專利名稱：一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬組織免疫熒光技術(shù)領域，具體涉及一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點 免疫熒光試劑盒，適用于人乳腺癌組織抗原的準確、定量檢測以及量子點標記的鏈霉親和素 復合物探針(QDs-SA)應用中的質(zhì)量控制，還涉及該試劑盒在定量檢測人乳腺癌組織抗原中 的用途。
背景技術(shù)：
人乳腺癌相關標志物，比如人類表皮生長因子受體2 (HER2)，雌激素受體(ER)、孕激 素受體(PR)等在乳腺癌分子靶向治療、預后判斷及化療方案選擇中具有重要作用，準確檢 測非常重要。目前檢測的主要方法是，利用待測組織靶抗原的特異性抗體與組織靶抗原結(jié)合 后，采用顯色試劑盒中酶標記的親和素或已知抗體(或抗原)作為探針，通過酶-底物顯色來 反映待測組織靶抗原的量。目前市場上已有多種酶底物顯色試劑盒，最常用的是DAB (3,3-二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒。采用這種試劑盒對組織抗原的檢測存在敏感性有限、實驗室間 差異較大，結(jié)果判斷主觀性等不足，其中酶一底物顯色反應的控制程度是導致產(chǎn)生差異的主 要原因之一；這種試劑盒中的DAB為致癌物質(zhì)，對人體有一定的傷害作用；而且采用這種試 劑盒難以對抗原實現(xiàn)準確、定量檢測。
組織免疫熒光技術(shù)是采用熒光物質(zhì)標記的親和素或已知抗體作為探針，與待測組織靶抗 原結(jié)合，使形成的抗原抗體復合物上帶有熒光物質(zhì)，在激發(fā)光照射下，熒光物質(zhì)發(fā)出明亮熒 光，以此來檢測抗原并通過熒光強度進行量化。該技術(shù)1941年由Cocms等創(chuàng)建，發(fā)展至今已有 很大的進展，已在現(xiàn)代生物學和醫(yī)學領域廣泛應用。但以異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)、羅丹明(rhodamine)為代表的傳統(tǒng)熒光染料，其熒光效率及強度均 不理想，且熒光易漂白及易受組織自發(fā)熒光干擾，而難以廣泛用于常規(guī)分子病理學檢測。
量子點(Quantum dots， QDs)是一類大小在1 10 nm，半徑小于或接近于激子玻爾半徑 的新型半導體納米晶粒，自1998年在生物醫(yī)學領域應用以來，隨著QDs制備及修飾技術(shù)的進 步，逐漸引起臨床應用的關注，將其作為一種新型納米熒光材料探針，能克服傳統(tǒng)有機熒光 染料的不足，具有激發(fā)光譜寬、連續(xù)，檢測靈敏度高，抗光漂白能力強，熒光強度高而穩(wěn)定，
生物相容性好，不易受組織自發(fā)熒光干擾等特點。目前所國內(nèi)外采取的QDs檢測組織抗原的 方法主要是將量子點直接與一抗或二抗結(jié)合制成探針，進行多抗原同時標記，這種方法成本 較高，實用性不強，難以與目前臨床現(xiàn)有的檢測體系相結(jié)合，探針保存期有限，難以常規(guī)臨 床應用。目前尚無用于檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的QDs-SA免疫熒光試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒， 該試劑盒可與目前臨床上檢測乳腺癌組織抗原的生物素化抗體相結(jié)合；更重要的是，采用該 試劑盒能夠經(jīng)濟、快速、靈敏、準確地對組織抗原進行定量檢測。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種量子點免疫熒光試劑盒在檢測人乳腺癌石蠟包埋組織抗 原中的應用，該試劑盒可簡便、快速、靈敏、高效地對組織抗原進行定量檢測。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量 子點免疫熒光試劑盒，其特征是該試劑盒中包括a)封閉液，b)清洗液，C)生物化抗體 稀釋液，d)封片液，和e)量子點標記的鏈霉親和素復合物探針液；采用水溶性CdSe/ZnS核 殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物(QDs-SA)作為熒光探針，與目前臨床上現(xiàn)有的檢測乳 腺癌石蠟包埋組織抗原的生物素化抗體相結(jié)合，間接標記石蠟包埋乳腺癌組織中的抗原；所 述的封閉液由三羥基氨基甲烷一鹽酸(TBS)緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH 7.2-7.6)與100% 牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量百分比100: 1—3配第U;清洗液由三羥基氨基甲烷一鹽酸(TBS) 緩沖液(0.005-0.02 M7L, PH 7.2-7.6)與吐溫-20按體積百分比1000: 0.2 — 1配制；生物素化 抗體稀釋液由三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH7.2-7.6)與100% 牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量比100: l—3配制；封片液由三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS) 緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH 7.2-7.6)與無熒光甘油按照體積比1: 7 — 10配制;量子點標記 的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物 (QDs-SA)溶液(量子點濃度0.5 — 1 ^M/L，激發(fā)波長590—620 nm)和上述的生物素化抗 體稀釋液按照體積百分比l: 10 — 200配制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，封閉液是由三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01M/L， RH 7.2-7.6)與100%牛血清白蛋白(BSA)以質(zhì)量百分比100: l—3配制；在本發(fā)明的一個 具體方案中，封閉液是由三羥基氨基甲烷一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01M/L, PH 7.2-7.6)與 100%牛血清白蛋白(BSA)以質(zhì)量比50: l配制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，清洗液是由三羥基氨基甲烷一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01M/L， PH 7.2-7.6)與吐溫-20按照體積百分比1000: 0.2 — 1;在本發(fā)明的一個具體方案中，清洗液
是由三羥基氨基甲院一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01M/L, PH 7.2-7.6)與吐溫-20以體積百分比 2000: 1配制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，生物素化抗體稀釋液由三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩 沖液(0.01 M/L， PH 7.2-7.6)與100%牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量比100: l—3配制；在 本發(fā)明的一個具體方案中，生物化抗體稀釋液是由三羥基氮基甲烷一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01 M/L， PH 7.2-7.6)與100%牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量比50: 1配制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，封片液是由三羥基氨基甲烷一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01M/L， PH 7.2-7.6)與無熒光甘油按照體積比1: 7—10配制；在本發(fā)明的一個具體方案中，封片液 是由三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01 M/L， PH 7.2-7.6)與無熒光甘油按照體積 比1: 9配制。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS 核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物溶液(量子點濃度0.6—0.8 ^M/L，激發(fā)波長590 — 620 nm)和生物素化抗體稀釋液三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩沖液(0.009 — 0.011 M/L， PH 7.2-7.6)與100%牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量比100: l — 3配制，按照體積百分比l: 10—200配制；在本發(fā)明的一個具體方案中，量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性 CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物溶液(量子點濃度0.76 ^M/L，激發(fā)波長600 一610nm)和生物素化抗體稀釋液三羥基氨基甲垸一鹽酸(TBS)緩沖液(0.01 M/L， PH 7.2-7.6)與100%牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量比50: 1配制按照體積百分比1: 50配制。
在本發(fā)明提供的檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒中，量子點標記
的鏈霉親和素探針的用途是待測抗原與生物素化抗體結(jié)合后，將該探針與生物素化抗體結(jié)
合，在熒光顯微鏡下藍光激發(fā)下，可觀察到熒光信號，即為待測抗原，熒光信號的強弱可反 映抗原表達量的多少，可通過光譜成像或軟件分析系統(tǒng)對熒光強度進行定量。
在本發(fā)明提供檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒中，量子點復合物 探針為一種納米材料，極易產(chǎn)生非特異性吸附作用，針對該特點，結(jié)合傳統(tǒng)免疫組織化學檢 測步驟，對試劑盒試劑進行優(yōu)化，與現(xiàn)有臨床上檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的生物素化抗 體相結(jié)合，用于乳腺癌組織抗原的準確、定量檢測。通過優(yōu)化方案，反復實驗，以及與傳統(tǒng)
檢測方法進行比較，建立了準確、定量檢測乳腺癌組織中HER2和ER抗原的方法，并研制 出乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒，該試劑盒具有經(jīng)濟、簡便、快速、靈 敏的特點。
本發(fā)明中提供的檢測乳腺癌組織抗原的的量子點免疫熒光試劑盒可用于乳腺癌組織抗原 的高效、準確、快速、定量檢測，以及對用傳統(tǒng)免疫酶底物顯色試劑盒檢測的乳腺癌組織抗
原結(jié)果進行質(zhì)量控制，同時還可對試劑盒中的量子點探針進行質(zhì)量控制；該試劑盒可推廣用 于一種操作步驟簡單、快速、靈敏、高效、經(jīng)濟實用的通用分子病理學檢測技術(shù)及科研平臺， 并可替代一直沿用的免疫酶底物顯色試劑盒。
在本發(fā)明的另外一個方面，還提供了使用本發(fā)明的試劑盒在檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗 原中的應用，其應用過程是
1. 臨床常規(guī)乳腺癌石蠟包埋組織，按常規(guī)免疫組化要求切片，并將切片脫蠟水化，按照待 測抗原的要求進行抗原修復；
2. 蒸餾水沖洗，清洗液沖洗；
3. 除去清洗液，用封閉液封閉；
4. 除去封閉液，滴加待測抗原的單克隆抗體(若為生物素標記的一抗則直接進入第7步)；
5. 清洗液洗滌玻片，除去清洗液，封閉液封閉；
6. 除去封閉液，滴加用生物素化抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗；
7. 清洗液洗滌玻片，除去清洗液，封閉液封閉；
8. 除去封閉液，加量子點標記的鏈霉親和素復合物探針；
9. 清洗液洗漆玻片，再用TBS洗，除去清洗液，封片液封片。
10. 在熒光顯微鏡觀察下，用藍光激發(fā)觀察橙紅色量子點熒光并通過熒光信號采集系統(tǒng)進行 定量，之后將切片置于4'C避光保存。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果
1. 檢測靈敏度高、便于量化；
2. 背景清晰，便于組織形態(tài)學觀察；
3. 方法簡便，易于標準化，無需復染，影響因素相對較少，重復性較好，結(jié)果判斷便利；
4. 無需DAB (3，3-二氨基聯(lián)苯胺)顯色，對人毒害較小；
5. 熒光強度高，持續(xù)時間長，結(jié)果容易保存及反復觀察；
6. 經(jīng)濟實惠。


圖1為檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒對人乳腺癌HER2的量子 點免疫熒光特異性成像。圖1中A為用特異性鼠抗人HER2抗體作為一抗，生物素標記的IgG 作為二抗，再加入SA-QDs的標記結(jié)果；圖1中C為用TBS作為一抗，生物素標記的IgG作 為二抗，再加入SA-QDs的標記結(jié)果，證明該技術(shù)的特異性強。圖1中B為該病例用免疫酶 組織化學(IHC)試劑盒的檢測結(jié)果；圖1中D為該病例的原始蘇木精和伊紅(HE)染色結(jié) 果，說明量子點探針標記的位置正確。標尺為100nm，量子點圖象由LEICADM4000B正
置熒光顯微鏡在藍光(波長450490 rnn，藍色熒光濾片)激發(fā)下，通過Olympus DP71成像 系統(tǒng)釆集圖象，曝光時間1/1.8秒；原始IHC及HE染色圖象由OLYMPUS BX51生物顯微鏡 及HMIAS-2000W高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析管理系統(tǒng)進行圖象采集
圖2為檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒對人乳腺癌HER2的熒光 穩(wěn)定性實驗示意圖。將做好的切片置于fC保存，研究量子點熒光的光漂性，結(jié)果表明，圖 象熒光在9天內(nèi)無明顯變化。圖2中A為制片當天的圖象；圖2中B為放置75天后的圖象； 圖2中C為放置150天的圖象；圖2中D為放置150天后再次進行量子點復染的圖象。結(jié)果 顯示組織熒光褪色后，重新加入量子點，依然可以清晰染色，與原始圖片相比，此時組織背 景更低。(標尺為IOO,,拍攝條件同上)
圖3為檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒對人乳腺癌HER2標記切 片在熒光淬滅后的IHC復染示意圖。將用本發(fā)明標記后熒光淬滅的標本重新進行DAB顯色。 圖3中A為原始IHC圖象；圖3中B為制片當天的圖象；圖3中C為量子點熒光淬滅后的 IHC復染圖象。表明量子點熒光淬滅后仍可進行DAB顯色，從而便于結(jié)果的相互印證和保存。 (標尺為100tmi，拍攝條件同上)
圖4為檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒對人乳腺癌HER2的免疫 熒光標記敏感性實驗。圖4中A為該標記技術(shù)對IHC分別為一、+、 2+、 3+病例的標記成像； 圖4中B為相對應的原始IHC圖象；結(jié)果表明該標記技術(shù)可以更清晰地區(qū)分HER2的不同表 達水平。同時選取60例主要為IHC (2+)的標本同時進行本技術(shù)檢測和FISH檢測，后者 委托北京金泰思生物科技有限公司進行檢測，圖4中C為FISH陰性，圖4中D為FISH陽 性，結(jié)果表明，該技術(shù)的操作性較好，影響因素相對較少，結(jié)果易于判斷，便于量化，與FISH 的吻合率較高。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。
實施例1檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒組成與配制
該試劑盒中包括a)封閉液，b)清洗液，c)生物化抗體稀釋液，d)封片液，和e)量子 點標記的鏈霉親和素復合物探針液；采用水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復 合物(QDs-SA)作為熒光探針，與目前臨床上現(xiàn)有的檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的生物素 化抗體相結(jié)合，間接標記石蠟包埋乳腺癌組織中的抗原；所述的封閉液由三羥基氨基甲垸一 鹽酸(TBS)緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH 7.2-7.6)與100。/。牛血清白蛋白(BSA)按質(zhì)量百分比100: l一3配制;清洗液由TBS緩沖液(0.005-0.02 M/L, PH 7.2-7.6)與吐溫-20按體積 百分比1000: 0.2—1配制；生物素化抗體稀釋液由TBS緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH 7.2-7.6) 與100。/。BSA按質(zhì)量比100: 1—3配制;封片液由TBS緩沖液(0.005-0.02 M/L， PH7.2-7.6)
與無熒光甘油按照體積比1: 7—10配制；量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性
CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物(QDs-SA)溶液(量子點濃度0.5 — 1 ^M/L， 激發(fā)波長590—620nm)和上述的生物素化抗體稀釋液按照體積百分比1: 10—200配制。
A) .封閉液組成
TBS緩沖液0.01M/L， PH7.4;配方三羥基氨基甲烷(凌飛科技)1.21 g，氯化鈉(國 藥集團化學試劑有限公司)7.6 g，加蒸餾水(SZ-93型自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化 儀器廠)至1000 ml，濃鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司)調(diào)整PH至7.4與100%牛血 清白蛋白(BSA，凌飛科技)以質(zhì)量比50: l配制。
B) .清洗液組成
TBS緩沖液(0.01M/L， PH 7.4)與吐溫-20 (國藥集團化學試劑有限公司)按照體積百 分比2000: l配制。
C) .生物素化抗體稀釋液組成
TBS緩沖液(0.01 M/L, PH 7.4)與100%BSA按質(zhì)量比50: 1配制。
D) .封片液組成
TBS緩沖液(0.01 M/L， PH7.4)與無熒光甘油(上海申博化工有限公司)按照體積比1: 9配制。
E) .量子點標記的鏈霉親和素探針液
由量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親 和素復合物溶液(量子點濃度0.76 pM/L，激發(fā)波長605 nm，武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限 公司)和生物素化抗體稀釋液TBS緩沖液(0.01 M/L， PH7.4)與100%BSA按質(zhì)量比50: l配制組成，按照體積百分比l: 50配制。
實施例2用檢測乳腺癌組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒在檢測乳腺癌石蠟包埋組織中 人類表皮生長因子受體2 (HER2)中的應用，其過程如下
1. 臨床常規(guī)乳腺癌石蠟包埋組織，常規(guī)切片、脫蠟水化。
2. 高溫高壓抗原修復取1500ml0.01M/L， PH 6.0的檸檬酸緩沖液(檸檬酸三鈉，2.45 g
(上海試劑一廠)，檸檬酸，0.38g (湖北襄樊化學試劑廠)加蒸餾水至1000ml，濃鹽酸 和氫氧化鈉(均為國藥集團化學試劑有限公司)調(diào)整PH至6.0于高壓鍋(不銹鋼型壓 力鍋，規(guī)格高20cm，容積4.0L，浙江蘇泊爾炊具股份有限公司)中。用電磁爐(型號C21A01,浙江蘇泊爾股份有限公司)蒸煮檔加熱至沸騰(IO(TC)，將脫蠟水化的切片置 于耐高溫染色架上，放入已沸騰的修復液中；蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽， 計時2分鐘后，關閉電磁爐并將壓力鍋離開熱源；室溫(20—25'C)放置20分鐘，用自 來水沖淋20分鐘，去閥開蓋，用自來水沖洗后取出切片，蒸餾水(SZ-93型自動雙重純 水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠)沖洗2次，每次2分鐘；再用0.01M/L， PH7.4的TBS 緩沖液沖洗2次，每次2分鐘。
3. 除去TBS，封閉液封閉，封閉條件為濕盒孵育，37'C (GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱， 上海精宏實驗設備有限公司)，30分鐘。
4. 除去封閉液，滴加鼠抗人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2， c-erbB-2或HER2/neu或HER2)單克隆抗體(一種抗人c-erbB-2的IgGt型單克隆抗體， 克隆號CB11 ，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，van de V^jver MJ， Peterse JL, Mooi WJ, et al. Neu-protein overexpression in breast cancer. Association with comedo-type ductal carcinoma in situ and limited prognostic value in stage II breast cancer[J]. N Engl J Med， 1988, 319(19):1239-1245.) 50 ^1 (h 50稀釋，稀釋液為0.01M/L, PH 7.4的TBS緩沖液, 陰性對照僅加TBS緩沖液)，37°C，濕盒孵育l小時。
5. 清洗液洗滌玻片，洗滌3次，每次3分鐘。
6. 除去清洗液，封閉液封閉。封閉條件為濕盒孵育，37'C， 10分鐘。
7. 除去封閉液，滴加生物素標記的羊抗鼠IgG50[U (1: 100稀釋，抗體稀釋液稀釋，福州 邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，37°C,濕盒孵育30分鐘。
8. 清洗液洗滌玻片，洗滌3次，每次3分鐘。
9. 除去清洗液，封閉液封閉。封閉條件為濕盒孵育，37°C， 20分鐘。
10. 除去封閉液，加量子點復合物，滴加量子點標記的鏈霉親和素復合物(QDs-SA)探針50 W， 37°C,濕盒孵育30分鐘。
11. 清洗液洗滌玻片，洗滌2次，每次3分鐘，再用TBS緩沖液洗2次，每次3分鐘；
12. 除去清洗液，緩沖甘油封片。
13. 在熒光顯微鏡觀察(LEICADM4000B正置熒光顯微鏡)用藍光激發(fā)(波長450490 nm， 藍色熒光濾片)觀察橙紅色量子點熒光，并用Olympus DP71圖象采集系統(tǒng)采集圖象，之 后將切片置于4'C避光保存。
用該試劑盒，根據(jù)以上使用過程檢測人乳腺癌HER2，做了如下實驗 1、本發(fā)明對人乳腺癌HER2的標記顯像及特異性
按照上述的使用過程，通過熒光顯微鏡，在藍光(波長450490 nm,藍色熒光濾片)激
發(fā)下，得到了乳腺癌HER2抗原的體外標記成像(圖1A)，組織結(jié)構(gòu)和抗原分布部位清晰、 易于分辨，與原始IHC和HE染色對比可看到量子點對HER2的識別部位一致(圖1B和D)。 為了進一步證明本發(fā)明熒光標記的特異性，采用特異性鼠抗人HER2抗體作為一抗，生 物化的羊抗鼠IgG作為二抗，用QDs-SA復合物探針作為三抗，進行人乳腺癌組織HER2抗 原的標記，用TBS代替鼠抗人HER2抗體作為一抗，并按照同樣的方法和條件標記作為陰性 對照，熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)視野中沒有出現(xiàn)明顯的QDs橘紅色熒光，這與使用特異性一抗 的結(jié)果形成鮮明的對比(圖1C),組織結(jié)構(gòu)清晰可見，極少見非特異吸附。
2、 本發(fā)明標記顯像的穩(wěn)定性及結(jié)果的保存和印證
將做好的切片置于4'C保存，研究量子點熒光的光漂性，結(jié)果表明，量子點熒光在9天內(nèi) 基本無變化，有些切片甚至在75天后仍可看到量子點熒光(圖2B)。但不同強度和不同組織 類型的熒光漂白速度不同， 一般來說，HER2強度越高，熒光漂白越慢。待量子點熒光基本漂 白后(圖2C)，先將切片置于蒸餾水中浸泡20分鐘，去除蓋玻片，用TBS沖洗2次，每次2分鐘， 再加入量子點探針，37°C，濕盒孵育30分鐘，之后用含0.05% Tween20的TBS ,洗滌2次，每 次3分鐘，再用TBS洗2次，每次3分鐘；封片液封片，熒光顯微鏡下仍可觀察到量子點熒光， 熒光強度與初始無明顯差異，而組織背景自發(fā)熒光更低(圖2D)。
在上述使用過程中若不加入量子點探針，而加入生物素標記的二抗，進行DAB顯色。結(jié) 果顯示，仍可對組織結(jié)構(gòu)和抗原表達進行DAB顯色(圖3)。對該原因進行了探討，可能是量 子點與親和素并非等比例結(jié)合，此外量子點粒徑較大，使其并未占據(jù)所有抗原結(jié)合位點，量 子點淬滅后，未結(jié)合位點暴露出來，因此本方法具有可重復標記的優(yōu)點。先用過量的生物素 處理切片后，再次加入量子點或者進行DAB顯色時，未出現(xiàn)該現(xiàn)象。
3、 本發(fā)明標記顯像的可靠性及敏感性實驗
為了驗證該技術(shù)的可靠性、重復性及敏感性，對54例HER2IHC不同強度的病例進行了 該技術(shù)檢測，其中僅2例檢測失敗，使用結(jié)果表明本發(fā)明可靠、重復性好、便于操作，對HER2 低表達量仍可清晰檢測(圖4A和B)。另外還將本發(fā)明與目前相對的"金標準"HSH技術(shù)進 行了對比，對60例主要為HER2IHC(2+)的病例進行了量子點探針技術(shù)檢領!)，同時同時委托 第三方(北京金泰思生物科技有限公司)進行FISH檢測驗證(圖4C和D)，通過專門開發(fā) 的量子點檢測結(jié)果分析軟件(購置武漢大學科學儀器工程技術(shù)中心)，對每個病例進行了量化 評分，在最佳點時，在IHC(2+)中，量子點探針技術(shù)與FISH的吻合率為78.85%,通過本發(fā) 明的使用，有效地檢測HER2擴增的特異度為75%，靈敏度為79.55%。
從上述實驗對比可以說明，該試劑盒對乳腺癌抗原HER2的檢測具有準確、快速、經(jīng)濟、 靈敏、穩(wěn)定、背景清晰、結(jié)果易保存、便于定量的特點。
權(quán)利要求
1、一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒，其特征是該試劑盒中包括a)封閉液，b)清洗液，c)生物化抗體稀釋液，d)封片液，和e)量子點標記的鏈霉親和素復合物探針液；采用水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物作為熒光探針，與檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的生物素化抗體相結(jié)合，間接標記石蠟包埋乳腺癌組織中的抗原；所述的封閉液由三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液0.005-0.02M/L，PH 7.2-7.6，與100％牛血清白蛋白按質(zhì)量百分比100∶1-3配制；所述的清洗液由三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液0.005-0.02M/L，PH 7.2-7.6，與吐溫-20按體積百分比1000∶0.2-1配制；所述的生物素化抗體稀釋液由三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液0.005-0.02M/L，PH7.2-7.6，與100％牛血清白蛋白按質(zhì)量比100∶1-3配制；所述的封片液由三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液0.005-0.02M/L，PH 7.2-7.6，與無熒光甘油按體積比1∶7-10配制；所述的量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物溶液和生物素化抗體稀釋液按體積百分比1∶10-200配制，所述的量子點濃度0.5-1μM/L、激發(fā)波長590-620nm。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒， 其特征是所述的封閉液是由三羥基氨基甲烷一鹽酸緩沖液0.01M/L，與100%牛血清白蛋白按質(zhì)量比50: l配制。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒，其特征是所述的清洗液是由三羥基氨基甲垸—鹽酸緩沖液0.01M/L，與吐溫-20按體積百 分比2000: l配制。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒， 其特征是所述的生物素化抗體稀釋液由三羥基氨基甲烷一鹽酸緩沖液0.01 M/L ，與100% 牛血清白蛋白按質(zhì)量比50: l配制。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒，其特征是所述的封片液是由三羥基氨基甲烷一鹽酸緩沖液0.01 M/L,與無熒光甘油按體 積比1: 9配制。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒， 其特征是所述的量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記 的鏈霉親和素復合物溶液，量子點濃度0.6 — 0.8 pM/L，生物素化抗體稀釋液為三羥基氨基甲 垸一鹽酸緩沖液0.009 — 0.011 M/L，與100%牛血清白蛋白組成，或量子點標記的鏈霉親和素復合物探針由水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和 素復合物溶液與生物素化抗體稀釋液按體積百分比1: 50配制；所述的量子點濃度為0.76 ^M/L，激發(fā)波長600—610nm;所述的生物素化抗體稀釋液為三羥基氨基甲烷一鹽酸緩沖液 0.01 M/L，與100%牛血清白蛋白按質(zhì)量比50: 1配制。
7、 權(quán)利要求1所述的一種量子點組織免疫熒光試劑盒在檢測人乳腺癌石蠟包埋組織抗原 中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒及應用，該試劑盒包括a)封閉液，b)清洗液，c)生物素化抗體稀釋液，d)封片液，和e)量子點標記的鏈霉親和素復合物(QDs-SA)探針液，采用水溶性CdSe/ZnS核殼型量子點標記的鏈霉親和素復合物作為熒光探針，通過與生物素化的二抗或一抗結(jié)合，間接標記石蠟包埋乳腺癌組織中的抗原。利用該試劑盒檢測人乳腺癌石蠟包埋組織抗原的方法以及該試劑盒在快速準確檢測人乳腺癌組織抗原中的應用。該試劑盒及方法克服了傳統(tǒng)和現(xiàn)代方法中存在的不足，可準確、快速、經(jīng)濟、靈敏地對乳腺癌組織抗原進行定量檢測。
文檔編號G01N21/64GK101339188SQ20081004873
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者夏和順, 龐代文, 朱小波, 雁 李, 創(chuàng) 陳 申請人:武漢大學