一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用電沉積方法得到松枝狀納米金銅合金，制備一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物抗原的電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，檢測(cè)線性范圍為0.0005~500ng/mL，檢測(cè)限0.15pg/mL。
【專利說明】一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用電沉積方法得到松枝狀納米金銅合金，制備一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物抗原的電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]目前電化學(xué)免疫傳感器已經(jīng)廣泛用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，因?yàn)殡娀瘜W(xué)免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動(dòng)化檢測(cè)分析等一系列優(yōu)點(diǎn)。其中，由于無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器可以直接用于檢測(cè)抗原抗體的識(shí)別過程并且避免了標(biāo)記物帶來的干擾，得到了更加廣泛的關(guān)注。
[0003]本發(fā)明利用簡(jiǎn)單的電沉積方法，得到了松枝狀的納米金銅合金。首先，不需要引入其他電子媒介體，合金中的銅可以直接產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)；其次，不需要引入任何連接劑，合金中的金可以用于抗體的固定和促進(jìn)電子的傳遞；最后，松枝狀的形貌增加了與蛋白質(zhì)的接觸面積，進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白質(zhì)和電極之間的電子傳遞。該方法在檢測(cè)過程中產(chǎn)生了良好的電化學(xué)信號(hào)，可用于多種腫瘤標(biāo)志物抗原的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，而且制備過程較為簡(jiǎn)單，有效克服了目前腫瘤標(biāo)志物抗原檢測(cè)方法的不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是基于松枝狀納米金銅合金，構(gòu)建了一種無電子媒介體、無標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器。
[0005]本發(fā)明的目的之二是將該無標(biāo)記電化學(xué)傳感器應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、特異性檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法:
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mffl的氧化鋁粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> (2)以10mL含有濃度為10 mmol/L的硫酸鈉、5 mmol/L的氯金酸、10 mmol/L的硫酸和10 mmol/L的硫酸銅溶液為底液，在-0.8 V電壓下掃描400?600 S，得到電沉積松枝狀納米金銅修飾的電極；
(3)繼續(xù)將6μ?濃度為8?12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為5?15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0005?500 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0007]腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)步驟:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)選擇循環(huán)伏安法對(duì)腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行檢測(cè)，將電壓設(shè)置為-0.8、.8 V，記錄電流的變化，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。
[0008]3.上述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:TPA、CEA、SCCA、CD146、AFP、CA724。
[0009]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明首次利用新方法電沉積得到松枝狀納米金銅合金，在構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的過程中，即作為信號(hào)生成器有作為信號(hào)放大器。
[0010](2)本發(fā)明不需要引入其他電子媒介體，合金中的銅可以直接產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。
[0011](3)本發(fā)明不需要引入任何連接劑，合金中的金可用于抗體的固定和促進(jìn)電子的傳遞。
[0012](4)松枝狀的形貌增加了與蛋白質(zhì)的接觸面積，顯著促進(jìn)了蛋白質(zhì)和電極之間的電子傳遞。
[0013](5)本發(fā)明將制備的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于腫瘤標(biāo)志物抗原的檢測(cè)，檢測(cè)限低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、靈敏和特異性檢測(cè)。線性范圍為0.0005?500 ng/mL,檢測(cè)限可達(dá)至Ij 0.15 pg/mLo

【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法:
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mffl的氧化鋁粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> (2)以10mL含有濃度為10 mmol/L的硫酸鈉、5 mmol/L的氯金酸、10 mmol/L的硫酸和10 mmol/L的硫酸銅溶液為底液，在-0.8 V電壓下掃描400 S，得到電沉積松枝狀納米金銅修飾的電極；
(3)繼續(xù)將6μ?濃度為8 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0005?500 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0015]實(shí)施例2基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法:
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mffl的氧化鋁粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> (2)以10mL含有濃度為10 mmol/L的硫酸鈉、5 mmol/L的氯金酸、10 mmol/L的硫酸和10 mmol/L的硫酸銅溶液為底液，在-0.8 V電壓下掃描500 S，得到電沉積松枝狀納米金銅修飾的電極； (3)繼續(xù)將6μ?濃度為10 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0005?500 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0016]實(shí)施例3基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法:
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mffl的氧化鋁粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑?br> (2)以10mL含有濃度為10 mmol/L的硫酸鈉、5 mmol/L的氯金酸、10 mmol/L的硫酸和10 mmol/L的硫酸銅溶液為底液，在-0.8 V電壓下掃描600 S，得到電沉積松枝狀納米金銅修飾的電極；
(3)繼續(xù)將6PL濃度為12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3μ L濃度為15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.0005?500 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0017]實(shí)施例4腫瘤標(biāo)志物CA724的檢測(cè)步驟:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)選擇循環(huán)伏安法對(duì)腫瘤標(biāo)志物CA724進(jìn)行檢測(cè)，將電壓設(shè)置為-0.88 V，記錄電流的變化，繪制工作曲線；
(3)將待測(cè)樣品溶液代替腫瘤標(biāo)志物CA724標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。
[0018](4)該電化學(xué)免疫傳感器對(duì)腫瘤標(biāo)志物CA724檢測(cè)線性范圍為0.0005?500 ng/mL，檢測(cè)限 0.15 pg/mLo
[0019]實(shí)施例5按照實(shí)施例4的方法對(duì)TPA、CEA、SCCA,⑶146、AFP進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得線性范圍為 0.0005?500 ng/mL，檢測(cè)限 0.18 pg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)依次用1.0,0.3,0.05 Mffl的氧化鋁粉末對(duì)玻碳電極進(jìn)行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮?dú)獯蹈桑? (2)以10mL含有濃度為10 mmol/L的硫酸鈉、5 mmol/L的氯金酸、10 mmol/L的硫酸和10 mmol/L的硫酸銅溶液為底液，在-0.8 V電壓下掃描400?600 S，得到電沉積松枝狀納米金銅修飾的電極； (3)繼續(xù)將6μ?濃度為8?12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈； (4)用3μ L濃度為5?15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈； (5)將6μ L濃度為0.0005?500 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法，其特征在于，用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試； (2)選擇循環(huán)伏安法對(duì)腫瘤標(biāo)志物抗原進(jìn)行檢測(cè)，將電壓設(shè)置為-0.8、.8 V，記錄電流的變化，繪制工作曲線； (3)將待測(cè)樣品溶液代替腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。
3.如權(quán)利要求1?2所述的一種基于松枝狀納米金銅的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:TPA、CEA、SCCA, CD146、AFP、CA724。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK104407138SQ201410635022
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】王玉蘭, 閆濤, 李月云, 龐雪輝, 吳丹, 馬洪敏, 范大偉, 魏琴 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)