專利名稱：用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海帶育苗方法，特別是涉及一種用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法。
海帶夏苗自然光培育是目前我國海帶全人工養(yǎng)殖通常采用的育苗工藝，它包括選擇種海帶，室內(nèi)采孢子及幼苗培育，下海暫養(yǎng)和分苗養(yǎng)殖等步驟。目前，這種育苗方法在我國育苗單位雖然普遍采用，但還存在著以下幾個方面的問題(1)種海帶的選種和海上培育管理繁雜、勞動強度和風險較大；在南方，種海帶室內(nèi)低溫培育加上育苗階段長達半年之久，更易加大生產(chǎn)成本和引起病害發(fā)生；(2)由于海上自然水溫因素的限制，為防止水溫升高對種海帶發(fā)育不利和幼苗下海的適宜水溫，因此既要早采苗(采孢子)，又要在育苗前中期控制光、溫，致使幼苗期培育時間過長，不僅造成幼苗的非正常生長和發(fā)病機會，而且還加大了育苗的生產(chǎn)成本；(3)無法真正實現(xiàn)良種苗培育。海帶育苗生產(chǎn)中，種海帶用量大(生產(chǎn)5億株苗需要3萬棵種海帶)，混采孢子，子代性狀分離較大，無法保持純一。因此，經(jīng)幾個養(yǎng)殖周期后，品種易出現(xiàn)性狀退化，產(chǎn)量下降，給海帶養(yǎng)殖造成損失。
本發(fā)明的目的是提供一種用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法，它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法，包括幼苗培育、下海暫養(yǎng)和分苗養(yǎng)殖，其特征是在幼苗培育之前，先將雌雄配子體克隆細胞分別擴增培養(yǎng)，再將配子體克隆附著在基質(zhì)上，然后讓雌雄配子體克隆進行雜交。
本發(fā)明把優(yōu)良品系的雌雄海帶配子體克隆分別擴增，進行兩系雜交，生產(chǎn)雜種苗，免去了海上培育種海帶的過程，縮短了室內(nèi)育苗時間。把良種培育和良種苗生產(chǎn)合而為一，既可穩(wěn)定地生產(chǎn)雜種優(yōu)勢種苗，又可大大降低育苗生產(chǎn)成本。
下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。
本實施例用的雌雄配子體克隆是發(fā)明人自1978年以來所分離培養(yǎng)的部分材料。其中，雌性克隆有C11-1(1982)、C15-1(1982)、C26-2(1982)、TPJ-1(1994)；
先把配子體克隆粉碎成少量的細胞的個體，再進行擴增培養(yǎng)。本發(fā)明利用超聲波粉碎儀將克隆簇狀體粉碎。開始先用400W、30S將大塊克隆簇打碎，然后用200W、120S把克隆分解成為5～10個細胞的小段分枝。也可以利用機械粉碎的方法，將克隆粉碎成20～50個細胞的絲狀體。
將粉碎后的克隆細胞加入培養(yǎng)液(總計2L體積)。開始用3L三角瓶培養(yǎng)，水色加深后再移入20L的容器中培養(yǎng)。擴增培養(yǎng)條件是溫度8～18℃；光照強度40～60μmolm-2s-1(相當于2000～3000Lux)，光照時間12h；培養(yǎng)液天然海水煮沸消毒，加入營養(yǎng)鹽(NO3-N 16mg /L，PO4-P 1mg/L)；24h充氣，充氣的目的一是補充CO2，二是防止克隆細胞下沉和堆積。換水除需倒瓶或稱重換水外，一般進行封閉培養(yǎng)，按時加入新培養(yǎng)液，并適量補充營養(yǎng)鹽。在關(guān)于海帶配子體克隆細胞擴增初期的接種量問題，根據(jù)日增長速率，從日增重效果比較和節(jié)約種源出發(fā)，實驗初始接種量1～2g(培養(yǎng)液1～2L)是適宜的。
關(guān)于配子體克隆附著在基質(zhì)上之前的雌雄配子體克隆比例，根據(jù)實驗，在同樣條件下，雌雄克隆的生長速率和日增重效果基本相同，為有利于受精，在配子體克隆附著在基質(zhì)上之前5～12天就可將雌雄克隆細胞按1∶1的比例混合培養(yǎng)以促進協(xié)同發(fā)育。
再將配子體克隆附著在基質(zhì)上。附著基質(zhì)采用棕簾或維尼簾兩種苗簾?？捎门渥芋w克隆直接附著也可使用固化材料促進其附著效果。固定化劑使用3％(w/v)褐藻酸鈉溶液和1mol/L的Cacl2溶液。按照雌雄配子體克隆細胞比例1∶1，制成克隆細胞懸液，然后用噴霧器灑在苗簾上，苗簾即移到低溫(8～10℃)下培養(yǎng)，保持苗濕度避光放置24h后緩慢加入消毒海水。營養(yǎng)鹽(NO3-N16mg/L，，PO-P 1mg/L)，光強20～30μml 1m-2s-1，光周期12h，溫度8～10℃。使用前將苗簾浸在60℃的固化劑溶液中，5min后取出，瀝干后備用。實驗中發(fā)現(xiàn)維尼綸簾交織較密且表面光滑，如直接將克隆懸液噴灑到苗簾上，大部分克隆懸液滑落到解剖盤中，較難附著。加過固化劑的維尼綸簾，克隆的附著效果好，但克隆大部分是固著在固化劑表面，這對于克隆育苗后期的孢子固著存在一定隱患。后期使用棕簾加固化劑，超生波粉碎的克隆懸液(3～5個細胞/分枝，細胞密度1.0×105)噴灑到棕簾上，噴灑量在40ml左右(分2～3次噴灑)。發(fā)現(xiàn)固定效果較好，可達到×150顯微鏡下每視野80個分枝的附著效果。且棕簾絲較松散，對后期孢子體附著有一定的作用。
克隆細胞附著后，在7～20天內(nèi)配子體克隆細胞發(fā)育，形成受精卵及幼孢子體，即得到雜種優(yōu)勢苗種，然后進行幼苗培育，下海暫養(yǎng)和分苗養(yǎng)殖，完成本項目的整個工藝。
選取C11-1和D4-4進行克隆育苗實驗。對照組為靜置附苗組(將苗簾放在克隆的細胞懸液中)。在培養(yǎng)的第30天，剪少量棕毛觀察，發(fā)現(xiàn)噴灑組出現(xiàn)孢子體，只有少量卵，而對照組因細胞附著量過少，無法統(tǒng)計發(fā)育率。在實驗進行到2000年1月24日，棕簾上海帶苗已長到2～3cm，平均6棵/cm，達到了商品苗出庫的標準。
權(quán)利要求
1.一種用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法，包括幼苗培育、下海暫養(yǎng)和分苗養(yǎng)殖，其特征是在幼苗培育之前，先將雌雄配子體克隆細胞分別擴增培養(yǎng)，再將配子體克隆附著在基質(zhì)上，然后讓雌雄配子體克隆進行雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的擴增培養(yǎng)條件是溫度8～18℃；光照強度40～60μmolm-2s-1，光照時間12h；培養(yǎng)液天然海水煮沸消毒，加入營養(yǎng)鹽，24h充氣。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的附著基質(zhì)采用棕簾或維尼簾。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的在配子體克隆附著在基質(zhì)上之前5～12天，將雌雄克隆細胞按1∶1的比例混合培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述的苗簾在使用前浸在固化劑溶液中，取出后瀝干。
全文摘要
一種用配子體克隆培育海帶雜種優(yōu)勢苗種的方法,包括幼苗培育、下海暫養(yǎng)和分苗養(yǎng)殖,其特征是在幼苗培育之前,先將雌雄配子體克隆細胞分別擴增培養(yǎng),再將配子體克隆附著在基質(zhì)上,然后讓雌雄配子體克隆進行雜交。本發(fā)明把優(yōu)良品系的雌雄海帶配子體克隆分別擴增,進行兩系雜交,生產(chǎn)雜種苗,免去了海上培育種海帶的過程縮短了室內(nèi)育苗時間。把良種培育和良種苗生產(chǎn)合而為一,既可穩(wěn)定地生產(chǎn)雜種優(yōu)勢種苗,又可大大降低育苗生產(chǎn)成本。
文檔編號A01K67/00GK1342401SQ0011136
公開日2002年4月3日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者崔競進, 劉濤, 包振民, 戴繼勛, 韓寶芹 申請人:青島海洋大學