專利名稱：在遺傳載體上表面展示蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表面展示蛋白的方法，具體涉及在孢子等的表面上展示目的蛋白的、改進目的蛋白和分離目的物質的方法。
背景技術：
生物體在其表面上展示所需的擬蛋白(proteinaceous)物質如肽和多肽的表面展示技術有更廣的應用領域，這取決于所展示蛋白或宿主生物體的類型(Georgiou等，1993，1997；Fischetti等，1993；和Schreuder等，1996)。這種常規(guī)表面展示技術已通過采用若干單細胞生物體如噬菌體、細菌、酵母和哺乳動物細胞開發(fā)出來。
把待展示蛋白的基因含在宿主生物體中，由此利用所展示蛋白的特征可選擇性地篩選宿主，從而容易地從所選擇的宿主中獲得所需的基因。所以，這種表面展示技術對蛋白的分子進化可確保有強大的工具(參見WO 9849286；和美國專利號5,837,500)。
高通量篩選例如，將在其表面上展示具有所需結合親和性的抗體的噬菌體與固定化抗原結合，然后洗脫，接著使洗脫的噬菌體增殖，由此獲得編碼噬菌體靶抗體的基因(美國專利號5,837,500)。上述的生物搖攝方法通過在大量的噬菌體表面上表面展示抗體文庫，可提供篩選靶抗體的工具，以及包含如下的連續(xù)步驟(1)構建文庫；(2)表面展示文庫；(3)與固定化抗原結合；(4)洗脫結合的噬菌體；最后(5)使選擇的克隆增殖。
已發(fā)現(xiàn)噬菌體表面展示技術在從大量文庫中獲取所需的單克隆變體方面是有用的(例如，106-109變體)，并因此應用到抗體的高通量篩選的領域?？贵w已用于各種領域如治療、診斷、分析等，并且其需求已日益增長。就此而論，對新物質具有結合親和性或催化生化反應的新型抗體一直存在著需要。生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤技術已普遍使用以滿足需求。然而，常規(guī)方法的實施需要高的成本和長的時間，但抗體的產(chǎn)量卻很低。除此以外，為了篩選新型抗體，一般使用超過1010個抗體文庫，結果，雜交瘤技術已被認為在發(fā)現(xiàn)顯示新的結合特性的抗體方面是不夠的。
許多研究已集中在較容易和更有效的新方法上，如上述的生物搖攝方法，然后開發(fā)了以此方式進行的新技術，該方式是將文庫展示在細菌或酵母的表面上，然后展示靶蛋白的細胞用流式細胞儀以高通量方式分類。根據(jù)此技術，將標記有熒光染料的抗原與表面-展示細胞結合，以及具有所需的結合親和性的抗體用每小時能分析超過108細胞的流式細胞儀分離。通過揭示表面展示單克隆抗體可用流式細胞儀以超過105的速率被濃縮，最終超過79％經(jīng)證明是所需的細胞(Daugherty等，1998)，F(xiàn)rancisco等已證實微生物展示技術的有用性。
活疫苗上述的表面展示技術可展示抗原或其片段，因此提供重組活疫苗的遞送系統(tǒng)。迄今為止，減毒的病原體或病毒已被主要用作疫苗。特別地，已發(fā)現(xiàn)細菌在胞內或胞外或其細胞膜上表達抗原，由此給宿主細胞遞送抗原。表面展示的活疫苗誘導潛在的免疫反應，并在宿主細胞的增殖過程中連續(xù)表達抗原；所以，它已成為突出的疫苗的新遞送系統(tǒng)。具體而言，展示在非病原性大腸桿菌(E.coli)或沙門氏菌(Salmonella)的表面上的病原體衍生的抗原性表位以活體形式口服，然后顯示以更連續(xù)或強大的方式誘導免疫反應(Georgiou等，1997；和Lee等，2000)。
全細胞生物轉化全細胞作為生物催化劑，在其表面上展示的酶能催化化學反應，可避免酶的直接表達、分離和穩(wěn)定的必要性。在細胞中表達酶用于生物轉化的情況下，迫使細胞回收及化學(例如甲苯)處理以確保對底物的不通透性。此外，持續(xù)使用致使酶失活或者帶來底物和產(chǎn)物轉移上的問題，由此降低整個過程的生產(chǎn)率。
利用展示在細胞表面上的酶可克服上述的缺陷(Jung等，1998a1998b)。采用在其表面上展示磷酸二酯酶的全細胞，具有更高毒性的有機磷種類對硫磷和對氧磷可被降解，這是個典型的例子，表示展示酶的細胞對環(huán)境純化過程的應用性(Richins等，1997)。
抗肽抗體Martineau等報道了利用大腸桿菌的表面展示技術生產(chǎn)抗肽抗體的高度簡便的方法(Martineau等，1991)。正如所述，把所需的肽展示在MalE和外膜蛋白LamB的突出區(qū)域，然后，全細胞或片段化的細胞施用給動物以生成抗肽抗體。該方法使得生產(chǎn)抗體的同時避免肽的化學合成及其與載體蛋白的鍵合成為可能。
全細胞吸附劑為了使抗體或多肽固定于合適的載體上，這在吸附層析中是有用的，必須進行隨后的若干步驟，例如，發(fā)酵生長蛋白，純化純的蛋白以及固定于載體上。一般而言，難以制備生物吸附劑。
作為吸附劑，已開發(fā)出了展示吸附蛋白的全細胞。最有名的全細胞吸附劑是在其表面上自然展示蛋白A的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，它與哺乳動物抗體的Fc區(qū)具有高的結合親和性。當前，已提出了去除和回收重金屬的新方法，其采用大量展示在微生物細胞表面上的金屬硫蛋白或金屬吸附蛋白(Sousa等，1996，1998；和Samuelson等，2000)。與利用吸附金屬微生物的常規(guī)方法比較，該方法可更有效地從污染源中去除和回收重金屬。
正是基于對上述事實的了解，為了在細胞表面上展示外源蛋白，合適的表面蛋白和外源蛋白必須在基因水平是相互連接的以表達融合蛋白，以及融合蛋白應穩(wěn)定地越過細胞內膜以附著于細胞表面。優(yōu)選地，具有下列特征的表面蛋白推薦為表面展示基元1)有能通過細胞內膜的分泌信號，2)有能穩(wěn)定附著于細胞表面上的靶信號，3)細胞表面上的高表達水平，和4)不管蛋白大小都可穩(wěn)定表達(Georgiou等，1993)。
同時，根據(jù)上述現(xiàn)有的表面展示方法，為了把目的蛋白整合到表面蛋白的N-端或C-端或中心區(qū)，表面展示的基元需要進行遺傳修飾。所有表面展示的蛋白以與表面展示基元融合的方式表達。所以，所得表面展示的蛋白是修飾蛋白而非野生型蛋白。
迄今為止，所開發(fā)的表面展示系統(tǒng)如下噬菌體表面展示系統(tǒng)(Chiswell和McCarferty，1992)、細菌表面展示系統(tǒng)(Georgiou等，1993；Little等，1993；和Georgiou等，1997)、革蘭氏陰性細菌表面展示系統(tǒng)(Francisco等，1992；Fuchs等，1991；Klauser等，1990，1992；和Hedegaard等，1989)、革蘭氏陽性細菌表面展示系統(tǒng)(Samuelson等，1995；Palva等，1994；和Sleytr和Sara，1997)和酵母表面展示系統(tǒng)(Ferguson，1988；和Schreuder等，1996)。此外，還已開發(fā)出了與芽孢外被蛋白融合的目的蛋白展示在孢子表面上。例如，美國專利號5,766,914公開了利用枯草芽孢桿菌的芽孢外被蛋白中的cotC或cotD與作為報道蛋白的lacZ的融合蛋白來生產(chǎn)和純化酶的方法。美國專利號5,837,500和5,800,821也表明cotC和cotD作為優(yōu)選的表面展示基元，但其實驗演示未加以說明。
根據(jù)革蘭氏陰性細菌的表面展示系統(tǒng)，外源多肽整合到表面結構不僅導致位的限制使得不可能具有穩(wěn)定的膜蛋白(Charbit等，J.Immunol，1391644-1658(1987)；和Agterberg等，Gene，8837-45(1990))而且導致細胞外膜的穩(wěn)定性及其生存力的降低。大腸桿菌作為展示宿主，其已被深入地進行了研究，通常利用細胞外膜蛋白作為表面展示基元。然而，與外源蛋白融合的細胞外膜蛋白的過表達可能帶來細胞外膜結構的不穩(wěn)定，結果使宿主細胞的生存力突然下降(Georgiou等，1996)。
上述常規(guī)展示方法中存在的問題是由于目的蛋白和用于展示的表面展示基元之間的融合蛋白的制備。如果融合蛋白以少量表達，則全細胞生物轉化的反應效率、蛋白陣列和抗體產(chǎn)量降低；但如果過表達，很可能導致上述的缺陷。另外，利用融合蛋白的表面展示方法依賴于表面展示基元整合到細胞、孢子或噬菌體表面中的程度，引起展示蛋白量的限制。
如上所述，常規(guī)表面展示技術根本上取決于目的蛋白和表面展示基元之間的融合蛋白的形成。因此，在常規(guī)表面展示系統(tǒng)中存在若干缺陷(1)必須得知表面展示基元的基因序列；(2)必須克隆表面展示基元的基因；(3)表面展示基元很可能影響目的蛋白的三級結構；(4)當僅有多聚體形式的目的蛋白具有活性以及融合蛋白是獨立表面展示時，致使目的蛋白失活；(5)由于利用融合蛋白的表面展示方法依賴于表面展示基元整合到宿主細胞表面中的程度，限制所展示蛋白的量；(6)當目的蛋白過量表面展示時，誘導宿主細胞的結構不穩(wěn)定，從而降低了宿主細胞對環(huán)境的抗性和生存力。
因此，為了開發(fā)新表面展示系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠克服常規(guī)方法中的缺陷，下列特征應得以實現(xiàn)(1)能夠構建系統(tǒng)而無需知道表面展示基元的基因序列；(2)能夠構建系統(tǒng)而無需克隆表面展示基元的基因；(3)在目的蛋白形成其內在結構后，能夠在宿主細胞表面上進行展示；(4)通過非選擇性鍵合，能夠增加表面展示的蛋白的量；和/或(6)即使在目的蛋白過量表面展示時，也不降低宿主細胞對環(huán)境的抗性和生存力。
在整個申請中，參考了各種各樣的專利和出版物，文獻引用在括號內。為了更充分說明本發(fā)明以及本發(fā)明涉及的技術領域狀態(tài)，這些專利和出版物以其全文在此引作參考。
發(fā)明內容
在此情形下，本發(fā)明人進行了深入研究以克服常規(guī)表面展示方法的缺陷，結果我們開發(fā)了無需表面展示基元的新型展示系統(tǒng)。令人驚奇的是，開發(fā)的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)能夠在表面上展示任何蛋白，而同時維持其內在結構，并且當過量展示時，遺傳載體可保持其生存力以及對周圍環(huán)境的抗性。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供利用在遺傳載體上表面展示的方法改進目的蛋白的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供利用在遺傳載體上表面展示的方法從混合物中分離目的物質的方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供利用在遺傳載體上表面展示的方法進行生物轉化的方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供利用在遺傳載體上表面展示的方法生產(chǎn)針對脊椎動物抗原的抗體的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于在遺傳載體表面上展示目的蛋白的載體。
本發(fā)明的另一目的是提供用于在遺傳載體表面上展示目的蛋白的微生物轉化子。
本發(fā)明的進一步目的是提供遺傳載體和目的蛋白之間的復合體。
本發(fā)明的進一步目的是提供展示在表面目的蛋白變體上的遺傳載體文庫。
本發(fā)明的另一目的是提供利用在遺傳載體上表面展示的方法所制備的蛋白微陣列。
附圖簡述
圖1示意性說明本發(fā)明的原理；圖2表示展示在孢子表面上的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂肪酶活性；圖3表明在宿主細胞中表達的野生型脂肪酶在孢子表面上的展示；圖4顯示流式細胞儀分析的結果，用于證實野生型羧甲基纖維素酶的孢子表面展示；圖5是用于孢子表面展示的載體pCrylp-CMCase-hp的遺傳圖；圖6顯示流式細胞儀分析的結果，用于證實含有修飾的分泌信號的羧甲基纖維素酶的孢子表面展示；圖7是用于孢子表面展示的載體pCrylp-CMCasehis的遺傳圖；和圖8示出流式細胞儀分析的結果，用于證實含有融合序列、陽離子區(qū)的羧甲基纖維素酶的孢子表面展示。
實施本發(fā)明的最佳方式首先在此使用的術語“遺傳載體”是指在其表面上展示目的蛋白并具有下列特征的生物體(1)選自孢子和病毒；(2)具有與目的蛋白形成非共價鍵的能力，所述目的蛋白具有所需的解離常數(shù)，在內含遺傳載體的宿主細胞中表達；和(3)如果需要，其表面特性能夠通過遺傳工程方法進行修飾。
此處所用的術語“宿主細胞”意思不同于涉及蛋白表面展示的現(xiàn)有出版物所公開和顯示的含義。在此所用的術語“宿主細胞”是指表達目的蛋白并具有下列特性的細胞(1)能夠被編碼目的蛋白的基因轉化；(2)能夠內含遺傳載體如孢子和病毒以及增殖遺傳載體；和(3)如果需要，能夠進行遺傳操作。
如上所述，在本說明書中，術語“遺傳載體”在其表面上展示目的蛋白，以及“宿主細胞”表達目的蛋白，它們具有嚴格不同的含義。
在本發(fā)明的一個方面，提供了在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的制備方法，所述方法包含下列步驟(a)用含有編碼目的蛋白的基因的載體轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(b)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白；和(c)使表達蛋白和遺傳載體表面之間形成非共價鍵，以便目的蛋白展示在遺傳載體表面上。
在本發(fā)明的另一方面，提供了改進目的蛋白的方法，所述方法包括下列步驟(a)通過突變編碼目的蛋白的基因，構建目的蛋白的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白的變體；(e)通過在表達的蛋白變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以便使變體展示在遺傳載體表面上，從而獲取遺傳載體文庫；和(f)篩選在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白變體的遺傳載體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了從混合物中分離目的物質的方法，所述方法包括下列步驟(a)通過突變編碼結合蛋白或作為目的蛋白的結合區(qū)的基因，構建編碼結合蛋白或其結合區(qū)的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達結合蛋白或結合區(qū)的變體；(e)通過在表達的結合蛋白變體或結合區(qū)變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以便使變體展示在遺傳載體表面上，從而獲取遺傳載體文庫；和(f)將遺傳載體文庫與預定的物質接觸，并通過選擇在其表面上展示變體結合預定的物質來篩選改進的結合蛋白或其結合區(qū)；(g)將在其表面上展示改進的結合蛋白或其結合區(qū)的遺傳載體與混合物接觸以從混合物中分離物質。
本發(fā)明方法已根據(jù)新的概念開發(fā)出來，其與常規(guī)表面展示方法大大不同。本發(fā)明方法利用了在遺傳載體表面上組分的特性，具體利用了在遺傳載體表面上的蛋白和目的蛋白之間的非共價鍵。本發(fā)明的原理路線利用孢子作為遺傳載體，說明性示例在圖1中。參照圖1，宿主細胞被攜帶編碼目的蛋白的序列的載體轉化，目的蛋白在形成孢子過程中或之前胞內或胞外表達，并且憑借目的蛋白和宿主細胞中形成的孢子表面之間的非共價鍵最終實現(xiàn)目的蛋白的表面展示。
如上所述，本發(fā)明的顯著特征在于無需表面展示的基元，所述基元在常規(guī)表面展示蛋白的方法中是必需的。由于本發(fā)明方法規(guī)避了表面展示基元的必要性，因此蛋白在宿主細胞中表達時，發(fā)現(xiàn)難以越過細胞膜，可在遺傳載體表面上充分展示，當宿主細胞裂解露出遺傳載體時，可回收在其表面上展示蛋白的遺傳載體。這種回收的目的蛋白和遺傳載體的復合體具有廣泛的用途。
根據(jù)本發(fā)明方法，孢子或病毒可作為遺傳載體使用。孢子是優(yōu)選的遺傳載體，這是由于其具有如下特性(Driks，1999)(1)較高的熱穩(wěn)定性；(2)對放射性顯著的穩(wěn)定性；(3)對毒素的穩(wěn)定性；(4)對酸和堿較高的穩(wěn)定性；(5)對溶菌酶顯著的穩(wěn)定性；(6)抗干燥性；(7)對有機溶劑較高的穩(wěn)定性；(8)無代謝活性；和(9)較短的獲取孢子的時間，例如幾小時。
根據(jù)本發(fā)明方法，當病毒用作遺傳載體時，優(yōu)選使用噬菌體，以及在原核宿主細胞中表達的目的蛋白是通過非共價鍵結合到噬菌體的外被蛋白而得到表面展示的。如果噬菌體位于宿主細胞的周質中，可將信號肽與目的蛋白融合，以允許向周質中分泌，從而確保表面展示。如果目的蛋白不能與噬菌體的外被蛋白自然結合，則為了進行表面展示，可將其融合到能與噬菌體的外被蛋白結合的基元上。
根據(jù)一優(yōu)選的實施方案，遺傳載體具有修飾的表面蛋白以增強與目的蛋白的非共價鍵。遺傳載體的修飾方法包括(i)將寡肽或多肽與遺傳載體表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增強了目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(ii)使遺傳載體表面蛋白進行定點誘變；和(iii)把遺傳載體表面蛋白進行隨機誘變，但不限于此。
在本發(fā)明方法中，目的蛋白包括任何蛋白和肽，如激素、激素類似物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白或其片段、抗體或其片段、單鏈抗體、結合蛋白或其片段、肽、抗原、粘著蛋白、結構蛋白、調節(jié)蛋白、毒素蛋白、細胞因子、轉錄調節(jié)蛋白、血液凝固蛋白和植物防衛(wèi)-誘導蛋白，但不限于此。
本發(fā)明所用的結合蛋白或其結合區(qū)包括任何能夠結合預定的物質的蛋白或其結構域，例如當分離某種抗原物質時，所述結合蛋白或其結合區(qū)是抗體或其抗體結構域。結合蛋白或結合區(qū)包括但不限于蛋白酶抑制劑、芥菜素(crambin)、腸毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽(apaminm)溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、水蛭蛋白酶抑制劑、卵類粘蛋白、天青蛋白、腫瘤壞死因子和CD4。
根據(jù)本發(fā)明方法，單體或多聚體(包括同型多聚體和異型多聚體)可被表面展示。多聚體蛋白一般只有其所有單體結合時才具有完整的活性。在常規(guī)方法中，已發(fā)現(xiàn)多聚體蛋白是以失活形式進行表面展示的，因為其單體是彼此獨立表面展示的。根據(jù)本發(fā)明方法，多聚體蛋白可以展示在遺傳載體表面上而同時維持其整體結構。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，待表面展示的目的蛋白可以被修飾，以便增強與遺傳載體的非共價鍵。修飾方法包括(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；和(iv)將目的蛋白進行隨機誘變，但不限于此。
使一部分目的蛋白氨基酸缺失的方法可以各種各樣的方式進行，例如通過從目的蛋白的N-端序列(例如信號肽)缺失離子型氨基酸。由此修飾的目的蛋白增強了與遺傳載體的疏水性相互作用，因此可以較低的解離常數(shù)被表面展示。有報道孢子表面攜帶陰離子電荷。所以優(yōu)選陽離子肽與用于表面展示的目的蛋白進行融合。
在本發(fā)明方法中，作為編碼待轉化目的蛋白的基因，兩個或更多個重復序列也是有用的。在兩個或更多個重復序列中，重復序列可以彼此相同或不同。其他組合也可用于融合序列中。此外，轉化中所用的基因可以質粒獨立存在于宿主細胞中，或整合到宿主細胞的染色體中。
目的蛋白的表達可以依靠其自身的啟動子或其他可在宿主細胞中誘導的適當?shù)膯幼舆M行誘導。
根據(jù)本發(fā)明方法，非共價鍵，尤其是疏水鍵、離子鍵、氫鍵和范德瓦耳斯鍵中的一種或多種，使得目的蛋白與遺傳載體之間相互作用。
根據(jù)一優(yōu)選的實施方案，內含孢子的宿主細胞包括但不限于孢子形成革蘭氏陰性菌如粘球菌(Myxococcus)；孢子形成革蘭氏陽性菌如梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)和芽孢桿菌(Bacillus)；孢子形成放線菌(Actionmycete)；孢子形成酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母(Candida)和漢遜酵母(Hansenulla)和孢子形成真菌。更優(yōu)選地，宿主細胞是孢子形成革蘭氏陽性菌，以及最優(yōu)選地，芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。具體而言，枯草芽孢桿菌在某種意義上是有利的，因為對其孢子形成的遺傳知識和實驗方法以及培養(yǎng)方法是眾所周知的。
根據(jù)一優(yōu)選的實施方案，宿主細胞是一種突變細胞，其刪除了胞內和胞外蛋白酶的生成，所述蛋白酶參與表面展示的目的蛋白的降解。
雖然本發(fā)明方法主要針對通過遺傳載體和目的蛋白之間非共價鍵的表面展示，但如果需要更穩(wěn)定的連接，其它共價鍵也可使用。使遺傳載體表面和目的蛋白之間的鍵穩(wěn)定的操作方法可以是使用物理、化學或生化方法在遺傳載體表面和目的蛋白之間形成共價鍵，接著通過非共價鍵在遺傳載體表面上展示目的蛋白。在形成共價鍵的方法中，化學法戊二醛處理(DeSantis G.和Jones J.B.Curr.Opin.Biotechnol.10324-330(1999))是優(yōu)選的，物理法紫外線處理(Graham L.，和Gallop P.M.Anal.Biochem.217298-305(1994))是優(yōu)選的，以及生化法酶處理確保了共價鍵的形成(Gao Y.，和Mehta K.，J.Biochem.129179-183(2001))。
在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的制備方法中，優(yōu)選方法進一步包含篩選在其表面上展示目的蛋白的遺傳載體的步驟。
在改進目的蛋白的方法中，通過突變野生型目的蛋白基因來構建基因文庫的步驟是利用DNA改組方法(Stemmer，Nature，370389-391(1994))、StEP方法(Zhao，H.等，Nat.Biotechnol.，16258-261(1998))、RPR方法(Shao，Z.等，Nucleic acids Res.，26681-683(1998))、分子繁殖方法(Ness，J.E.等，Nat.Biotechnol.，17893-896(1999))、ITCHY方法(Lutz S.和Benkovic S.，Current Opinion in Biotechnology，11319-324(2000))、易錯PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，228-33(1992))和點誘變(Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
根據(jù)改進目的蛋白方法的一優(yōu)選實施方案，遺傳載體是孢子，以及篩選步驟的方式是將孢子文庫用選自有機溶劑、熱、酸、堿、氧化劑、干燥、表面活性劑和蛋白酶中的一種或多種進行處理，然后對在其表面上展示目的蛋白變體、具有處理抗性的孢子加以選擇。
根據(jù)改進目的蛋白方法的另一優(yōu)選實施方案，遺傳載體是孢子，以及篩選步驟的方式是將孢子文庫先用選自有機溶劑、熱、酸、堿、氧化劑、干燥、表面活性劑中的一種或多種進行處理，接著用蛋白酶進行二次處理，然后對在其表面上展示目的蛋白變體、具有蛋白酶抗性的孢子加以選擇。
在本發(fā)明方法中，篩選步驟的操作依靠(i)展示在遺傳載體表面上的目的蛋白的活性；(ii)能夠識別標記目的蛋白的物質的蛋白；(iii)能夠結合目的蛋白的標記配體；或(iv)能夠與目的蛋白特異性結合的抗體，但不限于此。優(yōu)選地，通過能夠與目的蛋白結合的標記配體或能夠與目的蛋白特異性結合的抗體，將流式細胞儀用于篩選中。例如，一級抗體結合于展示在孢子表面上的目的蛋白，然后與標記有熒光化學物質的二級抗體反應以染色孢子，接著用熒光顯微鏡觀察或用流式細胞儀分析。如果二級抗體是金標記的，則能用電子顯微鏡觀察。通過測量由此蛋白催化的比色反應，利用目的蛋白的活性進行篩選。
在本發(fā)明制備表面展示的目的蛋白以及改進目的蛋白的方法中，優(yōu)選的是在所篩選的遺傳載體增殖后，具有所需特性的蛋白變體或編碼它們的基因得到回收。
根據(jù)利用孢子作為遺傳載體的一優(yōu)選實施方案，孢子回收的操作方式是通過控制培養(yǎng)時間，使目的蛋白在孢子表面上的展示最大化，其后培養(yǎng)終止，然后回收孢子。適當?shù)呐囵B(yǎng)時間是變化的，這取決于所用的細胞類型，例如在使用枯草芽孢桿菌作為宿主的情形下，優(yōu)選的培養(yǎng)時間為16-25小時。根據(jù)本領域一名技術人員已知的常規(guī)方法，更優(yōu)選renografin梯度方法(C.R.Harwood等，＂Molecular BiologicalMethods for Bacillus.＂John Wiley & Sons，New York，第416頁(1990))，可進行孢子回收。
改進蛋白的方法以高通量方式從野生型中提供(1)催化非生物反應的酶(例如第爾斯-阿爾德縮合)；(2)具有非自然立體選擇性或區(qū)域選擇性的酶；(3)在有機溶劑或有機溶劑-水溶液兩相體系中具有活性的酶；和(4)在極端條件如高溫或高壓下具有活性的酶。此外，為了選擇具有增強的結合親和性的抗體變體，通常是使pH突然發(fā)生變化或調整堿的濃度，從而洗脫變體。在利用噬菌體或細菌作為載體的方法中，這種洗脫條件有可能降低噬菌體或細菌在培養(yǎng)基中的生存力。然而，利用孢子表面展示系統(tǒng)改進蛋白的方法克服了這種障礙。
在本發(fā)明的進一步方面，提供了在遺傳載體表面上展示目的蛋白的載體，所述載體包含復制起點、抗生素抗性基因、限制性位點、編碼目的蛋白的基因，其中當目的蛋白在宿主細胞中表達時，其能夠與遺傳載體的表面形成非共價鍵。
根據(jù)一優(yōu)選實施方案，編碼目的蛋白的基因是一種突變基因，其增強遺傳載體表面和目的蛋白之間的非共價鍵。將編碼目的蛋白的基因突變成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；或(iv)將目的蛋白進行隨機誘變。
在本發(fā)明的進一步方面，提供了微生物轉化子，其特征在于轉化子的制備方法是用本發(fā)明載體轉化內含孢子或病毒的宿主細胞。根據(jù)一優(yōu)選實施方案，宿主細胞是一種突變細胞，其消除了胞內蛋白酶或胞外蛋白酶的產(chǎn)生，所述蛋白酶參與降解表面展示的目的蛋白。
在本發(fā)明的另一方面，提供了遺傳載體和目的蛋白之間的復合體，其特征在于復合體的制備是根據(jù)權利要求1所述的方法在遺傳載體表面上展示激素、激素類似物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白或其片段、抗體或其片段、單鏈抗體、結合蛋白或其片段、肽、抗原、粘著蛋白、結構蛋白、調節(jié)蛋白、毒素蛋白、細胞因子、轉錄調節(jié)蛋白、血液凝固蛋白和植物防衛(wèi)-誘導蛋白。
根據(jù)一優(yōu)選實施方案，目的蛋白是一種修飾蛋白，其修飾方法是(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；或(iv)將目的蛋白進行隨機誘變。
此外，本發(fā)明復合體可具有其它共價鍵以使遺傳載體表面和目的蛋白之間的鍵穩(wěn)定，其中使用物理、化學或生化方法形成共價鍵，接著通過非共價鍵在遺傳載體表面上展示目的蛋白。
在本發(fā)明復合體中，孢子是優(yōu)選的遺傳載體。如果孢子用作遺傳載體，孢子優(yōu)選的是非繁殖孢子，其獲得途徑是選自遺傳方法(PophamD.L.等，J.Bacteriol.，1816205-6209(1999))、化學方法(Setlow T.R.等，J.Appl.Microbiol.，89330-338(2000))和物理方法(Munakata N等，Photochem.Photobiol.，54761-768(1991))中的一種或多種。本發(fā)明復合體僅利用孢子作為目的蛋白的展示手段可排除繁殖孢子的必要性?？煽紤]的是經(jīng)遺傳工程改造的生物體有可能受到法律和規(guī)章的控制；因此非繁殖孢子是優(yōu)選的。造成孢子非繁殖的遺傳方法可通過缺失參與宿主細胞的孢子再生的基因來實施。例如，缺乏cwlD基因的枯草芽孢桿菌優(yōu)選用于本發(fā)明中。另外，孢子優(yōu)選衍生自突變的變體，所述變體通過選自物理方法(Wienc K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，562600-2605(1990))、化學方法和遺傳方法中的一種或多種增加了其凝集特性。具有增加的凝集特性的孢子可在以工業(yè)規(guī)模進行的生物轉化中從所得產(chǎn)物方便地分離出來。
在優(yōu)選的實施方案中，遺傳載體是噬菌體。
在本發(fā)明另一方面，提供了在其表面上展示目的蛋白變體的遺傳載體文庫，該文庫的制備方法包含下列步驟(a)通過突變編碼目的蛋白的基因，構建目的蛋白的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白變體；(e)通過在表達的蛋白變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以使變體展示在遺傳載體表面上，獲取遺傳載體文庫；和(f)篩選在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白變體的遺傳載體。
根據(jù)一優(yōu)選實施方案，遺傳載體是孢子或噬菌體。
在本發(fā)明的進一步方面，提供了利用具有轉化反應活性的蛋白來進行生物轉化的方法，其特征在于所述方法采用遺傳載體和目的蛋白之間的本發(fā)明復合體。能夠催化(生物)化學反應的任何蛋白包括酶和酶活性抗體，可用于此生物轉化中。
同時，利用表面展示的酶的生物轉化方法要求表面展示的遺傳載體在極端條件下的生理化學的穩(wěn)定性，這是因為所述方法通常在高溫和/或有機溶劑下進行。特別地，在當今工業(yè)中有價值的化學合成主要在有機溶劑中進行，以及手性化合物的合成或外消旋混合物的分辨也是在高度苛刻的生理化學條件下進行的。所以，表面展示的酶以及展示酶的生物體被迫在如此極端條件下具有穩(wěn)定性。就此而論，本發(fā)明利用表面展示的孢子或病毒的生物轉化方法顯示是大為有利的。
利用表面展示酶的化學方法已有人提出(Georgiou等，1993)。然而，這種方法一般要求細胞表面用交聯(lián)劑固定化，因為展示酶的宿主在此過程中很不穩(wěn)定(Freeman等，1996)。本發(fā)明生物轉化方法不含有上述的缺陷。由于表面展示的酶以及展示酶的遺傳載體大都穩(wěn)定，因此本發(fā)明方法避免了固定化。本發(fā)明生物轉化方法也可應用于任意類型的酶，如脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、糖基轉移酶、氧化還原酶和醛縮酶。此外，本發(fā)明方法在單步或多步反應以及水溶液或非水溶液中是有用的。本發(fā)明生物轉化方法采用遺傳載體作為游離或固定的形式，可采用其他微生物或酶來實施。
在本發(fā)明的進一步方面，提供針對脊椎動物抗原的抗體的生產(chǎn)方法，其特征在于所述方法包含給脊椎動物施用一種組合物，所述組合物含有免疫學上有效量的在遺傳載體和目的蛋白之間的本發(fā)明復合體。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)抗體的方法，組合物含有免疫學上有效量的復合體，優(yōu)選另包含佐劑，如不完全和完全弗氏佐劑。在本發(fā)明方法中，給藥可通過口服和靜脈內、腹膜內、皮下和肌內注射進行。第一次給藥后，在適當?shù)钠陂g內加強給藥是優(yōu)選的，以生成足夠量的抗體。
與DNA微陣列相似，蛋白質微陣列提供用于分析某些細胞中靶蛋白的表達或表達水平的手段。為了制造蛋白質陣列，必須獲得適當?shù)拇嚵械牡鞍?，然后固定于固相表面。在利用蛋白質陣列的分析過程中，清洗步驟必須進行以除去非結合的蛋白，以及各種處理如高溫、高鹽濃度和pH調節(jié)得以實施；所以，關鍵是保證擬蛋白物質在這種有害環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性。此外，制備蛋白質陣列的常規(guī)方法需要乏味和重復的工作，如克隆數(shù)千到數(shù)萬種蛋白的基因并且固定所表達的蛋白。所以，有需要對該工作的簡便和快速進行改進。
根據(jù)本發(fā)明蛋白質陣列的制備方法，上述工作可確保以更迅速的方式進行。在本發(fā)明方法中，將前述的本發(fā)明復合體或遺傳載體文庫固定于固相基底上。本發(fā)明蛋白質陣列的制備方法是使在其表面上展示目的蛋白的遺傳載體固定于固相基底上。在制備蛋白質陣列的方法中，可使用常規(guī)的方法(參見WO 0061806、WO 0054046、US 5807754、EP 0818467、WO 9742507、US 5114674和WO 9635953)。由本發(fā)明制造的蛋白質微陣列具有各種各樣的可應用領域，包括診斷、基因表達的分析、蛋白質之間相互作用的分析、蛋白和配體之間的相互作用的分析、代謝的研究、篩選新型或改進的酶、組合的生化合成和生物傳感器。
本發(fā)明方法中適當?shù)墓滔嗷装ǖ幌抻诓Ａ?例如，功能化的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO、SiN4、改性的硅氧烷硝化纖維素、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、聚苯乙烯(polystylene)、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龍、纖維及其組合。遺傳載體通過接頭分子可任選連接到陣列基底。陣列表面未被點擊的區(qū)域優(yōu)選加以封閉。施用到各個點(或地址)的遺傳載體的量依賴于陣列的種類。連接到固相基底的遺傳載體上展示的蛋白和所施加的樣品之間的相互作用可根據(jù)它們固有的特征(例如免疫原性)加以檢測或通過標記有獨立可檢測的標志(例如熒光、化學發(fā)光或放射分子和表位)給予檢測。利用已知的電腦化的系統(tǒng)如“讀數(shù)儀”和“掃描儀”對用本發(fā)明的蛋白質陣列所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行分析。
正如從本申請的所有說明中所了解的，本發(fā)明表面展示方法利用適合于所有本發(fā)明方法的遺傳載體，具有若干優(yōu)點(1)避免需要表面展示的基元；(2)確保目的蛋白具有其完整的活性，其作用方式是目的蛋白在表達后形成其固有的結構，并且展示在表面上；(3)增加目的蛋白表面展示的量，這是因為蛋白通過非共價鍵即以非選擇的方式加以展示；和(4)盡管表面展示的蛋白量得到增加，但是對遺傳載體的存活力和周圍環(huán)境的抗性沒有或很少有影響。
下列特定的實施例旨在說明本發(fā)明，不應理解成如所附權利要求所限定的那樣限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1對孢子表面展示純的分離的脂肪酶的確認胞質蛋白能否如以前報道的外被蛋白或結構蛋白(形態(tài)發(fā)生素)那樣結合和展示在孢子表面仍有待證實。根據(jù)孢子表面的疏水特性(Wiencek，K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，562600-2605(1990))，本發(fā)明人假設含有疏水區(qū)的蛋白如脂肪酶(Brockerhoff H.，Chem.Phys.Lipids，10215(1973))可通過疏水鍵連接并展示在孢子表面上。該假設的證實是在脂肪酶附著到從枯草芽孢桿菌中分離的純孢子上后測定其酶活性，該酶純化自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
首先，將枯草芽孢桿菌DB104菌株(Kawamura F.和Doi R.H.，J.Bacteriol.，160442-444(1984))在GYS培養(yǎng)基((NH4)2SO42g/l、酵母提取物2g/l、K2HPO40.5g/l、葡萄糖1g/l、MgSO4·H2O 0.41g/l、CaCl2·2H2O 0.08g/l、MnSO4·5H2O 0.07g/l)中搖床(37℃，250rpm)培養(yǎng)24小時，以及利用renografin梯度方法僅分離純化的孢子(C.R.Harwood等，＂Molecular Biological Methods for Bacillus.＂John Wiley &Sons，New York，第416頁(1990))。在顯微鏡下驗證純的分離的孢子(1000x，ALPHAPHOT-2，Nikon)。
將2mg純的分離的芽孢桿菌孢子和94μg部分純化的假單胞菌脂肪酶(Ahn，J.H.等，J.Bacteriol.，1811847-1852(1999))混合到2001的50mM Tris緩沖液(pH8.0)中，4℃下無攪動反應12小時，然后離心使孢子從緩沖液中分離出來。接著，分離的孢子用0.5ml的50mMTris緩沖液(pH8.0)漂洗三次，最后將脂肪酶附著的孢子進行純化。為了測定附著在孢子上的脂肪酶活性，將脂肪酶附著的孢子懸浮在添加有10％橄欖油的PBS緩沖液中反應48小時，上清液用0.2ml銅酸(cupric acid)處理，以及在715nm處測定最終的OD。上清液的結果顯示脂肪酶活性通過橄欖油從脂肪酶附著的孢子中釋放出來(圖2)。在圖2中，線(1)代表脂肪酶附著的孢子，線(2)代表無脂肪酶附著的對照，以及水平線是指脂肪酶活性的反應時間。
這些結果顯示由于疏水作用，脂肪酶僅能通過吸附結合到孢子表面。
這些結果舉例說明具有疏水性的任何蛋白都可展示在孢子上，本領域的那些技術人員應理解，當?shù)鞍自诩毎斜磉_或分泌到胞外時，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面上。
實施例2野生型脂肪酶在孢子表面上的展示對宿主細胞中表達的野生型脂肪酶的孢子展示進行如下檢查質粒pBSlipA(Bell P.J.L.等，Biotechnol.Lett.，211003-1006(1999))由澳大利亞的Bergquist博士贈送。利用lipl(SEQ ID NO1)和lip2(SEQ IDNO2)為引物及pBSlipA質粒為模板進行PCR。Taq聚合酶購自Boehringer Mannheim，PCR共35次循環(huán)，條件為94℃變性30秒、55℃退火30秒以及72℃延伸1分鐘。
然后，將各個擴增的PCR產(chǎn)物用BamHI和KpnI限制性酶切，并克隆到切去預先克隆的羧甲基纖維素酶基因后的質粒pCrylP-CMCase同樣的限制性位點中，并通過自然轉化方法(C.R.Harwood等，＂枯草芽孢桿菌的分子生物學方法(Molecular Biological methods forBacillus)＂John Wiley & Sons，New York，第416頁(1990))將該克隆的質粒轉化到枯草芽孢桿菌DB104中。在以實施例1相同的方式從轉化的芽孢桿菌菌株分離孢子后，測定純的分離的孢子中的脂肪酶活性(圖3)。在圖3中，線(1)代表展示有野生型脂肪酶的孢子，線(2)為對照孢子的結果，以及水平線是指脂肪酶活性的反應時間。這些結果顯示，利用本發(fā)明的孢子展示系統(tǒng)，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面。
該實施例中表達的脂肪酶的N-端含有分泌信號肽，導致胞外分泌。分泌的酶可附著到在孢子形成后暴露于培養(yǎng)基的孢子表面。此外，盡管存在分泌性信號肽，非分泌酶在孢子形成過程中由于疏水特性(Bron S.，J.Biotechnol.，64313(1998))也可附著到孢子表面上。
結果一目了然，具有疏水性的蛋白可展示到孢子表面，不管蛋白是胞內表達還是胞外分泌。
實施例3野生型羧甲基纖維素酶在孢子表面上的展示為了在孢子表面上展示羧甲基纖維素酶，將分離自枯草芽孢桿菌BSE616菌株的羧甲基纖維素酶基因(Park S.H.等，Agric.Biol.Chem.，55441-448(1991))克隆在蘇云金芽孢桿菌菌株的crylAa毒素基因的啟動子的控制之下。
首先，利用1AP1(SEQ ID NO3)和1AP2(SEQ ID NO4)為引物，通過Kalman S.等方法(Appl.Environ.Microbiol.，591131-1137(1993))從購自BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，Ohio，USA)的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillus thurigiensis kurstaki)HD1菌株中分離的DNA為模板，以實施例2相同的條件，由PCR擴增crylAa啟動子。將PCR產(chǎn)物克隆到購自Promega公司(USA)的載體pGemT-easy中，隨后用SphI和SalI消化，并克隆到質粒pUC19(GenBank X02514)同樣的限制性位點中。質粒pUC19再次用HindIII和BamHI限制性酶切割，并把所得的片段插入到pCPaC3(KCTC 0831BP)同樣的限制性位點中，由此構建pCrylP-CMCase。pCrylP-CMCase是一種穿梭載體，其在大腸桿菌和芽孢桿菌菌株中均可復制。
將最終構建的質粒pCrylP-CMCase通過自然轉化方法轉化到枯草芽孢桿菌DB104菌株中。其他方法如接合或轉導也可用于使重組載體導入到芽孢桿菌菌株中。其后，由pCrylP-CMCase轉化的芽孢桿菌菌株在GYS培養(yǎng)基中搖床(37℃，250rpm)培養(yǎng)24小時，并利用renografin梯度方法僅分離純的孢子。
對分離的孢子中的羧甲基纖維素酶活性進行如下測定首先，將100μl密度為OD(600nm)＝1.4的孢子懸浮液的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)與200μl的1％羧甲基纖維素的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)混合，然后50℃反應40分鐘。反應后，向反應溶液中加入900μl的DNS溶液(20％酒石酸鉀鈉、1％NaOH、0.05％NaHSO3、0.2％苯酚、1％3，5-二硝基水楊酸)，加熱5分鐘，然后在冷水中冷卻。離心后上清液的光密度在波長575nm處進行測定。與對照0mU比較，展示在孢子表面上的羧甲基纖維素酶的活性為1.96mU。
在另一確認方法中，當通過Kim等(Appl.Environ，Microbiol.，66788-793(2000))的方法利用羧甲基纖維素酶特異抗體(Kim等，Appl.Environ，Microbiol.，66788-793(2000))來操作流式細胞儀(FACSort，Becton Dickinson，USA)時，流式細胞儀也顯示在轉化有pCrylP-CMCase的芽孢桿菌菌株的孢子表面上展示羧甲基纖維素酶(圖4)。在圖4中，線1代表對照孢子，線2是指由pCrylP-CMCase轉化的芽孢桿菌菌株的孢子，垂直線表示孢子數(shù)，以及水平線為熒光強度。如圖4所示，與對照比較，在展示羧甲基纖維素酶的孢子中峰移向右邊，這說明有更多的特異于羧甲基纖維素酶的抗體結合在轉化有質粒pCrylP-CMCase的孢子表面上。結果，羧甲基纖維素酶附著在轉化有pCrylP-CMCase的孢子表面上。
該實施例中表達的羧甲基纖維素酶的N-端含有分泌信號肽，導致胞外分泌。雖然分泌的酶有可能附著到在孢子形成后暴露于培養(yǎng)基的孢子表面，但是非分泌酶盡管存在分泌性信號肽(Bron S.，J.Biotechnol.，64313(1998))，由于信號肽的疏水特性也可附著到孢子上。因此可以理解，任何具有分泌信號的蛋白通過本發(fā)明的孢子表面展示系統(tǒng)能在孢子表面上得以展示。
實施例4具有修飾的分泌信號的羧甲基纖維素酶的孢子展示N-端分泌信號肽一般包含N-端2-3個陽離子型氨基酸殘基，接著是疏水區(qū)，陽離子型氨基酸通過與細胞膜的陰離子磷脂結合使得蛋白分泌(Tjalsma H.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64515-547(2000))。另外，用中性氨基酸取代陽離子型氨基酸已知會導致分泌降低(Chen M.和Nagarajan V.，J.Bacteriol.，1765796-5801(1994))?；谏鲜鍪聦?，本發(fā)明人假設蛋白分泌的降低會增加胞內蛋白，并且由于蛋白的N-端疏水區(qū)，導致蛋白在孢子表面上更高的展示。為了試圖證明此假設，進行了如下實驗。
為了用僅含有疏水區(qū)而不含陽離子型氨基酸殘基的分泌信號克隆羧甲基纖維素酶，將法國巴斯德研究所(Pasteur Institute in France)的F.Kunst博士贈送的枯草芽孢桿菌168菌株的DNA(Nature，390249-256(1997))通過Kalman等方法分離。其后，利用引物cmc-hp(SEQ NO5)和另一引物(SEQ NO6)以及與實施例2同樣條件分離的DNA為模板進行PCR。
隨后，用BamHI和SacI消化PCR產(chǎn)物，并克隆到已切去CMCase基因的pCrylP-CMCase中。通過自然轉化方法，將pCrylP-CMCase-hp(圖5)轉化到枯草芽孢桿菌DB104中。所得轉化子命名為“枯草芽孢桿菌BSK209”，于2000年12月2日保藏在國際保藏機構韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC 0902BP。SEQ ID NO7是指在其信號肽中缺乏陽離子型氨基酸的CMCase的DNA序列，而SEQID NO8是指其CMCase的氨基酸序列。
然后，將轉化的芽孢桿菌菌株BSK209培養(yǎng)在搖床(37℃，250rpm)中，并通過renografin梯度方法分離純的孢子。
與對照0mU比較，以實施例3所述的同樣方法，分離孢子的羧甲基纖維素酶活性為4.74mU。該結果比野生型高出2.4倍，并顯示比野生型有更多的酶得到展示。此外，以實施例3的同樣方式，流式細胞儀利用羧甲基纖維素酶，顯示有更多的酶展示在轉化有pCrylP-CMCase-hp的芽孢桿菌菌株的孢子表面上(圖6)。
在圖6中，線1是指對照孢子，而線2是用質粒pCrylP-CMCase-hp轉化的芽孢桿菌菌株的孢子。如圖6所示，與圖4所示的野生型羧甲基纖維素酶比較，峰移向右邊，這顯示有更多的羧甲基纖維素酶結合到孢子表面。結果，其分泌信號僅含疏水區(qū)而不含陽離子殘基的羧甲基纖維素酶是孢子展示的中意形式。
從這些結果中可以理解，N-端陽離子信號氨基酸的缺失或中和在孢子展示中可利用來得到更多的便利。此外，信號肽的疏水區(qū)或其他不含信號肽的目的蛋白的疏水區(qū)顯然可用于孢子展示。再者，通過選擇性或隨機誘變編碼遺傳載體表面蛋白的基因，或通過融合其他增強載體蛋白和目的蛋白之間的非共價鍵合的寡肽或多肽，疏水性增加，顯然也會在孢子表面上增強目的蛋白的展示。
實施例5利用離子結構域進行孢子表面展示羧甲基纖維素酶如實施例1所示，盡管芽孢桿菌的孢子表面是疏水的，但是也有陰離子型氨基酸殘基(Nishihara T.等，Microbiol.Immunol.，25763771(1981))。本發(fā)明人假設目的陽離子蛋白可由離子鍵展示，而陽離子基元融合到無陽離子特性的目的蛋白將能在孢子表面上展示目的蛋白。為了試圖證實這種假設，實施了如下實例。
為了使陽離子結構域融合到羧甲基纖維素酶上，利用下列引物將6個組氨酸殘基融合到酶的成熟形式的N-端。首先，利用引物cmc-his(SEQ ID NO9)和引物cmc-ter(SEQ ID NO10)以及枯草芽孢桿菌168的DNA為模板在與實施例2相同的條件下進行PCR。
隨后，PCR產(chǎn)物用BamHI和SacI限制性酶切，并克隆到實施例3所述的pCrylP-CMCase而非CMCase基因中。把構建的質粒pCrylP-CMCase-his(圖7)通過自然轉化方法轉化到枯草芽孢桿菌DB104中。SEQ ID NO11是指在其N-端區(qū)域融合有6個組氨酸殘基的CMCase的基因序列，而SEQ No.12是指其氨基酸序列。
然后，將轉化有pCrylP-CMCase-his的芽孢桿菌菌株培養(yǎng)在搖床(37℃，250rpm)中，并通過renografin梯度方法分離純的孢子。
以實施例3所述的相同方法，與對照0mU比較，分離孢子的羧甲基纖維素酶活性為1.90mU，以及利用羧甲基纖維素酶特異的抗體以實施例3相同的方式操作流式細胞儀，顯示酶展示在用pCrylP-CMCase-his轉化的芽孢桿菌菌株的孢子表面上(圖8)。
在圖8中，線1是指對照孢子，線2代表用質粒pCrylP-CMCase-his轉化的芽孢桿菌菌株的孢子。如圖8所示，與對照比較，峰移至右邊，這表明有更多的特異于羧甲基纖維素酶的抗體結合于孢子表面。這些結果顯示其N-端含有其他陽離子結構域的羧甲基纖維素酶結合于轉化有pCrylP-CMCase-his的芽孢桿菌的孢子表面。
所以，通過選擇性或隨機誘變基因或通過與任何蛋白中的陽離子結構域融合，陽離子特性增加顯然會增強孢子展示。此外，融合其他寡肽或多肽，增強遺傳載體表面蛋白和目的蛋白之間的非共價鍵，或通過選擇性或隨機誘變編碼遺傳載體表面蛋白的基因，增加陰離子特性，會提高孢子表面展示陽離子目的蛋白。
根據(jù)實施例的結果，顯示通過融合其他序列增加表面展示，可以想象的是把結合配偶體如抗體-抗原或配體-受體融合到目的蛋白和遺傳載體表面蛋白有助于表面展示。
另應理解，通過戊二醛、紫外線或酶處理，催化共價鍵的形成，由此在遺傳載體表面蛋白和目的蛋白之間形成其他共價鍵，所展示的目的蛋白會更加得以穩(wěn)定。
實施例6在噬菌體表面上展示目的蛋白根據(jù)上述實施例所證實的事實和發(fā)現(xiàn)，能夠與噬菌體的外被蛋白結合的目的蛋白可展示在噬菌體表面上是一目了然的。這種可能性證實如下而且，不能結合于噬菌體表面的目的蛋白通過融合能結合于外被蛋白的基元可在噬菌體表面上加以展示，這也是很有可能的。
首先，把疏水結構域融合到噬菌體的外被蛋白和目的蛋白上。此外，還融合向胞質分泌的信號肽。當它們在宿主細胞中表達時，所分泌的目的蛋白通過與位于胞質中的噬菌體的外被蛋白疏水作用，在噬菌體表面上得以展示。
根據(jù)此實施例中的發(fā)現(xiàn)，通過其他鍵合而非疏水作用能夠展示的修飾對本領域那些技術人員來說是一目了然的。
實施例7利用在遺傳載體上的展示方法定向進化目的蛋白利用本發(fā)明中設計的展示系統(tǒng)，有可能實施目的蛋白的定點進化，其中表面展示由目的蛋白和遺傳載體表面之間的相互作用來實現(xiàn)。首先，以羧甲基纖維素酶基因為模板進行易錯PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，228-33(1992))。采用特異于羧甲基纖維素酶基因的引物和以實施例3中所述的質粒pCPaC3為模板，進行PCR。
PCR混合物的制備方法是混合0.3μM各種引物、5ng DNA模板、PCR溶液(10mM Tris(pH 8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v)明膠)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mM MnCl2、5 U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸餾水補至100μl。在下列條件下共進行13個循環(huán)的PCR94℃變性30秒、50℃退火30秒以及72℃延伸1分鐘。
隨后，將上述PCR擴增的插入片段克隆到可復制載體中，并通過自然轉化方法用克隆的載體轉化枯草芽孢桿菌DB104，以及通過在搖床中培養(yǎng)轉化的芽孢桿菌菌株24小時，將羧甲基纖維素酶在孢子表面上得以展示，并通過renografin梯度方法分離純的孢子。其后，如實施例3所述，利用羧甲基纖維素酶活性的變化或采用特異于羧甲基纖維素酶的抗體的流式細胞儀的變化，對具有改性羧甲基纖維素酶的孢子加以選擇。
實施例8利用遺傳載體表面展示目的蛋白進行生物轉化利用有機溶劑中的脂肪酶進行生物轉化已有報道(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.823192(1985)；和Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16354(1986))。沒有酶的失活對實施反應是必不可少的。為了達到此目的，按慣例一直采用脂肪酶的固定(Mustranta，A.Forssell等，Enz.Microb.Technol.，15133(1993)；和Reetz，M.T.等，J.Biotechnol.Biogen.，49527(1996))。根據(jù)這些報道，固定的脂肪酶在有機溶劑中保持高的穩(wěn)定性，并與游離的脂肪酶比較，合成增加。
首先，根據(jù)本發(fā)明將脂肪酶展示孢子的表面上，以及如所述進行生物轉化(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.823192(1985)；Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16；354(1986))。
本發(fā)明的生物轉化也可通過在抗有機溶劑的病毒表面上展示目的蛋白來進行。
實施例9利用遺傳載體上表面展示的目的蛋白的蛋白質陣列采用自動化陣列裝置，將106-109個展示抗特異表面抗原的單克隆抗體的孢子附著到玻璃基底上用于在其表面上含有醛官能團的蛋白質陣列(BMS，Germany)。附著以共價鍵的形式進行，所述共價鍵是孢子表面上蛋白的氨基和載玻片表面上的醛基之間的席夫堿。雖然在固相表面上附著的展示蛋白有可能是失活的，但它們可具有方向性。
根據(jù)本發(fā)明制造的蛋白質陣列試劑盒具有各種各樣的應用領域，包括診斷、基因表達的分析、蛋白質之間相互作用的分析、蛋白和配體之間的相互作用的分析、代謝的研究、篩選新型或改進的酶、組合的生化合成和生物傳感器。
實施例10利用遺傳載體上表面展示的目的蛋白生產(chǎn)抗體通過展示能夠體內誘導免疫應答的抗原，抗體可被誘導。
首先，通過自然轉化方法，將實施例3中所用的含有羧甲基纖維素酶的pCrylP-CMCase作為抗原轉化到枯草芽孢桿菌DB104中。然后，通過在補充有GYS培養(yǎng)基的搖床中培養(yǎng)轉化的芽孢桿菌菌株24小時，將羧甲基纖維素酶展示在孢子表面上。隨后，通過renografin梯度方法分離純的孢子。將抗原-展示的孢子重懸浮于PBS中，并加入相同體積的佐劑。其后，通過旋渦混合上述溶液，并靜脈內注射到出生后6-8周齡的BALB/c小鼠中。4周后，進行第二次注射。通過2-3次加強誘導抗體。
實施例11利用遺傳載體上表面展示的目的蛋白分離特異物質利用遺傳載體展示結合區(qū)從混合物中分離特異物質是可能的。首先，采用編碼結合區(qū)的基因作為模板進行易錯PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，228-33(1992))。利用特異于目的基因的引物以及含有目的基因或染色體的質粒模板，進行PCR。PCR混合物的制備方法是混合0.3μM各種引物、5ng DNA模板、PCR溶液(10mM Tris(pH 8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v)明膠)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mMMnCl2、5 U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸餾水補至100μl。在下列條件下共進行13個循環(huán)的PCR94℃變性30秒、50℃退火30秒以及72℃延伸1分鐘。
隨后，將上述PCR擴增的插入片段克隆到可復制的載體中以在宿主細胞中構建文庫。用克隆載體文庫轉化宿主細胞，使結合區(qū)在宿主細胞中表達并在遺傳載體表面上展示，并對具有目標特性的載體展示修飾的結合區(qū)進行篩選。通過與混合物混合，將篩選的遺傳載體分離、繁殖、表達并用于分離特異物質。
如上所述，本發(fā)明方法用于制備在遺傳載體上表面展示的目的蛋白，可用來在缺乏展示基元的情況下在遺傳載體表面上展示各種各樣的蛋白，目的蛋白在形成其固有結構后，由于展示可獲取完全的活性，并且目的蛋白表達和展示的量的增加從來不降低對環(huán)境的抗性和遺傳載體的生存力。
參考文獻1.Agterberg，M.，Adriaanse，H.和Tommassen，J.利用外膜蛋白PhoE作為載體用于把外源抗原決定簇轉運到大腸桿菌(Escherichiacoli)K-12的細胞表面上。Gene 59145-150(1987)2.Agterberg，M.，Adriaanse，H.，van Bruggen，A.，Karperien，M.和Tommassen，J.大腸桿菌K-12的外膜PhoE蛋白作為暴露載體可能性和限制。Gene 883745(1990)3.Arnold，F(xiàn).H.和Volkov，A.A.生物催化的定向進化。Curr.Opin.Chem.Biol.354-59(1999).
4.Charbit，A.，Molla，A.，Saurin，W.和Hofnung，M.用于在革蘭氏陰性細菌的表面上表達外源多肽的載體的多樣性。Gene 70181-189(1988)5.Charbit，A.，Sobczak，E.，Michel，M.-L.，Molla，A.，Tiollais，P.和Hofnung，M.將乙型病毒的preS2區(qū)的兩個表位在活的重組細菌上呈遞。J.Immunol 13916441658(1987)6.Chiswell，D.J.和McCafferty，J.噬菌體抗體新“多克隆抗體”會取代單克隆抗體嗎？TIBTECH 1080-84(1992)7.Daugherty，P.S.，Chen G.，Olsen，M.J.，Iverson，b.L.，Georgiou，G.利用細菌表面展示的抗體親和性成熟。Protein Eng.11825-832(1998)8.d′Enfert，C.，Ryter，A.和Pugsley，A.P.在大腸桿菌中克隆和表達肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因用于載脂蛋白普魯蘭酶的生產(chǎn)、細胞表面定位和分泌。EMBO J.63531-3538(1987)9.Driks，A.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)芽孢外被。Microbiol.Mol.Biol.Rev.63(1)1-20(1999)10.Ferguson，M.A.J.和Williams，A.F.通過糖基磷脂酰肌醇結構對蛋白進行細胞表面錨定。Ann.Rev.Biochem.57285-320(1988)11.Fischetti，V.A.，Medaglini，D.，Oggioni，M.和Pozzi，G.外源蛋白在革蘭氏陽性共生細菌上的表達用于粘膜疫苗遞送。Curr.Opin.Biotechnol.4603-610(1993)12.Francisco，J.A.，Earhart，C.F.和Georgiou，G.把b-內酰胺酶轉運和錨定到大腸桿菌的外部表面上。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)13.Freeman，A.，Abramov，S.，和Georgiou G.展示表面錨定的β-內酰胺酶的大腸桿菌細胞的位點保護的固定和固定化。Biotechnol.Bioeng.62(2)155-159(1999).
14.Fuchs，P.，Breitling，F(xiàn).，Dubel，S.，Seehaus，T.和Little，M.將重組抗體靶擊到大腸桿菌的表面與肽聚糖相關的載脂蛋白的融合。Bio/Technology 91369-1372(1991)15.Georgiou，G.利用流式細胞儀分析大的蛋白突變體的文庫。Adv.Protein Chem.55293-315(2000).
16.Georgiou，G.，Poetschke，H.L.，Stathopoulos，C.和Francisco，J.A.改造革蘭氏陰性細菌1細胞表面的實際應用。TIBTECH 116-10(1993)17.Georgiou，G.，Stathopoulos，C.，Daugherty，P.S.，Nayak，A.R.，Iverson，B.L.和Curtiss III，R.異源蛋白在微生物表面上的展示從組合文庫的篩選到活的重組疫苗。Nature Biotechnology 1529-34(1997)18.Georgiou，G.，Stephens D.，Stathopoulos，C.，Poetschke H.L.，Mendenhall J.和Earhart C.F.在大腸桿菌表面上展示b-內酰胺酶由Lpp′-OmpA′-b-內酰胺酶融合賦予外膜表型。Protein Eng.9239-247(1996)19.Hedegaard，L.和Klemm，P.大腸桿菌的1型傘作為異源抗原序列的載體。Gene 85115-124(1989)20.Jung，H.C.，Lebeault，J.M.和Pan，J.G.通過利用丁香假單胞菌(Pseudomonas syringe)的冰核蛋白來表面展示運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)左聚糖蔗糖酶(levansucrase)。Nature Biotechnol.16576-580(1998a).
21.Jung，H.C.，Park，J.H.，Park，S.H.，Lebeault，J.M.和Pan，J.G.利用丁香假單胞菌(Pseudomonas syringe)冰核蛋白在大腸桿菌表面上表達羧甲基纖維素酶。Enzyme Microb.Technol.16576-580(1998b).
22.Kim，E.J.和Yoo，S.K.利用冰核蛋白在大腸桿菌上細胞表面展示CD8外結構域。Biotechnol.Tech.12197-201(1998).
23.Kim，E.J.和Yoo，S.K.利用丁香假單胞菌(Pseudomonassyringe)冰核蛋白在大腸桿菌上細胞表面展示乙型病毒表面抗原。Lett.Appl.Microbiol.29292-297(1999).
24.Kim，Y.S.，Jung，H.C.和Pan，J.G.細菌細胞表面展示酶文庫用于選擇性篩選改進的纖維素酶變體。Appl.Environ.Microbiol.66788-793(2000).
25.Kwak，Y.D.，Kim，E.J.和Yoo，S.K.通過利用冰核蛋白在大腸桿菌上細胞表面展示人免疫缺陷病毒I型gpl20。Clinic.Diag.Lab.Immun.6499-503(1999).
26.Klauser，T.，Kramer，J.，Otzelberger，K.，Pohlner，J.和Meyer，T.F.奈瑟球菌Iga-核心的表征用于外膜靶擊和胞外蛋白分泌的必要單元。J.Mol.Biol.234579-593(1993)27.Klauser，T.，Pohlner，J.和Meyer，T.F.利用奈瑟球菌IgA蛋白酶-結構域胞外轉運霍亂毒素B亞基構型依賴的外膜易位。EMBO J.91991-1999(1990)28.Kornacker，M.G.和Pugsley，A.P.當普通周質的酶-內酰胺酶與細胞表面酶普魯蘭酶融合時可使其特異和有效地通過大腸桿菌外膜進行移位。Mol.Microbiol.4(7)1101-1109(1990)29.Lee，J.S.，Shin，K.S.，Pan，J.G.和Kim，C.J.Nature Biotechnol.18645-648(2000)30.Lewis P.J.和Errington J.利用綠色熒光蛋白對在枯草芽孢桿菌的孢子形成過程中細胞特異的基因表達和亞細胞蛋白定位進行檢測。Microbiology 142733-740(1996)31.Little，M.，F(xiàn)uchs，P.，Breitling，F(xiàn).和Dubel，S.細菌表面呈遞蛋白和肽一種噬菌體展示技術的替代。TIBTECH 113-5(1993)32.Martineau，P.，Charbit，A.，Leclerc，C.，Werts，C.，O′Callaghan，D.和Hofnung，M.引出和監(jiān)控抗肽抗體的無需肽合成的遺傳系統(tǒng)。Bio/Technology 9170-172(1991)33.Newton，S.M.，Jacob，C.O.和Stocker，B.A.D.對插入到沙門氏菌鞭毛蛋白中的霍亂毒素表位的免疫應答。Science 24470-72(1989)34.Ochs，M.，Angerer，A.，Enz，S.和Braun，V.表面信號在大腸桿菌的檸檬酸鐵轉運系統(tǒng)中的轉錄調節(jié)突變分析或選的σ因子FecI支持其在fee轉運基因轉錄中的必要作用。Mol.Gen.Genet.250455-465(1996)35.Palva，A.M.和Palva，I.A.利用表面蛋白基因序列的乳桿菌表達系統(tǒng)，W094/00581(1994).
36.Richins，R.D.，Kaneva，I.，Mulchandani，A.，和Chen，W.通過表面展示的水解酶生物降解有機磷殺蟲劑。Nature Biotechnol.15984-987(1997).
37.Samuelson，P.，Hansson，M.，Ahlborg，N.，Androoni，C.，Gotz，F(xiàn).，Bachi，T.，Nguyen，T.N.，Binz，H.，Ulhen，M.和Stahl，S.在肉葡萄球菌(Stapholococcus carnosus)上細胞表面展示重組蛋白。J.Bacteriol.177(6)1470-1476(1995).
38.Samuelson，P.，Wernerus，H.，Svedberg，M.和Stahl S.葡萄球菌表面展示金屬結合的聚組氨酰肽。Appl.Envir.Microbiol.661243-1248(2000).
39.Schreuder，M.P.，Mooren，A.T.A.，Toschka，H.Y.，TheoVerrips，C.和Klis，F(xiàn).M.酵母細胞表面上的固定化。TIBTECH 14115-120(1996).
40.Schulz，G.E.細菌孔蛋白結構和功能。Curr.Opin.Cell Biol.5701-707(1993)41.Sleytr，U.B.和Sara，M.細菌l和archaeal S-層蛋白結構-功能關系及其生物技術的應用。TIBTECH 151-9(1997)42.Stathopoulos，C.，Georgiou G.，和Earhart C.F.表達位于外膜中的Lpp′OmpA(46-159)-PhoA融合蛋白的大腸桿菌的鑒別。Appl.Microbiol.Biotechnol.45(12)112-119(1996).
43.Sousa，C.，Cebolla，A.，和de Lorenzo，V.增強的展示聚組氨酸肽的細菌細胞的金屬吸附。Nature Biotechnol.141017-1020(1996).
44.Sousa，C.，Kotrba，P.，Ruml，T.Cebolla，A.，和de Lorenzo，V.通過大腸桿菌展示酵母的金屬吸附和錨定于外膜蛋白LamB的哺乳動物金屬硫蛋白。Bacteriol.1802280-2284 (1998).
45.Taylor，I.M.，Harrison，J.L.，Timmis，K.N.和O′Conor，C.D.TraT載脂蛋白作為媒介物用于把外源抗原決定簇轉運到大腸桿菌K12的細胞表面TraT蛋白的結構-功能關系。Mol.Microbiol.4(8)1259-1268(1990)46.Webb，C.D.，Decatur A.，Teleman A.和Losick R.利用綠色熒光蛋白目測細胞特異基因表達以及在枯草芽孢桿菌的孢子形成過程中亞細胞蛋白的定位。J.Bacteriol.1775906-5911(1995)47.Zheng L和Losick R.，級聯(lián)調節(jié)孢子外被基因在枯草芽孢桿菌中的表達。J.Mol.Biol.212645-660(1990)
SEQ ID NO50和51分別顯示麻風分枝桿菌硫氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶的核苷酸序列和編碼的蛋白質。
SEQ ID NO52-313描述于表5中。
表5
<p>序列表<110> 格諾福庫斯株式會社(GENOFOCUS Co.，Ltd.)<120> 在遺傳載體上表面展示蛋白的方法(Method for Surface Display of Proteins on Genetic Carriers)<130> SCT03 1940-47<150> KR2001-2156<151> 2001-01-15<160> 12<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對脂肪酶基因進行PCR的有義引物<400> 1ggggatccgt tggaaggaga gggagaac 28<210> 2<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對脂肪酶基因進行PCR的反義引物<400> 2gcggtacctt tttgtccgtt ctcctga 27<210> 3<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對cry1Aa啟動子進行PCR的有義引物<400> 3tccccgcggg actcttccta tatttactt 29<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對cry1Aa啟動子進行PCR的反義引物<400> 4atttgtacag gaaatgcgtc 20<210> 5<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對突變CMCase基因進行PCR的有義引物<400> 5ggatccgggg aggagaatca tgatctctat ttttattacg tg42<210> 6<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 對突變CMCase基因進行PCR的反義引物<400> 6gagctccagt atttcatcca caacgc 26<210> 7<211> 1491<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 含有突變的信號序列以增強其疏水性的CMCase基因<220><221>CDS<222>(1)..(1488)<400>7atg atc tct att ttt att acg tgt tta ttg att acg tta ttg aca atg48Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met1 5 10 15ggc ggc atg ctg gct tcg ccg gca tca gca gca ggg aca aaa acg cca96Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro20 25 30gta gcc aag aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac144Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn35 40 45cga gac ggt aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg192Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu50 55 60caa tgg tat gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg240Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg65 70 75 80gac gat tgg ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat288Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp85 90 95ggc ggt ata att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg336Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala100 105 110gtt gaa gcg gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat384Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu 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權利要求
1.一種制備在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的方法，其包括下列步驟(a)用含有編碼目的蛋白基因的載體轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(b)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白；和(c)使表達蛋白和遺傳載體表面之間形成非共價鍵，以便目的蛋白展示在遺傳載體表面上。
2.一種改進目的蛋白的方法，其包括下列步驟(a)通過突變編碼目的蛋白的基因，構建目的蛋白的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白的變體；(e)通過在表達的蛋白變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以便使變體展示在遺傳載體表面上，從而獲取遺傳載體文庫；和(f)篩選在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白變體的遺傳載體。
3.一種從混合物中分離目的物質的方法，其包括下列步驟(a)通過突變編碼作為目的蛋白的結合蛋白或結合區(qū)的基因，構建編碼結合蛋白變體或其結合區(qū)的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達結合蛋白或結合區(qū)的變體；(e)通過在表達的結合蛋白變體或結合區(qū)變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以使變體展示在遺傳載體表面上，從而獲取遺傳載體文庫；(f)將遺傳載體文庫與預定的物質接觸，并通過選擇在其表面上展示結合預定物質的變體來篩選改進的結合蛋白或其結合區(qū)；和(g)將在其表面上展示改進的結合蛋白或其結合區(qū)的遺傳載體與混合物接觸以從混合物中分離目的物質。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中目的蛋白選自激素、激素類似物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白或其片段、抗體或其片段、單鏈抗體、結合蛋白或其片段、肽、抗原、粘著蛋白、結構蛋白、調節(jié)蛋白、毒素蛋白、細胞因子、轉錄調節(jié)蛋白、血液凝固蛋白和植物防衛(wèi)-誘導蛋白。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中結合蛋白或其結合區(qū)為抗體或其抗體結構域。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中結合蛋白或其結合區(qū)為抗體或其抗體結構域。
7.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中結合蛋白或結合區(qū)選自蛋白酶抑制劑、芥菜素、腸毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、水蛭蛋白酶抑制劑、卵類粘蛋白、天青蛋白、腫瘤壞死因子和CD4。
8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中結合蛋白或結合區(qū)選自蛋白酶抑制劑、芥菜素、腸毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、水蛭蛋白酶抑制劑、卵類粘蛋白、天青蛋白、腫瘤壞死因子和CD4。
9.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中結合蛋白為單體或多聚體。
10.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中結合蛋白為單體或多聚體。
11.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中目的蛋白是一種修飾蛋白，其增強與遺傳載體的非共價鍵。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中目的蛋白的修飾方法有(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；或(iv)將目的蛋白進行隨機誘變。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中缺失一部分目的蛋白的氨基酸的操作是使離子型氨基酸從目的蛋白的N-端序列中缺失。
14.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中融合寡肽是陽離子型肽。
15.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中遺傳載體具有修飾的表面蛋白，以增強與目的蛋白的非共價鍵。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中遺傳載體的修飾方法有(i)將寡肽或多肽與遺傳載體表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增強了目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(ii)使遺傳載體表面蛋白進行定點誘變；或(iii)將遺傳載體表面蛋白進行隨機誘變。
17.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中內含孢子的宿主選自孢子形成革蘭氏陰性菌、孢子形成革蘭氏陽性菌、孢子形成放線菌(Actionmycete)、孢子形成酵母和孢子形成真菌。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中孢子形成革蘭氏陽性細菌選自梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)和芽孢桿菌(Baeillus)。
19.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中芽孢桿菌選自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。
20.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中病毒是噬菌體。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中噬菌體位于宿主細胞的周質，以及目的蛋白結合于噬菌體的表面。
22.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中宿主細胞一種突變細胞，其消除了胞內蛋白酶或胞外蛋白酶的產(chǎn)生，所述蛋白酶參與降解表面展示的目的蛋白。
23.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中篩選步驟的操作方式是將孢子文庫用選自有機溶劑、熱、酸、堿、氧化劑、干燥、表面活性劑和蛋白酶中的一種或多種進行處理，然后對在其表面上展示目的蛋白變體、具有處理抗性的孢子加以選擇。
24.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中遺傳載體是孢子，以及篩選步驟的操作方式是將孢子文庫用選自有機溶劑、熱、酸、堿、氧化劑、干燥和表面活性劑中的一種或多種首先進行處理，接著用蛋白酶進行二次處理，然后對在其表面上展示目的蛋白變體、具有蛋白酶抗性的孢子加以選擇。
25.根據(jù)權利要求1所述的方法，其進一步包括對在其表面上展示目的蛋白的遺傳載體進行篩選的步驟。
26.根據(jù)權利要求2、3或25所述的方法，其中篩選步驟的操作依靠(i)展示在遺傳載體表面上的目的蛋白的活性；(ii)能夠識別標記目的蛋白的物質的蛋白；(iii)能夠結合目的蛋白的標記配體；或(iv)能夠與目的蛋白特異性結合的抗體。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中篩選采用能夠結合于目的蛋白的標記配體或能夠特異性結合于目的蛋白的抗體，由流式細胞儀來實施。
28.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其還包括使遺傳載體表面和目的蛋白之間的鍵穩(wěn)定的步驟，所述穩(wěn)定步驟的操作途徑是使用物理、化學或生化方法在遺傳載體表面和目的蛋白之間形成共價鍵，接著通過非共價鍵在遺傳載體表面上展示目的蛋白。
29.根據(jù)權利要求28所述的方法，其中形成共價鍵的化學法是戊二醛處理，物理法是紫外線處理，以及生化法是酶處理，以確保共價鍵的形成。
30.一種用于在遺傳載體表面上展示目的蛋白的載體，其包括復制起點、抗生素抗性基因、限制性位點、編碼目的蛋白的基因，其中當目的蛋白在宿主細胞中表達時，其能夠與遺傳載體表面形成非共價鍵。
31.根據(jù)權利要求30所述的載體，其中編碼目的蛋白的基因是一種突變基因，以增強遺傳載體表面和目的蛋白之間的非共建鍵。
32.根據(jù)權利要求31所述的載體，其中將編碼目的蛋白的基因突變成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；或(iv)將目的蛋白進行隨機誘變。
33.一種微生物轉化子，其特征在于轉化子的生產(chǎn)方法是用根據(jù)權利要求30-32中任一項所述的載體轉化內含孢子或病毒的宿主細胞。
34.根據(jù)權利要求33所述的轉化子，其中宿主細胞是一種突變細胞，以消除胞內蛋白酶或胞外蛋白酶的產(chǎn)生，所述蛋白酶參與降解表面展示的目的蛋白。
35.一種遺傳載體和目的蛋白之間的復合體，其特征在于復合體的制備方法是根據(jù)權利要求1所述的方法在遺傳載體表面上展示激素、激素類似物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白或其片段、抗體或其片段、單鏈抗體、結合蛋白或其片段、肽、抗原、粘著蛋白、結構蛋白、調節(jié)蛋白、毒素蛋白、細胞因子、轉錄調節(jié)蛋白、血液凝固蛋白或植物防衛(wèi)-誘導蛋白。
36.根據(jù)權利要求35所述的復合體，其中目的蛋白是一種修飾蛋白，修飾方法有(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)將寡肽或多肽與(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增強目的蛋白與遺傳載體之間的非共價鍵；(iii)將目的蛋白進行定點誘變；或(iV)將目的蛋白進行隨機誘變。
37.根據(jù)權利要求35所述的復合體，其中復合體具有其他共價鍵以使遺傳載體表面和目的蛋白之間的鍵穩(wěn)定，其中共價鍵的形成是采用物理、化學或生化方法，接著通過非共價鍵在遺傳載體表面上展示目的蛋白。
38.根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的復合體，其中遺傳載體為孢子。
39.根據(jù)權利要求38所述的復合體，其中孢子是非再生孢子，其是通過選自遺傳方法、化學方法和物理方法中的一種或多種獲得的。
40.根據(jù)權利要求39所述的復合體，其中使孢子成為非再生性的遺傳方法是通過缺失參與宿主細胞的孢子再生的基因來進行的。
41.根據(jù)權利要求38所述的復合體，其中孢子衍生自變變體，以通過選自遺傳方法、化學方法或物理方法中的一種或多種來增加其凝集特性。
42.根據(jù)權利要求35所述的復合體，其中目的蛋白為單體或多聚體。
43.根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的復合體，其中遺傳載體是噬菌體。
44.一種在其表面上展示目的蛋白變體的遺傳載體文庫，其制備方法包含下列步驟(a)通過突變編碼目的蛋白的基因，構建目的蛋白的基因文庫；(b)制備含有構建的基因文庫的載體文庫；(c)用載體文庫轉化內含選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(d)培養(yǎng)轉化的宿主細胞并在宿主細胞中表達目的蛋白的變體；(e)通過在表達的蛋白變體和遺傳載體表面之間形成非共價鍵以使變體展示在遺傳載體表面上，從而獲取遺傳載體文庫；和(f)篩選在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白變體的遺傳載體。
45.根據(jù)權利要求44所述的遺傳載體文庫，其中遺傳載體為孢子。
46.根據(jù)權利要求44所述的遺傳載體文庫，其中遺傳載體為噬菌體，以及目的蛋白變體為結合蛋白或結合區(qū)的變體。
47.一種利用具有轉化反應活性的蛋白進行生物轉化的方法，其特征在于該方法采用根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的遺傳載體和目的蛋白之間的復合體。
48.根據(jù)權利要求47所述的方法，其中具有轉化反應活性的蛋白為酶或抗體。
49.一種生產(chǎn)針對脊椎動物抗原的抗體的方法，其特征在于該方法包括給脊椎動物施用一種組合物，所述組合物含有免疫有效量的根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的遺傳載體和目的蛋白之間的復合體。
50.一種蛋白微陣列，其包括固相基底和固定到所述基底上的物質，其特征在于固定到基底上的物質選自根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的遺傳載體和目的蛋白之間的復合體以及根據(jù)權利要求44-46中任一項所述的遺傳載體文庫。
全文摘要
本發(fā)明涉及在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的制備方法，目的蛋白的改進方法，目的物質的分離、生物轉化以及生產(chǎn)抗體的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及在遺傳載體上表面展示的目的蛋白的制備方法，其包含下列步驟(a)用含有編碼目的蛋白基因的載體轉化內有選自孢子和病毒的遺傳載體的宿主細胞；(b)培養(yǎng)轉化的宿主細胞和在宿主細胞中表達目的蛋白；和(c)讓表達蛋白和遺傳載體表面之間形成非共價鍵，從而目的蛋白展示在遺傳載體表面上。
文檔編號C12N7/00GK1486328SQ02803752
公開日2004年3月31日 申請日期2002年1月15日 優(yōu)先權日2001年1月15日
發(fā)明者潘在龜, 崔樹根, 鄭興采 申請人:格諾福庫斯株式會社