一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌 株，本發(fā)明還涉及該真菌菌株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物在阿爾茨海默病藥物市場上處于主導(dǎo)地位。石杉 堿甲為從民間草藥蛇足石杉中分離獲得的新型石松類單體生物堿，是一種強(qiáng)效的可逆性的 膽堿酯酶抑制劑，具有多靶點(diǎn)作用，對乙酰膽堿酯酶的抑制作用為毒扁豆堿的3倍、加蘭他 敏的30倍，而且外周不良反應(yīng)低，是治療阿爾茨海默病臨床優(yōu)選藥物之一。
[0003] 源于天然植物的藥物開發(fā)歷史悠久且富有生命力，植物提取獲得石杉堿甲為最簡 便方式，但植物提取獲得石杉堿甲已面臨植物資源匱乏瓶頸;化學(xué)合成生產(chǎn)石杉堿甲仍是 研發(fā)重要途徑之一，但合成步驟繁瑣、代價昂貴，很難獲得純光學(xué)活性的合成物。
[0004] 因此利用從野生蛇足石杉內(nèi)生真菌中篩選分離具有產(chǎn)石杉堿甲能力的菌株對于 治療阿爾茨海默病和保護(hù)植物資源意義重大。雖然目前國內(nèi)外已有對產(chǎn)石杉堿甲菌株進(jìn)行 開發(fā)和研究，但哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)具備產(chǎn)石杉堿甲功能卻鮮有報道。對 已獲得的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)NSW_V株可通過生物技術(shù)改造菌株為獲得 石杉堿甲工業(yè)化生產(chǎn)提供新的菌種資源。同時，通過對其菌株產(chǎn)石杉堿甲機(jī)理的研究，構(gòu)建 新的轉(zhuǎn)基因生物，使其獲得更優(yōu)良穩(wěn)定的產(chǎn)石杉堿甲性狀和能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，解決植物提取 獲得石杉堿甲已面臨植物資源匱乏瓶頸;及化學(xué)合成步驟繁瑣、代價昂貴，很難獲得純光學(xué) 活性的合成物的問題。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，該菌 株為從野生蛇足石杉(Huperzia serrata石杉科，石杉屬）內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于木霉 屬哈茨木霉菌種(Trichoderma harzianum)NSW_V株，在實(shí)驗(yàn)室傳代15代后具有遺傳穩(wěn)定 性，其氨基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0009] 該真菌菌株高效表達(dá)石杉堿甲培養(yǎng)條件為：
[0010] (1)培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基，具體配方為：馬鈴薯300g，葡萄糖20g，蒸餾水 1000ml；
[0011] (2)培養(yǎng)條件:28°C，220r/min;
[0012] ⑶裝液量:250ml錐形瓶，裝液量為100ml;
[0013] ⑷培養(yǎng)時間：5天。
[0014] 該真菌菌株高效穩(wěn)定性表達(dá)石杉堿甲時，該菌株的實(shí)驗(yàn)室保存條件為：（1)菌株每 次在PDA固體斜面?zhèn)鞔?，生長時間為72h; (2)保存菌種條件為4°C，12h后在將其放置-25°C 冰箱中進(jìn)行保存。
[0015] 本發(fā)明所采用的另一個技術(shù)方案是，一種高效表達(dá)石杉堿甲并作為治療阿爾茨海 默病的功能菌株在生物合成制藥方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所采用的第三個技術(shù)方案是，一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株 的應(yīng)用，通過轉(zhuǎn)基因、誘變育種對真菌菌株進(jìn)行基因改造，以獲得表達(dá)效率更高、遺傳穩(wěn)定 性更好的系列菌株;但基因改造的技術(shù)手段并不限于此，也可以采用其他的生物技術(shù)進(jìn)行 基因改造方面的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，屬于哈茨 木霉菌種(Trichoderma harzianum)NSW-V株，可以作為治療阿爾茨海默病的生物菌株，將 其優(yōu)良的產(chǎn)石杉堿甲高效表達(dá)基因轉(zhuǎn)入其他模式菌株中，通過基因改造獲得更多的優(yōu)良性 狀，此外還可通過誘變育種達(dá)到菌株的進(jìn)一步優(yōu)化。對其研究將會為生物合成工業(yè)化生產(chǎn) 石杉堿甲，保護(hù)植物資源、解決臨床一線用藥需求、降低治療阿爾茨海默病醫(yī)藥費(fèi)用有著巨 大意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株產(chǎn)石杉堿甲能力與標(biāo)準(zhǔn)品高 效液相檢測對照圖，圖中，a為石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜，b為本發(fā)明菌株高效液相色 譜；
[0019] 圖2為瓊脂糖凝膠電泳檢測NSW-V菌株中所抽提DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖，圖中，a為電 泳PCR產(chǎn)物結(jié)果，其中a圖中第一條帶為菌株NSW-V檢測區(qū)，第二條帶為Marker檢測區(qū)；b為 Marker大小標(biāo)示圖；
[0020] 圖3為本發(fā)明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株光學(xué)顯微鏡圖，圖中，a為光 學(xué)顯微鏡下菌絲形態(tài)圖，b為光學(xué)顯微鏡下孢子形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0022] 本發(fā)明一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，該菌株為從野生蛇足石杉 (Huperzia serrata石杉科，石杉屬）內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于木霉屬哈茨木霉菌種 (Trichoderma harzianum)NSW-V株，在實(shí)驗(yàn)室傳代15代后具有遺傳穩(wěn)定性，其氨基序列如 SEQ ID N0:1 所示。
[0023] 該菌株已在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國普通微生物菌種保藏中心保藏。 [0024]生物材料保藏信息：
[0025] 名稱：哈茨木霉（Trichoderma harzianum)NSW_V株
[0026] 保藏編號：CGMCC No.12076
[0027] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)
[0028] 保藏時間：2016年01月15日
[0029] 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0030] ( - )本發(fā)明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株的分離方法如下：
[0031]將從四川省旺蒼縣采集的新鮮蛇足石杉植株用自來水沖洗后，先用75%酒精進(jìn)行 表面消毒30s，無菌水沖洗4次，接著用10%NaC10浸泡5min，無菌水沖洗4次，最后再用75% 乙醇表面消毒30s，無菌水沖洗4次后，用無菌刀片將莖切成0.5cm大小，葉片切成0.3cm X 0.3cm小塊，接種到含有15μg/ml鏈霉素和lmg/ml脫氧膽酸鈉的PDA固體培養(yǎng)基上，倒置于28 °C培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。為了檢驗(yàn)上述表面消毒是否徹底，同時把在消毒過程中最后一次 沖洗組織塊的無菌水涂布在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。2~3d后，無菌操作法挑取在莖段和葉片切 口上所長出的菌絲，平板劃線法轉(zhuǎn)接到新鮮的TOA平板上，重復(fù)上述操作直到得到純化的內(nèi) 生真菌為止。
[0032](二)具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株發(fā)酵液制備
[0033]將分離得到的純化內(nèi)生菌分別接入裝有100ml PDA培養(yǎng)基的250ml錐形瓶(每個菌 株接3瓶），置于搖床上，28 °C、220r/min振蕩培養(yǎng)5d。設(shè)置3個重復(fù)。內(nèi)生真菌在振蕩培養(yǎng)5d 后，發(fā)酵液于l〇〇〇〇r/min離心15min。
[0034](三)具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株產(chǎn)物分析測定 [0035]取發(fā)酵液離心后的上清液50ml，采用氯仿和乙醚提取方法提取石杉堿甲，用甲醇 定容到5ml，用高效液相法測定發(fā)酵上清液產(chǎn)石杉堿甲的含量。高效液相(HPLC)色譜柱為 Agi lent C18柱(4 · 60mm X 250mm，5μπι);色譜條件為:流動相為甲醇-0 · 1 %甲酸(75:25);流 量1.0ml/min;柱溫25°C，進(jìn)樣量20μ1;檢測波長31 Onm。以石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品作對照。
[0036] 精密稱取石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品20mg，溶于20ml蒸餾水中，再依次制備成0.05，0.025， 0.0125，0.006，0.003mg/ml質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣20μ1。每次5次重復(fù)，以確定精密度良好。以 峰面積與對應(yīng)石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。通過線性回歸方程計(jì) 算分離獲得產(chǎn)石杉堿甲菌株代謝產(chǎn)物含量。結(jié)果表明石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品出峰時8.805min (圖 l，a)，線性回歸