目的基因轉(zhuǎn)化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目的基因中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中目的基因轉(zhuǎn)化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目 的基因中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 新疆野蘋果(Malus sieversii Roem.)主要分布在中亞天山山脈，被認(rèn)為是現(xiàn)代 栽培蘋果的祖先種，且具有豐富的遺傳多樣性，是常用蘋果砧木中抗旱能力最強(qiáng)的一種，對 其抗旱基因的分離研究，有助于揭示果樹對逆境的響應(yīng)機(jī)制。胚性愈傷組織作為一種良好 的試驗(yàn)試材，廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化、再生植株等研究，是游離原生質(zhì)體的良好試材； 無細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的代謝過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、對環(huán)境因素和外來刺激的反應(yīng)等，都與完 整的植物細(xì)胞或組織基本相同，通過向原生質(zhì)體中導(dǎo)入功能基因與報(bào)告基因融合的DNA，利 用報(bào)告基因在植物原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行蛋白質(zhì)及細(xì)胞器定位、相關(guān) 基因功能研究、蛋白質(zhì)互作研究及細(xì)胞代謝過程研究等，為在細(xì)胞水平上研究植物的生理 變化、基因表達(dá)、信號傳遞等提供了簡便有效的實(shí)驗(yàn)體系。
[0003] 目前新疆野蘋果穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未構(gòu)建成功，相關(guān)基因在本屬植物中的功能 研究無法順利開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何在野生蘋果中進(jìn)行目的基因的瞬時(shí)表達(dá)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了蘋果轉(zhuǎn)化方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的蘋果轉(zhuǎn)化方法，包括以蘋果胚原生質(zhì)體為受體進(jìn)行蘋果轉(zhuǎn)化；
[0007] 所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法包括下述A1)和A2):
[0008] A1)將蘋果胚性愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞；
[0009] A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì)胞得到所述蘋果胚原生質(zhì)體。
[0010] 上述方法中，所述將蘋果胚性愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)包括:將所述蘋果胚性 愈傷組織在懸浮系繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞；
[0011] 所述懸浮系繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4-D、維生素 C和蔗糖得到的培 養(yǎng)基;所述懸浮系繼代培養(yǎng)基中所述BA、所述2,4-D、所述維生素 C和所述蔗糖的濃度可分別 為0.511^凡、311^凡、211^凡和質(zhì)量百分比濃度3%4!1為5.8。
[0012] 上述方法中，所述A1)具體可包括:研磨所述蘋果胚性愈傷組織，得到研磨物;將所 述研磨物在所述懸浮系繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到所述懸浮細(xì)胞。
[0013] 上述目的基因轉(zhuǎn)化蘋果的方法中，所述研磨蘋果胚性愈傷組織可為用網(wǎng)篩研磨所 述蘋果胚性愈傷組織。所述網(wǎng)篩可為不銹鋼網(wǎng)篩，如40目不銹鋼網(wǎng)篩。
[0014] 上述方法中，所述以蘋果胚原生質(zhì)體為受體進(jìn)行蘋果轉(zhuǎn)化可為用含有目的基因的 侵染液侵染所述蘋果胚原生質(zhì)體。所述用含有目的基因的侵染液侵染所述蘋果胚原生質(zhì)體 可為利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)方法完成所述侵染。
[0015] 上述方法中，所述侵染時(shí)間可為10_30min，如15min或20min。
[0016] 上述方法中，所述懸浮繼代培養(yǎng)的次數(shù)可大于等于2次，每次懸浮繼代培養(yǎng)的時(shí)間 可為7-10d，如8d。所述懸浮繼代培養(yǎng)可在黑暗、150r/min下進(jìn)行。所述懸浮繼代培養(yǎng)的溫度 可為22-24°C。
[0017] 上述方法中，所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì)胞前還包括將所述懸浮細(xì) 胞用CPW13M進(jìn)行處理；所述CPW13M為向細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液（cell protoplast wash medium，以下簡稱CPW溶液）中加入甘露醇得到的溶液;所述CPW13M中甘露醇的質(zhì)量百分比 濃度可為(如13%)。
[0018] 其中，所述CPW溶液由水和溶質(zhì)組成，所述CPW溶液的溶質(zhì)及其濃度分別為 KH2P〇427.2mg/L、KN〇3 101.0mg/L、CaCl2.2H20 1480.0mg/L、MgS〇4.7H20 246.0mg/L、KI 0.16mg/L及CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L。
[0019] 上述方法中，用所述CPW13M處理所述懸浮細(xì)胞的時(shí)間可為0.5-2h。所述用所述 CPW13M處理所述懸浮細(xì)胞的浸泡時(shí)間具體可為lh。
[0020] 上述方法中，所述纖維素酶、所述果膠酶和所述CPW13M處理的懸浮細(xì)胞的比例可 為100U:15U:10mL。
[0021] 上述方法中，所述A2)可包括A21)和A22):
[0022] A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細(xì)胞，得到酶-原 生質(zhì)體混合液；
[0023] A22)將所述酶-原生質(zhì)體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-原生 質(zhì)體混合液的分層液體1;將所述分層液體1進(jìn)行離心，使原生質(zhì)體位于所述分層液體1的界 面處，分離原生質(zhì)體，得到所述蘋果胚原生質(zhì)體；
[0024] 所述CPW25S為向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S中蔗糖質(zhì)量百 分比濃度具體可為23 % -27 % (如25 % )。
[0025] 上述方法中，所述酶液由溶質(zhì)和溶劑組成;所述溶劑為所述CPW溶液，所述溶質(zhì)及 其濃度分別為100000U/1所述纖維素酶、15000U/L所述果膠酶、0.65mol/L D-mannitol、 1.0% (質(zhì)量百分比濃度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1 % (質(zhì)量百分比濃度)MES和0.1 % (質(zhì)量 百分比濃度沖34，？!1為5.6。
[0026] 上述方法中，用所述酶液浸泡所述懸浮細(xì)胞可在弱光（如5001ux以下）、22-24Γ、 40r/min下進(jìn)行。用所述酶液浸泡所述CPW13M處理的懸浮細(xì)胞的時(shí)間可為15-25h，如20h。
[0027] 上述方法中，所述纖維素酶可為Cellulase R-10。所述果膠酶可為Pectolase Y-23。所述Cellulase R-10具體可為北京優(yōu)尼康生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號為C8260-100。 所述Pectolase Y-23具體可為北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品，貨號為MMF-1069。
[0028] 上述方法中，所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法可包括:將蘋果胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到蘋果胚性愈傷組織；
[0029] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4_D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基；
[0030] 其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中BA、2,4-D和蔗糖的濃度分別可為3mg/L、lmg/L和3% (質(zhì) 量百分比濃度）。
[0031] 上述方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)可在22-24Γ、黑暗下進(jìn)行。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間 可為 7-21d，如 14d。
[0032] 上述方法中，所述蘋果胚為盛花后60-80d的蘋果胚。
[0033] 上述方法中，所述盛花后60-80d具體可為盛花后70d。
[0034] 上述方法中，所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法還包括將所述蘋果胚性愈傷組織 在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
[0035]所述繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基；
[0036]其中所述繼代培養(yǎng)基中BA、2,4-D和蔗糖的濃度分別可為4mg/L、2mg/L和3% (質(zhì)量 百分比濃度）。
[0037] 上述方法中，所述繼代培養(yǎng)可在22-24Γ、黑暗下進(jìn)行。所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間 可為 7-21d，如 14d。
[0038] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述P1或P2的方法：
[0039] P1、所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法；
[0040] P2、所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法。
[0041] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Ml或M2的產(chǎn)品：
[0042] Ml、用于制備蘋果胚原生質(zhì)體的成套試劑，為所述懸浮系繼代培養(yǎng)基、所述 CPW13M、所述CPW25S、所述CPW溶液、所述纖維素酶、所述果膠酶、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基和所述繼 代培養(yǎng)基中的至少兩種；
[0043] M2、用于誘導(dǎo)蘋果胚性愈傷組織的試劑，為所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或所述繼代培養(yǎng) 基。
[0044] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0045] XI、所述蘋果轉(zhuǎn)化方法在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0046] X2、所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0047] X3、所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0048] X4、所述產(chǎn)品在蘋果中瞬時(shí)表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0049] X5、所述蘋果轉(zhuǎn)化方法在植物基因功能驗(yàn)證中的應(yīng)用；
[0050] X6、所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在植物基因功能驗(yàn)證中的應(yīng)用；
[0051] X7、所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在植物基因功能驗(yàn)證中的應(yīng)用；
[0052] X8、所述產(chǎn)品在植物基因功能驗(yàn)證中的應(yīng)用。
[0053] X9、所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在制備蘋果胚原生質(zhì)體的中的應(yīng)用；
[0054] X10、所述蘋果胚性愈