一種檢測(cè)t-2毒素的試紙條及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)T-2毒素的試紙條及其應(yīng)用。該試紙條包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊和底板；其中，所述反應(yīng)膜上具有包被有T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線，所述結(jié)合物釋放墊上噴涂有T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測(cè)樣品中T-2毒素的方法。本發(fā)明提供的試紙條和檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)速度快、成本低、不受檢測(cè)設(shè)備限制的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大批量的T-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)T-2毒素的試紙條及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)Τ-2毒素的試紙條及其應(yīng)用，具體涉及一種用于檢測(cè)Τ-2毒 素的膠體金試紙條。 技術(shù)背景
[0002] Τ-2毒素 （Τ-2 toxin)是單端孢霉烯族毒素 （Trichothecenes)之一，是一種倍半 廠烯化合物，學(xué)名為4β_1, 5_二乙醜氧基_8 α - (3_甲基丁醜氧基）_3 α -羧基-12, 13-環(huán) 氧單端孢霉_9_烯，分子式為C24H340 9，分子量為466. 22。Τ-2毒素作為一種常見(jiàn)的真菌毒 素，可由多種真菌在濕冷的生長(zhǎng)環(huán)境和潮濕的儲(chǔ)存條件下產(chǎn)生，廣泛存在于自然界中，污染 玉米、小麥、燕麥、黑麥等谷物，以玉米污染最為常見(jiàn)。T-2毒素能抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的 合成，干擾生物體能量代謝，可引起機(jī)體過(guò)氧化損傷，還具有致癌和致畸性，可能還與我國(guó) 某些地區(qū)的大骨節(jié)病、食管癌和克山病的高發(fā)病率有關(guān)，對(duì)人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了較大 危害，因此建立靈敏的糧食和飼料中的T-2毒素檢測(cè)方法十分重要。糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組 織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)（JACFA)規(guī)定的T-2毒素的每日最大耐受攝入量（PMTDI)為 60ng/kg，以色列規(guī)定谷物飼料中T-2毒素不得超過(guò)100 μ g/kg，歐洲國(guó)家規(guī)定T-2毒素在谷 物中的最高殘留限量（MRL)為2(Γ300μ g/kg，我國(guó)規(guī)定豬配合飼料和禽配合飼料中T-2毒 素的允許量為lmg/kg。
[0003] 目前檢測(cè)T-2毒素的方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法、放射免疫 法、酶聯(lián)免疫法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但主要存在的問(wèn)題是對(duì)設(shè)備 依賴性高，并且不能實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣品的快速檢測(cè)，限制了這些方法的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一 種不受檢測(cè)設(shè)備限制并且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)的產(chǎn)品和方法成為迫切需 要解決的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的檢測(cè)T-2毒素的方法存在的對(duì)設(shè)備依賴性高，并且 不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)大批量樣品的快速檢測(cè)的特點(diǎn)，提供一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)速度快、 成本低、不受檢測(cè)設(shè)備限制的試紙條，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量的T-2毒素樣品進(jìn)行快速檢測(cè)和現(xiàn) 場(chǎng)監(jiān)控。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)T-2毒素的試紙條，該試紙條包 括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊和底板；其中，所述反應(yīng)膜上具有包被有T-2 毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線，所述結(jié)合物釋放 墊上噴涂有T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
[0006] 所述T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由T-2毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得 至|J，所述τ-2毒素半抗原是由T-2毒素與對(duì)苯二甲酸反應(yīng)得到，所述載體蛋白可為牛血清白 蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0007] 所述T-2毒素單克隆抗體是以T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備 獲得，所述羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對(duì)山羊進(jìn)行免疫制備獲得。
[0008] 所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次粘貼在底板上，所述結(jié)合物 釋放墊1/3~1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。
[0009] 所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或 濾油紙；所述結(jié)合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜可 為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試紙條的方法，該方法包括以下步驟：
[0011] 1)制備噴涂有T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；
[0012] 2 )制備具有包被有T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗 抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；
[0013] 3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成 試紙條。
[0014] 具體地說(shuō)，步驟包括：
[0015] 1)將T-2毒素與對(duì)苯二甲酸反應(yīng)，制備T-2毒素半抗原；
[0016] 2)將T-2毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；
[0017] 3)用T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞通 過(guò)融合、篩選，得到分泌T-2毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0018] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0019] 5)分別將T-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠抗抗體包被于反應(yīng)膜的檢測(cè) 線（T)和質(zhì)控線（C)上；
[0020] 6)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
[0021] 7)將制備的T-2毒素單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到T-2毒素單克隆抗 體-膠體金標(biāo)記物；
[0022] 8)將T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物噴涂在結(jié)合物釋放墊上，37°C烘lh后取 出，置于干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?br> [0023] 9)將樣品吸收墊用含0. 5%牛血清白蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 7. 2的0. lmol/L磷酸鹽 緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h ;
[0024] 10)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊，最后切成 3_寬的小條，加塑料盒，真空包裝，4~30°C條件下可保存12個(gè)月。
[0025] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測(cè)樣品中T-2毒素的方法，該 方法包括如下步驟：
[0026] ( 1)對(duì)樣品進(jìn)行前處理；
[0027] (2)用試紙條進(jìn)行檢測(cè)；
[0028] (3)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0029] 本發(fā)明的檢測(cè)T-2毒素的試紙條采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分 析技術(shù)，將T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物固定于結(jié)合物釋放墊上，樣品中的T-2毒 素在流動(dòng)過(guò)程中，與結(jié)合物釋放墊上的T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物結(jié)合，形成毒 素-抗體-膠體金標(biāo)記物。樣本中的毒素與反應(yīng)膜檢測(cè)線上的T-2毒素半抗原-載體蛋白 偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)檢測(cè)線紅色條帶有無(wú)來(lái)判斷待 測(cè)樣品液中是否含有T-2毒素殘留。
[0030] 檢測(cè)時(shí)，樣品經(jīng)處理后滴入試紙條卡孔內(nèi)，當(dāng)Τ-2毒素在樣品中的濃度低于檢測(cè) 限或?yàn)榱銜r(shí)，單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物在層析過(guò)程中會(huì)與固定在反應(yīng)膜上的Τ-2毒素半 抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，在檢測(cè)線（Τ)和質(zhì)控線（C)處各出現(xiàn)一條紅色條帶；如果Τ-2 毒素在樣品中的濃度等于或高于檢測(cè)限，單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物會(huì)與Τ-2毒素全部結(jié) 合，從而在Τ線處因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)反應(yīng)不會(huì)與Τ-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅 色條帶。如圖2所示。
[0031] 陰性：當(dāng)質(zhì)控線（C)顯示出紅色條帶，檢測(cè)線（Τ)同時(shí)也顯示出紅色條帶，判為陰 性。
[0032] 陽(yáng)性：當(dāng)質(zhì)控線（C)顯示出紅色條帶，而檢測(cè)線（Τ )不顯色，判為陽(yáng)性。
[0033] 無(wú)效：當(dāng)質(zhì)控線（C)不顯示出紅色條帶，則無(wú)論檢測(cè)線（Τ)顯示出紅色條帶與否， 該試紙條均判為無(wú)效。
[0034] 本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、不受檢 測(cè)設(shè)備限制、適合各種單位使用、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。用本發(fā)明試紙條檢測(cè)Τ-2毒 素的方法，簡(jiǎn)便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0036] 圖2為試紙條檢測(cè)結(jié)果判定圖。
[0037] 圖3為Τ-2毒素半抗原合成圖。
[0038] 圖4為Τ-2毒素半抗原核磁共振氫譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0040] 實(shí)施例1檢測(cè)Τ-2毒素的試紙條的制備
[0041] 該試紙條的制備方法主要包括以下步驟：
[0042] 1)制備噴涂有Τ-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；
[0043] 2 )制備具有包被有Τ-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗 抗體的質(zhì)控線的反應(yīng)膜；
[0044] 3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和PVC底板組 裝成試紙條。
[0045] 下面分步詳細(xì)敘述：
[0046] 1、Τ-2毒素半抗原的制備
[0047] 將47mg Τ-2毒素、25mg對(duì)苯二甲酸及少量4-二甲氨基吡啶（DMAP)加入5ml干燥 的N，N-二甲基甲酰胺（DMF)中，0°C下緩慢滴加 40mg二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)與lml干燥 的DMF的混合液，滴加完畢后自然升溫至室溫，繼續(xù)反應(yīng)24h。蒸除溶劑，柱層析純化后得到 T-2毒素與對(duì)苯二甲酸的單縮合物，即為目標(biāo)半抗原，合成路線見(jiàn)圖3。
[0048] 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，如圖4所示，8. Oppm左右增加的芳環(huán)信號(hào)峰以 及12. 6ppm附近增加的羧基信號(hào)峰，說(shuō)明目標(biāo)半抗原合成成功。
[0049] 2、免疫原的制備
[0050] 取15mg半抗原，溶解于0· 8ml DMF中；取20mg碳化二亞胺（EDC)用0· 2ml水充 分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取牛血清白蛋白（BSA) 3611^，使之充分溶解在311110.1111〇1/108(?!19.6)中，將反應(yīng)液4逐滴緩慢滴加到蛋白溶 液中，并于室溫下攪拌24h，用0. Olmol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反 應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0051] 3、包被原的制備
[0052] 制備方法同免疫原的制備，將BSA換為卵清蛋白（0VA)即得包被原。
[0053] 4、T-2毒素單克隆抗體的制備
[0054] (1)動(dòng)物免疫
[0055] 將步驟2得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生 抗血清。
[0056] (2)細(xì)胞融合和克隆化
[0057] 取產(chǎn)生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng) 酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，得 到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0058] (3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0059] 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮 中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng) 瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
[0060] (4)單克隆抗體的制備與純化
[0061] 采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠（8周齡）腹腔注入滅菌石蠟油，7~14天后腹腔注 射雜交瘤細(xì)胞，7~10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，小瓶分裝，_20°C保存。
[0062] 5、羊抗鼠抗抗體的制備
[0063] 以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗 抗體。
[0064] 6、T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0065] (1)膠體金的制備
[0066] 用雙蒸去離子水將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液稀釋成0. 01%，取100ml置于錐形 瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入1. 5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的 檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的酒紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離 子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備良好的膠體金用肉眼觀察是清亮透明的，沒(méi)有混濁，液體 表面無(wú)漂浮物，在日光下觀察膠體金的顏色為酒紅色。
[0067] (2) T-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0068] 在磁力攪拌下，用0· 2mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH至7. 2 (不同抗體的pH標(biāo) 記范圍在7~8之間，可以變化)，按每毫升膠體金溶液中加入2(Γ50 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金 溶液中加入上述T-2毒素單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置lOmin，加入10% BSA使其在膠體 金溶液中的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，靜置lOmin。12000r/min，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù) 溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。 [0069] 復(fù)溶緩沖液：含BSA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 19Γ0. 3%、吐溫-80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 05%?0. 2%、pH7. 2 的 0. 02mol/L 磷酸鹽緩沖液。
[0070] 7、結(jié)合物釋放墊的制備
[0071] 將結(jié)合物釋放墊浸泡于含0· 5% BSA (質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 7. 2的0· 5mol/L磷酸鹽緩沖 液中，均勻浸濕lh，37°C烘3h備用。用Isoflow噴膜儀將制備好的T-2毒素單克隆抗體-膠 體金標(biāo)記物均勻噴涂在結(jié)合物釋放墊上，每lcm結(jié)合物釋放墊噴涂0. 01ml T-2毒素單克隆 抗體-膠體金標(biāo)記物后，置于37°C環(huán)境中（濕度< 20%) 60min后取出，置于干燥環(huán)境(濕度 < 20%)中保存?zhèn)溆谩?br> [0072] 8、反應(yīng)膜的制備
[0073] 將T-2毒素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物包被到反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測(cè)線，將羊抗鼠抗抗 體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線。
[0074] 包被過(guò)程：用磷酸緩沖液將T-2毒素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到lmg/ml， 用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線（T)，包被量為1.0 μ 1/cm;用 0· 01m〇l/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200 μ g/ml，用Isoflow點(diǎn)膜儀將 其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C)，包被量為1. 0 μ Ι/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C 條件下干燥2h，備用。
[0075] 9、樣品吸收墊的制備
[0076] 將樣品吸收墊用含0. 5%牛血清白蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH 7. 2的0. lmol/L磷酸鹽緩 沖液浸泡2h，37°C下烘干2h備用。
[0077] 10、試紙條的組裝
[0078] 將樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC底板上；結(jié) 合物釋放墊從起始端有1/3區(qū)域被樣品吸收墊覆蓋，結(jié)合物釋放墊的末端與反應(yīng)膜的始端 連接，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC底板的始端對(duì)齊，吸水 墊的末端與PVC底板的末端對(duì)齊；所述反應(yīng)膜上有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線（T)和質(zhì)控線 (C)均呈與所述試紙條的長(zhǎng)相垂直的條狀帶；檢測(cè)線位于靠近結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)； 質(zhì)控線位于遠(yuǎn)離結(jié)合物釋放墊的末端的一側(cè)；將試紙條用機(jī)器切成3_寬的小條，裝在特 制的塑料制卡中，4~30°C條件下可保存12個(gè)月。
[0079] 實(shí)施例2樣品中T-2毒素的檢測(cè)
[0080] 1、樣品的前處理
[0081] 稱取4. 0g±0. 05g粉碎的黃豆、玉米等谷物樣本或飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心 管中；加入3g NaCl、5ml甲醇和5ml去離子水，用渦旋儀渦動(dòng)3min ;室溫（20-25°C) 3000g 以上離心5min ;移取100 μ 1上清液與200 μ 1樣本復(fù)溶液（0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液)混 勾后待檢。
[0082] 2、用試紙條進(jìn)行檢測(cè)
[0083] 用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2~3滴于加樣孔，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng) 7?10min，判定結(jié)果。
[0084] 3、分析檢測(cè)結(jié)果
[0085] 陰性（-):T線和C線都顯色，表示樣品中T-2毒素濃度低于檢測(cè)限，如圖2a。
[0086] 陽(yáng)性（ + ):T線無(wú)顯色C線顯色，表示樣品中T-2毒素濃度等于或高于檢測(cè)限，如圖 2b 〇
[0087] 無(wú)效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過(guò)程或試紙條已變質(zhì)失效，如圖2c。在 此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說(shuō)明書，并用新的試紙條重新測(cè)試。
[0088] 實(shí)施例3樣品檢測(cè)實(shí)例
[0089] 1、檢測(cè)限試驗(yàn)
[0090] 取空白黃豆、玉米和飼料樣品，在其中分別添加T-2毒素至終濃度為250、500、 1000 μ g/kg，取試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定三次。
[0091] 用試紙條檢測(cè)黃豆、玉米和飼料樣品時(shí)，當(dāng)其中T-2毒素添加濃度為250 μ g/kg 時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見(jiàn)的兩條紅色線條，呈陰性；當(dāng)其中T-2毒素添加濃度為500、 1000 μ g/kg時(shí)，試紙條質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色，呈陽(yáng)性，表明本試紙條對(duì)黃豆、玉米等谷 物和飼料中T-2毒素的檢測(cè)限為500 μ g/kg。
[0092] 2、假陽(yáng)性率、假陰性率試驗(yàn)
[0093] 取已知T-2毒素含量大于500 μ g/kg的黃豆、玉米、飼料陽(yáng)性樣品各20份和含量 小于500 μ g/kg的黃豆、玉米、飼料陰性樣品各20份，用三批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其陰陽(yáng) 性率。
[0094] 結(jié)果表明：用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條檢測(cè)陽(yáng)性樣品時(shí)，結(jié)果全為陽(yáng)性，可知陽(yáng)性樣 品符合率為100%，假陰性率為〇 ;檢測(cè)陰性樣品時(shí)，結(jié)果全為陰性，可知陰性樣品符合率為 100%，假陽(yáng)性率為0。說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)T-2毒素的試紙條可以對(duì)黃豆、玉米等谷物和飼料 中的T-2毒素進(jìn)行快速檢測(cè)。
[0095] 3、特異性試驗(yàn)
[0096] 將玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等用pH7. 2、0. 2mol/L的磷 酸鹽緩沖液稀釋至5mg/L，用T-2毒素試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，用該試紙條檢測(cè)5mg/L 玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素時(shí)，試紙條質(zhì)控線和檢測(cè)線均顯色，呈陰 性。說(shuō)明本試紙條對(duì)玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素?zé)o交叉反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)T-2毒素的試紙條，其特征在于，該試紙條包括樣品吸收墊、結(jié)合物釋放 墊、反應(yīng)膜、吸水墊和底板；其中，所述反應(yīng)膜上具有包被有Τ-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián) 物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控線，所述結(jié)合物釋放墊上噴涂有Τ-2毒素單克隆 抗體-膠體金標(biāo)記物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述樣品吸收墊、結(jié)合物釋放墊、反應(yīng) 膜、吸水墊依次粘貼在底板上。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于，所述結(jié)合物釋放墊1/3~1/2被 覆蓋于樣品吸收墊下。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述Τ-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物 由Τ-2毒素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán) 蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于，所述Τ-2毒素半抗原是由 Τ-2毒素與對(duì)苯二甲酸反應(yīng)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述Τ-2毒素單克隆抗體是以Τ-2毒素 半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得，所述羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原 對(duì)山羊進(jìn)行免疫制備獲得。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述試紙條的方法，其特征在于，該方法包括以下步 驟： 1) 制備噴涂有Τ-2毒素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊； 2) 制備具有包被有Τ-2毒素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠抗抗體 的質(zhì)控線的反應(yīng)膜； 3) 將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙 條。
8. -種檢測(cè)樣品中Τ-2毒素的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 1) 對(duì)樣品進(jìn)行前處理； 2) 用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試紙條進(jìn)行檢測(cè)； 3) 分析檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104215763SQ201310218289
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】馮才偉, 羅曉琴, 馮才茂, 馮靜, 崔廷婷, 湯慶彩, 陳煒玲, 余厚美 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司