專利名稱：分選細胞的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及分選細胞的方法及裝置，特別是涉及使用受控的能量源修飾所關 注的細胞群的方法及裝置，方式是選擇性地去除、富集或改變該群中的細胞、病毒或微粒。
背景技術：
流式細胞分選可實現(xiàn)對所關注的細胞、病毒、小體或微粒(下文稱為細胞)的群進 行選擇、富集、分配或劃分。選擇標準包括個體細胞的可測量特性或復合體或小體的可測量 特性，前者可以在不借助化學試劑的情況下從細胞外部進行檢測，后者與細胞相關，或者可 以使之與細胞相關。例如，可以通過對細胞與一種或多種標記的結合進行檢測和/或定量 來測量或大致估計細胞的特性，所述標記例如為發(fā)熒光或經修飾呈熒光性的分子、復合體 或小體。這種熒光分子、復合體和/或小體可以根據(jù)細胞的定性或定量特性而有差別地與 細胞相關聯(lián)，這些特性包括它們就蛋白質、脂質、磷蛋白、糖蛋白、磷脂、糖脂、核酸(包括核 酸的數(shù)量、序列或組織)、碳水化合物、鹽/離子以及在細胞內、細胞上或與細胞關聯(lián)的任何 其它分子而言的組成。另外，這種熒光分子、復合體和/或小體可以根據(jù)細胞的物理或生理 特性而有差別地與細胞相關聯(lián)，這些特性的例子包括但不限于細胞膜滲透性、細胞膜組成、 細胞膜流動性、化學或膜電位、存活能力、化學梯度、運動性、還原或氧化電位或還原或氧化 態(tài)以及其它參數(shù)或特性。對于細胞來說，無論是標記的或未標記的、修飾的或未修飾的，可以作為細胞選擇 的基礎的其它細胞可測量特性可以包括但不限于與細胞相互作用的光的特性，如熒光性、吸光度、反射率、散射性、極化性或其它特 性；細胞的電學特性或細胞對其環(huán)境的影響的電學特性，包括電導率、電感、電阻、膜 電位或膜電壓或其它特性；細胞的磁特性或電磁特性，包括磁性、順磁性、磁共振和/或細胞與電磁能的相互 作用；細胞的外形、圖像或形態(tài)學特性；以及就任何物質或參數(shù)而言的細胞組成，可通過任何方式直接或間接地進行測量。此外，直接或間接、單獨或組合地測量這類參數(shù)可以反映對細胞所關注的簡單或 復雜特性。這種特性的一個例子是包含在二倍體、單倍體或配子基因組中的性染色體，根據(jù) 細胞類型和生物體的情況，該性染色體可以是X染色體或Y染色體或二者的組合。對性染
7色體內含物的確定可以通過采用直接或間接測量或利用一種或多種方法進行測定來推斷。 這種方法包括測量相對或絕對確定的細胞的DNA含量；某些DNA序列的存在與否，或表示某 些DNA序列存在與否的標記物的存在與否；細胞的大小，或細胞組成部分或細胞器的大?。?蛋白質或細胞性染色體內含物的其它特性標記物的存在與否及位置，或這種標記表達的組 合或模式；或反映細胞性染色體組成的任何其它的測量?？梢赃M行多種其它的此類測量或 特性的測定，用以識別在特定實例、情況、系統(tǒng)、疾病、病癥、過程或環(huán)境中所關注的細胞。這種細胞測量可實現(xiàn)對細胞、細胞群、器官、組織或生物體的定量和/或定性測 定。這種測定可應用于許多領域，包括但不限于診斷、生物醫(yī)學研究、工程學、流行病學、醫(yī) 藥、農業(yè)、畜牧業(yè)、牲畜管理、動物學、生物制藥業(yè)以及其它領域。除了能進行這種測量外，根 據(jù)上述細胞術法測定的特征或參數(shù)，現(xiàn)有的方法及裝置可實現(xiàn)細胞的分離。對所關注的細 胞進行富集、采集或分隔，或者在制劑中除去非所需或非所關注的細胞，由此可以對細胞進 行正選或負選。根據(jù)可如上所述進行測定的任何參數(shù)、特征或參數(shù)或特征的組合可以對這 種選擇進行控制。通過包括或涉及上述方法識別的細胞可以被分離、分隔、富集、耗盡或收集到任意 數(shù)量的任何組中。一種常見的分離方法(如圖IA所示)利用靜電力使含具有所需或非所 需特性的(多個)細胞的帶電或帶靜電的液流、(多個)液滴轉向。根據(jù)具體的應用情況， 收集或丟棄轉向的細胞，如圖IA所示。其它分離方法包括使用具有閥的流控裝置使液流中 的細胞轉向至另外的途徑、通道、管路或元件中供后續(xù)的采集或處理用，如圖IB所示。對細胞進行流式細胞分選有許多方法和系統(tǒng)。在這些方法和系統(tǒng)中，有些是專門 設計用來對哺乳動物精細胞進行流式細胞分選的，特別是把精細胞分為攜帶X染色體的精 細胞群和/或攜帶Y染色體的精細胞群，目的是提高由經分選的精子得到的受精卵產生所 需性別的后代的幾率。例如，奶農可能期望分選公牛的精子，以便通過用具有X染色體的精 子進行人工授精、體外受精或其它方法得到牛胚胎，從而產生更多的雌性牛犢。流式細胞分選方法面臨一系列挑戰(zhàn)，特別是在分選哺乳動物精細胞供以后產生后 代之用的方面。重要的是，用于標記和/或區(qū)分細胞的方法和/或用于分選細胞的方法不 能對細胞的存活能力產生不利的影響。通常，所述方法和/或系統(tǒng)的一個或多個目標(例 如，更快的分選、提高準確度等)與所述方法和/或系統(tǒng)的其它目標沖突。必須平衡考慮各 種因素，包括細胞經受的溫度、溫度變化、壓力和/或壓力變化、細胞暴露的流體環(huán)境、施加 于細胞的力以及細胞的壽命。例如，隨著溫度的升高，熒光分子(例如，熒光色素)進入細 胞中與細胞核內的DNA結合的速率(S卩，細胞被染色的速率)可增大。因此，系統(tǒng)的處理能 力(至少染色過程的處理能力)可隨著細胞環(huán)境溫度的升高而提高。然而，經證實溫度的升 高對細胞的存活能力和/或細胞保持存活的持續(xù)時間是不利的。相反，將細胞保持在適合 存活能力的最佳溫度下可能會增加對細胞進行染色(以及測量和分選)所需的時間，從而 使過程所花費的時間比可行的要長，或者在完成所述過程所需的時間過后細胞無法存活。有關分選細胞的另一個挑戰(zhàn)涉及細胞的物理及光學特性。特別是，扁平或以其它 方式非對稱的細胞(如哺乳動物血紅細胞或精細胞)表現(xiàn)出各向異性的能量(例如光)發(fā) 射。細胞內部的復雜幾何形狀和/或細胞邊界的復雜幾何形狀的作用是以一定方式折射和 /或反射光，這些方式高度依賴于細胞相對于用來區(qū)分細胞的任何照射源和/或檢測器的 取向。例如，將哺乳動物精細胞通過流式細胞分選分為具有X或Y染色體的群通常涉及使用與細胞內的DNA結合的熒光分子將細胞染色。大多數(shù)哺乳動物物種的X染色體與Y染色 體之間的DNA含量差異(Y染色體含有的DNA通常少于X染色體)導致含X染色體的細胞 有相對較高的熒光性。然而，X染色體和Y染色體的DNA含量差異通常僅為百分之幾，并且， 通常細胞的幾何形狀和/或取向對所檢測的熒光性的影響百分數(shù)遠遠超過了 X染色體與Y 染色體之間的DNA含量差異百分數(shù)。另外，這種分析要求細胞單個通過檢測區(qū)，這樣檢測器 不會將來自二個細胞的熒光性解析成來自單細胞的熒光性。流式細胞分選系統(tǒng)通常采用鞘包芯式(core-in-sheath)流控裝置攜帶細胞通過 檢測區(qū)。如圖IC所示，將細胞52的水性懸浮液的相對慢速移動流50注入至鞘液的相對較 快的移動流M。這樣的設置將細胞52聚集成被稱為芯流的液流56。通過適當?shù)剡x擇芯懸 浮液和鞘液的壓力和隨之而來的速度，由鞘流施加的流體動力使芯流變窄，芯流中的細胞 縱向分布，從而使它們在液流中被依次攜帶。使芯流拉長和變窄的力具有定向細胞52的附 加效果，這樣使細胞52的縱軸58與單行流56的流動方向平行。然而，細胞對縱軸58的取 向仍有些許的隨機性。因此，當每個細胞52經過檢測區(qū)時，入射到細胞上的光、從細胞發(fā)出 的光(例如熒光)和由細胞反射出的光仍依賴于細胞52的取向。特別是對于許多類型的 哺乳動物精細胞來說確實如此。關于精細胞在流式細胞系統(tǒng)內相對于細胞的照射和檢測的取向問題，存在著許多 解決方案。例如，圖ID示出一種解決方案，該方案采用在管62上切出的斜面尖頭60向鞘 流66中注入樣本流64。該扁平的斜面尖頭60有助于在鞘流66內將細胞相對于它們的縱 軸58定向，這樣使細胞的扁平面趨于排列在一致的方向上。另一種解決方案(可與斜面尖 頭方案結合)采用二個相互垂直的檢測器68和70 (0度檢測器68和90度檢測器70)，該 二個檢測器結合使用以估計每個經過檢測區(qū)72的細胞52的取向并測量那些被發(fā)現(xiàn)適當定 向的細胞的熒光性，從而可實現(xiàn)熒光信號的精確量化。采用細胞相對于縱軸的流體動力定 向的方案通常產生這樣的群，其中樣本流中約70%或更少的細胞達到了熒光測量所需的排 列，這降低了儀器的處理能力，并導致不適當定向的細胞的丟棄。再一種針對與細胞幾何形狀和取向有關的問題的解決方案利用沿與攜帶細 胞的鞘包芯式液流同軸的光學檢測。在一個這樣的方案中，使用頂置式照射光學器件 (epi-illumination optics)照射細胞和檢測由細胞發(fā)出的光。如圖IE所示，鞘流76攜帶 的樣本流74直接向顯微鏡物鏡78移動，消除了對細胞(例如，精細胞80)相對于細胞80 的縱軸82的取向的依賴性。然而，細胞80朝向物鏡78的軌跡要求細胞80在經過檢測區(qū) 82 (S卩，物鏡78的焦點84)后立即改變軌跡。系統(tǒng)通過使用液體的橫向流86完成此軌跡變 化。分析之后，橫向液流86、鞘流76和液流74的匯流88可能會引起個體細胞位置的不確 定性。因為細胞經過檢測區(qū)82后，匯集流內的細胞80的位置立即變得不可預測，所以這種 位置的不確定性可以使系統(tǒng)無法進行細胞分選操作。圖IF示出的再一種解決方案利用一個或多個拋物面反射鏡102均勻地照射細胞 和/或從細胞徑向集光。系統(tǒng)使用噴嘴104發(fā)射含個體細胞92的液流/射流106。液流 106移動經過檢測區(qū)94并通過拋物面反射鏡102上的孔96。在經過檢測區(qū)后的某點上，液 流106被分割為可帶電的液滴90。此后可以對每一液滴90進行分選，方式例如是，使帶電 液滴90和帶電偏轉器板98偏轉，從而將液滴偏轉到一個或多個容器100中。問題是，這種 “空氣中的射流(jet-in-air) ”構造使得當液流106離開噴嘴104時，液流106(以及包含在液流106內的細胞92)的壓力下降。壓力的突然變化(以及噴嘴本身內的壓力升高)和 隨后細胞92進入容器100時的碰撞一樣，會對細胞92的存活能力產生不利影響。因此液 流106離開噴嘴104時的壓力和速度必須保持低于任何可能損壞細胞92的閾值，而細胞的 損壞會降低系統(tǒng)的處理能力。另外，液滴90通過大氣的移動可能要求一些環(huán)境約束條件， 包括室內空氣的清潔(例如，“無塵室”)和溫度控制。所以，盡管流式細胞術已經相對先進，本領域中仍然不斷地要求提供更有效、更靈 敏和更精確的方法及裝置來進行細胞分離和/或識別。

發(fā)明內容
本發(fā)明描述了采用流式細胞術的方法及裝置，用于檢測、通過功能和/或物理性 修飾而選擇性地改變、和收集細胞群中所需或非所需的細胞。和現(xiàn)有常見的細胞分選方法 及裝置不同，本方法不依賴拋物面反射鏡或正交檢測來對細胞進行檢測和分類。而本方法 使用物鏡，該物鏡具有與通過檢測區(qū)的樣本流同軸的光軸。本方法可依賴或不依賴于細胞 液流的轉向或分離或將細胞分類到不同的接收容器或通路，這些也都是現(xiàn)有常見的細胞分 選方法及裝置中的情況。本方法設想使用可控能量源，例如但不限于電磁輻射源(如激光器)，對已經利用 細胞檢測技術識別的細胞群中的所需或非所需的細胞進行照射。對于所關注的細胞來說， 在細胞儀中對它們進行分析之后，在某些方面在對它們進行分析后的一秒鐘內，同時細胞 還保持于裝置的液流中，根據(jù)其所測量的特性或特征，將可控能量源選擇性地導向所關注 的細胞。所施加的能量可以在功能上和物理上改變這種細胞。根據(jù)本方法或裝置的具體用 途和具體實施例，可以在功能上和物理上消耗所得細胞群中的非所需細胞，或以能隨后實 現(xiàn)所需細胞的富集或非所需細胞的去除的方式修飾所得細胞群。所述方法及裝置廣泛適用 于需要富集或消耗細胞的應用當中。在一些實施例中，所述方法和/或裝置改變含有細胞 群中所需和非所需細胞的液體，可能不會直接改變細胞，其中已經利用細胞檢測技術對所 述細胞群進行了識別。在這種實施例中，所述方法和/或裝置可依靠細胞液流的轉向或分 離或將細胞分類到不同的接收容器或通路。所述方法及裝置的一方面包括基于包含在細胞中的性染色體X或Y對細胞群中的 精細胞進行富集、選擇、功能性改變或消耗的用途。所述方法及裝置包括對細胞儀的流體及 光學系統(tǒng)使用替代性的設計，在一方面包括垂直于液流定向光學測量部件和/或細胞改變 能量源的裝置，在另一方面所包括的裝置中，也可以或作為另外的選擇將一些此類部件按 與液流同軸和/或成斜角的方式定向。通過在細胞分析過程中觀察細胞，不依賴于細胞相對于其最長軸的取向而精確地 對每個細胞進行分類，隨后利用該分類確定是否對細胞進行修飾、衍化、破壞、殺死或破碎， 所述流式細胞方法及裝置能提供新的方法及裝置以實現(xiàn)細胞的正選或負選。在細胞測量的 同時或細胞測量之后的一秒鐘內，本發(fā)明所述的方法及裝置對所需或非所需細胞結合應用 力、能量或輻射，在那些細胞中產生變化，從而在物理上或功能上改變它們。根據(jù)具體用途 或應用的要求，這種被改變的細胞或它們的碎片或衍生物在一方面可保留在所得制劑中， 或者在另一方面被富集或除去。描述的一個實施例可實現(xiàn)從攜帶Y染色體的精子中功能性和/或物理性地分離攜帶X染色體的精子，和/或從攜帶X染色體的精子中功能性和/或物理性地分離攜帶Y 染色體的精子。在這個實施例中，利用具有公知特性的DNA結合化學物質間接地測量精 子群中個體精子的相對DNA含量，這些化學物質例如但不限于雙苯酰亞胺、STOR染料(如 SYBR-14), Hoechst 33342, Hoechst 33258、溴化乙錠、吖啶橙、DAPI、色霉素、光神霉素、橄 欖霉素以及本領域中已知當與DNA結合時表現(xiàn)出熒光性增強的其它化學物質。通過當細胞 在向觀察點流動的液流中運動時優(yōu)選使用物鏡觀察該細胞來完成所述測量，其中所述物鏡 具有與液流的流動同軸的光軸。據(jù)推測，含相對較多DNA(即較高DNA含量)的細胞含較大 的X染色體，而含相對較少DNA (即較低DNA含量)的細胞含較小的Y染色體。在一些期望 最終制劑中的細胞只具有一種性染色體的方法實施例中，所述方法一方面在進行細胞分析 的同時，或者在另一方面，在進行細胞分析后的一秒或更短的時間內，利用導向細胞的激光 能量源，其中可快速調節(jié)激光能量源以照射含非所需性染色體的細胞和/或性染色體含量 不確定的細胞。在本實施例的一個方面，本方法使用的激光能量源儲存的能量在質量和/ 或數(shù)量上足以對非所需細胞進行修飾、衍化、破壞、失活和/或殺死。選定細胞中的這種變 化在一方面涉及細胞的破碎，或者在另外的方面中是破壞性較小的，這取決于應用的情況。 例如，在將識別和/或分離的精子用于受精和/或生殖的方法實施例中，一方面，例如通過 破壞細胞中的DNA分子的序列或結構，或者通過降低其活動性，使其在用于人工授精時大 部分不育，使非所需細胞不能生育可存活的后代，在這方面足以生產所需的制劑。在其它方 面，以一些其它方式使非所需細胞不能活動，殺死、修飾它們或使它們失活，從而影響非所 需細胞的生殖能力。在另一方面，以允許隨后從所需細胞的制劑中除去或部分除去非所需 細胞來對它們進行修飾或衍化。在另一實施例中，細胞儀的配置采用一個或多個光學元件，在一方面，所述光學元 件用于測量細胞的特性，和/或在另一方面，所述光學元件用于向細胞傳遞能量，其中至少 一個光學元件，優(yōu)選物鏡的光軸，與經受分析的細胞流同軸定向。因此，在一些實施例中，所 提供的方法及裝置使用光學元件，特別是使用與液流同軸設置的物鏡，來對細胞進行照射、 測量或傳遞能量。在另一實施例中，所提供的方法及裝置使用單獨或組合的一個或多個附 加光學元件，它們與液流成90度設置，用以對細胞進行測量或傳遞能量。在又一實施例中， 所提供的方法及裝置使用單獨或組合的一個或多個附加光學元件，它們的設置與液流非同 軸，用以對細胞進行測量或傳遞能量。再一實施例中，所提供的方法及裝置使用單獨或組合 的一個或多個附加光學元件，它們與液流成斜角設置，用以對細胞進行測量或傳遞能量。用 在本文中的“斜角，，是諸如銳角或鈍角的角，其不是直角或直角的倍數(shù)。一些實施例提供修飾細胞群中所關注的細胞的方法，包括使所關注的細胞與可控 能量源接觸的步驟，所述可控能量源在將細胞群中的細胞識別為所關注的細胞后對所關注 的細胞進行修飾，在經由能量源修飾后不用從細胞群中分離所關注的細胞。一些實施例提供識別細胞群中所關注的細胞亞群的方法，包括使細胞群與可控能 量源接觸的步驟，所述可控能量源修飾所關注的細胞亞群中的細胞，其中的接觸發(fā)生于在 對流式細胞儀的樣本液流中的細胞進行首次分析之后，且在首次分析后不超過約一秒鐘進 行接觸，細胞保留在流式細胞儀的樣本液流內，其中在那些所關注的細胞流向詢問區(qū)時，首 次分析將細胞亞群中的細胞識別為所關注的細胞，且其中可控能量源通過流式細胞儀修飾 樣本流中所關注的細胞。
在一些實施例中，首次分析包括檢測具有所需特性的所關注的細胞，該所需特性 選自所需的蛋白質組成、DNA組成、細胞表面標記物、分子大小、吸光度、光反射、熒光性、 光散射、極化、電特性、磁性、形態(tài)特性、細胞膜滲透性、細胞膜流動性和氧化還原態(tài)。在一些實施例中，在細胞群經過流式細胞儀中的液流時使細胞群與能量源接觸。 在相關的實施例中，在將液流中的細胞識別為所關注的細胞之后且在之后的一秒鐘之內使 所關注的細胞與能量源接觸。在一些實施例中設想將能量源與液流同軸設置。進一步設想將能量源與液流成90 度角設置，或者與液流成斜角設置。在另一實施例中，通過科勒(Kohler)和/或頂置式照 射光學器件將能量源傳遞至所關注的細胞。在另一實施例中，將能量源導向細胞流上的一 點，該點在細胞特性的測量位置的下游。在另一實施例中，將能量源導向細胞流上的一點， 該點在細胞特性的測量位置的下游，并且在液流從其初始流動方向上轉向或轉彎后。在一些實施例中，當細胞在流向觀察點的液流中移動時，優(yōu)選通過使用物鏡觀察 該細胞，由此完成一種或多種分析，其中所述物鏡具有與液流的流動同軸的光軸。在一些實 施例中，液流在經過觀察點后改變方向，同時仍可確定液流內的細胞順序和/或位置。在一 些實施例中，根據(jù)一種或多種分析，可控能量源可選擇性地改變一個或多個細胞。在一些實 施例中，可控能量源與新導向的液流同軸設置，而在其它實施例中，可控能量源與新導向的 液流垂直或成斜角設置。在可包括或不包括可控能量源的一些實施例中，噴嘴可噴射液流， 形成可用已知方法(例如使用可控能量源施加靜電荷、控制各液流通路中的壓力等)分選 的液滴。在一些相關的實施例中，以選自以下的方式將可控能量源導向液流中的細胞位 置連續(xù)液流、脈沖液流、間歇通/斷循環(huán)、能量源的定期聚焦或散焦以及能量源向液流的 間歇快速轉向。在一些實施例中，受控能量源是電磁源。在一些實施例中，能量源是激光器。在一些實施例中，對細胞的修飾選自對所關注的細胞進行衍化、殺死、破壞、分裂 和破碎。在另外的方面，使用可通過電、磁、光譜、光化學、生物化學、免疫化學、熒光或其它 化學手段檢測的標記將細胞識別為所關注的細胞。在一些實施例中，所述標記是添加光活 化型化學化合物或標記物。在相關的實施例中，所關注的細胞被識別為具有所需的特性，該所需特性選自所 需的蛋白質組成、蛋白質含量、DNA組成、DNA含量、細胞表面標記物、分子大小、吸光度、光 反射、熒光性、光散射、極化、電特性、磁性、形態(tài)特性、細胞膜滲透性、細胞膜流動性和氧化 還原態(tài)。在所述方法及裝置中可設想將用于檢測液流中的細胞特性的任何能量源、檢測器 或聚焦元件與液流同軸設置。例如，在包括檢測器和可控能量源的流式細胞儀中，檢測器或 可控能量源其中之一或二者與液流同軸設置。在相關的實施例中，用于檢測液流中的細胞 特性的任何檢測裝置和或光學元件與液流同軸設置。在另一實施例中，使用科勒和/或頂置式照射光學器件傳遞用于檢測所需特性的 光或能量。在相關的實施例中，當所述方法使用流式細胞儀時，該流式細胞儀是頂置式照射 細胞儀。進一步設想將適用于所述方法中的頂置式照射細胞儀與修飾所關注的細胞的裝置相結合，這將在本文中進一步描述。當流式細胞儀用于所述方法時，流式細胞儀具有一個或多個樣本流并結合具有物 鏡的光學器件，所述物鏡與一個或多個樣本流的流動同軸，用于傳遞檢測所需特性所用的 光或能量、用于檢測細胞的所需特性和/或用于傳遞修飾所需或非所需細胞所用的光或能量。在另一實施例中，能量源修飾具有所需特性的所關注的細胞。在相關的實施例中， 能量源修飾缺乏所需特性的所關注的細胞。在又一實施例中，所關注的細胞是選自攜帶X染色體的精子和攜帶Y染色體的精 子的精細胞。在一些實施例中設想的是，攜帶X染色體的精子與攜帶Y染色體的精子之間 存在著DNA含量的差異，基于這一所需特性將精細胞識別為所關注的細胞。所述方法及裝置進一步提供的是，在收集室中收集細胞群供進一步使用。在一些 實施例中，收集室中包含已被可控能量源修飾的所關注的細胞和沒有被可控能量源修飾的 細胞。在相關的實施例中，收集之后，所關注的細胞可用于后續(xù)處理或程序。還在另外的實 施例中，設想在收集之后丟棄所關注的細胞，細胞群的剩余部分用于后續(xù)處理或程序。所述方法及裝置還提供修飾細胞群中所關注的細胞的裝置，所述裝置包括可控能 量源，經將細胞識別為細胞群中所關注的細胞，所述可控能量源對所關注的細胞進行修飾， 不用在經能量源修飾后從細胞群中分離所關注的細胞。在相關的實施例中，設想所述方法及裝置使用流式細胞儀從細胞群中識別所關注 的細胞亞群，所述流式細胞儀包括修飾所關注的細胞亞群的可控能量源，其中在樣本流經 流式細胞儀的樣本管期間，在首次細胞分析后進行接觸，且通常是在細胞分析后的一秒鐘 內進行，這時細胞仍保持在裝置的樣本液流內，其中首次分析將細胞識別為所關注的細胞， 且其中在樣本流經流式細胞儀期間，可控能量源修飾所關注的細胞。在一些實施例中，所述方法的一步或多步以機器可讀指令的形式存儲在控制器內 的有形存儲介質上?？刂破鞯奶幚砥鲌?zhí)行指令以全方位地監(jiān)視和/或控制分選流式細胞 儀。所述指令可實施為與細胞儀內的各項任務相適應的一個或多個程序。在一些另外的實施例中，分選流式細胞儀的光學池、比色皿、視窗、液流管、壁、邊 界或其它部件由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成。在這些及其它實施例中，可以調節(jié) 攜帶分析物的溶液，使溶液的折射率接近分選流式細胞儀的光學池、比色皿、視窗、液流管 或其它部件的折射率，特別是折射率相差為0. 02或更小。


圖IA示出分選流式細胞儀中采用的液滴分選法；圖IB示出分選流式細胞儀中采用的流動壓差法；圖IC描述流式細胞系統(tǒng)中采用的鞘-流裝置；圖ID描述采用斜面尖頭在液流內定向的鞘-流裝置；圖IE描述使用與液流同軸定向的物鏡檢測細胞的流式細胞儀；圖IF示出使用拋物面反射鏡均勻照射細胞并從細胞徑向集光的系統(tǒng)；圖2描述分選流式細胞儀的流徑的設想實施例；圖3描述分選流式細胞儀的設想實施例；
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圖4描述分選流式細胞儀的設想的替代實施例；圖5描述分選流式細胞儀的另一設想的替代實施例；圖6A描述分選流式細胞儀的一部分的設想替代實施例。圖6B描述分選流式細胞儀的一部分的另一設想替代實施例；圖7示出可使用設想的分選流式細胞儀的一個或多個實施例為系統(tǒng)內的能量產 生兩個不同焦點的方法；圖8A描述在本發(fā)明所述的方法及裝置的設想實施例的流徑內的物鏡及相關的焦點。圖8B示出在標稱焦點與物鏡之間形成的通常是錐形的體積的實施例；圖9描述在本發(fā)明所述的方法及裝置的實施例的流徑內的水浸物鏡及相關焦點；圖10描述根據(jù)本發(fā)明所述的方法及裝置的實施例在其中可形成分選流式細胞儀 的一部分流徑的主體；圖11描述圖9中所示主體的替代實施例；圖12描述圖9中所示主體的另一替代實施例；圖13描述圖9中所示主體的又一替代實施例；圖14描述圖9中所示主體的再一替代實施例；及圖15描述顯示根據(jù)本發(fā)明所述方法及裝置的方法步驟的流程圖。
具體實施例方式本說明書描述基于流式細胞術的細胞分離方法、系統(tǒng)和裝置。除另有定義外，本文 中所使用的所有科技術語的含義與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同。這里需要注意的是，用在本說明書和所附權利要求書中的單數(shù)形式“一”、“一個 (種)”和“所述(該)”包括復數(shù)個指代物，除非上下文中明確指出另外的情況。本領域普通技術人員容易理解的是，除因對理解所述方法及裝置有重要性而另指 出外，所包括的附圖沒有按比例繪制。除另有規(guī)定外，用在本文中的以下術語具有它們本來的含義。術語“細胞”指所述方法及裝置中的分析物，這種物質包括但不限于細胞、病毒、小 體或微粒。術語“所關注的細胞”指具有所需特性的細胞，在細胞流過流式細胞裝置的過程 中可以檢測該所需特性?！八杼匦浴敝甘咕哂兴杼匦缘募毎c不具有所述特征的細胞 區(qū)別開來的某種特征。具有所需特性的細胞在細胞的“所需亞群”內。在所關注的細胞中 的示例性可測量或可檢測的細胞特征包括但不限于蛋白質組成、蛋白質含量、DNA組成、DNA 含量、細胞表面標記物、分子大小、吸光度、光反射、熒光性、光散射、極化、細胞的電特性、磁 性、形態(tài)學特性、細胞膜滲透性、細胞膜流動性和氧化還原態(tài)。本領域普通技術人員容易理 解的是，細胞儀可以測量或檢測所關注的細胞的多種選擇性特征中的任一種，并且這些選 擇性特征可以很容易地在所述方法及裝置中利用。在一方面，所述方法或裝置利用所關注 的細胞的“所需特性”識別具有此特性的細胞。術語“首次分析”指當細胞通過流式細胞裝置行進時對細胞進行的初始分析，用以 確定所述細胞是否是所關注的細胞，所述流式細胞裝置可以是管、比色皿、區(qū)域、槽、室等。 在一些實施例的一方面，流式細胞儀中的檢測器執(zhí)行首次分析。
用在本文中的術語“二次分析”指在通過液流管進行首次分析后，對所關注的細胞 進行表征以確定是否使用能量源改變所關注的細胞。在一些實施例的一方面，通常在首次 分析之后不到一秒鐘之內進行二次分析。用在本文中的術語“修飾(modify，modification)”禾Π “改變(alter, alteration) ”指使用能量源引起細胞發(fā)生變化。修飾包括但不限于對細胞的直接作用，包 括但不限于修飾細胞組分或化學物質，包括蛋白質、DNA和涉及細胞代謝的物質；在細胞內 或細胞附近進行的分裂、加熱、空化或爆破；細胞的透化或穿孔；以及對細胞的破壞、破碎 或形態(tài)改變。在其它方面，修飾也包括或作為另外的選擇而包括能量源的間接作用，這種間 接作用受能量源或其它因素的介導，包括細胞或一種或多種細胞組分的化學活化和/或去 活化、化學交聯(lián)或化學衍化；細胞內或細胞附近的一種或多種化學試劑的活化和/或去活 化，這使這種試劑或其衍化物與細胞或其組分結合或關聯(lián)；或誘導細胞功能的改變。在某些 方面，在細胞被照射的情況下，通常存在于細胞內或另外施加于細胞的化學試劑與細胞相 互作用。所述方法及裝置可通過檢測任何數(shù)量的特征(例如所需特性)或參數(shù)的存在與否 來實現(xiàn)對所關注的細胞的識別，所述特征或參數(shù)可以在與流式細胞技術相容的測量中得到 確定、估計或反映。在各方面，用于確定所關注的細胞或細胞群的細胞測量包括本文中討論 的和另外在本領域中已知的細胞測量以及可引進到或可使之應用于流式細胞分析的新測 量方法、手段和/或裝置。通過本發(fā)明所述方法及裝置的實踐進行細胞分析的細胞可以是 標記的或未標記的，或者另外是利用本領域中已知的技術和試劑修飾或未修飾的。用在本文中的術語“標記物”是指可通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學 手段檢測的成分。例如，有用的標記物包括抗血清或單克隆抗體可用的熒光染料、高電子密 度試劑、酶、生物素-鏈霉親和素、地高辛(dioxigenin)、半抗原、蛋白質，或核酸特異性染 料。因此，在本發(fā)明所述的方法及裝置中，就任何物質或參數(shù)而言的細胞組成、特性和/或 特征(以任何方式直接或間接測量的)是為選擇或排除而進行的細胞和細胞群的識別的基 石出?？蓹z測的細胞組成、特性和/或特征的例子包括但不限于與細胞相互作用或自 細胞發(fā)出的光的特性的測量，如吸光度、光散射、發(fā)光性、熒光性、磷光性、光的極化或去極 化或其它特性；電特性，包括但不限于細胞或周圍介質的電感、電容、電位、電流或電阻；電 磁特性，包括磁性、順磁性、磁共振和/或細胞與電磁力和/或波的相互作用或電磁力和/ 或波的發(fā)射；成像、圖像特性、形態(tài)學特性或由細胞的圖像或圖像樣特性的收集和/或分析 得到的相關特性。在某些方面，測量的是細胞的固有數(shù)量或質量特性，或者在另外的方面， 測量的是間接反映、表現(xiàn)或大致估計細胞的數(shù)量或質量特性的值。還在另外的方面，測量的 既是細胞的固有數(shù)量或質量特性，也是細胞的數(shù)量或質量特性的間接反映、表現(xiàn)或大致估 計。作為例子而非限制，測量細胞的熒光性可反映細胞的固有熒光性，或者測量細胞的熒光 性可反映與細胞結合或關聯(lián)的熒光色素或熒光微粒的存在和/或數(shù)量，或者間接地反映細 胞的一些特性，或兼而有之。在所述方法及裝置的一些方面，分選細胞儀采用可實現(xiàn)細胞和細胞群的物理和空 間分離的技術。在所述方法及裝置的其它方面，分選細胞儀利用在物理上和/或功能上修 飾細胞群中選定細胞的技術來實現(xiàn)它們的功能性和/或物理性分離和/或區(qū)分，任選供后續(xù)使用。在所述方法及裝置的一些方面，分選細胞儀不依靠按位置、定位、容器或時間對細 胞進行即時分離，而是提供就一些所需特性而言是失活、鈍化、分裂、分離、破碎或以其它方 式改變(即，“修飾”)的細胞，這可任選能在制劑中實現(xiàn)亞群的分離和區(qū)分。修飾的類型 完全或部分地取決于識別的細胞的預期應用或用途，并因此取決于識別的細胞在應用中的 相關特征。例如，僅旨在說明或解釋而言，在制備正常體細胞的情況下，如果細胞的繁殖能 力受到負面影響或細胞被殺死，則惡性或以其它方式毫無節(jié)制或快速生長的細胞可視為在 機能上失活。在另一實例中，也僅旨在說明或解釋而言，在要求從細胞群中去除產生不良蛋 白質或其它物質的細胞亞群的應用中，分選細胞儀可以通過以下的方式實現(xiàn)這一效果停 止在這些細胞中產生所述物質、殺死細胞和/或修飾細胞以允許將其從細胞群中物理地去 除。在一些實施例中，本發(fā)明所述的方法及裝置利用能量源修飾細胞或者誘導或引發(fā) 諸如化學活化的過程，所述化學活化可修飾細胞。能量源誘導的修飾包括在各方面對細胞 的直接影響，包括但不限于修飾細胞的組分或化學物質，包括蛋白質、DNA和涉及細胞代謝 的物質；在細胞內或細胞附近進行的分裂、加熱、空化或爆破；細胞的透化或穿孔；以及對 細胞的破壞、破碎或形態(tài)改變，包括細胞、病毒、小體或微粒。在其它實施例中，修飾也包括 或作為另外的選擇而包括能量源的間接作用，這種間接作用受能量源或其它因素的介導， 包括細胞或一種或多種細胞組分的化學活化和/或去活化、化學交聯(lián)或化學衍化，細胞內 或細胞附近的一種或多種化學試劑的活化和/或去活化，這使這種試劑或其衍化物與細胞 或其組分結合或關聯(lián)，或誘導細胞功能的改變。在某些實施例中，經照射與細胞發(fā)生反應的 化學試劑通常存在于細胞內或應用中，或作為所述方法的一部分進行添加。在一些實施例中，所述方法及裝置結合使用光活化型化合物，所述光活化型化合 物經用適當強度或能量的光照射而受誘導與細胞或細胞組分結合或關聯(lián)。這種化合物在某 些方面誘導能影響所關注的細胞的細胞進程或代謝的一種或多種細胞組分發(fā)生充分的交 聯(lián)或變性。或者，這種化合物在某些方面誘導能殺死所關注的細胞的一種或多種細胞組分 發(fā)生充分的交聯(lián)或變性。在另一種可供選擇的方案中，在所述方法及裝置中使用的光活化 型化合物與選定的細胞結合，并以這樣的方式改變所關注的細胞的一種或多種特性，即，使 所關注的細胞在后續(xù)過程中適于識別和/或富集和/或消耗。對于通過化學衍化(例如添 加化學物質)改變的所關注的細胞來說，在某些方面，在后續(xù)的步驟中通過利用這種物質 的特性或相互作用的方法對其進行去除、富集或純化。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一 方面，通過添加隨后由抗體結合的物質對所關注的細胞進行衍化，所述抗體可通過各種方 式實現(xiàn)對所關注的衍化細胞的捕集或截留。設想了許多這類物質，并且在一方面，這種物質 包括含2，4_ 二硝基苯基(DNP)或與之相關的一類化合物，這類化合物在一方面由識別DNP 的抗體識別并專門地結合。因此，在一方面，DNP或相關化合物的光活化型衍化物用于在 這種類型的應用中衍化所關注的細胞?；蛘?，利用使所關注的衍化細胞優(yōu)先與某些底物結 合的策略捕集或去除所關注的衍化細胞。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一方面，使用含 生物素或與之相關的化合物衍化的所關注的細胞被捕集或截留在與生物素結合或經修飾 (例如通過存在親和素、鏈霉親和素、生物素結合抗體或其它生物素結合分子)與生物素結 合的底物、表面、物質、介質、化合物或微粒上。在涉及本方面的另一可供選擇的方案中，生 物素或相關化合物的光活化型衍化物用于在這種應用中衍化所關注的細胞。或者在其它方面中，所關注的細胞在經受選擇和修飾之前通過化學物質或化合物的添加或結合被改變。 因此在這種情況下，本文中所述方法及裝置的實施例利用添加物質對選定細胞的改變來實 現(xiàn)這種細胞與細胞群中其它細胞的區(qū)分。例如，僅旨在說明或解釋而言，在一方面，在分析 前通過添加光不穩(wěn)定的化學化合物對群中的所有細胞進行衍化，在一方面，針對特定的細 胞進行修飾，方式是使用裝置的能量源修飾這些細胞上的光不穩(wěn)定的化學化合物。在細胞儀的一些實施例中(見圖1)，細胞以本領域中熟悉的常見方式進入詢問或 分析室、比色皿、液流或其它分析位置或區(qū)域供流式細胞分析和/或分選。細胞儀通過如上 所述測量細胞的特性將其識別為在最終制劑中具有所需特性或不具有所需特性，所述細胞 的特性包括但不限于諸如熒光和/或光散射之類的特性。液體的流動攜帶細胞經過細胞儀 的區(qū)域，并且在一方面，通過一個或多個激光束、檢測器和/或檢測細胞數(shù)量和質量特性的 其它裝置。在一個這樣的方面中，液體的流動使細胞向著具有通常與液流同軸對準的軸的 光學元件移動。作為例子而非限制，光學元件可以包括諸如物鏡的透鏡，和/或可以包括一 個或多個檢測器、激光束和/或其它能量源。通過細胞與檢測器、激光束和或其它能量源之 間的光和/或能量可以穿過光學元件(例如，物鏡)，所述光學元件通常與細胞通過細胞儀 的相關部分的流動同軸對準。在一方面，由細胞或流體經過儀器的相關部分的速度直接或 間接地確定和/或估計在任意時間點時每個細胞在細胞儀中的位置。在一方面，將已經通 過區(qū)域中的一些或所有分析位置的細胞識別為在最終制劑中具有所需特性或不具有所需 特性。在一方面，由計算機和/或模擬和/或數(shù)字電氣和/或電子和/或軟件和/或計算 計硬件數(shù)據(jù)分析設備完成這種測定。這種設備將每個細胞的單個或多個特性、測量結果和 /或特征與由裝置的操作員確定的一個或一套或一組特性、測量結果和/或特征進行比較。 或者，在一方面，使用細胞儀所包括或帶有的算法或程序自動地確定要與測量的特性進行 比較的特性。在一方面，在細胞儀中測定的細胞與之進行比較的特性集合確定在細胞制劑中具 有所需特性或不具有所需特性的一個或多個所關注的細胞亞群。在一方面，迅速完成對經 過儀器的分析區(qū)的細胞是否屬于所關注的特定細胞亞群的確定，使得當細胞在儀器的流動 系統(tǒng)中的位置得到確定之時將細胞的狀態(tài)確定為在細胞制劑中具有所需特性或不具有所 需特性，在某些方面，通常在進入儀器的分析區(qū)后不到一秒內確定。一旦完成所述確定，在 一方面使細胞受選擇性地施與滿足或不滿足選擇標準的細胞的能量或力的作用。就與任 選的后續(xù)應用相關的所需特性而言，所述力或能量在各方面使所關注的細胞失活、鈍化、分 裂、分離、破碎或以其它方式改變所關注的細胞，或者所述力或能量在另外的方面修飾和/ 或衍化所關注的細胞，或使所關注的細胞以這樣的一種方式衍化，即，可實現(xiàn)在制劑中隨后 分離或區(qū)分一個或多個所關注的細胞亞群。在各方面，這種力或能量是由導向流動液流中的細胞位置的一個或多個激光器或 其它光和/或電磁源以這樣的方式施與的，即，使能量源能夠進行快速轉向、散焦或關閉以 允許未選擇進行修飾的細胞通過。例如，僅旨在說明或解釋而言，能夠快速脈沖或開閉的高 能量和/或高強度激光將選定的細胞暴露于使它們在任何所需用途中喪失功能的破壞性 輻射。在一些方面，所述力或能量穿過光學元件，所述光學元件通常與在細胞經過細胞儀的 相關區(qū)域時的細胞流動同軸對準。無論如何，所有細胞，不論是選定并受修飾力或能量作用 的細胞還是未選擇且不受所述力或能量作用的細胞，均繼續(xù)隨細胞流遷移，并離開裝置中
17進行細胞特性測量和選定細胞修飾的區(qū)域。收集流出液，其含有修飾和未修飾的細胞，以及 在某些方面含有細胞的碎片或殘留物以及所述過程中使用的流體、溶液和/或緩沖液。在 各方面，以這種形式進一步使用流出液，或者在其它方面中對其進行濃縮、分級或以另外的 方式進一步處理以獲得所需特性和/或組成。圖2至5描述根據(jù)所述方法及裝置的分選流式細胞儀的各種實施例。圖2特別地 描述這種細胞儀的基本流徑110的實施例。鞘液輸入管112容許加壓鞘液在鞘液輸入端114 進入流徑110，產生經過流徑110的鞘液流116。在鞘液輸入端114的下游、優(yōu)選在鞘液的 平穩(wěn)層流區(qū)，分析物流體輸入管118容許分析物液流120(即，懸浮、攜帶分析物的流體等) 經分析物輸入端122進入流徑110。在一些實施例中，分析物輸入端122設置在鞘液流116 內的中心處和/或流徑110內的中心處，并定向成在分析物流體進入流徑110時，分析物液 流120平行于鞘液流116。當然，分析物輸入端122不必在鞘液流116或流徑110的中心， 并且本領域的普通技術人員可以設想出在分析物液流120進入流徑110時分析物液流120 不與鞘液流116平行的實施例。鞘液流116相對于分析物液流120的流速和壓力壓縮分析 物液流120并使之收縮而相對于鞘液流116變窄。鞘液流116與分析物液流120合并形成 樣本流123。流徑110可以在區(qū)域124改變方向，但優(yōu)選此后包括沒有障礙和流動方向陡變的 區(qū)域，用來在樣本流123到達詢問區(qū)128(即，觀察區(qū)、分析區(qū)、標稱焦點等)之前穩(wěn)定樣本 流123。樣本流123經過流徑110的路徑限定了流動軸130。在一些實施例中，分析物液流 120，特別是分析物液流120內的分析物(即，細胞)，通常沿著流動軸130經過流徑110移動。在到達和/或經過詢問區(qū)1 后，樣本流123轉向。在一些實施例中，流徑110在 轉角132(圖2中以虛線標示)改變方向。在其它實施例中，樣本流123在其到達區(qū)域126 的端部136時遇到橫流134。橫流134使樣本流123改變方向。在一些實施例中，轉角132 或橫流Π4使樣本流123的方向改變90度。然而在可供選擇的實施例中，樣本流123的改 變可以超過或不到90度。在任何情況下，樣本流123在改變方向后可以流向收集容器138， 并且在到達收集容器138之前可以經過一個或多個流徑元件140(例如，流量調節(jié)器、過濾 器等)ο通常設置在轉角132或其附近或者設置在樣本流123與橫流134的交點或其附近 的物鏡142起到在詢問區(qū)128內產生焦點(未示出)的作用。在流徑110經過詢問區(qū)1 時，物鏡142的光軸144通常與流徑110的流動軸130同軸對準。當然，光軸144與流動軸 130不必完全同軸，可有所不同，如光軸144平行且偏離流動軸130，如光軸144相對于流動 軸130呈斜角，等等。圖3示出包括所述方法及裝置的各種特征的示例性分選流式細胞儀151。類似于 圖2中所示的流徑110的實施例，圖3描述鞘流輸入管112和樣本流輸入管118，它們分別 通過鞘液輸入端114和分析物流體輸入端122引入鞘液流116和分析物液流120。特別地， 圖3中所示的分析物流體包含哺乳動物精細胞150和攜帶哺乳動物精細胞150的緩沖液 152。由于鞘液流116與分析物液流120并成樣本流123，各自的流速使細胞150形成單行 流并使它們的縱軸(即，沿著細胞尾的長度方向)對準樣本流123的方向。仍參照圖3，分選流式細胞儀的一個實施例包括首次分析和二次分析。當細胞150隨著樣本流123經過流徑110行進時，首次分析可以確定細胞是否是所關注的細胞，可以確 定細胞經過流徑110的移動速度，可以確定在樣本流123中的給定點處，對于一種或多種稍 后的分析來說，細胞150是否過于密集，細胞150是尾部朝前還是頭部朝前定向等。在圖3 所示的實施例中，在細胞150到達流徑110中的點IM時進行首次分析。首次分析照射源 156將能量158導向點154。能量158可以與每個細胞150相互作用以分散能量158，或者 以其它的方式與細胞150、細胞150的相關抗體、細胞150的相關熒光色素(例如，熒光素) 等相互作用。檢測器160可以檢測所產生的能量162(例如，分散的能量、所產生的熒光信 號等)并通過接線164向控制器166發(fā)送相應的信號。檢測器160可以設置在適于檢測能 量162的任何位置，包括與點154(相對于照射能量源156)成斜角，或者與點IM成一直線。 首次分析照射源156優(yōu)選為488nm激光器，但也可以包括設想適合在首次分析中進行測量 的任何能量源。首次分析照射源156可以定向成使能量158垂直于樣本流123移動，或者 作為另外的選擇，可以定向成使能量158以相對于樣本流123的方向成斜角的方式入射到 細胞150上。此外，能量158和/或能量162可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個或多個光 學元件(未示出)，這樣可允許如本領域中通常已知的那樣，通過建立不同的光路以不同于 所描述的方式設置照射能量源156和檢測器160中的任一者或兩者。一些實施例可以省略首次分析。例如，從二次分析(下文進行詳述)收集的信息 經證實可足以確定哪些細胞是所關注的細胞并區(qū)別在所需和非所需亞群中的細胞。因此在 一些實施例中可以省略元件154-164?；蛘?，一些實施例可以包括兩個或多個首次分析，并 相應地包括兩組或多組元件154-164。作為例子而非限制，樣本流123可以包括一個或多個 標記物(例如，包括于鞘流116中、附著于或以其它的方式與樣本流120中的一些細胞150 結合等)。主要的首次分析可以在第一點檢測標記物之一，次要的首次分析可以在第二點檢 測該標記物以確定樣本流123中的細胞流速。在任何情況下，首次分析后樣本流123繼續(xù)行進，沿著流徑110攜帶細胞150。在 細胞150經過點170時，如下文所述，二次分析對細胞150進行表征，用以確定是否對每個 細胞150進行修飾。在每個細胞150到達點170時，二次分析照射源172將能量174導向 點170。能量174可以與細胞150、細胞150的相關抗體、細胞150或細胞150內的DNA的 相關熒光色素(例如，Hoechst染色劑)等相互作用。如本領域中通常已知的那樣，在一些 實施例中，二次分析照射源172是以紫外輻射的形式發(fā)射能量174的紫外激光器，所述紫外 輻射與附著于細胞150內部的DNA上的Hoechst染色劑微粒相互作用，從而產生正比于細 胞150的DNA含量的熒光。如圖3所示，二次分析照射源172可定向成使射束174垂直于 樣本流123。然而，二次分析照射源172的位置也可以相對于樣本流123成斜角。此外，能 量174可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個或多個光學元件(未示出)，這樣可允許通過建 立不直的光路以不同于所描述的方式設置二次分析照射源172。能量174與細胞150或與細胞150的內部成分的相互作用使所產生的能量176自 細胞150發(fā)散出來。將物鏡142設置成使物鏡142的光軸144通常與樣本流123同軸，這 樣的作用是聚焦能量176。物鏡142的焦點178通常位于點170，但可以設置成便于在能量 174照射細胞150的稍后檢測自細胞150的所產生的能量176( S卩，焦點178可以稍微比點 170更靠近物鏡14 。設置成便于接收由物鏡142聚焦的能量182的檢測器180檢測自細 胞150的聚焦能量182，并通過接線184向控制器166發(fā)送相應的信號。當然，諸如濾光器186的一個或多個光學元件可起到改動或改變物鏡142與檢測器180之間的能量182的方 向的作用。在一些實施例中，物鏡142在轉角132之前或者在橫流134與樣本流123匯合 之前產生焦點178。在其它實施例中，物鏡142在轉角132或橫流134與樣本流123的匯合 點或其附近產生焦點(未示出)?？刂破?66可以包括一個或多個微處理器188、一個或多個晶體振蕩器190、存儲 一個或多個程序194的一個或多個存儲器192等，它對接收自檢測器160和/或檢測器180 的信號進行解析，用以針對每個細胞150確定細胞150是否屬于所需的細胞亞群。例如在一 些實施例中，細胞150是哺乳動物精細胞，控制器166解析接收自檢測器180的信號，用以 確定每個細胞150攜帶X染色體還是Y染色體。本領域的普通技術人員通常已知的是，在 哺乳動物的精細胞中，Y染色體所含的DNA通常比X染色體所含的要少。因此，通過分析由 細胞150中的染色劑經二次分析照射源172的照射而發(fā)射的熒光(即，產生的能量176)，控 制器166通常可以確定細胞150攜帶X染色體還是攜帶Y染色體。在一些實施例中，程序 194之一連續(xù)地監(jiān)測檢測熒光信號的統(tǒng)計分布，以便隨著時間的推移提高測定的精確度。仍參照圖3，在一些實施例中，控制器166根據(jù)對細胞150是否屬于所需亞群的確 定，通過接線198向可控能量源196輸出信號?？煽啬芰吭?96可以發(fā)出導向樣本流123 中的點199的能量197。在一些實施例中，操作控制器166使信號與可控能量源196協(xié)調， 和/或根據(jù)細胞150經過流徑110的移動速度選擇點199(例如，通過瞄準、通過一個或多 個透鏡、鏡子等)。在一些實施例中，點199可以位于轉角132或橫流134與樣本流123的 匯合點之前，從而簡化對沿流徑110移動的細胞150的位置確定。在其它實施例中，點199 可以位于轉角132之后，或者可以位于橫流134與樣本流123的匯合點或其后。在上述實 例中，控制器166可以輸出信號，使可控能量源196響應對細胞150具有X染色體的確定或 響應對細胞150具有Y染色體的確定而發(fā)出能量197?；蛘?，控制器166可以輸出信號，使 可控能量源196響應對細胞150具有X染色體的確定或響應對細胞150具有Y染色體的確 定而停止發(fā)出能量197。由能量源196發(fā)出的能量197的作用可以是使細胞150喪失機能 或使細胞150不能存活(例如，通過修飾細胞的組分或化學物質，包括蛋白質、DNA和涉及 細胞代謝的物質；通過在細胞150中或其附近造成分裂、加熱、空化或爆破；通過造成細胞 150的透化或穿孔；和/或通過造成對細胞的破壞、破碎或形態(tài)改變)，可以是改變(例如， 通過與細胞組分中或附著于細胞組分的化學物質的相互作用)細胞，使之隨后可以被識別 和/或從所需細胞亞群150中被去除，或者可以是有利地影響細胞。在一些實施例中，可控 能量源196是激光器，并且特別地，可以是輸出光譜的可見光或紅外部分能量的激光器。在 一些實施例中，激光器輸出具有690nm波長的能量。在其它實施例中，可控能量源196可以 輸出其它類型或波長的輻射，如X射線、微波、可見光、紅外光、紫外光或對細胞150具有所 需效果的任何其它類型的能量。當然，響應于對細胞是否屬于所需亞群的確定，控制器166 可以(1)發(fā)出能量197以不利地影響確定不屬于所需亞群的細胞150 (而留下確定屬于所 需亞群的細胞150) ； (2)可以發(fā)出能量197以有利地影響確定屬于所需亞群的細胞150(而 留下確定不屬于所需亞群的細胞150) ； (3)可以停止發(fā)出能量197以避免有利地影響確定 不屬于所需亞群的細胞150(而繼續(xù)發(fā)出能量197以有利地影響確定屬于所需亞群的細胞 150)；或(4)可以停止發(fā)出能量197以避免不利地影響確定屬于所需亞群的細胞150(而繼 續(xù)發(fā)出能量197以不利地影響確定不屬于所需亞群的細胞150)。此外，在一些實施例中，控制器166可以按與控制器166處理確定不在所需亞群中的細胞相同的方式處理不確定的細 胞150(例如，控制器166不能進行確定的細胞150、過于密集的細胞150等)。圖4示出包括所述方法及裝置的各種特征的示例性分選流式細胞儀200，特別地， 圖4中所示的分選流式細胞儀200省略了首次分析，因此沒有元件154-164。然而，雖然未 示出，但本領域的普通技術人員可以理解的是，如有必要，圖4示出的實施例可以包括首次 分析。如在圖3中所示的實施例中的那樣，樣本流123沿流徑110攜帶細胞150。在細胞 150經過點170時，如上所述，二次分析(在圖4的描述中并不是在任何首次分析之后)對 細胞150進行表征，用以確定是否修飾每個細胞150。也就是說，在每個細胞150到達點170 時，如上所述，二次分析照射源172將能量174導向點170，能量174與細胞150相互作用。 當然，二次分析照射源172可以是紫外激光器，并且能量174可以與附著于細胞150內部的 DNA上的Hoechst 33342染色劑的分子相互作用。如圖4所示，二次分析照射源172可以定 向成使射束174與樣本流123垂直。然而，二次分析照射源172也可以相對于樣本流123 成斜角。此外，能量174可以穿過諸如濾光器、透鏡等的一個或多個光學元件(未示出)，這 樣可允許通過建立不直的光路以不同于所描述的方式設置二次分析照射源172。從細胞150發(fā)出的所產生的能量176向著物鏡142傳播，所述物鏡142設置成使 物鏡142的光軸144(見圖幻通常與樣本流123同軸，并且作用是聚焦能量176。物鏡142 的焦點178通常位于點170，但作為另外的選擇，可設置成便于在能量174照射細胞150的 稍后檢測自細胞150的所產生的能量176。一個或多個光學元件可以將由物鏡142聚焦的 能量182導向檢測器180。例如，在圖4所示的實施例中，聚焦的能量182在到達檢測器180 之前經過分束器202和濾光器186。其它光學元件(例如，透鏡、鏡子、濾光器等)也可影 響聚焦的能量在物鏡142與檢測器180之間的路徑。如在圖3所示的實施例中的那樣，在 一些實施例中，物鏡142在轉角132或橫流134與樣本流123的匯合點之前建立焦點178。 在其它實施例中，物鏡142在轉角132或橫流134與樣本流123的匯合點處或其附近建立 焦點(未示出)。如上文參照圖3所述，控制器166的作用是解析(通過接線184)接收自檢測器 180(以及檢測器160，如果細胞儀200包括首次分析的話)的信號以對每個細胞150確定 細胞150是否屬于所需細胞亞群(例如，帶有X染色體的精細胞)?？刂破?66通過接線 206向可控能量源204輸出信號?？煽啬芰吭?04以與可控能量源196(圖幻相同的方式 進行操作。然而，在圖4所示的實施例中，由可控能量源204發(fā)出的能量208在一些實施例 中穿過諸如濾光器216的一個或多個光學元件之后穿過物鏡142。物鏡142的作用是在焦 點210聚焦能量208。在一些實施例中，物鏡142可以聚焦來自可控能量源204的能量208， 使聚焦的能量212通常與樣本流123同軸，并且使點210位于比點170更靠近物鏡142的 位置。本領域的普通技術人員可以理解的是，使用相同的透鏡建立焦點210和焦點178 有多種方法。圖7描述細胞儀200可用來為能量176建立焦點178和為能量212建立焦點 210的一種方法。圖7描述在能量176 (圖7中以實線標示)從焦點178 (即，從點170處的 細胞150)經過物鏡142(圖7中未示出)的透鏡214時，透鏡214作用于能量176，使能量 176的射線在其離開透鏡214時是平行的。相比之下，能量208的射線在其落射在透鏡214 上的時候略微收斂，并因此在經過透鏡214后匯合于焦點210。當然建立焦點178和焦點210有其它方法，包括利用不同波長的能量通過相同材料時的折射不同的事實，或者采用多 焦點透鏡，作為例子而非限制，如美國專利No. 6，010, 647中所述的方法。為說明的目的，圖5描述分選流式細胞儀220的另一示例性實施例。分選流式細 胞儀220包括通常參照圖3和4所描述的流徑110。類似于圖4中所示的分選流式細胞儀 200，分選流式細胞儀220省略了首次分析(以及首次分析的相關設備)。樣本流123，特 別是細胞150，向著物鏡142流動。如在前述實施例中的那樣，物鏡142在流徑110中的點 170處建立焦點178。在細胞150到達點170時，來自細胞150的能量176穿過物鏡142，物 鏡142設置成使物鏡142的光軸144通常與樣本流123同軸，且作用是聚焦能量176。物 鏡142的焦點178通常位于點170，但作為另外的選擇，可設置成便于在能量174照射細胞 150的稍后檢測自細胞150的所產生的能量176。一個或多個光學元件(如分束器202、濾 光器186等)可以將自物鏡142聚焦的能量182導向檢測器180。仍參照圖5，所示的分選流式細胞儀220包括二次分析照射源222。二次分析照射 源222發(fā)出能量224，能量2M可以是紫外能量174。由二次分析照射源222發(fā)出的能量 2M經光路移動至物鏡142。物鏡142可以將能量2M聚焦到焦點178，按照這種方式，能量 176和能量224的光路可以在一定程度上重疊。諸如分束器202和濾光器226的其它光學 元件的各種配置的作用可以是將能量2M從二次分析照射源222導向物鏡，并將(來自細 胞150)的能量176從物鏡142導向檢測器180。如上文參照圖3和4所述，控制器166的作用是解析(通過接線184)接收自檢測 器180 (和檢測器160，如果細胞儀200包括首次分析的話)的信號，用以對每個細胞150確 定細胞150是否屬于所需細胞亞群?？刂破?66通過接線230向可控能量源2 輸出信號。 可控能量源228以與可控能量源196(圖幻相同的方式進行操作，輸出導向點234的能量 232。圖6A和6B分別描述根據(jù)設想方法及裝置的流式細胞儀的其它實施例的部分235A 和235B。如參照圖2所述的那樣，在各圖6A和6B中，細胞236經流徑238在液流237中 移動，流徑238在點239或其附近改變軌跡。流徑238和/或經過流徑238的細胞236的 液流237的流體建模和/或精確形成和/或為監(jiān)測細胞236的位置而并入附加元件(未示 出)可以改善不然由在點239或其附近改變軌跡所導致的不確定性。按照這種方式可以在 改變軌跡后仍能確定個體細胞的位置和本體。圖6A描述一個實施例，其中將按與上文參照 圖3、4和5所述(分別是196、204和228)相同的方式操作的可控能量源240設置成使細 胞236移過流徑238中的點239后，所發(fā)出的能量241落射到細胞236上。圖6A描述垂直 于細胞236經流徑238的流動方向移動的能量Ml。當然，可以理解的是，作為另外的選擇， 可以將可控能量源240設置成使發(fā)出的能量241通常與細胞236經流徑238的流動方向同 軸地移動(例如，通過再次改變流動方向，并將可控能量源240設置成使流徑238中的細胞 236向著可控能量源240移動)。應當理解的是，作為另外的選擇，根據(jù)設想方法及裝置的分選流式細胞儀可以采 取如圖6B所示的“空氣中的射流(jet-in-air)”配置。圖6B描述了發(fā)射由液滴244組成 的液流243的噴嘴M2?？煽啬芰吭?未示出)通過對一個或多個液滴244施予電荷而選 擇性地改變液滴。此后，作為例子而非限制，如上所述，一對帶電板245可以根據(jù)檢測器(未 示出)的確定將由液滴244組成的液流243分選到容器246當中。
圖8A描述物鏡142和包括詢問區(qū)128在內的部分流徑110。本領域中通常已知的 是，一個或多個透鏡元件250(例如，半球前透鏡、彎月透鏡等)的作用是建立標稱焦點252。 在上文參照圖3-5所述的實施例中，標稱焦點252在樣本流123內，特別是在細胞150經過 流徑110的路徑內。標稱焦點252限定通常為錐形體254的頂點，所述錐形體254在標稱 焦點252與物鏡142的外部元件256 (形成錐形體254的基部253)之間。錐形體254可以 是正圓錐體，但也可以是斜錐形體。在錐形體254是正圓錐體的實施例中，錐軸258通常與 物鏡142的軸260同軸。在這種實施例中，軸258和260進一步與流徑110內的流動軸262 同軸，流動軸262通常限定細胞150在流徑110內移動的路徑。在一些實施例中，物鏡142的焦點252使錐形體254的側面264穿過的界面數(shù)最小 化。例如，參照圖8A，流徑壁268A形成通常為圓柱形的橫流徑270A，流徑壁268B形成通常 為圓柱形的流徑270B，所述流徑270B通常與錐形體254的軸同軸。圖8A中的錐形體254 在進入和離開包括壁268A的材料時僅穿過兩個界面。錐形體254穿過在空氣276與包括 壁268A的材料之間的界面272，并穿過在包括壁268A的材料與流徑110中的流體278之間 的界面274。此外，在一些實施例中，側面264經過的流徑110的壁268A通?？善叫杏阱F形 體254的基部253。這樣簡化了由物鏡142聚焦的能量必須穿過的界面(S卩，能量不穿過任 何曲面)，每個所述界面可通過折射作用影響物鏡142的焦點252。此外，如圖8B所示，錐 形體254可以由多個錐體257、259和261的255A、255B和255C部分連在一起形成，例如由 具有不同折射率的材料形成一個或多個界面(如界面272和274)的情況。一般來說，錐形體254必須穿過至少兩個界面272和274。在所述方法及裝置的 一些實施例中，物鏡142例如可根據(jù)形成界面(例如，壁268A)的材料的厚度和折射率情況 而考慮一個或多個界面。此外，在一些實施例中，物鏡142可以是使用折射率類似于形成界 面(例如，壁268A)的材料的浸泡介質(例如，水或油)的水蘸透鏡、水浸透鏡或油浸透鏡。 因此，如圖9所示，一些實施例通過使錐形體254穿過的材料的各折射率之差最小化而進一 步減少焦點252的變形。例如在圖9中，錐形體254可以穿過水280、壁268A和流徑110中 的流體278。物鏡142可以是水浸物鏡，其中例如壁268A由玻璃制成?；蛘?，在不必要校正 由壁268A造成的折射的情況下，例如當壁268A由折射率與流體278的折射率類似或相同 的材料形成時，物鏡142可以是水蘸透鏡。還在另外的實施例中，如在同時提交的專利申請(律師文案號30752/44821)中充 分描述的那樣，流徑110的壁268A和268B可以由折射率接近于流體278的折射率的材料 形成(即，使錐形體254穿過的材料的折射率之差最小化的材料)。例如，折射率接近于水 的材料包括折射率范圍在1.30-1. 40(含)的材料。無定形全氟聚合物、無定形氟聚合物和 全氟烷氧基聚合物系列的若干固體材料的折射率在該范圍內。作為例子而非限制，Asahi Glass Co.，Ltd.制造的 Cytop 以及 DuPont 制造的 Teflon AF 和 Teflon PFA 是三種 此類材料。在一些實施例中，所述方法或裝置也可以調節(jié)流體278的折射率，使流體278的折 射率更接近于形成流徑Iio的壁268A和/或268B的材料的折射率。特別地，所述方法或 裝置可以將流體278的折射率調節(jié)成與形成流徑110的壁268A和/或268B的材料的折射 率相差在0.02以內。在一些細胞儀中，在主體280中形成包括詢問區(qū)128在內的部分流徑110，例如圖
2310所示的主體280。圖10描述的主體280為矩形立方體，其內有鉆成或以其它方式形成的 流徑110的部分281。所述部分281包括第一流徑部分282 (通常垂直于表面284，物鏡142 可以通過表面284進行觀察)和第二流徑部分286 (通常平行于表面284，并與最靠近表面 284的第一流徑部分282的端部288交叉)。主體280例如可以是比色皿，可以由拋光的石 英、玻璃、塑料或本領域中通常已知的其它材料形成。在一些實施例中，主體280可以完全 或部分地由折射率范圍在1. 30-1. 40 (含)的材料形成，如Cytop 或Teflon AF。在如圖11示出的另一實施例中，主體280包括流徑的部分281。所述部分281包 括通常垂直于表面284 (物鏡142可以通過表面284進行觀察)的第一流徑部分282。然 而，在圖11所示的實施例中，第二流徑部分286形成具有上邊緣290的槽，通常與表面284 共面。在一些實施例中，設置在表面284頂部上的蓋玻片292可允許使用為與這種蓋玻片 292使用而校正的物鏡，用以消除不同折射率材料之間的界面的折射影響或使這種影響最 小化。還在其它實施例中，如圖12所示，主體280包括在第一流徑部分282與第二流徑 部分286的交叉處形成的儲池294。例如，第一流徑部分282可以與儲池294交叉在通常平 的底表面296處，底表面296通常與表面284平行。流徑部分286的兩部分286A和286B可 在通?？梢詾楸馄綀A筒形狀的儲池294的相對表面上與儲池294連接。當調節(jié)焦點252(圖 8和9)時，這種布置可例如通過防止錐形體254穿過通常是圓柱形橫流徑270A(圖8和9) 的壁268A而提供進一步的靈活性。圖13描述了一個類似的實施例，其中儲池294的上邊緣298與主體280的表面 284共面。水蘸物鏡(未顯示)可延伸到儲池294當中，并且如此一來可以與流經流徑110 的流體接觸，這樣可以消除不同折射率材料之間的任何界面。圖14描述又一實施例，其中蓋玻片299放置在圖13的實施例中所示的暴露儲池 之上。圖15示出從細胞樣本中選擇所需細胞亞群的方法300。在一些實施例中，方法 300或其部分方法以構成一個或多個相關裝置的控制程序的一組機器可讀指令的形式存儲 在存儲器中。處理器可以從存儲器中讀取指令和執(zhí)行指令以實施方法300。在另一實施例 中，方法300包括若干程序，所述程序可以單獨控制一個或多個裝置，可以對由一個或多個 裝置收集的數(shù)據(jù)進行分析，可以根據(jù)分析的數(shù)據(jù)做出一種或多種確定，等等。通常已知的 是，技術員或裝置可以標記(例如，通過應用Hoechst染色劑)用于分析的樣本(例如，精 細胞集)(方塊305)。標記細胞可以在分選流式細胞儀內完成，或者在分選流式細胞儀以外 的單獨過程或程序中完成。此外，應用于細胞的具體標記物可取決于細胞儀的應用。在任何情況下，標記細胞后，分選流式細胞儀可以在流徑中產生鞘液流(方塊 310)。分選流式細胞儀可以通過單獨的輸入端將樣本(即，標記的細胞)注入流徑(方塊 315)，優(yōu)選在鞘液流的中心或其附近。還優(yōu)選的是，樣本相對于鞘液流以緩慢的方式進入鞘 液流，使樣本內的單細胞(例如精細胞)與平行于鞘液流的長軸對準，并且使細胞以通常單 行的模式流動。在細胞經流徑移動時，諸如UV激光器的激發(fā)能量源照射樣本(方塊320)。激發(fā)能 量源可以不斷地照射流徑，或者在處理器上執(zhí)行的程序可以控制激發(fā)能量源選擇性地照射 流徑(例如，只有當樣本存在于流徑中的時候)。
物鏡或其它聚焦裝置的作用是在與液流同軸的方向上聚焦由每個細胞發(fā)出、傳輸 或反射的能量(例如由標記物發(fā)出的熒光)(方塊325)。也就是說，在流徑內合并的鞘流和 樣本通常向著具有光軸的物鏡移動，所述光軸通常與液流同軸，并且名義上而言，樣本內的 每個細胞經過物鏡的焦點。檢測器接收由物鏡聚焦的能量(方塊330)，并對控制器發(fā)送代 表檢測能量的信號。在一些實施例中，檢測器每秒可以單獨檢測從超過40，000個細胞聚焦 的能量、每秒可以單獨檢測從超過75，000個細胞聚焦的能量或者每秒可以單獨檢測從超 過100，000個細胞聚焦的能量?？刂破鹘邮沾頇z測能量的信號并分析數(shù)據(jù)(方塊335)以確定(方塊340)數(shù)據(jù) 所代表的是所需亞群內的細胞、不是所需亞群內的細胞，還是既不能確定在所需亞群也不 能確定不在所需亞群的不確定的細胞。在后一種情況下，控制器可以如同檢測器已確定細 胞不在所需亞群的那樣對細胞進行處理。如果控制器確定細胞不在所需亞群或者是不確定 的，控制器可以對諸如紅外激光器的可控能量源發(fā)送信號以照射細胞(例如，改變細胞、破 壞細胞、使細胞無法存活等)(方塊345)?；蛘?，如果控制器確定細胞在所需的亞群，控制器 可以對可控能量源發(fā)送信號(或不再發(fā)送信號)，使可控能量源不照射細胞(方塊350)。所述裝置可用于收集細胞供過程末期使用和/或進一步處理(例如，分離細胞)。 在可以包括圖15所示實施例的一些實施例中，控制器對可控能量源發(fā)送信號，對確定在所 需亞群的細胞不進行改變(即，不照射)，所得到的經處理的細胞集具有的所需細胞亞群中 的細胞與未被改變的細胞總數(shù)之比大于或等于60%。此外，在可以包括圖15所示實施例的 一些實施例中，控制器對可控能量源發(fā)送信號，對確定在所需亞群的細胞不進行改變(即， 不照射)，所得到的經處理的細胞集具有的所需亞群中被改變的細胞與所需亞群中的細胞 總數(shù)之比小于或等于50%。當然，上述方法反映的是本發(fā)明所述方法的一個或多個實施例，但也可以包括一 個或多個附加的步驟或程序，如在整個本說明書中參照各實施例描述的那樣。此外，一些實 施例可以省略參照方法300描述的一個或多個步驟或程序。作為例子而非限制，在一些實 施例中，標記物可自動發(fā)出熒光，從而不再需要用照射能量源照射樣本。此外，在一些實施 例中(如上所述)，所述方法可以顛倒方塊345和350，不用可控能量源進行照射而允許確 定不在所需亞群的細胞通過，而使可控能量源照射確定在所需亞群的細胞。所述方法及裝置提供的許多重要的優(yōu)點都優(yōu)于目前已實施的分選流式細胞儀。作 為一項優(yōu)點，本發(fā)明所述的方法及裝置不使分析物細胞(在一些實施例中為哺乳動物精細 胞)受限于分選流式細胞儀中通常采用的空氣中射流的配置。其結果是，根據(jù)本發(fā)明所述 實施例的細胞儀不將分析物細胞暴露于細胞儀外部的環(huán)境或分選液滴與容器所產生的碰 撞，并且不會經歷與空氣中的射流配置的噴嘴相關的壓力和壓力變化。這允許在實施嚴格 的空氣質量條件和溫度控制的環(huán)境以外使用細胞儀(例如，在“無塵室”環(huán)境以外)。實際 上，細胞儀本身可以實施溫度控制，從而擴充分析物細胞的存活能力。此外，本發(fā)明所述方 法及裝置可以更快和/或更精確地檢測和改變分析物細胞，這部分是因為通常物鏡與分析 物通過詢問區(qū)的流動同軸對準緩解和/或消除了與由分析物各向異性地發(fā)出能量相關的 問題，特別是在用來分選許多類型哺乳動物精細胞的實施例中。在閱讀本文中公開的方法 及裝置的說明書之后，本發(fā)明所述的方法及裝置的其它優(yōu)點對本領域的普通技術人員而言 將是顯而易見的。
雖然前文給出了對許多不同實施例的詳細描述，但應該理解的是，保護范圍由隨 后的權利要求的文字所限定。詳細描述僅可視為是示例性的，并不描述全部可能的實施例， 因為描述全部可能的實施例即使并非不可能，也是不切實際的?？梢圆捎矛F(xiàn)有技術或本專 利提交日之后開發(fā)的技術實施許多替代性實施例，這也在所述權利要求的范圍以內。因此，在不偏離本權利要求書的實質和范圍的情況下可以對本文中所描述和說明 的技術和結構做出許多修改和變化。因此，應當理解的是，本文中所述的方法及裝置僅是示 例性的，并不限制權利要求的范圍。上述說明書描述至少以下各方面1. 一種從包括第一組細胞和第二組細胞的細胞群中選擇第一組細胞的方法，該方 法包括對細胞群進行標記，以便可以區(qū)分第一組細胞與第二組細胞；提供具有遠端、近端、設置在近端與遠端之間的詢問區(qū)、和流動軸的第一流徑；產生通過第一流徑的鞘液的鞘流，鞘流以第一流速朝近端移動；在近端上游點處將包括細胞群的樣本流注入鞘流，該樣本流具有低于第一流速的 初始第二流速；提供激發(fā)能量源，當個體細胞經過詢問區(qū)時，由激發(fā)能量源發(fā)出的能量作用于個 體細胞，并引起自細胞發(fā)出或傳輸二次輻射；當細胞經過詢問區(qū)時，使用具有通常與流動軸同軸對準的光軸的物鏡聚焦自個體 細胞的二次輻射；檢測自個體細胞的聚焦二次輻射；由檢測的二次輻射確定個體細胞是在第一組還是在第二組；以及選擇確定在第一組的細胞。2.根據(jù)第1方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細胞包括對不是確定在第 一組的細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎中的一種處理。3.根據(jù)第1方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細胞包括由噴嘴噴射細胞 流，由該流產生許多液滴，對液滴選擇性地施加電荷，以及根據(jù)每個液滴的電荷對液滴進行 分選。4.根據(jù)第1至3中任一方面所述的方法，其中標記細胞群包括對細胞染色。5.根據(jù)第1至4中任一方面所述的方法，其中引起發(fā)出二次輻射包括引起發(fā)出熒光。6.根據(jù)第1至5中任一方面所述的方法，其中由激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過物鏡。7.根據(jù)第1至6中任一方面所述的方法，其中的細胞是精細胞，并且進一步地，其 中第一組細胞包括帶有X染色體的細胞或帶有Y染色體的細胞任一者。8.根據(jù)第1至7中任一方面所述的方法，其中選擇確定在第一組的細胞包括使用 區(qū)別能量源照射不是確定在第一組的細胞。9.根據(jù)第8方面所述的方法，其中的區(qū)別能量源是近紅外激光器。10.根據(jù)第8方面或第9方面所述的方法，其中由區(qū)別能量源發(fā)出的能量穿過物
^Mi ο11.根據(jù)第1至10中任一方面所述的方法，其中提供激發(fā)能量源包括提供紫外激光器。
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12.根據(jù)第10方面所述的方法，進一步包括選擇區(qū)別能量源的波長、第一流速、第二流速和物鏡的組合，使得物鏡的標稱焦點 與區(qū)別能量源的標稱焦點隔開一定的距離，該距離是在檢測聚焦二次輻射與使用區(qū)別能量 源照射不是確定不在第一組的細胞的過程之間個體細胞所經過的流徑的距離。13.根據(jù)第8方面或第10方面所述的方法，其中提供激發(fā)能量源包括提供從區(qū)別 能量源中衰減的輸出。14.根據(jù)第1至13中任一方面所述的方法，進一步包括提供垂直于流動軸并設置 在第一流徑的近端的第二流徑，使得細胞在經過詢問區(qū)并到達第一流徑的近端后進入第二 流徑并遠離詢問區(qū)。15.根據(jù)第1至14中任一方面所述的方法，其中提供流徑進一步包括提供由折射 率范圍在1. 30-1. 40 (含)的材料形成的流徑。16.根據(jù)第1至15中任一方面所述的方法，進一步包括調整含細胞群的溶液的折 射率，使得溶液的折射率與形成流徑的材料的折射率相差在0. 02以內。17. 一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的裝置，該裝置 包括流體流徑，具有具有流動軸的第一流動部分，和第二流動部分，第一與第二流動部分在第一流動部分的測量端相交；設置在第一流動部分的測量端或其附近的詢問區(qū)；以流體流動的方式與流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動的方式與流體流徑連通的樣本輸入端；具有標稱焦點和光軸并設置在第一流動部分的測量端的物鏡，該物鏡對準第一流 動部分，使標稱焦點沿著流動軸且在詢問區(qū)，并且使光軸通常與流動軸同軸對準；設置檢測由物鏡聚焦的光的檢測器；與檢測器通信連接的邏輯程序，可操作該邏輯程序以確定樣本細胞群中的細胞是 否屬于所需細胞亞群，并且可進一步操作該邏輯程序以根據(jù)對細胞是否屬于所需細胞亞群 的確定來輸出信號；和可控能量源，該可控能量源與邏輯程序通信連接，并且可操作該可控能量源以 根據(jù)至少由邏輯程序輸出的信號選擇性地改變所需細胞亞群中的細胞或不在所需細胞亞 群中的細胞。18.根據(jù)第17方面所述的裝置，其中可控能量源通過對不是確定在所需亞群中的 一個或多個細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來選擇性地改變細胞。19.根據(jù)第17方面或第18方面所述的裝置，還包括激發(fā)能量源。20.根據(jù)第19方面所述的裝置，其中由激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過物鏡。21.根據(jù)第19方面或第20方面所述的裝置，其中激發(fā)能量源包括具有作為輸入端 的可控能量源的衰減器。 22.根據(jù)第17至21中任一方面所述的裝置，其中由可控能量源發(fā)出的能量穿過物
23.根據(jù)第17至22中任一方面所述的裝置，其中可控能量源包括激光器。24.根據(jù)第17至23中任一方面所述的裝置，其中可控能量源包括近紅外激光器。25.根據(jù)第17至24中任一方面所述的裝置，還包括在其中形成流徑的主體。26.根據(jù)第25方面所述的裝置，還包括在主體的第一表面形成第二流動部分的 槽，其中第一流動部分的測量端與該槽相交于該第一表面。27.根據(jù)第25方面所述的裝置，還包括通過主體的第一內部通道，其從主體的第一表面延伸至主體內的一點并形成第一 流動部分；和通過主體的第二內部通道，其從主體內的所述點延伸至主體的第二表面。28.根據(jù)第25至27中任一方面所述的裝置，其中主體由折射率為1. 30-1. 40 (含) 的材料形成。29.根據(jù)第28方面所述的裝置，其中該材料包括無定形全氟聚合物、無定形氟聚 合物或全氟烷氧基聚合物。30.根據(jù)第17至29中任一方面所述的裝置，其中物鏡是水浸透鏡或者是水蘸透
^Mi ο31.根據(jù)第17至30中任一方面所述的裝置，其中樣本細胞群包括精細胞。32.根據(jù)第31方面所述的裝置，其中所需細胞群包括帶有X染色體的細胞或帶有 Y染色體的細胞。33. 一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的系統(tǒng)，該系統(tǒng) 包括具有流動軸的流體流徑；設置在流體流徑內的詢問區(qū)；以流體流動的方式與流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動的方式與鞘液輸入端連通的第一泵；以流體流動的方式與流體流徑連通的樣本流體輸入端；以流體流動的方式與樣本流體輸入端連通的第二泵；物鏡，具有標稱焦點和光軸，并設置成使標稱焦點沿著流動軸并在詢問區(qū)，且使光 軸通常在詢問區(qū)與流動軸同軸對準；設置檢測由物鏡聚焦的光的檢測器；可控能量源；與計算機可讀存儲介質、檢測器和可控能量源通信連接的處理器；以及其中處理器和可控能量源配合，根據(jù)處理器的輸出選擇性地改變所需細胞亞群中 的細胞或不在所需細胞亞群中的細胞。34.根據(jù)第33方面所述的系統(tǒng)，進一步地，其中處理器和可控能量源合作，通過對 不是確定在所需細胞亞群中的一個或多個細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來 選擇性地改變所需細胞亞群中的細胞。35.根據(jù)第33方面或第34方面所述的系統(tǒng)，其中由可控能量源發(fā)出的能量穿過物

36.根據(jù)第33至35中任一方面所述的系統(tǒng)，其中可控能量源包括近紅外激光器。
37.根據(jù)第33至35中任一方面所述的系統(tǒng)，還包括由折射率為1. 30-1. 40 (含) 的材料形成的主體。38.根據(jù)第33至37中任一方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細胞群包括精細胞。39.根據(jù)第38方面所述的系統(tǒng)，其中所需的亞群是帶有X染色體的細胞或帶有Y 染色體的細胞。40. 一種檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的方法，該方法具體 實施為在處理器上執(zhí)行并儲存在有形介質上的一套機器可讀的指令，該方法包括控制樣本細胞群通過具有流動軸的流徑的流動；控制照射源以對樣本細胞群中的細胞經過的詢問區(qū)進行照射；接收來自具有物鏡的光路上的檢測器的數(shù)據(jù)，該物鏡具有光軸和標稱焦點，光軸 通常與流動軸同軸對準，標稱焦點在詢問區(qū)內；由接收到的數(shù)據(jù)確定樣本細胞群中的一個細胞在詢問區(qū)中的存在；由接收到的數(shù)據(jù)確定該一個樣本細胞是否屬于所需細胞亞群；以及根據(jù)至少對該一個樣本細胞是否屬于所需細胞亞群的確定來控制細胞選擇能量 源。41.根據(jù)第40方面所述的方法，其中控制細胞選擇能量源包括確定該一個樣本細胞通過詢問區(qū)的流速；以及根據(jù)確定的該一個樣本細胞通過流徑的流速來控制細胞選擇能量源，由此選擇性 地照射該一個細胞。42.根據(jù)第40方面所述的方法，其中控制細胞選擇能量源包括對包含一個細胞的 液滴選擇性地施加電荷。43. 一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的系統(tǒng)，該系統(tǒng) 包括具有詢問區(qū)和詢問區(qū)中的流動軸的流徑；控制樣本細胞群通過流徑的流動的控制裝置；當樣本細胞經過詢問區(qū)時對它們進行照射的照射裝置；具有光軸和標稱焦點的物鏡，該光軸通常與流動軸同軸對準，該標稱焦點在詢問 區(qū)內；檢測由物鏡聚焦的能量并提供有關檢測能量數(shù)據(jù)的檢測裝置；接收有關檢測能量數(shù)據(jù)并確定經過詢問區(qū)的個體樣本細胞是否屬于所需亞群的 處理裝置；選擇性地照射樣本細胞的細胞選擇裝置；和根據(jù)至少對個體樣本細胞是否屬于所需亞群的確定來控制細胞選擇裝置的細胞 選擇控制裝置。44.根據(jù)第43方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細胞群包括精細胞群，且其中所需的細 胞亞群包括帶有X染色體的精細胞。45.根據(jù)第43方面所述的系統(tǒng)，其中樣本細胞群包括精細胞群，且其中所需的細 胞亞群包括帶有Y染色體的精細胞。46.根據(jù)第43至45中任一方面所述的系統(tǒng)，其中由細胞選擇裝置發(fā)出的能量在到達樣本細胞前穿過物鏡。47.根據(jù)第43至46中任一方面所述的系統(tǒng)，其中至少部分流徑由折射率為 1·30-1·40(含)的材料形成。48. 一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的方法，該方法 包括產生攜帶通常為單行前進的樣本細胞通過流徑的流動；當樣本細胞在流徑中經過詢問區(qū)時照射樣本細胞；定位物鏡，使得物鏡的光軸通常與流徑同軸，
流束通過流徑向物鏡移動，且物鏡具有在詢問區(qū)中的標稱焦點；當樣本細胞經過詢問區(qū)時檢測個體樣本細胞的參數(shù)；解釋檢測到的個體樣本細胞的參數(shù)以確定個體樣本細胞是否屬于所需亞群；根據(jù)對個體樣本細胞是否屬于所需細胞亞群的確定對一個或多個樣本細胞群進 行選擇性的衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎；以及收集所得到的經處理的細胞群。49.根據(jù)第48方面所述的方法其中樣本細胞群包括精細胞；其中所需細胞亞群包括具有X染色體的細胞或具有Y染色體的細胞；且其中當樣本細胞經過詢問區(qū)時檢測個體樣本細胞的參數(shù)包括當細胞經過詢問區(qū) 時每秒鐘檢測超過40，000個樣本細胞的參數(shù)。50.根據(jù)第48方面所述的方法，其中當樣本細胞經過詢問區(qū)時檢測個體樣本細胞 的參數(shù)包括當細胞經過詢問區(qū)時每秒鐘檢測超過75，000個樣本細胞的參數(shù)。51.根據(jù)第48方面所述的方法，其中當樣本細胞經過詢問區(qū)時檢測個體樣本細胞 的參數(shù)包括當細胞經過詢問區(qū)時每秒鐘檢測超過100，000個樣本細胞的參數(shù)。52.根據(jù)第48至51中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細胞并不改變確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有 的所需細胞亞群中的細胞與未被改變的細胞總數(shù)之比大于或等于60%。53.根據(jù)第48至51中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細胞改變了確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的 所需細胞亞群中的細胞與被改變的細胞總數(shù)之比大于或等于60%。54.根據(jù)第48至53中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細胞并不改變確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有 的所需亞群中被改變的細胞與所需亞群中的細胞總數(shù)之比小于或等于50%。55.根據(jù)第48至53中任一方面所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、 分裂或破碎細胞改變了確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的 所需亞群中未被改變的細胞與所需亞群中的細胞總數(shù)之比小于或等于50%。
權利要求
1.一種從包括第一組細胞和第二組細胞的細胞群中選擇第一組細胞的方法，所述方法 包括對所述細胞群進行標記，以便可以區(qū)分所述第一組細胞與所述第二組細胞； 提供具有遠端、近端、設置在所述近端與所述遠端之間的詢問區(qū)、和流動軸的第一流徑；產生通過所述第一流徑的鞘液的鞘流，所述鞘流以第一流速朝所述近端移動； 在所述近端上游點處將包括細胞群的樣本流注入所述鞘流，所述樣本流具有低于所述 第一流速的初始第二流速；提供激發(fā)能量源，當個體細胞經過詢問區(qū)時，由所述激發(fā)能量源發(fā)出的能量作用于個 體細胞，并引起自所述細胞發(fā)出或傳輸二次輻射；當所述細胞經過所述詢問區(qū)時，使用具有通常與所述流動軸同軸對準的光軸的物鏡聚 焦自所述個體細胞的二次輻射；檢測自所述個體細胞的聚焦二次輻射；由檢測的二次輻射確定所述個體細胞是在所述第一組還是在所述第二組；以及 選擇確定在所述第一組的細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細胞包括對不是確定在 所述第一組的細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細胞包括 由噴嘴噴射細胞流；由所述流產生許多液滴；對所述液滴選擇性地施加電荷；以及根據(jù)每個液滴的電荷對所述液滴進行分選。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中由所述激發(fā)能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞是精細胞，且進一步地，其中所述第一組 細胞包括帶有X染色體的細胞或帶有Y染色體的細胞。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中選擇確定在所述第一組的細胞包括使用區(qū)別能量 源照射不是確定在所述第一組的細胞。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中由所述區(qū)別能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，進一步包括選擇所述區(qū)別能量源的波長、所述第一流速、所述第二流速和所述物鏡的組合，使得所 述物鏡的標稱焦點與所述區(qū)別能量源的標稱焦點隔開一定的距離，所述距離是在檢測所述 聚焦二次輻射與使用所述區(qū)別能量源照射不是確定不在所述第一組的細胞的過程之間所 述個體細胞所經過的所述流徑的距離。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括提供垂直于所述流動軸并設置在所述第一 流徑的近端的第二流徑，使得所述細胞在經過所述詢問區(qū)并到達所述第一流徑的近端后進 入所述第二流徑并遠離所述詢問區(qū)。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中提供流徑進一步包括提供由折射率范圍在 1. 30-1. 40 (含)的材料形成的流徑。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括調整含所述細胞群的溶液的折射率，使得所述溶液的折射率與形成所述流徑的材料的折射率相差在0. 02以內。
12.一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的裝置，所述裝置包括流體流徑，具有具有流動軸的第一流動部分，和第二流動部分，所述第一與所述第二流動部分在所述第一流動部分的測量端相交； 設置在所述第一流動部分的測量端或其附近的詢問區(qū)； 以流體流動的方式與所述流體流徑連通的鞘液輸入端； 以流體流動的方式與所述流體流徑連通的樣本輸入端；具有標稱焦點和光軸并設置在所述第一流動部分的測量端的物鏡，所述物鏡對準所述 第一流動部分，使所述標稱焦點沿著所述流動軸且在所述詢問區(qū)，并且使所述光軸通常與 所述流動軸同軸對準；設置檢測由所述物鏡聚焦的光的檢測器；與所述檢測器通信連接的邏輯程序，可操作所述邏輯程序以確定所述樣本細胞群中的 細胞是否屬于所需細胞亞群，并且可進一步操作所述邏輯程序以根據(jù)對所述細胞是否屬于 所需細胞亞群的確定來輸出信號；和可控能量源，所述可控能量源與所述邏輯程序通信連接，并且可操作所述可控能量源 以根據(jù)至少由所述邏輯程序輸出的信號選擇性地改變所需細胞亞群中的細胞或不在所需 細胞亞群中的細胞。
13.根據(jù)權利要求12所述的裝置，其中所述可控能量源通過對不是確定在所需亞群中 的一個或多個細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎來選擇性地改變細胞。
14.根據(jù)權利要求12所述的裝置，還包括激發(fā)能量源，且其中由所述激發(fā)源發(fā)出的能 量穿過所述物鏡。
15.根據(jù)權利要求14所述的裝置，其中所述激發(fā)能量源包括具有作為輸入端的可控能 量源的衰減器。
16.根據(jù)權利要求12所述的裝置，其中由所述可控能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
17.根據(jù)權利要求12所述的裝置，還包括在其中形成所述流徑的主體。
18.根據(jù)權利要求17所述的裝置，還包括在所述主體的第一表面形成所述第二流動部 分的槽，其中所述第一流動部分的測量端與所述槽相交于所述第一表面。
19.根據(jù)權利要求17所述的裝置，還包括通過所述主體的第一內部通道，其從所述主體的第一表面延伸至所述主體內的一點并 形成所述第一流動部分；和通過所述主體的第二內部通道，其從所述主體內的所述點延伸至所述主體的第二表
20.根據(jù)權利要求17所述的裝置，其中所述主體由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成。
21.根據(jù)權利要求20所述的裝置，其中所述材料包括無定形全氟聚合物、無定形氟聚 合物或全氟烷氧基聚合物。
22.根據(jù)權利要求12所述的裝置，其中所述物鏡是水浸透鏡或者是水蘸透鏡。
23.根據(jù)權利要求12所述的裝置，其中所述樣本細胞群包括精細胞，且其中所需細胞 群包括帶有X染色體的細胞或帶有Y染色體的細胞。
24.一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括具有流動軸的流體流徑；設置在所述流體流徑內的詢問區(qū)；以流體流動的方式與所述流體流徑連通的鞘液輸入端；以流體流動的方式與所述鞘液輸入端連通的第一泵；以流體流動的方式與所述流體流徑連通的樣本流體輸入端；以流體流動的方式與所述樣本流體輸入端連通的第二泵；物鏡，具有標稱焦點和光軸，并設置成使所述標稱焦點沿著所述流動軸并在所述詢問 區(qū)，且使所述光軸通常在所述詢問區(qū)與所述流動軸同軸對準； 設置檢測由所述物鏡聚焦的光的檢測器； 可控能量源；與計算機可讀存儲介質、所述檢測器和所述可控能量源通信連接的處理器；且 其中所述處理器和所述可控能量源配合，根據(jù)所述處理器的輸出選擇性地改變所需細 胞亞群中的細胞或不在所需細胞亞群中的細胞。
25.根據(jù)權利要求M所述的系統(tǒng)，進一步地，其中所述處理器和所述可控能量源合作， 通過對不是確定在所需細胞亞群中的一個或多個細胞進行衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或 破碎來選擇性地改變所需細胞亞群中的細胞。
26.根據(jù)權利要求M所述的系統(tǒng)，其中由所述可控能量源發(fā)出的能量穿過所述物鏡。
27.根據(jù)權利要求M所述的系統(tǒng)，還包括由折射率為1.30-1.40(含)的材料形成的主體。
28.根據(jù)權利要求M所述的系統(tǒng)，其中所述樣本細胞群包括精細胞，且其中所需亞群 是帶有X染色體的細胞或帶有Y染色體的細胞。
29.一種檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的方法，所述方法具體實 施為在處理器上執(zhí)行并儲存在有形介質上的一套機器可讀的指令，所述方法包括控制樣本細胞群通過具有流動軸的流徑的流動； 控制照射源以對樣本細胞群中的細胞經過的詢問區(qū)進行照射； 接收來自具有物鏡的光路上的檢測器的數(shù)據(jù)，所述物鏡具有光軸和標稱焦點，所述光 軸通常與所述流動軸同軸對準，所述標稱焦點在所述詢問區(qū)內；由接收到的數(shù)據(jù)確定所述樣本細胞群中的一個細胞在所述詢問區(qū)中的存在； 由接收到的數(shù)據(jù)確定所述一個樣本細胞是否屬于所需細胞亞群；以及 根據(jù)至少對所述一個樣本細胞是否屬于所需細胞亞群的確定來控制細胞選擇能量源。
30.根據(jù)權利要求四所述的方法，其中控制所述細胞選擇能量源包括 確定所述一個樣本細胞通過所述詢問區(qū)的流速；以及根據(jù)確定的所述一個樣本細胞通過所述流徑的流速來控制所述細胞選擇能量源，由此 選擇性地照射所述一個細胞。
31.根據(jù)權利要求四所述的方法，其中控制所述細胞選擇能量源包括對包含一個細胞 的液滴選擇性地施加電荷。
32.一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括具有詢問區(qū)和所述詢問區(qū)中的流動軸的流徑； 控制所述樣本細胞群通過所述流徑的流動的控制裝置； 當所述樣本細胞經過所述詢問區(qū)時對它們進行照射的照射裝置； 具有光軸和標稱焦點的物鏡，所述光軸通常與所述流動軸同軸對準，所述標稱焦點在 所述詢問區(qū)內；檢測由所述物鏡聚焦的能量并提供有關檢測能量數(shù)據(jù)的檢測裝置； 接收有關檢測能量數(shù)據(jù)并確定經過所述詢問區(qū)的個體樣本細胞是否屬于所需亞群的 處理裝置；選擇性地照射所述樣本細胞的細胞選擇裝置；和根據(jù)至少對所述個體樣本細胞是否屬于所需亞群的確定來控制所述細胞選擇裝置的 細胞選擇控制裝置。
33.根據(jù)權利要求32所述的系統(tǒng)，其中所述樣本細胞群包括精細胞群，且其中所需的 細胞亞群包括帶有X染色體的精細胞；或 帶有Y染色體的精細胞。
34.根據(jù)權利要求32所述的系統(tǒng)，其中由所述細胞選擇裝置發(fā)出的能量在到達所述樣 本細胞前穿過所述物鏡。
35.根據(jù)權利要求32所述的系統(tǒng)，其中至少部分所述流徑由折射率為1.30-1.40(含) 的材料形成。
36.一種用于檢測和選擇性地改變樣本細胞群中的所需細胞亞群的方法，所述方法包括產生攜帶通常為單行前進的樣本細胞通過流徑的流動； 當所述樣本細胞在所述流徑中經過詢問區(qū)時照射所述樣本細胞； 定位物鏡，使得所述物鏡的光軸通常與所述流徑同軸，流束通過所述流徑向所述物鏡移動，且所述物 鏡具有在所述詢問區(qū)中的標稱焦點；當所述樣本細胞經過所述詢問區(qū)時檢測個體樣本細胞的參數(shù)；解釋檢測到的所述個體樣本細胞的參數(shù)以確定所述個體樣本細胞是否屬于所需亞群；根據(jù)對所述個體樣本細胞是否屬于所需細胞亞群的確定對一個或多個所述樣本細胞 群進行選擇性的衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎；以及 收集所得到的經處理的細胞群。
37.根據(jù)權利要求36所述的方法 其中所述樣本細胞群包括精細胞；其中所需細胞亞群包括具有X染色體的細胞或具有Y染色體的細胞；且其中當所述樣本細胞經過所述詢問區(qū)時檢測所述個體樣本細胞的參數(shù)包括當所述細 胞經過所述詢問區(qū)時每秒鐘檢測超過40，000個樣本細胞的參數(shù)。
38.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中當所述樣本細胞經過所述詢問區(qū)時檢測所述個 體樣本細胞的參數(shù)包括當所述細胞經過所述詢問區(qū)時每秒鐘檢測超過75，000個樣本細胞 的參數(shù)。
39.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中當所述樣本細胞經過所述詢問區(qū)時檢測所述個 體樣本細胞的參數(shù)包括當所述細胞經過所述詢問區(qū)時每秒鐘檢測超過100，000個樣本細 胞的參數(shù)。
40.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細胞并不改變確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的所需細 胞亞群中的細胞與未被改變的細胞總數(shù)之比大于或等于60%。
41.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細胞改變了確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的所需細胞 亞群中的細胞與被改變的細胞總數(shù)之比大于或等于60%。
42.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細胞并不改變確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的所需亞 群中被改變的細胞與所需亞群中的細胞總數(shù)之比小于或等于50%。
43.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中選擇性地衍化、殺死、破壞、修飾、分裂或破碎所 述細胞改變了確定在所需亞群中的細胞，且其中所得到的經處理的細胞群具有的所需亞群 中未被改變的細胞與所需亞群中的細胞總數(shù)之比小于或等于50%。
全文摘要
用于分選流式細胞儀的方法、裝置和系統(tǒng)，包括物鏡，所述物鏡具有在焦點處與流徑同軸對準的光軸?？煽啬芰吭锤鶕?jù)對分析物是否在所需亞群的確定選擇性地改變分析物。在各實施例中，由可控能量源發(fā)出的光和/或由照射能量源發(fā)出的光中之一或二者穿過物鏡。在由可控能量源發(fā)出的光穿過物鏡的一些實施例中，物鏡可以在與分析物的檢測信號的焦點不同的點、特別是在靠近物鏡的點處聚焦由可控能量源發(fā)出的光。
文檔編號G01N33/483GK102119212SQ200980131133
公開日2011年7月6日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權日2008年6月30日
發(fā)明者M·盧舍爾 申請人:邁克必斯生物系統(tǒng)公司