 600acaacccctt attatatttt gaaaaaatat caacgttggg tacttgcaac aggaagtggt 660ctatctgtac ctgcacatgt caaatcaact ttcgaatacg aatggggaac agacacagat 720caaaaaacca gtgtaataaa tacattaggt tttcaaatta atacagatac aaaattaaaa 780gctactgtac cagaagtagg tggaggtaca acagatataa gaacacaaat cactgaagaa 840cttaaagtag aatatagtag tgaaaataaa gaaatgcgaa aatataaaca aagctttgac 900gtagacaact taaattatga tgaagcacta aatgctgtag gatttattgt tgaaacttca 960ttcgaattat atcgaatgaa tggaaatgtc cttataacaa gtataaaaac tacaaataaa 1020gacacctata atacagttac ttatccaaat cataaagaag ttttattact tcttacaaat 1080cattcttatg aagaagtaac agcactaact ggcatttcca aagaaagact tcaaaatctt 1140aaaaacaatt ggaaaaaaag ataa1164<210>136<211>387<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>136Met Ile Glu Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Lys Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Thr Thr Tyr Leu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Leu Asn Lys Asn Glu Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Val50 55 60Asn Lys Asn Lys Val Trp Thr Ala Asn Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr65 70 75 80Thr Tyr Ser Ala Glu Asn Ser Ala Gln Gln Trp Gln Ile Arg Asn Ser85 90 95Ser Ser Gly Tyr Ile Ile Glu Asn Asn Asn Gly Lys Ile Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr Asp Glu Ile Pro115 120 125Glu Asp Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Ser Gln Pro Ile Ile Asp Thr Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Thr Thr Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Gln Leu165 170 175Met Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Tyr Asp Lys Thr Ile180 185 190Ala Ser Thr His Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys195 200 205Lys Tyr Gln Arg Trp Val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Leu Ser Val Pro210 215 220Ala His Val Lys Ser Thr Phe Glu Tyr Glu Trp Gly Thr Asp Thr Asp225 230 235 240Gln Lys Thr Ser Val Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Thr Asp245 250 255Thr Lys Leu Lys Ala Thr Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Thr Asp260 265 270Ile Arg Thr Gln Ile Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Ser Glu275 280 285Asn Lys Glu Met Arg Lys Tyr Lys Gln Ser Phe Asp Val Asp Asn Leu290 295 300Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Asn Ala Val Gly Phe Ile Val Glu Thr Ser305 310 315 320Phe Glu Leu Tyr Arg Met Asn Gly Asn Val Leu Ile Thr Ser Ile Lys325 330 335Thr Thr Asn Lys Asp Thr Tyr Asn Thr Val Thr Tyr Pro Asn His Lys340 345 350Glu Val Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Thr Ala355 360 365Leu Thr Gly Ile Ser Lys Glu Arg Leu Gln Asn Leu Lys Asn Asn Trp370 375 380Lys Lys Arg385<210>137<211>341<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>137atgtcagcag gtgaagttca tattgaaata aataataaaa cacgtcatac attacaatta 60gaggataaaa ctaaacttac cagtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggaat agaaggtatt 180atatatttta gcgtaaacgg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tccttatgta 240ggttctaata aatatgatgg ttcttctgat aaagctgcat acgaagttat tgctcaaggt 300ggatcagggg atatatctca tctaacatat acaattcaaa c 341<210>138<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>138Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Thr Ser Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Ile Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser50 55 60Val Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Val65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val85 90 95Ile Ala Gln Gly Gly Ser Gly Asp Ile Ser His Leu Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln<210>139<211>1158<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>139atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcatg ctaatggatt atatacatca 60acttatttaa gtctggatga ttcaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120gatgaataca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaata tattattaca 180agctatggag cgaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaagt aaatgtttca 240acgtattctc caacaaactc agtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300ataatacaaa gtgagaatgg aaaagtctta acagcaggaa taggtcaatc tcttggaata 360gtacgcttaa ccgatgaatc atcagagagt tctaaccaac aatggaattt aatccctgta 420caaacaattt cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaattcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa ataggtaaaa acactcaaat taaaactact 600ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900aatccaacta atcaaacaac gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020tatactctga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattct 1080tatcaagaag taagccgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg 1140gtaccaagct tggcgtaa 1158<210>140<211>385<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>140Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Gly Gln Asn Asp Glu Asp Ile Asp Glu Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Val Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Pro Thr Asn Ser Val Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Lys85 90 95Asn Ser Ser Tyr Ile Ile Gln Ser Glu Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Ile Gly Gln Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Glu Ser Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Lys Ile Asp Lys Lys Leu Lys Asp His Pro Glu145 150 155 160Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Ala Thr Gly Thr Ile Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Lys Ile Gly180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Lys Arg Ala Ile Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu Pro His210 215 220Gln Lys Lys Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Glu Asn Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Val Gly Phe Gln Ile Asn Val Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Glu Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Asp Thr Lys275 280 285Ile Met Lys Lys Tyr Gln Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn290 295 300Gln Thr Thr Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Phe Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Arg Met Glu Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Arg Glu Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Gln Glu Val Ser Arg Ile Pro355 360 365Ala His Trp Arg Pro Leu Leu Val Asp Pro Ser Ser Val Pro Ser Leu370 375 380Ala385<210>141<211>399<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>141atgtcagatc gcgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacagttca aagaaacata 360tcacgatata ccaataaatt atgttctaat aactcctaa399<210>142<211>132<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>142Met Ser Asp Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr Tyr Thr Val Gln Arg Asn Ile Ser Arg Tyr Thr Asn Lys Leu Cys115 120 125Ser Asn Asn Ser130<210>143<211>871<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>143atgatagaaa ctaataagat atatgaaata agcaataaag ctaatggatt atatgcaact 60acttatttaa gttttgataa ttcaggtgtt agtttattaa ataaaaatga atctgatatt 120aatgattata atttgaaatg gtttttattt cctattgata ataatcagta tattattaca 180agttatggag taaataaaaa taaggtttgg actgctaatg gtaataaaat aaatgttaca 240acatattccg cagaaaattc agcacaacaa tggcaaataa gaaacagttc ttctggatat 300ataatagaaa ataataatgg gaaaatttta acggcaggaa caggccaatc attaggttta 360ttatatttaa ctgatgaaat acctgaagat tctaatcaac aatggaattt aacttcaata 420caaacaattt cacttccttc acaaccaata attgatacaa cattagtaga ttaccctaaa 480tattcaacga ccggtagtat aaattataat ggtacagcac ttcaattaat gggatggaca 540ctcataccat gtattatggt atacgataaa acgatagctt ctacacacac tcaaattaca 600acaacccctt attatatttt gaaaaaatat caacgttggg tacttgcaac aggaagtggt 660ctatctgtac ctgcacatgt caaatcaact ttcgaatacg aatggggaac agacacagat 720caaaaaacca gtgtaataaa tacattaggt tttcaaatta atacagatac aaaattaaaa 780gctactgtac cagaagtagg tggaggtaca acagatataa gaacacaaat cactgaagaa 840cttaaagtag aatatagtag tgaaaataaa g871<210>144<211>290<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>144Met Ile Glu Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Lys Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Thr Thr Tyr Leu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Leu Asn Lys Asn Glu Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Val50 55 60Asn Lys Asn Lys Val Trp Thr Ala Asn Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr65 70 75 80Thr Tyr Ser Ala Glu Asn Ser Ala Gln Gln Trp Gln Ile Arg Asn Ser85 90 95Ser Ser Gly Tyr Ile Ile Glu Asn Asn Asn Gly Lys Ile Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr Asp Glu Ile Pro115 120 125Glu Asp Ser Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gln Thr Ile Ser130 135 140Leu Pro Ser Gln Pro Ile Ile Asp Thr Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Thr Thr Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Gln Leu165 170 175Met Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Tyr Asp Lys Thr Ile180 185 190Ala Ser Thr His Thr Gln Ile Thr Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys195 200 205Lys Tyr Gln Arg Trp Val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Leu Ser Val Pro210 215 220Ala His Val Lys Ser Thr Phe Glu Tyr Glu Trp Gly Thr Asp Thr Asp225 230 235 240Gln Lys Thr Ser Val Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Thr Asp245 250 255Thr Lys Leu Lys Ala Thr Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Thr Asp260 265 270Ile Arg Thr Gln Ile Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Ser Glu275 280 285Asn Lys290<210>145<211>372<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>145atgtcagcac gtgaagtaca cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300ggatcaggaa atcaatctca tgttacgtat actattcaaa ctgcatcttc acgatatggg 360aataactcat aa 372<210>146<211>123<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>146Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg20 25 30Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala35 40 45Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser50 55 60Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gln Tyr Glu Val85 90 95Thr Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile100 105 110Gln Thr Ala Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Asn Ser115 120<210>147<211>1152<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>147atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140tattattttt aa 1152<210>148<211>383<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>148Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe370 375 380<210>149<211>354<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>149atgtcagctc gcgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgacat atacaattca aaca 354<210>150<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>150Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100105 110Thr<210>151<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>151atgtcagctc gtgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacaattca aac353<210>152<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>152Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>153<211>353<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>153atgtcagcac gcgaagtaga tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtgactt atacaattca aac353<210>154<211>113<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>154Met Ser Ala Arg Glu Val Asp Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His1 5 10 15Thr Leu Gln Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile20 25 30Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gln Ala35 40 45Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr50 55 60Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala65 70 75 80Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val85 90 95Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val100 105 110Thr<210>155<211>37<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>155aaatattatt ttatgtcagc acgtgaagta cacattg 37<210>156<211>40<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>156tctctggtac cttattatga tttatgccca tatcgtgagg 40<210>157<211>45<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>157agagaactag taaaaaggag ataaccatgt tagatactaa taaag 45<210>158<211>46<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>158cgtgctgaca taaaataata tttttttaat ttttttagtg tacttt46<210>159<211>506<212>PRT<213>Bacillus thuringiensis<400>159Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly1 5 10 15Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu20 25 30Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe35 40 45Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gln Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala50 55 60Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser65 70 75 80Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gln Lys Trp Gln Ile Lys Ala Asn85 90 95Gly Ser Ser Tyr Val Ile Gln Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala100 105 110Gly Thr Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser115 120 125Asn Asn Pro Asn Gln Gln Trp Asn Leu Thr Ser Val Gln Thr Ile Gln130 135 140Leu Pro Gln Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys145 150 155 160Tyr Ser Pro Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gln Leu Met165 170 175Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp180 185 190Lys Asn Thr Gln Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr195 200 205Gln Tyr Trp Gln Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His210 215 220Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gln Lys225 230 235 240Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gln Ile Asn Ile Asp Ser Gly245 250 255Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys260 265 270Thr Gln Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys275 280 285Ile Met Glu Lys Tyr Gln Glu Gln Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp290 295 300Gln Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu305 310 315 320Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gln Ile Gln Thr Ser325 330 335Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asn His Gln Gln Ala340 345 350Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr355 360 365Asn Ile Pro Lys Ser Thr Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe Met370 375 380Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr385 390 395 400Leu Gln Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr405 410 415Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gln Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu420 425 430Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Ile435 440 445Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala Gly450 455 460Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln Tyr Glu Ile Ile465 470 475 480Thr Gln Gly Gly Ser Gly Asn Gln Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gln485 490 495Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser500 505<210>160<211>1521<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>160atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatggact atatgcagca 60acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120gatgattata acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactact 600ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gcacagaaat agatcaaaaa 720acaacaatta taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840atagaatata gtcatgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900aatccaactg atcaatcaat gaattctata ggatttctta ctattacttc cttagaatta 960tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020tataatgtta cttcttatcc aaatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140tattatttta tgtcagcacg tgaagtacac attgatgtaa ataataagac aggtcataca 1200ttacaattag aagataaaac aaaacttgat ggtggtagat ggcgaacatc acctacaaat 1260gttgctaatg atcaaattaa aacatttgta gcagaatcaa atggttttat gacaggtaca 1320gaaggtacta tatattatag tataaatgga gaagcagaaa ttagtttata ttttgacaat 1380ccttttgcag gttctaataa atatgatgga cattccaata aatctcaata tgaaattatt 1440acccaaggag gatcaggaaa tcaatctcat gttacgtata ctattcaaac cacatcctca 1500cgatatgggc ataaatcata a 1521<210>161<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>161gatratratc aatatattat tac 23<210>162<211>20<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>162caaggtarta atgtccatcc 20<210>163<211>24<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>163gatgatgrtm rakwwattat trca24<210>164<211>24<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>164gatgatgrtm ratatattat trca24<210>165<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>165ggawgkrcdy twdtmccwtg tat 23<210>166<211>23<212>DNA<213>Bacillus thuringiensis<400>166ggawgkacry tadtaccttg tat 2權(quán)利要求
1.編碼殺蟲蛋白的分離多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其變體。
2.編碼殺蟲蛋白的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸的互補(bǔ)鏈與選自下組的核苷酸序列可發(fā)生雜交SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85、SEQ ID NO87、SEQ ID NO89、SEQ ID NO91、SEQ ID NO93、SEQ ID NO95、SEQ ID NO97、SEQ ID NO99、SEQ ID NO101、SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQ ID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ ID NO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123、SEQ ID NO125、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、SEQ ID NO139、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、SEQ ID NO145、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、SEQ ID NO156、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO160、SEQ ID NO161、SEQ ID NO162、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO165、和SEQ ID NO166。
3.一種分離的殺蟲蛋白，其中所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其變體。
4.包含分離多核苷酸的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞，而且所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ IDNO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其變體。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)分離的、大約10-15kDa的殺蟲蛋白和分離的、大約40-50kDa的殺蟲蛋白。
6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是玉米細(xì)胞。
8.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是玉米根細(xì)胞。
9.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞。
10.控制非哺乳類害蟲的方法，其中所述方法包括將所述害蟲與分離的殺蟲蛋白進(jìn)行接觸，其中所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其變體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述方法包括將所述害蟲與大約10-15kDa的殺蟲蛋白和40-50kDa的殺蟲蛋白進(jìn)行接觸，其中至少一種所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO52、SEQ IDNO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159，及其變體。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述害蟲是鞘翅目害蟲。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述害蟲是玉米根蟲。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述害蟲是玉米幼芽根葉甲。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述害蟲是鱗翅目害蟲。
16.一種分離的殺蟲蛋白，其中所述蛋白質(zhì)可由選自下組的蘇云金芽孢桿菌分離物獲得PS185GG、PS18761、PS187Y2、PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
17.編碼殺蟲蛋白的分離多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)可由選自下組的蘇云金芽孢桿菌分離物獲得PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
18.選自下組的蘇云金芽孢桿菌分離物的生物學(xué)純培養(yǎng)物PS185GG，PS187G1，PS187Y2，PS201G，PS201HH2，PS242K10，PS69Q，KB54A1-6，KR589，PS185L12，PS185W3，PS187L14，PS186FF，PS131W2，PS158T3，PS158X10，PS185FF，PS187F3，PS201H2，PS201L3，PS203G2，PS203J1，PS204C3，PS204G4，PS204I11，PS204J7，PS236B6，PS246P42，KR1209，和KR1369.
19.編碼殺蟲蛋白的分離多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159。
20.編碼殺蟲蛋白的分離多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自下組的核苷酸序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83、SEQ ID NO85、SEQ ID NO87、SEQ ID NO89、SEQ ID NO91、SEQ ID NO93、SEQ ID NO95、SEQ ID NO97、SEQ ID NO99、SEQ ID NO101、SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ ID NO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123、SEQ ID NO125、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、SEQ ID NO139、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、SEQ ID NO145、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、SEQ ID NO156、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO160、SEQ ID NO161、SEQ ID NO162、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO165、和SEQ ID NO166。
21.一種分離的殺蟲蛋白，其中所述蛋白質(zhì)包含選自下組的氨基酸序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ IDNO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84、SEQ ID NO86、SEQ ID NO88、SEQ ID NO90、SEQ ID NO92、SEQ ID NO94、SEQ ID NO96、SEQ ID NO98、SEQ ID NO100、SEQ ID NO102、SEQ ID NO104、SEQ ID NO106、SEQ ID NO108、SEQ ID NO110、SEQ ID NO112、SEQ ID NO114、SEQ ID NO116、SEQ ID NO118、SEQ ID NO120、SEQ ID NO122、SEQ ID NO124、SEQ ID NO126、SEQ ID NO134、SEQ ID NO136、SEQ ID NO138、SEQ ID NO140、SEQ ID NO142、SEQ ID NO144、SEQ ID NO146、SEQ ID NO148、SEQ ID NO150、SEQ ID NO152、SEQ ID NO154、SEQ ID NO159。
全文摘要
本發(fā)明涉及殺蟲活性蛋白質(zhì)的新種類，及編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些殺蟲蛋白的分子量為大約40－50kDa和大約10－15kDa。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1408023SQ00801757
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2000年8月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者K·E·納瓦, H·E·施奈普, M·克努斯, M·R·保拉德, G·A·卡迪尼奧, G·E·史瓦伯, T·E·米歇爾斯, 李 S·芬斯塔德, P·迪耶爾, J·杜吉洛, L·斯坦普, R·A·赫爾曼 申請(qǐng)人:麥考根公司