本申請是申請日為2009年04月10日和發(fā)明名稱為“用于根結(jié)線蟲防治的方法和組合物”的200980115310.5號發(fā)明專利申請的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年4月10日提交的美國臨時申請61/044,015和2008年7月28日提交的美國臨時申請61/084,205的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用并入本申請中。通過引用并入計算機可讀形式的序列表作為本公開的一部分的序列表包括2009年創(chuàng)建的名稱為“mndi004wo_st25.txt”計算機可讀形式的113kb的文件，其包含本發(fā)明的核苷酸序列。序列表的主題通過引用全部并入本申請中。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及由植物寄生的線蟲引起的疾病的遺傳防治。更具體地，本發(fā)明涉及目標(biāo)編碼序列的確認(rèn)，并涉及使用重組dna技術(shù)在植物寄生線蟲的細(xì)胞中進行轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制目標(biāo)編碼序列的表達，從而提供植物保護效果。發(fā)明技術(shù)植物受到多種潛在的引起疾病的物質(zhì)的影響，包括植物寄生的線蟲，其為生活在潮濕表面上或液體環(huán)境(包括土壤內(nèi)的水膜和其它生物體內(nèi)的濕潤組織)中的活性的、柔軟的、細(xì)長的生物體。有許多的植物寄生性線蟲物種，包括各種根結(jié)線蟲(例如根結(jié)線蟲屬(meloidogyne)的種)、根腐線蟲(lesionnematodes)(如短體線蟲屬(pratylenchus)的種)、胞囊線蟲(cystnematodes)(例如異皮線蟲屬(heterodera)的種)、劍線蟲(daggernematodes)(例如劍線蟲屬(xiphinema)和莖線蟲(stemandbulbnematodes)(例如莖線蟲屬(ditylenchus)的種))及其它。墊刃線蟲(tylenchidnematodes)(墊刃目的成員)(包括異皮科(heteroderidae)、根結(jié)線蟲科(meloidogynidae)和短體科(pratylenchidae))是最大和最具經(jīng)濟重要性的一組植物寄生的線蟲。線蟲類通過一系列的生命周期階段和蛻皮期生長。典型地，具有五個階段和四個蛻皮期：卵階段、j1(即第一幼蟲階段)、m1(即第一蛻皮期)、j2(第二幼蟲階段，有時由卵孵化)、m2、j3、m3、j4、m4、a(成蟲)。幼蟲(“j”)階段有時也稱為蚴(“l(fā)”)階段。基因表達可能對于一個或多個生命周期階段是特異性的。植物特異性和動物特異性的線蟲種類已進化成為非常成功的寄生蟲，并在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)方面造成重大的經(jīng)濟損失和造成人的疾病和死亡。植物的線蟲寄生蟲可以寄居在植物的所有部分，包括根、發(fā)育的花蕾、葉和莖。植物寄生蟲根據(jù)其攝食習(xí)慣分成寬范圍的遷移性外寄生蟲(migratoryectoparasites)、遷移性內(nèi)寄生蟲(migratoryendoparasites)和定居性內(nèi)寄生蟲(sedentaryendoparasites)。定居性內(nèi)寄生蟲(包括根結(jié)線蟲種類(meloidogynespp.)和胞囊線蟲(球形胞囊線蟲屬(globodera)和異皮線蟲)誘生攝食位點(feedingsite)(在根結(jié)線蟲的情況中是“巨細(xì)胞”和在胞囊線蟲的情況中是“合胞體”)并在根中形成長期的感染，這通常對作物造成非常大的危害。據(jù)估計，按所有主要作物每年估計平均12％的損失，寄生的線蟲在全世界每年對園藝業(yè)和農(nóng)業(yè)造成超過780億美元的損失。例如，據(jù)估計線蟲每年引起全世界大約32億美元的大豆損失(barker等,1994)。已經(jīng)提供了幾種形式的用于防治線蟲感染的組合物、方法和藥物。在許多情況下嘗試了生物和耕作防治方法(包括植物檢疫)。在某些作物中，已確認(rèn)了提供線蟲抗性或耐受性的植物抗性基因?；瘜W(xué)組合物(如殺線蟲劑)通常應(yīng)用于其中存在植物寄生性線蟲的土壤中。但是，存在著對安全和高效的線蟲防治的急迫需求。與當(dāng)前防治策略的劣勢相關(guān)的因素包括對于農(nóng)業(yè)可持續(xù)性的更高的關(guān)切和可能禁止或嚴(yán)厲限制許多可用的農(nóng)業(yè)化學(xué)驅(qū)蟲劑的使用的新政府法規(guī)?；瘜W(xué)劑通常是非選擇性的并對非目標(biāo)生物體產(chǎn)生作用，從而在施用該化學(xué)劑后的一段時間內(nèi)嚴(yán)重地破壞了有益微生物的種群?；瘜W(xué)劑可能持久地存在于環(huán)境中且僅緩慢地代謝。殺線蟲土壤薰劑(如三氯硝基甲烷和甲基溴及相關(guān)化合物)是高毒性的。甲基溴已被確認(rèn)為消耗臭氧的化合物，且其在美國使用的注冊已經(jīng)被取消。這些藥劑也可能累積在地下水或食物鏈中，并累積在較高營養(yǎng)層次的物種中。這些藥劑也可能具有突變劑和/或致癌劑的作用以引起不可逆的和有害的遺傳改變。因此，線蟲防治的替代方法(如遺傳方法)越來越多地受到研究。rna干擾(“rnai”)是利用內(nèi)源細(xì)胞途徑的方法，從而雙鏈rna(dsrna)特異性的目標(biāo)基因?qū)е履繕?biāo)mrna的降解。rnai通過內(nèi)源途徑發(fā)揮作用，包括能夠從原dsrna產(chǎn)生大約21個核苷酸的小干擾rna(sirna)的dicer蛋白復(fù)合體和使用sirna引導(dǎo)(sirnaguides)識別并降低或阻斷相應(yīng)mrna的翻譯的rna-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)。僅與該sirna互補的轉(zhuǎn)錄物受到影響，并因此mrna表達的降低通常是序列特異性的。rnai的基因沉默效應(yīng)持續(xù)數(shù)天且在試驗條件下可導(dǎo)致目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物豐度的90％或更高的下降，隨之導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)水平的下降。附圖簡要說明圖1顯示了用于選擇組合化學(xué)品(basta)和熒光(dsred)以產(chǎn)生具有殺線蟲目標(biāo)基因(goi)的均勻表達的毛根(hairyroot)的毛根表達構(gòu)建體的示意性實例。goi可編碼殺線蟲核苷酸，如靶向于關(guān)鍵線蟲基因的雙鏈rna(dsrna)?？敲顾乜剐杂糜诩?xì)菌宿主內(nèi)的質(zhì)粒擴增(plasmidpropagation)。basta(草銨膦銨鹽:草胺膦)耐受性通過在甘露堿(mannopine)合成酶啟動子和終止子的控制下的bar基因(草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)表達賦予。goi可受到源自花椰菜花葉病毒35s啟動子(35s)或玄參花葉病毒(fmv)的強組成型啟動子的驅(qū)動，或者可以使用多種植物啟動子(如泛素3啟動子)和終止子(如e6、e9或章魚堿合成酶(ocs)終止子)。紅色熒光蛋白dsred可由強組成型病毒啟動子或其它啟動子(如肌動蛋白7植物啟動子)驅(qū)動，并使用終止子如e6、e9或ocs。圖2顯示了實施例2中使用的線蟲評定量表(1-4)的例子。發(fā)明概述在一個方面中，本發(fā)明包括選自以下的多核苷酸：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任何核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列。在特定的實施方式中，該多核苷酸定義為與異源啟動子可操作地連接?！爱愒吹摹币馑际俏窗l(fā)現(xiàn)天然地與所述多核苷酸結(jié)合的任何序列(如啟動子)，包括例如，來自相同植物的未發(fā)現(xiàn)天然地結(jié)合在一起的核酸序列的組合。在特定的實施方式中，該多核苷酸包含在植物轉(zhuǎn)化載體上。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，這里提供的多核苷酸序列可以定義為分離的多核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面是由這種多核苷酸的表達產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸序列，其中植物寄生的線蟲攝取該核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長。在特定的實施方式中，該雙鏈核糖核苷酸序列進一步定義為通過制備包含第一、第二和第三多核苷酸序列的重組多核苷酸序列產(chǎn)生，其中所述第一多核苷酸序列包含選自以下的多核苷酸：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任何核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列；且其中所述第三多核苷酸序列通過所述第二多核苷酸序列與第一多核苷酸連接，且其中第三多核苷酸序列基本上為第一多核苷酸序列的反向互補序列，從而第一和第三多核苷酸序列在轉(zhuǎn)錄成核糖核酸時雜交以形成由所連接的第二多核苷酸序列穩(wěn)定的雙鏈核糖核苷酸分子。在特別的實施方式中，當(dāng)該多核苷酸序列被植物寄生的線蟲攝取時，該雙鏈核糖核苷酸序列抑制基本上與該多核苷酸序列互補的核苷酸序列的表達。本發(fā)明的另一方面是包含選自以下的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任何核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列，其中該dna序列與在植物細(xì)胞中起作用的異源啟動子可操作地連接。本發(fā)明的進一步的實施方式是用這種多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在特定的實施方式中，該細(xì)胞定義為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在特別的實施方式中，該細(xì)胞定義為植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一實施方式涉及用選自以下的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任何核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列。在特定的實施方式中，該植物進一步定義為選自農(nóng)作物，其選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、煙草、胡蘿卜、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物。這種植物的種子(其中該種子包含所述多核苷酸)是本發(fā)明的另一實施方式。在一些實施方式中，所述多核苷酸在植物或植物細(xì)胞(如根細(xì)胞)中表達為雙鏈核糖核苷酸序列。在其它實施方式中，植物寄生的線蟲是根結(jié)線蟲種類。在特別的實施方式中，植物寄生的線蟲是南方根結(jié)線蟲(meloidogyneincognita)。在再其它的實施方式中，植物寄生的線蟲攝取抑制量的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長和繁殖。本發(fā)明的另一方面是由包含選自以下的多核苷酸的植物生產(chǎn)的商品：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任何核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列，其中該商品包含可檢測量的所述多核苷酸或由其表達的核糖核苷酸。本發(fā)明的另一方面是用于控制植物寄生線蟲的群體數(shù)量的方法，包括提供包含在由線蟲攝取時發(fā)揮作用的雙鏈核糖核苷酸序列的藥劑，以抑制該線蟲體內(nèi)的生物學(xué)功能，其中該藥劑包含選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列的核苷酸序列。本發(fā)明的再另一方面是用于控制植物寄生線蟲群體數(shù)量的方法，包括提供包含在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用的第一多核苷酸序列的藥劑，以抑制該線蟲體內(nèi)的生物學(xué)功能，其中該多核苷酸序列沿著至少大約19-大約25個連續(xù)核苷酸表現(xiàn)出與源自線蟲的編碼序列的大約95％-大約100％核苷酸序列同一性，并與第二多核苷酸序列雜交，該第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列互補，且其中所述源自線蟲的編碼序列選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列。在特定的實施方式中，線蟲是根結(jié)線蟲種類。在特別的實施方式中，線蟲是南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明的另一實施方式是用于控制植物寄生線蟲群體數(shù)量的方法，包括在植物寄生線蟲的宿主植物中提供表達選自以下的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47、這些多核苷酸序列的任一個的至少21個連續(xù)核苷酸的片段及其互補序列，其中該多核苷酸被表達來產(chǎn)生在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制線蟲體內(nèi)目標(biāo)序列的表達并導(dǎo)致線蟲或線蟲群的生長或繁殖相對于缺乏所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的宿主上的生長或繁殖降低。在特定的實施方式中，該線蟲在感染宿主植物后表現(xiàn)出生長降低。構(gòu)成本發(fā)明一部分的該方法的特別實施方式中，目標(biāo)序列編碼其預(yù)期功能如下的蛋白質(zhì)：dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸(proteintrafficking)、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生、繁殖和運輸。在特別的實施方式中，線蟲選自根結(jié)線蟲種類。在更特別的實施方式中，線蟲是南方根結(jié)線蟲。在一些實施方式中，該多核苷酸在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用以抑制其執(zhí)行的功能對于線蟲的存活、繁殖或生長關(guān)鍵的基因的表達，所述功能選自dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生和運輸。本發(fā)明的另一方面是用于減少宿主植物的根組織中形成的根結(jié)線蟲(rkn)攝食位點的數(shù)目的方法，包括在根結(jié)線蟲的宿主植物中提供表達選自以下的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47、這些多核苷酸的任一個的至少21個連續(xù)核苷酸的片段及其互補序列，其中該多核苷酸被表達以產(chǎn)生在由根結(jié)線蟲攝取時發(fā)揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內(nèi)目標(biāo)序列的表達并導(dǎo)致所形成的攝食位點數(shù)目相對于缺乏所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的宿主上形成的攝食位點數(shù)目降低。本發(fā)明的另一實施方式是防治植物中的植物線蟲蟲害的方法，包括在植物線蟲害蟲的食物中提供dsrna，其包含a)有義核苷酸序列；和b)與有義核苷酸序列互補的反義核苷酸序列，其中有義核苷酸序列包含選自以下的核苷酸序列或與選自以下的核苷酸序列互補：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列。在一個實施方式中，所述食物包含經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達所述有義和反義核苷酸序列的植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于提高由遭受植物寄生線蟲感染的作物植物產(chǎn)生的作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟：a)將這里描述的多核苷酸引入所述作物植物中；和b)種植該作物植物以使得所述多核苷酸表達，其中該多核苷酸的表達抑制植物寄生線蟲感染、生長、繁殖或由于植物寄生線蟲感染導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。在特定實施方式中，該作物植物選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、煙草、胡蘿卜、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物。在一些實施方式中，所述多核苷酸的表達產(chǎn)生抑制已經(jīng)與所述作物植物的一部分接觸的植物寄生線蟲中的至少第一目標(biāo)基因的rna分子，其中該目標(biāo)基因執(zhí)行至少一種選自以下的關(guān)鍵功能：dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生、繁殖和運輸。在特定的實施方式中，植物寄生的線蟲是墊刃線蟲。在特別的實施方式中，植物寄生的線蟲是根結(jié)線蟲種類。在更特別的實施方式中，植物寄生的線蟲是南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明的另一方面是用于提高遭受植物寄生線蟲感染的作物植物的滲透脅迫(osmoticstress)耐受性的方法，所述方法包括以下步驟：a)將權(quán)利要求1的多核苷酸引入所述作物植物；b)種植該作物植物以允許所述多核苷酸表達，其中所述多核苷酸的表達提高作物植物的滲透脅迫耐受性。在一些實施方式中，滲透脅迫耐受性定義為耐旱性。本發(fā)明的再另一方面是產(chǎn)生商品的方法，包括獲得包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47任一核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸，其中植物寄生的線蟲攝取包含至少一個與所述片段互補的鏈的雙鏈核糖核苷酸序列將抑制該線蟲的生長；和(b)(a)中的序列的互補序列的植物或其部分；和從該植物或其部分制備商品。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)食物或飼料的方法，包括獲得這種植物或其部分和從所述植物或其部分制備食物或飼料。在特定的實施方式中，食物或飼料定義為油、粗磨粉、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉或青貯飼料。本發(fā)明的再另一方面是調(diào)節(jié)植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達的方法，該方法包括：(a)用包含選自以下的核酸序列轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46、seqidno:47及這些序列中任一的至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中該核酸序列編碼dsrna并可操作地與啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列連接；(b)在足以允許包含多個轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)育的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)選擇已經(jīng)將所述核酸序列整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(d)篩選表達由所述核酸序列編碼的dsrna的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(e)選擇表達該dsrna的植物細(xì)胞。本發(fā)明的另一實施方式是進一步包括從表達所述dsrna的植物細(xì)胞再生植物，從而植物中基因的表達足以調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞接觸的植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達。特別地，本發(fā)明涉及以下各項：1.一種多核苷酸，包含：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任一核酸序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段；和(b)(a)中片段的反向互補序列。2.第1項的多核苷酸，其中植物寄生的線蟲攝取包含所述至少21個連續(xù)核苷酸的核糖核苷酸將抑制該線蟲的生長。3.第1項的多核苷酸，定義為可操作地與外源啟動子連接。4.第1項的多核苷酸，在所述片段和該片段的反向互補序列之間包含間隔多核苷酸序列。5.包含第1項的多核苷酸的轉(zhuǎn)化載體。6.第5項的轉(zhuǎn)化載體，其中所述多核苷酸可操作地與在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的外源啟動子連接。7.從第1項的多核苷酸表達產(chǎn)生的雙鏈核糖核苷酸分子，其中植物寄生的線蟲攝取所述核糖核苷酸分子將抑制該線蟲的生長。8.第7項的雙鏈核糖核苷酸分子，其中所述核糖核苷酸分子在植物寄生的線蟲中抑制基本上與所述多核苷酸分子互補的核苷酸序列的表達。9.用第1項的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。10.第9項的細(xì)胞，定義為原核細(xì)胞。11.第9項的細(xì)胞，定義為真核細(xì)胞。12.第9項的細(xì)胞，定義為植物細(xì)胞。13.用第1項的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。14.第13項的植物，進一步定義為選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、煙草、胡蘿卜、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物的作物。15.第13項的植物的種子，其中所述種子包含所述多核苷酸。16.第13項的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表達為雙鏈核糖核苷酸分子。17.第16項的植物，其中植物寄生的線蟲攝取包含所述雙鏈核糖核苷酸分子的植物的組織將抑制該線蟲的生長。18.第17項的植物，其中所述植物寄生的線蟲是根結(jié)線蟲種類(meloidogynespp)。19.第17項的植物，其中所述植物寄生的線蟲是南方根結(jié)線蟲(meloidogyneincognita)。20.由第13項的植物產(chǎn)生的商品，其中所述商品包含可檢測量的所述多核苷酸或由其表達的核糖核苷酸。21.一種用于控制植物寄生線蟲群體數(shù)量的方法，包括提供包含雙鏈核糖核苷酸分子的藥劑，該雙鏈核糖核苷酸分子在被線蟲攝取時發(fā)揮抑制線蟲內(nèi)的生物學(xué)功能的作用，其中所述藥劑包含選自以下的核苷酸序列：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47，及其互補序列。22.一種用于控制植物寄生線蟲群體數(shù)量的方法，包括提供包含在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用以抑制線蟲體內(nèi)的生物學(xué)功能的第一多核苷酸序列的藥劑，其中該多核苷酸序列沿至少大約19-大約25個連續(xù)核苷酸表現(xiàn)出與源自線蟲的轉(zhuǎn)錄序列的大約95％-大約100％的核苷酸序列同一性，并與第二多核苷酸序列雜交，該第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列互補，且其中所述源自線蟲的轉(zhuǎn)錄序列選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列。23.第22項的方法，其中所述線蟲是根結(jié)線蟲種類。24.第22項的方法，其中所述線蟲是南方根結(jié)線蟲。25.一種用于控制植物寄生線蟲的群體數(shù)量的方法，包括在植物寄生線蟲的宿主植物中提供表達第1項的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中該多核苷酸被表達以產(chǎn)生在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內(nèi)目標(biāo)序列的表達并導(dǎo)致線蟲或線蟲群體的生長或繁殖相對于在缺乏所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的宿主上的生長或繁殖降低。26.第25項的方法，其中所述線蟲在感染宿主植物后表現(xiàn)出生長降低。27.第25項的方法，其中所述目標(biāo)序列編碼蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有選自如下的預(yù)期功能：dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生、繁殖和運輸。28.第25項的方法，其中所述線蟲選自根結(jié)線蟲種類。29.第25項的方法，其中所述線蟲是南方根結(jié)線蟲。30.第25項的方法，其中所述多核苷酸在由植物寄生的線蟲攝取時發(fā)揮作用以抑制其執(zhí)行的功能對于線蟲的存活、繁殖或生長關(guān)鍵的基因的表達，所述功能選自dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生和運輸。31.一種用于減少宿主植物的根組織中形成的rkn攝食位點的數(shù)目的方法，包括在根結(jié)線蟲的宿主植物中提供表達第1項的多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述多核苷酸被表達以產(chǎn)生在由根結(jié)線蟲攝取時發(fā)揮作用的雙鏈核糖核酸，從而抑制所述線蟲體內(nèi)目標(biāo)序列的表達并導(dǎo)致所形成的攝食位點數(shù)目相對于在缺乏所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的宿主上形成的攝食位點數(shù)目降少。32.一種用于防治植物中的植物線蟲蟲害的方法，包括在植物線蟲害蟲的食物中提供dsrna，其包含a)有義核苷酸序列；和b)與所述有義核苷酸序列互補的反義核苷酸序列，其中所述有義核苷酸序列包含第1項的核苷酸序列或與其互補。33.第32項的方法，其中所述食物包含經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達所述有義和所述反義核苷酸序列的植物細(xì)胞。34.一種用于提高由遭受植物寄生線蟲感染的作物植物產(chǎn)生的作物產(chǎn)量的方法，所述方法包括以下步驟：a)將第1項的多核苷酸引入所述作物植物中；和b)種植該作物植物以使得所述多核苷酸表達，其中該多核苷酸的表達抑制植物寄生線蟲感染、生長、繁殖或由于植物寄生線蟲感染導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。35.第34項的方法，其中所述作物植物選自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、煙草、胡蘿卜、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物。36.第34項的方法，其中所述多核苷酸的表達產(chǎn)生抑制已經(jīng)與所述作物植物的一部分接觸的植物寄生線蟲中的至少第一目標(biāo)基因的rna分子，其中所述目標(biāo)基因執(zhí)行至少一種選自以下的關(guān)鍵功能：dna復(fù)制、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、核糖體功能、trna合成、trna功能、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、能量產(chǎn)生、線粒體功能、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞作用、離子調(diào)節(jié)、卵產(chǎn)生、繁殖和運輸。37.第36項的方法，其中所述植物寄生的線蟲是墊刃線蟲。38.第37項的方法，其中所述植物寄生的線蟲是根結(jié)線蟲種類。39.第37項的方法，其中所述植物寄生的線蟲是南方根結(jié)線蟲。40.一種用于提高遭受植物寄生線蟲感染的作物植物的滲透脅迫耐受性的方法，所述方法包括以下步驟：a)將第1項的多核苷酸引入所述作物植物；b)種植該作物植物以允許所述多核苷酸表達，其中所述多核苷酸的表達提高作物植物的滲透脅迫耐受性。41.第40項的方法，其中所述滲透脅迫耐受性定義為耐旱性。42.一種用于生產(chǎn)商品的方法，包括獲得第13項的植物或其部分，和從該植物或其部分制備商品。43.一種用于生產(chǎn)食品或飼料的方法，包括獲得第13項的植物或其部分和從所述植物或其部分制備食品或飼料。44.第43項的方法，其中所述食品或飼料定義為油、粗磨粉、蛋白質(zhì)、淀粉、面粉或青貯飼料。45.一種用于調(diào)節(jié)植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達的方法，該方法包括：(a)用包含編碼dsrna的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述核酸序列選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46、seqidno:47及其至少21個連續(xù)核苷酸的片段，其中所述核酸序列編碼dsrna并可操作地與啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列連接；(b)在足以允許包含多個轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)育的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)選擇已經(jīng)將所述核酸序列整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(d)篩選表達由所述核酸序列編碼的dsrna的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(e)選擇表達該dsrna的植物細(xì)胞。46.第45項的方法，進一步包括從表達所述dsrna的植物細(xì)胞再生植物，從而植物中核酸序列的表達足以調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞接觸的植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達。47.一種多核苷酸，包含：(a)seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47的任一核酸序列的連續(xù)核苷酸的片段；和(b)(a)中片段的反向互補序列，其中在植物寄生的線蟲的食物中提供表達足以調(diào)節(jié)所述線蟲中目標(biāo)基因表達的多核苷酸的植物細(xì)胞。發(fā)明詳述下面是用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明的本發(fā)明詳細(xì)說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在這里描述的實施方式中進行改進和變化而不脫離本發(fā)明的精神或范圍。本發(fā)明提供了用于遺傳防治植物寄生線蟲蟲害，特別是用于遺傳防治植物的根結(jié)線蟲屬(根癌)線蟲蟲害的方法和組合物。本發(fā)明還提供了根結(jié)線蟲屬植物寄生線蟲的生活周期中關(guān)鍵的基因的確認(rèn)和其用作線蟲種群的dsrna介導(dǎo)的防治的靶標(biāo)的方法。編碼dsrna分子的dna質(zhì)粒載體設(shè)計為抑制對于生長、發(fā)育、攝食或繁殖關(guān)鍵的線蟲基因。例如，本發(fā)明提供了用于在植物寄生線蟲中的轉(zhuǎn)錄后阻抑或抑制目標(biāo)編碼序列的表達的方法和重組dna技術(shù)，以通過允許植物寄生的線蟲食用由所有或一部分目標(biāo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的一種或多種雙鏈或小干擾核糖核酸(rna)分子而提供保護效應(yīng)，從而防治感染。本發(fā)明公開了根癌植物線蟲害蟲(根結(jié)線蟲種類)的來自保守的和對于植物寄生線蟲的存活力關(guān)鍵的基因靶標(biāo)的核苷酸和氨基酸序列。本發(fā)明進一步描述了這些序列用于通過在根結(jié)線蟲的食物中提供包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸分子的一部分、或全部或基本上全部的dsrna改變至少根結(jié)線蟲細(xì)胞中一種或多種目標(biāo)多核苷酸或蛋白質(zhì)分子的表達。這些目標(biāo)根結(jié)線蟲序列的高核苷酸保守性有利于以少數(shù)的dsrna構(gòu)建體同時靶向于多種根結(jié)線蟲種，同時提供對相似或同源的人和植物序列的選擇性，并還提供對存在于其它非目標(biāo)生物體(如有益的昆蟲，例如蜜蜂或蝴蝶)中的相似或同源序列的選擇性。用于防治根結(jié)線蟲的環(huán)境良好但高效的替代方法是使用對關(guān)鍵線蟲基因進行rna干擾以控制植物的線蟲蟲害。這是通過植物中與目標(biāo)線蟲基因互補的雙鏈rna(dsrna)的轉(zhuǎn)基因表達實現(xiàn)。該dsrna與目標(biāo)基因的互補性可能在選為靶標(biāo)的序列中是完全的(即100％)，或者dsrna的序列可能沿選為靶標(biāo)的序列基本上互補(例如90％或95％以上)。因此，本發(fā)明涉及使用雙鏈rna(dsrna)，包括小的干擾rna(sirna)，序列特異性地抑制編碼序列的表達，從獲得預(yù)期水平的根結(jié)線蟲防治。本發(fā)明還提供了抑制根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲種類)內(nèi)的目標(biāo)基因功能的方法，其可以通過rna干擾完成，從而導(dǎo)致病原體生活周期的破壞。用于破壞的最佳目標(biāo)基因包括生命周期關(guān)鍵基因，該破壞引起寄生蟲種群的高滲透性死亡或通過以對植物的最小攝食損傷阻止繁殖、減少所形成的攝食位點的數(shù)目、使所產(chǎn)生的卵的數(shù)目最小化、使卵的存活力最小化和使達到下一世代的存活逃脫蠕蟲的數(shù)目最小化而導(dǎo)致“遺傳性死亡”。在特別的實施方式中，可以通過將由施用本發(fā)明的方法和組合物的根結(jié)線蟲屬的線蟲產(chǎn)生的卵的數(shù)目與在類似條件下生長但未施用這些方法和組合物的根結(jié)線蟲屬的線蟲產(chǎn)生的卵的數(shù)目進行比較測定效率。本發(fā)明的另一方面提供預(yù)計對根結(jié)線蟲種類生長和/或發(fā)育(如攝食或卵的產(chǎn)生)關(guān)鍵的目標(biāo)基因的核酸。用于預(yù)測這類目標(biāo)的特征包括與具有強的和可再現(xiàn)的rna干擾表型的已知秀麗隱桿線蟲(c.elegans)基因的直系同源性、與大豆胞囊線蟲(h.glycines)(大豆的胞囊線蟲)中rnai驗證的基因和根結(jié)線蟲種類中的表達模式的直系同源性。在本發(fā)明的再另一實施方式中，提供了如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或者其互補序列的一系列分離的和純化的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了用于表達一種或多種rna以抑制植物寄生的線蟲中由這些序列及其片段表達的目標(biāo)基因的表達的穩(wěn)定dsrna分子。穩(wěn)定的dsrna(包括dsrna或sirna分子)可以包含至少兩個轉(zhuǎn)錄序列，如沿相對于至少一個啟動子的有義和反義方向排列的編碼序列，其中包含有義鏈和反義鏈的核苷酸序列通過至少大約1至大約1000個核苷酸的間隔序列連接或接合，其中該有義鏈和反義鏈可能長度不同，且其中兩個轉(zhuǎn)錄的序列各與以下所示的任何一個或多個核苷酸序列共有至少80％的序列同一性，至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或其互補序列。在再另一方面中，本發(fā)明提供了包含編碼這里描述的dsrna分子的核酸分子的重組dna構(gòu)建體。dsrna可以通過從與選自以下的核苷酸序列至少大約80％至大約100％相同的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄該dsrna分子的一個鏈而形成：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列的至少21個連續(xù)核苷酸至全長的片段。這些重組dna構(gòu)建體可以定義為產(chǎn)生能夠在攝食時抑制植物寄生線蟲細(xì)胞中內(nèi)源目標(biāo)序列的表達的dsrna分子。該構(gòu)建體可以包含可操作地與在宿主細(xì)胞(如植物細(xì)胞)中發(fā)揮作用的啟動子序列連接的本發(fā)明的核苷酸序列。這種啟動子可以是組織特異性的且可以是例如對作為植物寄生線蟲攻擊對象的組織類型特異性的。在例如分別為根或葉病原體的情況中，可能希望使用分別提供根或葉優(yōu)先表達的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體可以包含至少一個非天然存在的核苷酸序列，該非天然存在的核苷酸序列可以轉(zhuǎn)錄成能夠通過分子間或分子內(nèi)雜交在體內(nèi)形成dsrna分子的單鏈rna。這些dsrna序列自組裝并可以在植物寄生線蟲的營養(yǎng)源中提供以獲得希望的抑制作用。重組dna構(gòu)建體可以包含一個或多個不同的非天然存在的序列，該序列在體內(nèi)表達為dsrna序列并在植物寄生線蟲的宿主植物的組織中提供時，抑制植物寄生線蟲中至少兩個不同目標(biāo)基因的表達。在特定的實施方式中，至少2、3、4、5、6、8或10個或更多的不同dsrna在具有線蟲抑制效應(yīng)的細(xì)胞或包含該細(xì)胞的植物中產(chǎn)生。dsrna可以從在不同轉(zhuǎn)化事件中引入或可能引入到單一核酸分子上的多個構(gòu)建體表達。dsrna可以使用單個啟動子或多個啟動子表達。在本發(fā)明的一個實施方式中，產(chǎn)生包含與植物寄生線蟲體內(nèi)的多個基因座同源的核酸的單一dsrna。在再另一方面中，本發(fā)明提供了在其基因組中具有至少一個重組dna序列的重組宿主細(xì)胞，該重組dna序列被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生至少一個在被植物寄生的線蟲攝食時發(fā)揮功能的dsrna分子，從而抑制目標(biāo)基因在線蟲中的表達。dsrna分子可以由這里描述并如序列表中所示的任何核酸序列編碼。本發(fā)明還提供了在其基因組中具有至少一個這里描述的重組dna序列的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。還提供了包含這種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，包括任何世代的后代植物、種子和植物產(chǎn)物，各包含該重組dna。本發(fā)明的dsrna分子可以在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，例如在細(xì)胞質(zhì)中。它們也可以在非原質(zhì)體空間中發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明進一步提供選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列的核酸序列的片段。該片段可以定義為當(dāng)表達為dsrna并被線蟲攝取時引起死亡、生長抑制、繁殖降低或中止根結(jié)線蟲屬線蟲的蟲害或攝食。該片段可以例如包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或其互補序列中任何一個或多個序列的至少大約19、21、23、25、40、60、80、100、125、200、250、300、400或更多的連續(xù)核苷酸或其全長。用于本發(fā)明中的有益dna片段的一個例子是至少大約19至大約23、或大約23至大約100個核苷酸，但少于大約2000個核苷酸的長度。特別有用的是與包括19、21、23、25、40、60、80、100、125、200、250、300、400個或更多連續(xù)核苷酸的線蟲目標(biāo)序列同源的包括大約23至大約300個核苷酸的dsrna序列。本發(fā)明還提供從任何這些序列表達的核糖核酸(包括dsrna)。選擇用于表達基因抑制劑的序列可以由源自一個或多個目標(biāo)植物寄生線蟲種類并意圖用于表達rna的單個序列構(gòu)建，該rna起到在一種或多種目標(biāo)病原體中抑制單個基因或基因家族的作用，或該dna序列可以構(gòu)建為多個dna序列的嵌合體。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)線蟲細(xì)胞(如根結(jié)線蟲種類的細(xì)胞)中目標(biāo)基因的表達的方法，該方法包括：(a)用包含與啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列可操作地連接的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述核酸序列編碼dsrna；(b)在足以允許包含多個轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)育的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(c)選擇已經(jīng)將該載體整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(d)篩選表達由該載體編碼的dsrna的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(e)選擇表達該dsrna的植物細(xì)胞；(f)任選地從表達該dsrna的植物細(xì)胞再生植物，從而植物中核酸序列的表達足以調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞接觸的植物寄生線蟲的細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達?；虮磉_的調(diào)節(jié)可以包括這種表達的部分或完全抑制。在再另一方面中，本發(fā)明提供了用于抑制植物寄生的線蟲中的基因表達的方法，包括在線蟲宿主的組織中提供基因抑制量的由這里描述的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的至少一種dsrna分子，其至少一個片段與植物寄生線蟲細(xì)胞中的mrna序列互補。該方法可以進一步包括觀察植物寄生線蟲的死亡、生長抑制或繁殖降低及宿主癥狀的程度。在一個實施方式中，被按照本發(fā)明的病原微生物攝食的dsrna分子(包括其修飾形式如sirna分子)可以是與由選自以下的核苷酸序列的全部或一部分轉(zhuǎn)錄的rna分子至少大約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或大約100％相同：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47。因此，提供了用于轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的dsrna分子的分離的和基本純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重組dna構(gòu)建體，其在引入植物寄生線蟲中時阻止或抑制內(nèi)源編碼序列或目標(biāo)編碼序列在植物寄生線蟲體內(nèi)的表達。本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因植物，其(a)包含編碼所述分離的和基本純化的核酸分子的核苷酸序列和用于轉(zhuǎn)錄防治植物寄生線蟲感染的dsrna分子的非天然存在的重組dna構(gòu)建體和(b)顯示出對感染的抗性和/或增強的耐受性。本發(fā)明包括用于局部施用到植物上或動物上或動物的環(huán)境中以實現(xiàn)植物寄生線蟲感染的消除或降低的包含本發(fā)明的dsrna核苷酸序列的組合物。編碼對于生存關(guān)鍵的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的cdna序列(如參與各種代謝或降解代謝途徑、細(xì)胞分裂、繁殖、能量代謝、消化等的氨基酸序列)可以選擇用于制備在植物寄生線蟲的宿主植物中提供的雙鏈rna分子。如這里描述的，目標(biāo)生物體攝食包含一個或多個dsrna(其至少一個片段對應(yīng)于目標(biāo)病原體的細(xì)胞中產(chǎn)生的rna的至少基本上相同的片段)可導(dǎo)致目標(biāo)生物體的死亡或其它抑制。這些結(jié)果表明源自于植物寄生線蟲的核苷酸序列(dna或rna)可用于構(gòu)建對線蟲攝食具有抗性的植物細(xì)胞。例如，線蟲的宿主植物可轉(zhuǎn)化為包含一個或多個源自這里提供的線蟲的核苷酸序列。轉(zhuǎn)化到宿主中的核苷酸序列可以編碼形成為轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)的細(xì)胞或生物液體中的dsrna序列的一個或多個rna，因此如果/當(dāng)植物寄生線蟲形成與轉(zhuǎn)基因宿主的營養(yǎng)關(guān)系時使得該dsrna可為植物寄生線蟲得到。這可以導(dǎo)致植物植物寄生的根結(jié)線蟲類線蟲的細(xì)胞中一個或多個基因的表達的抑制及其最終死亡或其生長、發(fā)育或繁殖的抑制。本發(fā)明一般涉及宿主生物體中植物寄生的線蟲的遺傳防治。更特別地，本發(fā)明包括遞送線蟲防治藥劑至植物寄生的線蟲的方法。這類防治藥劑引起植物寄生線蟲攝食、生長或在目標(biāo)宿主中另外引起疾病的能力的直接或間接損害。本發(fā)明在一個實施方式中提供了包括向植物寄生線蟲遞送作為抑制植物寄生線蟲中的目標(biāo)基因的手段的穩(wěn)定的dsrna分子，因此在線蟲宿主中獲得預(yù)期的植物疾病的防治。在實現(xiàn)前述方法時，本發(fā)明提供了抑制植物寄生線蟲中目標(biāo)基因的表達的方法，從而導(dǎo)致生長、發(fā)育、繁殖和/或攝食的損害，并最終可能導(dǎo)致植物寄生線蟲的死亡。在一個實施方式中，該方法包括將部分或完全穩(wěn)定的雙鏈rna(dsrna)核苷酸分子(包括其修飾形式如小的干擾rna(sirna)序列)引入植物寄生線蟲的營養(yǎng)組合物中，和使得該營養(yǎng)組合物或食物源為植物寄生線蟲所用。攝食包含雙鏈或sirna分子的營養(yǎng)組合物導(dǎo)致線蟲細(xì)胞攝取分子，從而導(dǎo)致線蟲細(xì)胞中至少一個目標(biāo)基因表達的抑制。目標(biāo)基因的抑制發(fā)揮對線蟲的有害效應(yīng)。該方法和相關(guān)的組合物可用于通過在線蟲的宿主中提供一種或多種包含這里描述的dsrna分子的組合物在線蟲存在的任何宿主組織或環(huán)境中或其上限制或消除線蟲對植物或植物細(xì)胞的感染或寄生。在特定的實施方式中，本發(fā)明提供的dsrna分子包含與以下任一所示的序列互補的核苷酸序列：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47，其在植物寄生的線蟲中的抑制導(dǎo)致對線蟲的生長和發(fā)育、繁殖或其它生物功能關(guān)鍵的蛋白質(zhì)或核苷酸序列物質(zhì)的減少或消除。所選擇的核苷酸序列可以表現(xiàn)出與如下所示的一個核苷酸序列的大約80％至大約100％的同一性：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47，或者其至少21個連續(xù)核苷酸的片段直至該序列的全長，包括其互補序列。在特定的其它實施方式中，能夠編碼有效的dsrna分子的dna序列選自于seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:46和seqidno:47或其互補序列。這種抑制可描述為特異性的，因為來自目標(biāo)基因一部分的核苷酸序列選自抑制性dsrna或sirna由其轉(zhuǎn)錄的序列。該方法有效地抑制至少一個目標(biāo)基因的表達并可用于抑制植物寄生線蟲中的許多不同類型的目標(biāo)基因。確認(rèn)為具有線蟲防治效果的序列可以通過建立適宜的表達構(gòu)建體輕易地表達為dsrna分子。例如，這些序列可以通過以下方式表達為發(fā)夾及莖和環(huán)結(jié)構(gòu)：取得對應(yīng)于選自seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或其片段的第一片段；將這一序列連接到不與第一片段同源或互補的第二片段間隔區(qū)；并將其連接到轉(zhuǎn)錄rna的第三片段，其中該第三片段的至少一部分與第一片段基本互補。這種構(gòu)建體通過第一片段與第三片段的雜交形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)且形成包含第二片段的環(huán)結(jié)構(gòu)(wo94/01550、wo98/05770、us2002/0048814a1和us2003/0018993a1)。dsrna可以例如以雙鏈結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)結(jié)構(gòu)，例如發(fā)夾)的形式產(chǎn)生，從而靶向于線蟲序列的sirna的產(chǎn)生通過共表達導(dǎo)致sirna產(chǎn)生增加的靶向基因的片段(例如在另外的植物可表達盒上)而增強，或減少甲基化以阻止dsrna發(fā)夾啟動子的轉(zhuǎn)錄基因沉默(例如，wo05/019408)。本發(fā)明包括的根結(jié)線蟲屬的典型物種包括花生根結(jié)線蟲(m.arenaria)、奇特伍德根結(jié)線蟲(m.chitwoodi)、不列顛根結(jié)線蟲(m.artiellia)、偽哥倫比亞根結(jié)線蟲(m.fallax)、北方根結(jié)線蟲(m.hapla)、爪哇根結(jié)線蟲(m.javanica)、南方根結(jié)線蟲、小結(jié)根結(jié)線蟲(m.microtyla)、m.partityla、番禺根結(jié)線蟲(m.panyuensis)和m.paranaensis?？赡芘c根結(jié)線蟲一起發(fā)現(xiàn)的其它植物寄生線蟲包括球形胞囊屬、短體線蟲屬、擬毛刺線蟲屬(paratrichodorus)、穿孔線蟲屬(radopholus)、紐帶線蟲屬(hoplolaimus)、莖線蟲屬、錐線蟲屬(dolichodorus)、螺旋線蟲屬(helicotylenchus)、潛根線蟲屬(hirschmanniella)、劍線蟲屬、腎形線蟲屬(rotylenchulus)、毛刺線蟲屬(trichodorus)、矮化線蟲屬(tylenchorhynchus)、刺線蟲屬(belonolaimus)和長針線蟲屬(longidorus)。本發(fā)明的方法和組合物可應(yīng)用于任何單子葉或雙子葉植物，取決于所希望的病原體(例如線蟲)防治。本發(fā)明保護的典型植物以及與它們相關(guān)的根結(jié)和其它植物寄生的線蟲物種包括，但不限于苜蓿：北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、鱗球莖莖線蟲(ditylenchusdipsaci)、短體線蟲類、針線蟲類(paratylenchusspp.)、劍線蟲類；香蕉：南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲(radopholussimilis)、多帶螺旋線蟲(helicotylenchusmulticinctus)、咖啡短體線蟲(pratylenchuscoffeae)、腎形線蟲(rotylenchulusreniformis)；蠶豆和豌豆：根結(jié)線蟲類、異皮線蟲類、刺線蟲類、螺旋線蟲類、腎形線蟲、銀鏈花擬毛刺線蟲(paratrichodorusanemones)、毛刺線蟲類；木薯：根結(jié)線蟲類、腎形線蟲；谷類：納西根結(jié)線蟲(meloidogynenaasi(大麥、小麥、黑麥)；鷹嘴豆：根結(jié)線蟲類、木豆胞囊線蟲(heteroderacajani)、腎形線蟲、塞氏紐帶線蟲(hoplolaimusseinhorsti)、短體線蟲類；柑橘：根結(jié)線蟲類、柑橘半穿刺線蟲(tylenchulussemipenetrans)、香蕉穿孔線蟲、柑橘穿孔線蟲(radopholuscitrophilus)、hemicycliophoraarenaria、短體線蟲類、長尾刺線蟲(bolonolaimuslongicaudatus)、毛刺線蟲類、擬毛刺線蟲類、劍線蟲類；三葉草：根結(jié)線蟲類、三葉草胞囊線蟲(heteroderatrifolii)；玉米：南方根結(jié)線蟲、短體線蟲類、較小擬毛刺線蟲(paratrichodorusminor)、長針線蟲類、哥倫比亞紐帶線蟲(hoplolaimuscolumbus)；棉花：南方根結(jié)線蟲、長尾刺線蟲(belonolaimuslongicaudatus)、腎形線蟲、盔狀紐帶線蟲(hoplolaimusgaleatus)、短體線蟲類、矮化線蟲類、較小擬毛刺線蟲；葡萄：根結(jié)線蟲類、劍線蟲類、傷殘短體線蟲(pratylenchusvulnus)、柑橘半穿刺線蟲、腎形線蟲；草類：短體線蟲類、長針線蟲類、paratrichodoruschristiei、劍線蟲類、莖線蟲類；花生：北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、短體線蟲類、小環(huán)線蟲類(criconemellaspp.)、長尾刺線蟲；木豆：根結(jié)線蟲類、木豆胞囊線蟲、腎形線蟲、塞氏紐帶線蟲、短體線蟲類；馬鈴薯：根結(jié)線蟲類、馬鈴薯金線蟲(globoderarostochiensis)、馬鈴薯白線蟲(globoderapallida)、短體線蟲類、原始毛刺線蟲(trichodorusprimitivus)、莖線蟲類、擬毛刺線蟲類、異常珍珠線蟲(nacobbusaberrans)；稻：根結(jié)線蟲類、水稻干尖線蟲(aphelenchiodesbesseyi)、水稻莖線蟲(ditylenchusangustus)、潛根線蟲類(hirchmanniellaspp.)、水稻胞囊線蟲(heteroderaoryzae)；小果：根結(jié)線蟲類、短體線蟲類、劍線蟲類、長針線蟲類、paratrichodoruschristiei,滑刃線蟲類(aphelenchoidesspp.)；大豆：南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、大豆胞囊線蟲、刺線蟲類、哥倫比亞紐帶線蟲；甜菜：根結(jié)線蟲類、甜菜胞囊線蟲(heteroderaschachtii)、鱗球莖莖線蟲、異常珍珠線蟲、毛刺線蟲類、長針線蟲類、擬毛刺線蟲類；甘蔗：根結(jié)線蟲類、短體線蟲類、穿孔線蟲類、異皮線蟲類、紐帶線蟲類、螺旋線蟲類、盾線蟲類(scutellonemaspp.)、刺線蟲類、矮化線蟲類、劍線蟲類、長針線蟲類、擬毛刺線蟲類；煙草：根結(jié)線蟲類、短體線蟲類、煙草矮化線蟲(tylenchorhynchusclaytoni)、煙草胞囊線蟲(globoderatabacum)、毛刺線蟲類、美洲劍線蟲(xiphinemaamericanum)、鱗球莖莖線蟲、擬毛刺線蟲類；和西紅柿：根結(jié)線蟲類、短體線蟲類。本發(fā)明的各個方面特別可用于具有線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物，包括但不限于玉米、谷類(包括小麥、大麥、黑麥和水稻)、馬鈴薯、西紅柿、黃瓜、辣椒、三葉草、豆類(包括大豆(glycinesp.)、蠶豆和苜蓿)、甘蔗、甜菜、煙草、胡蘿卜、棉花(gossypiumsp.)、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、紅花、高粱、草莓、香蕉、草皮和觀賞植物等。本發(fā)明還提供用于防治植物寄生線蟲的感染的方法和組合物。一種方法提供了用于保護植物免受植物寄生線蟲侵害的如本文中所述的dsrna方法以及表現(xiàn)出與dsrna方法和組合物不同的特征且可以干擾線蟲生長、發(fā)育或繁殖的一種或多種化學(xué)劑。a.核酸組合物和構(gòu)建體本發(fā)明提供了用于獲得特定宿主靶標(biāo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的重組dna構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化的宿主靶標(biāo)可以由該重組dna構(gòu)建體表達有效水平的優(yōu)選dsrna或sirna。分離的和純化的核苷酸序列的對可以由cdna文庫和/或基因組文庫信息提供。核苷酸序列對可以源于用作熱擴增引物的任何線蟲以產(chǎn)生本發(fā)明的dsrna和sirna分子。如本文中所用的，術(shù)語“核酸”指從5’至3’端顯示的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。“核酸”也可以任選地包含允許通過聚合物正確地通讀且不減少該核酸編碼的多肽的表達的非天然存在的或改變的核苷酸堿基。術(shù)語“核苷酸序列”或“核酸序列”指作為單獨的單鏈或雙鏈體的核酸有義和反義鏈。術(shù)語“核糖核酸”(rna)包括rnai(抑制rna)、dsrna(雙鏈rna)、sirna(小干擾rna)、shrna(小發(fā)夾rna)、mrna(信使rna)、mirna(微rna)、trna(轉(zhuǎn)移rna，不論是否帶有相應(yīng)的?；被?和crna(互補rna)且術(shù)語“脫氧核糖核酸”(dna)包括cdna和基因組dna及dna-rna雜交體。詞語“核酸片段”、“核苷酸序列片段”或更一般地說“片段”，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為包括基因組序列、核糖體rna序列、轉(zhuǎn)移rna序列、信使rna序列、操縱子序列和表達或可適用于表達蛋白質(zhì)、多肽或肽的較小的工程核苷酸序列的功能術(shù)語。本發(fā)明提供了核苷酸序列，其表達產(chǎn)生基本上與植物寄生線蟲中靶向基因的rna分子的整個或部分同源的rna序列，該靶向基因的rna分子包含線蟲基因組中核苷酸序列編碼的rna序列。因此，在消化穩(wěn)定的rna序列后，可以獲得植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的核苷酸序列的下調(diào)，從而導(dǎo)致對線蟲生長、生存力、增殖或繁殖的有害效應(yīng)。如本文中所使用的，用于核酸序列的術(shù)語“基本上同源”或“基本同源性”包括在嚴(yán)格條件下與以下任一的編碼序列雜交的核苷酸序列：如序列表中所示的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或其互補序列。在嚴(yán)格條件下與如序列表中所示的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47或其互補序列雜交的序列是使得在兩個序列之間發(fā)生反平行排列的那些序列，且然后該兩個序列能夠在嚴(yán)格條件下與相對鏈上的相應(yīng)堿基形成氫鍵，從而形成可使用本領(lǐng)域中公知的方法檢測的在適當(dāng)?shù)膰?yán)格性(包括高嚴(yán)格性)條件下充分穩(wěn)定的雙鏈體分子?；就吹男蛄型ǔＥc序列表中的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47任一所示的所指核苷酸序列或其互補序列具有大約70％至大約80％的序列同一性，或更特別地大約80％至大約85％的序列同一性或更特別地大約90％至大約95％的序列同一性，至大約99％的序列同一性。如本文中所用的，術(shù)語“直系同源基因(ortholog)”指兩個或多個物種中由共同的祖先核苷酸序列進化的且可以在該兩個或多個物種保持相同功能的基因。如本文中所用的，術(shù)語“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”用于描述兩個或多個核苷酸序列之間的序列關(guān)系。兩個序列之間“序列同一性”的百分比通過在比較窗口內(nèi)比較兩個最佳對齊序列確定，其中比較窗口中的序列部分與用于兩個序列的最佳對齊的基準(zhǔn)序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即空隙)。該百分比通過確定兩個序列中存在的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中總的位置數(shù)目并將其結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比而計算。與基準(zhǔn)序列相比在每一位置相同的序列可以說與基準(zhǔn)序列相同，反之亦然。如果第一核苷酸序列表現(xiàn)出與第二或基準(zhǔn)序列的完全互補性，則沿5’-3’方向觀察的第一核苷酸序列可以說是沿3’-5’方向觀察的第二或基準(zhǔn)核苷酸序列的“互補序列”或與其互補。如本文中所用的，當(dāng)沿5’-3’閱讀的序列之一的每一核苷酸與沿3’-5’閱讀的其它序列的每一核苷酸互補，則可以說核酸序列分子表現(xiàn)出“完全互補性”。與基準(zhǔn)核苷酸序列互補的核苷酸序列表現(xiàn)出與基準(zhǔn)核苷酸序列的反向互補序列相同的序列。這些術(shù)語和說明在本領(lǐng)域中很好地定義并易于被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解。如本文中所用的，“比較窗口”指至少6個連續(xù)位置，通常大約50-大約100，更通常大約100-大約150個連續(xù)位置的概念片段(conceptualsegment)，其中兩個序列最佳對齊后某一序列與相同數(shù)目連續(xù)位置的基準(zhǔn)序列比較。比較窗口與用于兩個序列的最佳對齊的基準(zhǔn)序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含大約20％或更低的添加或缺失(即空隙)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0(geneticscomputergroup,575sciencedrivemadison,wis.,usa)中找到用于序列比對的詳細(xì)方法或從ausubel等(1998)找到序列分析的詳細(xì)說明。本發(fā)明提供了能夠在細(xì)胞或微生物中表達為rna轉(zhuǎn)錄物以抑制植物寄生線蟲的細(xì)胞、組織或器官中目標(biāo)基因表達的dna。該序列包含編碼一種或多種不同核苷酸序列的dna分子，其中各不同核苷酸序列包含有義核苷酸序列和反義核苷酸序列。該序列可以由編碼本發(fā)明的dsrna分子的一部分間隔序列連接。間隔序列可以構(gòu)成有義核苷酸序列或反義核苷酸序列的部分或者不相關(guān)核苷酸序列，并且在該dsrna分子中有義和反義序列之間形成。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列基本與目標(biāo)基因或其衍生物的核苷酸序列或其互補序列相同。dsrna分子可以可操作地置于在表達該dsrna的細(xì)胞、組織或器官中具有功能的啟動子序列的控制下以產(chǎn)生dsrna分子。在某些實施方式中，dna序列可以源自如序列表中的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47所示的核苷酸序列或其互補序列。本發(fā)明還提供用于在植物細(xì)胞中表達的dna序列，該植物在將該dna表達為rna并被植物寄生的線蟲攝食時獲得抑制植物寄生線蟲的細(xì)胞、組織或器官中的目標(biāo)基因的效果。dsrna可以包含一個或多個結(jié)構(gòu)基因序列，其中各結(jié)構(gòu)基因序列包含可以通過在互補和反義序列中形成環(huán)的間隔序列連接的有義核苷酸序列和反義核苷酸序列。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列基本與目標(biāo)基因的核苷酸序列、其衍生序列或其互補序列相同。一個或多個結(jié)構(gòu)基因序列可以可操作地置于一個或多個啟動子序列的控制下，至少一個啟動子序列在原核或真核生物體(特別是植物細(xì)胞)中是可操作的。在植物中表達基因抑制分子的方法是已知的(例如美國公開2006/0200878a1)，且可以用于表達本發(fā)明的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的用于植物寄生線蟲防治的基因序列或片段可以克隆到可在轉(zhuǎn)基因植物中操作的兩個組織特異性啟動子(如兩個根特異性啟動子)之間并且在其中表達以在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中產(chǎn)生向其中形成dsrna分子的mrna。根特異性啟動子的實例是本領(lǐng)域中已知的(例如線蟲誘導(dǎo)的rb7啟動子；美國專利5,459,252；opperman等，1994)。植物組織中包含的dsrna分子被植物寄生的線蟲攝食以獲得預(yù)期的目標(biāo)基因表達的抑制。花椰菜花葉病毒35s啟動子(轉(zhuǎn)基因植物中通用的原型強啟動子)或相關(guān)啟動子如e35s或fmv啟動子可以用于驅(qū)動線蟲抗性基因，特別是對于根結(jié)線蟲(參見實施例8)。啟動子也已確認(rèn)為指導(dǎo)在植物中線蟲誘導(dǎo)的覓食結(jié)構(gòu)中的基因表達(例如gheysen和fenoll,2002)。因此，可以利用在覓食位點中可再生表達的基因中確認(rèn)的啟動子。在線蟲形成的覓食位點中上調(diào)的基因的實例包括在根和芽頂端分生組織中表達的at10.1(mazarei等，2003)、hs1pro-1(thurau等，2003)、通常在伴細(xì)胞中表達的atsuc2(juergensen等，2003)、在維管組織和根尖中表達的at17.1(mazarei等，2004)、fgam合成酶(磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶(phosphoribosylformyl-glycinamidinesynthase))(vaghchhipawala等，2004)和abi3(demeutter等，2005)等。根結(jié)巨細(xì)胞具有傳遞細(xì)胞(transfercell)特有的細(xì)胞壁內(nèi)生形態(tài)。因此，韌皮部中的基因表達也可能適于輸送效應(yīng)分子到覓食位點中。本發(fā)明提供的核苷酸序列可以包含由“間隔序列”分隔的反向重復(fù)序列。間隔序列可以是包含有助于在各重復(fù)序列之間形成二級結(jié)構(gòu)(這是需要的)的任何核苷酸序列的區(qū)域。在本發(fā)明的一個實施方式中，間隔序列是mrna的有義或反義編碼序列的部分?；蛘唛g隔序列可以包含能夠與核酸分子共價連接的核苷酸或其同系物的任何組合。間隔序列可以包含例如至少大約10-100核苷酸長度，或大約100-200核苷酸長度，至少大約200-400核苷酸長度或至少大約400-500核苷酸長度的核苷酸序列。該核酸分子或核酸分子的片段或序列表中的其它核酸分子能夠在某些情況下特異性地與其它核酸分子雜交。如本文中所用的，如果兩個分子能夠形成反平行、雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則可以說兩個核酸分子能夠彼此特異性地雜交。如果它們表現(xiàn)出完全互補性，則可以說某一核酸分子是另一核酸分子的互補序列。如果兩個分子可以以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交以允許它們在至少常規(guī)“低嚴(yán)格性”條件下保持彼此退火，則可以說它們是“最小互補”的。類似地，如果兩個核酸分子可以以足夠的穩(wěn)定性彼此雜交以允許它們在常規(guī)“高嚴(yán)格性”條件下保持彼此退火，則可以說該分子互補。常規(guī)嚴(yán)格性條件由sambrook等，(1989)和haymes等，(1985)描述。因此，偏離完全互補性是可允許的，只要這種偏離不完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。因此，為了核酸分子或核酸分子的片段用作引物或探針，它只需要能夠在所采用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)的足夠互補性。促進dna雜交的適宜嚴(yán)格性條件例如可以以相對低的鹽和/或高溫條件(如通過大約0.02m至大約0.15mnacl和大約50℃至大約70℃提供的條件)用于需要高選擇性的應(yīng)用。例如，高嚴(yán)格性條件是用高嚴(yán)格性洗滌緩沖液(0.2xssc或1xssc,0.1％sds,65℃)洗滌雜交過濾器至少兩次。其它條件(如大約45℃下的6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)，隨后在50℃下進行2.0xssc的洗滌)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且可以在currentprotocolsinmolecularbiology(1989)中找到。例如，洗滌步驟中的鹽深度可以選自從50℃下大約2.0xssc的低嚴(yán)格性至50℃下大約0.2xssc的高嚴(yán)格性。另外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫(大約22℃)的低嚴(yán)格性條件到大約65℃的高嚴(yán)格性條件。溫度和鹽都可以變化，或者溫度或鹽濃度中任一可以保持恒定而另一變量發(fā)生改變。用于本發(fā)明中的核酸可以在這些條件下特異性地與來自線蟲的一種或多種核酸分子或其互補序列雜交。在特定的實施方式中，用于本發(fā)明中的核酸與序列表中seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47所示的一個或多個核酸分子或其互補序列表現(xiàn)出至少大約80％或至少大約90％或至少大約95％或至少大約99％或甚至大約100％的序列同一性。本發(fā)明的核酸也可以通過本領(lǐng)域中已知的方法完全或部分地合成，特別是在其中希望提供植物優(yōu)先序列的情況中。因此，本發(fā)明的核酸的全部或一部分可以使用所選擇的宿主優(yōu)先的密碼子合成。物種優(yōu)先密碼子可以例如選自在特定宿主物種中表達的蛋白質(zhì)中最常用的密碼子。核苷酸序列的其它修飾可以產(chǎn)生具有輕微改變的活性的突變體。dsrna或sirna核苷酸序列包含聚合核糖核苷酸的雙鏈且可以包括對磷酸糖骨架或核苷的修飾。rna結(jié)構(gòu)的修飾可以進行調(diào)整以允許特定的遺傳抑制。在一個實施方式中，dsrna分子可以通過酶學(xué)過程修飾以使得可以產(chǎn)生sirna分子。sirna可以在一些病原體中有效地介導(dǎo)一些目標(biāo)基因的下調(diào)效應(yīng)。這一酶學(xué)過程可以通過利用在昆蟲、脊椎動物、真菌或植物細(xì)胞中存在的真核rnai途徑的rnaseiii酶或dicer酶完成(elbashir等，2001；hamilton和baulcombe,1999)。這一過程也可以利用通過本領(lǐng)域技術(shù)人員很受容易理解的重組dna技術(shù)引入目標(biāo)昆蟲細(xì)胞中的重組dicer或rnaseiii。dicer酶和rnaseiii(天然存在于病原體中或通過重組dna技術(shù)制備)將較大的dsrna鏈切割成較小的寡核苷酸。dicer酶特異性地將dsrna分子切割成各大約19-25核苷酸長度的sirna段而rnaseiii酶通常將dsrna分子切割成12-15堿基對的sirna。由任一酶產(chǎn)生的sirna分子具有2-3個核苷酸的3’懸端及5’磷酸和3’羥基末端。通過rnaseiii酶產(chǎn)生的sirna分子與通過真核rnai途徑中的dicer酶產(chǎn)生的相同，并因此隨后在其后續(xù)解繞、分離成單鏈rna和與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的rna序列雜交后成為固有的細(xì)胞rna-降解機制的靶標(biāo)并降解。這一過程導(dǎo)致有效降解或消除由病原體中目標(biāo)基因的核苷酸序列編碼的rna序列。結(jié)果是病原體中特別靶向的核苷酸序列的沉默。酶學(xué)過程的詳細(xì)說明可以在hannon(2002)中找到。本發(fā)明的核苷酸序列可以記錄在計算機可讀介質(zhì)上。如本文中所用的，“計算機可讀介質(zhì)”指可以直接被計算機閱讀和訪問的任何有形的表達介質(zhì)。這類介質(zhì)包括，但不限于：磁性儲存介質(zhì)如軟盤、硬盤、存儲介質(zhì)和磁帶；光存儲介質(zhì)如cd-rom；電存儲介質(zhì)如ram和rom；光學(xué)字符識別格式的計算機文件及這些類別的混合如磁/光存儲介質(zhì)。熟練技術(shù)人員可以很容易理解，任何目前已知的計算機可讀介質(zhì)可用于產(chǎn)生包含已在其上記錄本發(fā)明的核苷酸序列的計算機可讀介質(zhì)的制品。如本文中所用的，“記錄”指將信息存儲在計算機可讀介質(zhì)上的過程。熟練技術(shù)人員可以很容易地采用目前已知的用于在計算機可讀介質(zhì)上記錄信息的任何方法以產(chǎn)生包含本發(fā)明的核苷酸序列信息的介質(zhì)。多種數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)可被熟練技術(shù)人員用于產(chǎn)生其上記錄有本發(fā)明的核苷酸序列的計算機可讀介質(zhì)。數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)的選擇一般基于選擇用于訪問存儲的信息的手段。另外，多種數(shù)據(jù)處理程序和格式可用于在計算機存儲介質(zhì)上存儲本發(fā)明的核苷酸序列信息。該序列信息可以表示在字處理文本文件中，在商用軟件如wordperfect和microsoftword中編排，或者以ascii文本文件的形式表示，存儲在數(shù)據(jù)庫應(yīng)用(如db2、sybase、oracle等)中。熟練技術(shù)人員可以很容易地采用多種數(shù)據(jù)處理結(jié)構(gòu)化格式(例如文本文件或數(shù)據(jù)庫)以獲得其上存儲有本發(fā)明的核苷酸序列信息的計算機可讀介質(zhì)。可公開獲得允許熟練技術(shù)人員訪問計算機可讀介質(zhì)中提供的序列信息的計算機軟件。在sybase系統(tǒng)上執(zhí)行blast(altschul等，1990)和blaze(brutlag等，1993)檢索算法的軟件可用于識別序列中的開放閱讀框(orfs)，如本文中提供的和包含與來自其它生物體的orf或蛋白質(zhì)的同源序列的unigenes和est。這類orf是本發(fā)明的序列中的蛋白質(zhì)編碼片段且可用于產(chǎn)生具有商業(yè)重要性和蛋白質(zhì)如用于氨基酸生物合成、代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、rna加工、核酸和蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)修飾及dna復(fù)制、限制、修飾、重組和修復(fù)的酶。本發(fā)明進一步提供包含本文中描述的序列信息的系統(tǒng)，特別是基于計算機的系統(tǒng)。這類系統(tǒng)設(shè)計為識別本發(fā)明的核酸分子的具有商業(yè)重要性的片段。如本文中所用的，“基于計算機的系統(tǒng)”指用于分析本發(fā)明的核苷酸序列信息的硬件裝置、軟件裝置和數(shù)據(jù)存儲裝置。本發(fā)明的基于計算機的系統(tǒng)的最小硬件裝置包含中央處理器(cpu)、輸入單元、輸出單元和數(shù)據(jù)存儲單元。熟練技術(shù)人員可很容易理解，任何當(dāng)前可得的基于計算機的系統(tǒng)適用于本發(fā)明。如本文中所用的，“靶結(jié)構(gòu)基序”或“靶基序”指任何適當(dāng)選擇的序列或序列的組合，其中該一個或多個序列基于在靶基序折疊時形成的三維構(gòu)型進行選擇。存在本領(lǐng)域中已知的多種靶基序。蛋白質(zhì)靶基序包括，但不限于酶活性位點和信號序列。核酸靶基序包括，但不限于啟動子序列、順式元件、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)型表達元件(蛋白質(zhì)結(jié)合序列)。b.重組載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化例如，重組dna載體可以是線性的或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)?；蛘咄瑫r包含待引入細(xì)菌宿主的基因組中的總dna的兩個或多個載體或質(zhì)粒。另外，細(xì)菌載體可以是表達載體。例如，如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47所示的核酸分子或其互補序列或片段可適當(dāng)?shù)夭迦朐谝环N或多種微生物宿主中發(fā)揮功能以驅(qū)動所連接的編碼序列或其它dna序列的表達的適當(dāng)啟動子控制下的載體中。許多載體可用于這一目的，且適宜載體的選擇主要取決于待插入載體中的核酸的大小和將用該載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。各載體包含取決于其功能(dna的擴增或dna的表達)和與其相容的特定宿主細(xì)胞的各種成分。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體成分一般包括，但不限于以下的一種或多種：信號序列、復(fù)制起點、一個或多個選擇標(biāo)記基因和允許外源dna表達的誘導(dǎo)型啟動子。表達和克隆載體一般包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。這一基因編碼在選擇培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞存活或生長必需的蛋白質(zhì)。典型的選擇基因編碼以下蛋白質(zhì)：(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨喋呤或四環(huán)素)的抗性，(b)補充營養(yǎng)缺陷型缺陷或(c)供應(yīng)復(fù)雜培養(yǎng)基不提供的關(guān)鍵營養(yǎng)物(例如編碼桿菌的d-丙氨酸消旋酶的基因)。成功地用異源蛋白質(zhì)或其片段轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)并因此在選擇配方中存活。用于產(chǎn)生mrna的表達載體也可以包含被宿主細(xì)菌生物體識別并與核酸可操作地連接的誘導(dǎo)型啟動子。適用于細(xì)菌宿主的誘導(dǎo)型啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶啟動子、大腸桿菌λ噬菌體pl和pr啟動子及大腸桿菌半乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子和乳糖操縱子啟動子及其變異體，以及雜合啟動子如tac啟動子。但是，其它已知的細(xì)菌誘導(dǎo)型啟動子是合適的。用于調(diào)控序列和結(jié)構(gòu)核苷酸序列的術(shù)語“可操作地連接”意思是調(diào)控序列引起所連接的結(jié)構(gòu)核苷酸序列的經(jīng)調(diào)控的表達?！罢{(diào)控序列”或“控制元件”指位于結(jié)構(gòu)核苷酸序列上游(5’非編碼序列)、之中或下游(3’非翻譯序列)的核苷酸序列，且其影響相關(guān)的結(jié)構(gòu)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定、或翻譯的時機和水平或量。調(diào)控序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強子、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、阻遏物結(jié)合序列和多腺苷酸化識別序列等。包含一個或多個上列成分的合適載體的構(gòu)建采用標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)。分離的質(zhì)粒或dna片段被切割、剪裁和重接合成產(chǎn)生所需要的質(zhì)粒希望的形式?？捎玫募?xì)菌表達載體的實例包括，但不限于多功能的大腸桿菌克隆和表達載體如bluescripttm(stratagene,lajolla,ca)(其中例如核酸或其片段可以接合到載體中與氨基末端met和后續(xù)的β-半乳糖苷酶的7個殘基的序列同框從而產(chǎn)生雜合蛋白質(zhì))、pin載體(vanheeke和schuster,1989)等。本發(fā)明還包括本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到植物中以實現(xiàn)一種或多種dsrna分子的線蟲抑制性的表達水平。轉(zhuǎn)化載體可以很容易地使用本領(lǐng)域中可得的方法制備。轉(zhuǎn)化載體包含能夠轉(zhuǎn)錄為rna分子且基本上與目標(biāo)線蟲基因組編碼的一種或多種核苷酸序列同源和/或互補的一個或多個核苷酸序列，從而由該一個或多個核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的rna被目標(biāo)植物寄生線蟲攝取時，線蟲基因組的至少一個相應(yīng)的核苷酸序列的表達下調(diào)。轉(zhuǎn)化載體可以稱為dsdna構(gòu)建體且也可以定義為重組分子、疾病控制劑、遺傳分子或嵌合遺傳構(gòu)建體。本發(fā)明的嵌合遺傳構(gòu)建體可以包含例如編碼一個或多個反義轉(zhuǎn)錄物、一個或多個有義轉(zhuǎn)錄物、一個或多個各前述的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中由此獲得的轉(zhuǎn)錄物的全部或部分與包含病原體基因組內(nèi)的核苷酸序列編碼的rna序列的全部或部分同源。在一個實施方式中，植物轉(zhuǎn)化載體包含分離和純化的dna分子，其包含與本發(fā)明的一個或多個核苷酸序列可操作地連接的異源啟動子。該核苷酸序列選自如序列表中所示的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47及其互補序列。該核苷酸序列包括編碼目標(biāo)線蟲rna轉(zhuǎn)錄物中存在的rna的全部或部分的片段且可以包含目標(biāo)線蟲rna的全部或部分的反向重復(fù)序列。包含表達載體的dna分子還可以包含位于編碼序列上游或甚至編碼序列中的功能內(nèi)含子序列，且還可以包含位于啟動子和翻譯起始點之間的五一撇(5’)未翻譯前導(dǎo)序列(即，utr或5’-utr)。植物轉(zhuǎn)化載體可以包含來自多于一個基因的序列，因此允許產(chǎn)生多于一種用于在目標(biāo)線蟲細(xì)胞中抑制兩個或多個基因的表達的dsrna。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，其序列對應(yīng)于不同基因中存在的序列的dna的序列可組合成用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達的單個復(fù)合dna片段。或者，已包含至少一個dna片段的本發(fā)明的質(zhì)?？梢酝ㄟ^在增強子和啟動子或終止子序列之間順序插入另外的dna片段進行修飾。在設(shè)計用于抑制多個基因的本發(fā)明的疾病控制劑中，待抑制的基因可以由相同的植物寄生線蟲物種獲得以增強控制劑的效果。在某些實施方式中，基因可源自不同的植物寄生線蟲以擴展該控制劑有效對抗的線蟲的范圍。當(dāng)以多個基因作為抑制或表達和抑制的組合的目標(biāo)時，多順反子dna元件可以如美國公開2004-0029283號中所表明和公開的制備。在不同植物物種中發(fā)揮功能的啟動子也是本領(lǐng)域中公知的。用于在植物中表達多肽的啟動子包括如odell等，(1985)所述的誘導(dǎo)型、病毒、合成或組成型啟動子，和/或時間調(diào)節(jié)的、空間調(diào)節(jié)的和時間空間調(diào)節(jié)的啟動子?？梢杂糜诒景l(fā)明中的啟動子包括增強的camv35s啟動子和fmv35s啟動子。也可以有利地使用表現(xiàn)出根特異性的camv35s啟動子的片段。出于本發(fā)明的目的，可能希望在植物的根組織中獲得這些基因的最高表達水平。多種根特異性啟動子已經(jīng)得到確認(rèn)并且是本領(lǐng)域中已知的(例如美國專利5,110,732、5,837,848、5,459,252、hirel等，1992)。本發(fā)明的重組dna載體或構(gòu)建體可以包含賦予植物細(xì)胞選擇表型的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記也可用于選擇包含編碼本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)的外源核酸的植物或植物細(xì)胞。該標(biāo)記可編碼殺生劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、g418博來霉素、潮霉素等)或滅草劑抗性(例如，草甘膦等)。選擇標(biāo)記的實例包括，但不限于編碼卡那霉素抗性且可以使用卡那霉素、g418等選擇的neo基因、編碼雙丙氨膦(bialaphos)抗性的bar基因、編碼草甘膦抗性的突變epsp合成酶基因、賦予對溴苯腈的抗性的腈水解酶基因、賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突變乙酰乳酸合成酶基因(als)和甲氨喋呤抗性dhfr基因?？色@得賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨喋呤、草胺膦、嘌呤霉素、壯觀霉素、利福平和四環(huán)素等的抗性的多重選擇標(biāo)記。這類選擇標(biāo)記的實例在美國專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中說明。本發(fā)明的重組載體或構(gòu)建體還可以包括篩選標(biāo)記。篩選標(biāo)記可用于監(jiān)測表達。典型的篩選標(biāo)記包括β-葡糖苷酸酶或編碼其各種發(fā)色底物已知的酶的uida基因(gus)(jefferson等，1987)；各種熒光蛋白質(zhì)(fp)基因中的一種或多種如綠色熒光蛋白(gfp)、紅色熒光蛋白(rfp)或通常以特征性波長發(fā)熒光的一大族蛋白質(zhì)中的任一種；r-基因座(其編碼調(diào)節(jié)植物組織中花青素色素(紅色)的產(chǎn)生的產(chǎn)物)(dellaporta等，1988)；β-內(nèi)酰胺酶基因(sutcliffe等，1978)，編碼其各種發(fā)色底物已知的酶的基因(例如，padac，顯色頭孢菌素)；熒光素酶基因(ow等，1986)；編碼可轉(zhuǎn)化顯色兒茶酚的兒茶酚加雙氧酶的xyle基因(zukowski等，1983)；α-淀粉酶基因(ikatu等，1990)；編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁閐opa和多巴醌(dopaquinone)的酶的酪氨酸酶基因(katz等，1983)，多巴醌隨之縮合成黑色素；α-半乳糖苷酶，其催化顯色α-半乳糖底物。植物轉(zhuǎn)化載體的實例包括源自根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的ti質(zhì)粒的那些載體(例如，美國專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967和ep0122791)。毛根土壤桿菌(agrobacteriumrhizogenes)質(zhì)粒(或“ri”)也是可用的且是本領(lǐng)域中已知的。其它植物轉(zhuǎn)化載體包括例如herrera-estrella(1983)、bevan(1983)、klee(1985)和ep0120516公開的那些。一般在，可能希望將非特異性位置的功能性重組dna引入植物基因組中。在特殊的情況中，通過位點特異性整合插入重組dna構(gòu)建體可能是有用的。已知在植物中發(fā)揮功能的現(xiàn)有的幾種位點特異性重組系統(tǒng)包括美國專利4,959,317中公開的cre-lox和美國專利5,527,695中公開的flp-frt。據(jù)相信，用于本發(fā)明的合適的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法實際上包括可以將dna引入細(xì)胞中的任何方法(參見，例如miki等，1993)，如通過原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化(美國專利no.5,508,184；omirulleh等，1993)、通過脫水/抑制介導(dǎo)的dna攝取(potrykus等，1985)、通過電穿孔(美國專利5,384,253)、通過用碳化硅纖維攪拌(kaeppler等，1990；美國專利5,302,523和美國專利no.5,464,765)、通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5,563,055；5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840、6,384,301)和通過dna涂覆顆粒的加速(美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、6,403,865；padgette等，1995)等。通過應(yīng)用如這些的技術(shù)，實際上任何物種的細(xì)胞可以穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化。在多細(xì)胞物種的情況中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以再生為轉(zhuǎn)基因生物體。最廣泛使用的將表達載體引入植物中的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(例如，horsch等，1985)。根癌土壤桿菌和毛根土壤桿菌是遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和毛根土壤桿菌的ti和ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的土壤桿菌載體系統(tǒng)和方法的由多種參考文獻提供，包括gruber等，1993、miki等，1993、moloney等，1989和美國專利4,940,838和5,464,763。其它天然地與植物相互作用的細(xì)菌如中華根瘤菌(sinorhizobium)、根瘤菌(rhizobium)和中生根瘤菌(mesorhizobium)可以修飾以介導(dǎo)對許多不同的植物的基因轉(zhuǎn)移。這些植物相關(guān)的共生細(xì)菌可使得通過獲得去武裝的ti質(zhì)粒和適宜的雙運載體(binaryvector)而處于基因轉(zhuǎn)移的感受態(tài)(broothaerts等，2005)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物和特別是在植物中表達異源核酸的方法是已知的且可以用于本文提供的核酸以制備表現(xiàn)出對目標(biāo)線蟲攝食的較低易感性。例如，植物轉(zhuǎn)化載體可以通過將本文公開的產(chǎn)生dsrna的核酸插入植物轉(zhuǎn)化載體中并將其引入植物中制備。一種已知的載體系統(tǒng)已通過改良根癌土壤桿菌的天然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)得到。該天然系統(tǒng)包含含有稱為t-dna的大片段的大ti(腫瘤誘導(dǎo))-質(zhì)粒，其被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物。ti質(zhì)粒的另一片段，vir區(qū)域，負(fù)責(zé)t-dna轉(zhuǎn)移。t-dna區(qū)域以末端重復(fù)序列為邊界。在改良的雙運載體中，腫瘤誘導(dǎo)的基因已被刪除且vir區(qū)域的功能用于轉(zhuǎn)移以t-dna邊界序列為邊界的外源dna。t-區(qū)域也可以包含用于有效回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞的選擇標(biāo)記及用于插入轉(zhuǎn)移序列(如編碼dsrna的核酸)的多克隆位點。使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通?？赡馨迦胍粋€染色體中的單一的簡單重組dna序列，稱為轉(zhuǎn)基因事件。這類轉(zhuǎn)基因植物可稱為對于插入的外源序列為雜合的。對于轉(zhuǎn)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物可以通過使包含單一外源基因序列的獨立隔離轉(zhuǎn)基因植物(例如f0植物)與其自身有性交配(自交)以產(chǎn)生f1種子而獲得。所產(chǎn)生的f1種子的四分之一將是對于轉(zhuǎn)基因純合的。萌發(fā)f1種子產(chǎn)生可以測試雜合性的植物，通亮使用snp分析或使得能夠區(qū)分雜合子和純合子的熱擴增分析(即，接合性分析)。將雜合植物與其自身或另一雜合植物雜交產(chǎn)生雜合后代以及純合轉(zhuǎn)基因和純合空白后代。c.核酸表達和目標(biāo)基因抑制舉例來說，本發(fā)明提供了病原性目標(biāo)生物體的轉(zhuǎn)化的宿主植物、轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞及它們的后代。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的植物可以進行生物工程以表達本文中所述的一種或多種在異源啟動子控制下的dsrna或sirna序列，從而提供病原體防治效果。這些序列可以用于病原體中的基因抑制，從而在所保護的轉(zhuǎn)化宿主生物體上降低病原體引起的疾病的水平和發(fā)病率。如本文中所用的，詞語“基因抑制”意圖指任何公知的用于降低由于基因轉(zhuǎn)錄為mrna和隨后mrna的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的水平的方法?；蛞种埔惨庵附档突蚧蚓幋a序列的蛋白質(zhì)表達，包括轉(zhuǎn)錄后基因抑制和轉(zhuǎn)錄抑制。轉(zhuǎn)錄后基因抑制是通過由作為抑制的基因或編碼序列轉(zhuǎn)錄的mrna的全部或部分和用于抑制的相應(yīng)的雙鏈rna之間的同源性介導(dǎo)的，并且指實質(zhì)和可測量地減少用于核糖體結(jié)合的細(xì)胞中可得的可利用mrna量或阻止核糖體的翻譯。轉(zhuǎn)錄的rna可以是沿有義方向產(chǎn)生dsrna以實現(xiàn)所謂的共抑制，沿反義方向產(chǎn)生dsrna以實現(xiàn)所謂的反義抑制或沿兩個方面產(chǎn)生dsrna以實現(xiàn)所謂的rna干擾(rnai)。轉(zhuǎn)錄抑制是通過在細(xì)胞中存在表現(xiàn)出與啟動子dna序列或其互補序列的基本序列同一性的dsrna基因抑制劑以實現(xiàn)所謂的啟動子反式抑制而介導(dǎo)的?；蛞种瓶梢杂行古c性狀相關(guān)的原始植物基因以例如產(chǎn)生具有降低的該原始基因編碼的蛋白質(zhì)的水平或具有增高的或降低的感染代謝物的水平的植物?；蛞种埔部梢杂行箶z食或接觸含有基因抑制劑的植物材料的植物寄生線蟲中的目標(biāo)基因，該基因抑制劑特別設(shè)計為阻止或抑制線蟲細(xì)胞中一種或多種同源或互補序列的表達。通過反義或有義定向的rna的轉(zhuǎn)錄后基因抑制調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中的基因表達公開于美國專利5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020中。dsrna用于抑制植物中的基因的用途公開于wo99/53050、wo99/49029、美國公開2003/017596、美國專利申請公開2004/0029283中。對植物寄生線蟲的轉(zhuǎn)錄后基因抑制的有益方法采用有義定向和反義定向的，轉(zhuǎn)錄的rna其是例如作為發(fā)夾或者莖和環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的。用于實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因抑制的dna構(gòu)建體的實例是其中第一片段編碼表現(xiàn)出與作為抑制目標(biāo)的基因的片段的基本同一性的、表現(xiàn)為反義定向的rna，該第一片段連接到編碼表現(xiàn)出與第一片段的基本互補性的rna的第二片段上。這種構(gòu)建體通過第一片段與第二片段的雜交形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)及由連接該兩個片段的核苷酸序列形成環(huán)結(jié)構(gòu)(參見wo94/01550、wo98/05770、us2002/0048814和us2003/0018993)。也可以采用與另外的目標(biāo)基因片段的共表達，如上所述(例如，wo05/019408)。按照本發(fā)明的一個實施方式，提供了其體外表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄與植物寄生線蟲中目標(biāo)基因的rna分子基本同源的穩(wěn)定rna序列的核苷酸序列，該目標(biāo)基因的rna分子包含線蟲基因組中的核苷酸序列編碼的rna序列。因此，在植物寄生的線蟲攝食該穩(wěn)定的rna序列后，實現(xiàn)了目標(biāo)線蟲細(xì)胞中對應(yīng)于目標(biāo)基因的核苷酸序列的下調(diào)。在本發(fā)明的特定實施方式中，可以利用seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47中任一核酸序列或其互補序列的至少21個連續(xù)核苷酸的片段的表達，包括最多21、36、60、100、550或1000個連續(xù)核苷酸的片段或表現(xiàn)出與這些序列的90-100％的同一性的序列或其互補序列的表達。在特定的實施方式中，本發(fā)明提供的核苷酸可以包含選自表4中所述的序列，包括如表4中所述的序列跨越核苷酸(sequencespanningnucleotide)上的位置。在再另外的實施方式中，本發(fā)明提供的核苷酸可以描述為包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27至seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46或seqidno:47中一個或多個的核苷酸1-21、22-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、601-650、651-700、701-750、751-800、801-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、1451-1500、1501-1550、1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-1850、1851-1900、1901-1950、1951-2000、2001-2050、2051-2100、23-75、76-125、126-175、176-225、226-275、276-325、326-375、376-425、426-475、476-525、526-575、576-625、626-675、676-725、726-775、776-825、826-875、876-925、926-975、976-1025、1026-1075、1076-1125、1126-1175、1176-1225、1226-1275、1276-1325、1326-1375、1376-1425、1426-1475、1476-1525、1526-1575、1576-1625、1626-1675、1676-1725、1726-1775、1776-1825、1826-1875、1876-1925、1926-1975、1976-2025、2026-2075、2076-2125、1-550、200-750、300-850、400-950、500-1050、600-1150、700-1250、800-1350、900-1450、1000-1550、1100-1650、1200-1750、1300-1850、1400-1950、1500-2050直至該序列的全長中一個或多個。用于選擇特定的亞序列作為sirna介導(dǎo)的基因抑制的靶標(biāo)的方法是本領(lǐng)域中已知的(例如，reynolds等，2004)。使用本發(fā)明的穩(wěn)定dsrna技術(shù)抑制目標(biāo)基因是序列特異性的，因為對應(yīng)于rna的雙鏈區(qū)域的核苷酸序列作為基因抑制的靶標(biāo)。包含與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物的一部分相同的核苷酸序列的rna在某些實施方式中可能對于抑制是有益的。具有相對于目標(biāo)序列的插入、缺失和單點突變的rna序列也已發(fā)現(xiàn)對于抑制是有效的。在進行本發(fā)明的特定實施方式中，抑制性dsrna和目標(biāo)基因的部分可以共有至少大約80％的序列同一性，或大約90％的序列同一性，或大約95％的序列同一性，或大約99％的序列同一性，或甚至大約100％的序列同一性?；蛘?，rna的雙鏈區(qū)域可以功能性地定義為能夠與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物的一部分雜交的核苷酸序列。表現(xiàn)出更高同源性的不到全長的序列補償了較長的低同源性序列。相同核苷酸序列的長度可以是至少大約25、50、100、200、300、400、500或至少大約1000堿基。正常地，長于20-100核苷酸的序列可能是希望的，盡管取決于目標(biāo)基因的大小，長于大約200-300核苷酸的序列和長于大約500-1000核苷酸的序列可能特別地提供某些益處。在一個實施方式中，本發(fā)明具有能夠耐受可預(yù)計由遺傳突變、株多態(tài)性或進化趨異產(chǎn)生的序列變異的優(yōu)勢。引入的核酸分子可能不需要與目標(biāo)序列絕對同源，且可能不需要相對于目標(biāo)基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mrna的全長。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，如本文中所公開的，實施本發(fā)明不需要rna和目標(biāo)基因之間的100％序列同一性。目標(biāo)基因表達的抑制可以通過測量內(nèi)源目標(biāo)rna或由目標(biāo)rna的翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)定量，且抑制的結(jié)果可以通過檢驗細(xì)胞或生物體的外向特性確認(rèn)。定量rna和蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在某些實施方式中，基因表達抑制至少10％，至少33％，至少50％或至少80％。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，基因表達在病原體的細(xì)胞內(nèi)抑制至少80％，至少90％，至少95％或至少99％，從而發(fā)生顯著的抑制。顯著抑制意思是指產(chǎn)生可檢測表型(例如，生長中止、覓食、發(fā)育、繁殖降低、死亡等)的充分抑制或?qū)?yīng)于所抑制的目標(biāo)基因的rna和/或蛋白質(zhì)的可檢測的減少。雖然在本發(fā)明的特定實施方式中，抑制在植物寄生線蟲的基本上所有細(xì)胞中發(fā)生，在其它實施方式中，抑制僅在表達該基因的細(xì)胞亞群中發(fā)生。dsrna分子可以在體內(nèi)或體外合成。dsrna可以通過單個自身互補rna鏈或由兩個互補rna鏈形成。細(xì)胞的內(nèi)源rna聚合酶可以介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或克隆的rna聚合酶可用于體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄。抑制可以靶向于器官、組織或細(xì)胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄、環(huán)境條件(例如，感染、應(yīng)激、溫度、化學(xué)誘導(dǎo)劑)的刺激和/或發(fā)育階段或時期的工程轉(zhuǎn)錄。rna鏈可以進行或不進行多腺苷酸化，rna鏈能夠或不能夠被細(xì)胞的翻譯器官翻譯成多肽。本發(fā)明的rna、dsrna、sirna或mirna可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過人工或自動反應(yīng)化學(xué)地或酶學(xué)地產(chǎn)生或者在另一生物體中體內(nèi)產(chǎn)生。rna也可以通過部分或完全有機合成產(chǎn)生；任何修飾的核糖核苷酸可以通過體外酶學(xué)或有機合成引入。rna可以通過細(xì)胞rna聚合酶或噬菌體rna聚合酶(例如，t3、t7、sp6)合成。表達構(gòu)建體的用途和產(chǎn)生是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，wo97/32016、美國專利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。如果化學(xué)合成或通過體外酶學(xué)合成，rna可以在引入細(xì)胞之前純化。例如，rna可以通過溶劑或樹脂的提取、沉淀、電泳、色譜或其組合由混合物純化?；蛘?，rna可以無純化或最小純化使用以避免由于樣品處理導(dǎo)致的損失。rna可以干燥用于存儲或溶解于水溶液中。溶液可以包含緩沖液或鹽以促進退火和/或雙鏈的穩(wěn)定。對于體內(nèi)轉(zhuǎn)基因或表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控區(qū)域(例如，啟動子、增強子、沉默子(silencer)和多腺苷酸化)可用于轉(zhuǎn)錄rna鏈(或多條鏈)。因此，在一個實施方式中，用于產(chǎn)生rna分子的核苷酸序列可以可操作地連接在微生物、真菌或植物宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的一個或多個啟動子。理想地，核苷酸序列置于通常存在于宿主基因組中的內(nèi)源啟動子的控制下。在可操作地連接的啟動子序列的控制下的本發(fā)明的核苷酸序列可以進一步側(cè)鄰有利地影響其轉(zhuǎn)錄和/或所獲得的轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性的其它序列。這類序列一般位于可操作地連接的啟動子的上游和/或表達構(gòu)建體3’末端的下游，且可以同時存在于啟動子的上游和表達構(gòu)建體3’末端的下游，雖然也包括僅這種上游序列。如本文中所用的，術(shù)語“疾病控制劑”或“基因抑制劑”指由第三rna片段連接的第一rna片段和第二rna序列組成的特定rna分子。第一和第二rna片段存在于rna分子的長度內(nèi)且為彼此的基本反向重復(fù)序列和通過第三片段連接到一起。第一和第二rna片段之間的互補性產(chǎn)生該兩個片段在體內(nèi)和體外雜交以形成在各第一和第二片段的一個末端由第三片段(其形成環(huán))連接在一起的雙鏈分子(即莖)的能力，從而整個結(jié)構(gòu)形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)，或甚至更緊密雜交的結(jié)構(gòu)可以形成莖-環(huán)的節(jié)結(jié)構(gòu)。第一和第二片段總是(但不是必然分別地)對應(yīng)于與在意圖通過攝取dsrna分子抑制的目標(biāo)病原體中由目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的目標(biāo)rna同源的有義和反義序列。控制劑也可以是基本純化(或分離)的核酸分子且更特別地來自于基因組dna(gdna)或cdna文庫的核酸分子或其核酸片段分子?；蛘撸慰梢园哂写蠹s15-大約250個核苷酸殘基和包括大約15-大約30個核苷酸殘基的較小的寡核苷酸。如本文中所用的，術(shù)語“基因組”在用于植物寄生線蟲的細(xì)胞或宿主時不僅包括細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的染色體dna還包括在細(xì)胞的亞細(xì)胞成分中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器dna。因此引入植物細(xì)胞中的本發(fā)明的dna可以進行染色體整合或定位于細(xì)胞器中。術(shù)語“基因組”在應(yīng)用于細(xì)菌時包括細(xì)菌宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體和質(zhì)粒。因此引入細(xì)菌宿主細(xì)胞中的本發(fā)明的dna可以進行染色體整合或定位于細(xì)胞器中。如本文中所用的，術(shù)語“植物寄生線蟲”指可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達雙鏈基因抑制劑或涂覆雙鏈基因抑制劑的宿主植物材料上感染、移殖、寄生或引起疾病的那些線蟲。如本文中所用的，“線蟲抗性”性狀是引起轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物或其它轉(zhuǎn)基因宿主抵抗通常能夠?qū)λ拗髟斐蓳p害或損失的線蟲攻擊的宿主特性。這種抗性可由天然突變或更典型地由引入賦予植物寄生線蟲抗性的重組dna產(chǎn)生。為向轉(zhuǎn)基因植物施加線蟲抗性，重組dna例如可以轉(zhuǎn)錄成在重組植物的組織或流體內(nèi)形成dsrna分子的rna分子。dsrna分子部分地由與植物寄生線蟲內(nèi)的dna序列編碼的相應(yīng)rna片段相同的rna的片段構(gòu)成，該植物寄生線蟲可引起宿主植物的疾病。目標(biāo)植物寄生線蟲內(nèi)基因的表達受到dsrna的抑制，且目標(biāo)植物寄生線蟲內(nèi)基因表達的抑制產(chǎn)生對線蟲具有抗性的植物。dsrna的調(diào)節(jié)效應(yīng)可應(yīng)用于在植物寄生線蟲中表達的多種基因，包括例如負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括管家基因、轉(zhuǎn)錄因子、蛻皮相關(guān)基因和編碼參與細(xì)胞代謝或正常生長和發(fā)育的多肽的其它基因。如本文中所用的，短語“基因表達的抑制”或“抑制植物寄生線蟲細(xì)胞中目標(biāo)基因的表達”指源自目標(biāo)基因的蛋白質(zhì)和/或mrna產(chǎn)物的不存在(或其水平的可觀察的降低)。特異性指抑制目標(biāo)基因而沒有對產(chǎn)生該dsrna分子的細(xì)胞的其它基因的直接效應(yīng)和沒有對細(xì)胞內(nèi)的任何基因的任何直接效應(yīng)的能力。目標(biāo)植物寄生線蟲中目標(biāo)內(nèi)基因的基因表達的抑制可以在線蟲中產(chǎn)生新的表型性狀。本發(fā)明部分地提供用于通過攝食宿主細(xì)胞或細(xì)胞的內(nèi)容物遞送線蟲控制劑的遞送系統(tǒng)。按照另一實施方式，本發(fā)明包括產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的穩(wěn)定dsrna分子的重組dna構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物。如本文中所用的，“攝取”指試劑與目標(biāo)生物體(如線蟲)的細(xì)胞形成接觸的過程。這可以例如通過線蟲覓食、通過吮吸或通過注入發(fā)生。如本文中所用的，短語“產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物”指采用本領(lǐng)域中很容易得到的重組dna技術(shù)(例如，sambrook等，1989)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的穩(wěn)定dsrna分子的植物轉(zhuǎn)化載體的方法，從而轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物和產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)錄的、穩(wěn)定的dsrna分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物?？深A(yù)想的是，本發(fā)明的組合物可作為整合到植物細(xì)胞基因組中的重組基因的表達產(chǎn)物或通過并入在播種前涂覆到種子上的涂層或種子處理劑中而并入植物物種的種子中。包含重組基因的植物細(xì)胞在本文中被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因事件。本發(fā)明部分地提供用于向植物寄生的線蟲遞送疾病控制劑的遞送系統(tǒng)。本發(fā)明的穩(wěn)定dsrna或sirna分子可以直接引入植物寄生線蟲的細(xì)胞中。用于引入的方法可以包括rna與用于植物寄生線蟲的宿主組織直接混合以及其中作為宿主的物種經(jīng)遺傳工程以表達dsrna或sirna的遺傳工程途徑。在一個實施方式中，rna可以噴射到植物表面上。在再另一實施方式中，dsrna或sirna可以由微生物表達且微生物可以應(yīng)用到植物表面上或通過物理手段(如注射)引入根、莖中。在再另一實施方式中，植物可以進行遺傳工程以表達足以殺滅已知侵染植物的植物寄生線蟲的量的dsrna或sirna。也可以預(yù)想，通過化學(xué)或酶學(xué)合成產(chǎn)生的dsrna可以以與常見農(nóng)業(yè)實踐協(xié)調(diào)的方式配制且用作用于防治植物疾病的噴涂產(chǎn)品。該制劑可以包括有效葉覆蓋所需的適當(dāng)?shù)恼持鴦?sticker)和濕潤劑以及保護dsrna免受uv損傷的uv保護劑。這類添加劑是生物殺蟲劑工業(yè)中通常使用的且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些應(yīng)用可以與其它噴涂殺蟲劑應(yīng)用(基于生物或不基于生物)以增強植物寄生線蟲的植物保護。本發(fā)明還涉及用于在微生物中表達的重組dna構(gòu)建體。外源核酸(目標(biāo)rna由其轉(zhuǎn)錄)可以使用本領(lǐng)域已知的方法引入微生物宿主細(xì)胞中，如細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。本發(fā)明的核苷酸序列可以引入很多種的原核和真核微生物宿主中以產(chǎn)生穩(wěn)定的dsrna或sirna分子。術(shù)語“微生物”包括原核和真核物種如細(xì)胞和真菌以及線蟲。真菌包括酵母和絲狀真菌等。例證的原核生物(革蘭氏陰性的和革蘭氏陽性的)包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬(escherichia)、歐文氏菌屬(erwinia)和沙雷氏菌屬(serratia)；芽胞桿菌科(bacillaceae)；根瘤菌科(rhizobiaceae)如根瘤菌屬(rhizobium)；螺菌科(spirillaceae)如發(fā)光菌屬(photobacterium)、酵單胞菌屬(zymomonas)；乳桿菌科(lactobacillaceae)；假單胞菌科(pseudomonadaceae)如假單胞菌屬(pseudomonas)和醋酸桿菌屬(acetobacter)；固氮菌科(azotobacteraceae)，放線菌目(actinomycetales)和硝化桿菌科(nitrobacteraceae)。真核生物中包括真菌如藻狀菌綱(phycomycetes)和子囊菌綱(ascomycetes)，包括酵母屬(saccharomyces)和裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)，和擔(dān)子菌綱(basidiomycetes)如紅酵母屬(rhodotorula)、短梗霉屬(aureobasidium)等。d.轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞毛根特征在于快速生長、頻繁分枝、斜生現(xiàn)象。毛根用作全根的強模型(strongmodel)，因為它們保持類似于完整植物的根合成化合物的能力(david等，1984)。已很好地建立了用于轉(zhuǎn)移和整合位于毛根土壤桿菌的根誘導(dǎo)質(zhì)粒ri上的基因到植物基因組中及其用于在其中的表達的方法(white和nester,1980)。這些類型的根在不含激素的培養(yǎng)基在體外繼續(xù)生長且還表現(xiàn)出高水平的遺傳穩(wěn)定性(aird等，1988)。土壤細(xì)菌毛根土壤桿菌將基因轉(zhuǎn)化到宿主植物基因組中的天然能力導(dǎo)致根在感染位點形成，且用于產(chǎn)生毛根培養(yǎng)物。用毛根土壤桿菌菌株r-1000感染植物導(dǎo)致t-dna整合到植物基因組中和表達，這引起毛根的發(fā)育。毛根培養(yǎng)物快速生長，顯示斜生的根生長且在無激素的培養(yǎng)基上高度分枝。由毛根土壤桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因毛根在體外支持根結(jié)線蟲(“rkn”；根結(jié)線蟲類)的完整生活周期，并允許大規(guī)模的組織快速生長，這可用于鑒別和分離目標(biāo)基因。毛根如下面所述且按照本領(lǐng)域中的知識由大豆或西紅柿植物開始。本發(fā)明提供具有一個或多個轉(zhuǎn)基因事件的種子和植物。事件的組合稱作“堆疊的(stacked)”轉(zhuǎn)基因事件。這些堆疊的轉(zhuǎn)基因事件可以是針對相同目標(biāo)生物體的事件，或者它們可以針對不同目標(biāo)病原體或害蟲。在一個實施方式中，具有表達本文提供的核酸的能力的種子也具有表達至少一種其它物質(zhì)的能力，包括但不限于其序列源自于目標(biāo)病原體(如線蟲)中表達的rna序列且在種子或由該種子生長的植物細(xì)胞中表達時形成雙鏈rna結(jié)構(gòu)的rna分子，其中一個或多個植物細(xì)胞被目標(biāo)攝食導(dǎo)致目標(biāo)的細(xì)胞中rna表達的抑制。在某些實施方式中，具有表達其序列源自目標(biāo)植物寄生線蟲的dsrna的能力也具有提供除草劑耐受性的“堆疊的”轉(zhuǎn)基因事件。除草劑耐受性基因的一個有益的實例提供對草甘膦(n-(膦?；谆?氨基乙酸)的抗性，包括這種除草劑的異丙胺鹽形式。本發(fā)明提供的益處可以包括，但不限于：將dsrna引入植物寄生線蟲細(xì)胞中的方便性、可使用的dsrna的低濃度、dsrna的穩(wěn)定性和抑制的有效性。使用低濃度的穩(wěn)定dsrna的能力避免了反義干擾的幾種缺陷。本發(fā)明不限于體外用途或特定的序列組成，不限于特定系列的目標(biāo)基因、目標(biāo)基因的核苷酸序列的特定部分或特定轉(zhuǎn)基因，或不限于特定的遞送方法，這與某些本領(lǐng)域中已知的可用技術(shù)(如反義和共抑制)相反。此外，在不是經(jīng)典遺傳模型的生物體中進行遺傳操作是可能的。為了實現(xiàn)希望防治的植物寄生線蟲物種內(nèi)的目標(biāo)基因的物性抑制，目標(biāo)基因應(yīng)通常表現(xiàn)出與植物或脊椎動物中的相應(yīng)基因的低水平的序列同一性。在特定的實施方式中，序列同一性的水平低于大約80％，包括低于大約70％和低于大約60％。除了用重組dna構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化植物外，轉(zhuǎn)基因植物可通過使具有重組dna構(gòu)建體的第一植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交。例如，用于基因抑制的重組dna可引入需轉(zhuǎn)化的第一植物家系以產(chǎn)生可與第二植物家系雜交的轉(zhuǎn)基因植物，從而將用于基因抑制的重組dna滲入第二植物家系中。實際上，本發(fā)明可以與植物中的其它疾病防治性狀組合以獲得希望的用于增強植物疾病防治的性狀。采用完全不同的作用模式的組合疾病防治性狀可以提供具有優(yōu)于攜帶單一防治性狀的植物的保護轉(zhuǎn)基因植物的耐久性，因為其在田間發(fā)展出抗性的可能性降低。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的一種或多種序列的商品，且特別地包括包含本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列的重組植物或種子產(chǎn)生的商品作為本發(fā)明的實施方式。包含本發(fā)明的一種或多種序列的商品意圖包括，但不限于包含本發(fā)明的一種或多種序列的重組植物或種子的粗磨粉、油或磨碎的或完整的谷粒。在本文中包括的一種或多種貨物或商品中本發(fā)明的一種或多種序列的檢測是該貨物或商品由設(shè)計為為了使用dsrna介導(dǎo)的基因抑制方法防治植物疾病的目的而表達本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列轉(zhuǎn)基因植物組成。e.獲得核酸本發(fā)明提供了用于獲得包含產(chǎn)生dsrna或sirna的核苷酸序列的核酸的方法。在一個實施方式中，這種方法包括：(a)分析在線蟲中的dsrna介導(dǎo)的基因抑制時一種或多種目標(biāo)基因的表達、功能和表型；(b)用包含來自目標(biāo)線蟲的核苷酸序列或其同源序列的全部或部分的雜交探針探測cdna或gdna文庫，該目標(biāo)線蟲在dsrna介導(dǎo)的抑制分析中表現(xiàn)出改變的(例如，降低的)線蟲生長、發(fā)育或繁殖表型；(c)鑒別與該雜交探針雜交的dna克??；(d)分離在步驟(b)中鑒別的dna克?。缓?e)測序包含步驟(d)中分離的克隆的cdna或gdna片段，其中測序的核酸分子轉(zhuǎn)錄rna核苷酸序列或其同源序列的全部或主要部分。在另一實施方式中，本發(fā)明的用于獲得包含產(chǎn)生dsrna或sirna的主要部分的核苷酸序列的核酸序列的方法包括：(a)合成對應(yīng)于來自目標(biāo)病原體的一種核苷酸序列的一部分的第一和第二寡核苷酸引物；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物擴增存在于克隆載體中的cdna或gdna插入序列，其中擴增的核酸分子轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的dsrna或sirna的主要部分。在實施本發(fā)明時，目標(biāo)基因可以源自南方根結(jié)線蟲或另一線蟲?？深A(yù)想的是，可采用幾種標(biāo)準(zhǔn)選擇目標(biāo)基因。根結(jié)線蟲類基因可以是具有秀麗隱桿線蟲同源基因的基因，在表達的rnai敲落時具有強表型(如p0表型)的高可能性。這些目標(biāo)通常是參與核心細(xì)胞過程(如dna復(fù)制、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄、rna加工、翻譯、蛋白質(zhì)運輸、分泌、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)穩(wěn)定和降解、能量產(chǎn)生、中間代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、通道和轉(zhuǎn)動蛋白及內(nèi)吞作用)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的那些目標(biāo)基因。在某些實施方式中，有利的是選擇其表達水平小的下降會導(dǎo)致對病原體的不利影響的基因。特別感興趣的是具有其它墊刃線蟲(例如，大豆胞囊線蟲)中的rnai驗證直系同源基因的根結(jié)線蟲基因。如本文中所用的，術(shù)語“源自”指可以從特別指定的來源或物種獲得的指定的核苷酸序列，盡管不是必然直接得自該指定的來源或物種。在一個實施方式中，選擇實質(zhì)上參與植物寄生線蟲的生長、發(fā)育或繁殖的基因。用于本發(fā)明中的其它目標(biāo)基因可以包括例如，在線蟲存活、生長、發(fā)育、感染和建立覓食位點中發(fā)揮重要作用的那些基因。這些目標(biāo)基因可以是管家基因、轉(zhuǎn)錄基因等之一。另外，用于本發(fā)明中的核苷酸序列也可以源自植物、病毒、細(xì)菌或昆蟲基因的同源基因(包括直系同源基因)，其功能已經(jīng)由文獻確定和其核苷酸序列與目標(biāo)線蟲基因組的目標(biāo)基因共有實質(zhì)的相似性。按照本發(fā)明的用于線蟲防治的一個方面，目標(biāo)序列可以基本源自目標(biāo)植物寄生線蟲。一些克隆自線蟲的典型目標(biāo)序列(其編碼作為已知蛋白質(zhì)的同源物或直系同源物的蛋白質(zhì)或其片段)可以在序列表中找到，例如在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23和seqidno:25、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46和seqidno:47中。出于本發(fā)明的目的，dsrna或sirna分子可以通過源自gdna或cdna文庫或其部分的目標(biāo)基因序列的聚合酶鏈(pcr)擴增獲得。dna文庫可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，且可以提取dna/rna。由目標(biāo)生物體產(chǎn)生的基因組dna或cdna文庫可以用于產(chǎn)生dsrna或sirna的pcr擴增。然后，目標(biāo)基因序列可以進行pcr擴增并使用本領(lǐng)域中容易獲得的方法測序。本領(lǐng)域技術(shù)人員也許能夠改變pcr條件以確保最佳的pcr產(chǎn)物形成。確認(rèn)的pcr產(chǎn)物可用作體外轉(zhuǎn)錄的模板以利用包括的最小啟動子產(chǎn)生有義和反義rna。在一個實施方式中，本發(fā)明包含可用作植物寄生線蟲防治劑的分離和純化的核苷酸序列。分離和純化的核苷酸序列可以包含如序列表中所示的那些核苷酸序列。如本文中所用的，短語“編碼序列”、“結(jié)構(gòu)核苷酸序列”或“結(jié)構(gòu)核酸分子”指當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列控制下翻譯成多肽(通常通過mrna)的核苷酸序列。編碼序列的邊界通過5’末端的翻譯起始密碼子和3’末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括，但不限于基因組dna、cdna、est和重組核苷酸序列。術(shù)語“重組dna”或“重組核苷酸序列”指包含通過經(jīng)由誘變、限制性酶等的操作的遺傳工程修飾的dna。對于作為本發(fā)明防治的潛在靶標(biāo)的許多植物寄生的線蟲，可能存在有關(guān)大多數(shù)基因的序列或由特定基因的突變產(chǎn)生的表型的有限信息。因此，可以預(yù)想，選擇用于本發(fā)明中的適當(dāng)基因可以通過使用由模型生物體(如秀麗隱桿線蟲)中的相應(yīng)基因的研究提供的信息完成，其中該基因已經(jīng)按照實施例1-8所述的分析方法鑒定。在某些情況中，有可能通過利用基因的名稱或來自例如該基因由其克隆的線蟲的序列檢索數(shù)據(jù)庫(如genbank)而獲得來自目標(biāo)線蟲的相應(yīng)基因的序列。一旦獲得了序列，pcr可以用于擴增用于本發(fā)明的目標(biāo)線蟲中基因的適當(dāng)選擇的片段。pcr引物可以基于在該基因由其克隆的另一生物體中發(fā)現(xiàn)的序列進行設(shè)計。該引物設(shè)計為擴增用于本發(fā)明中的足夠長的dna片段。dna(基因組dna或cdna)從目標(biāo)植物寄生線蟲制備，且pcr引物用于擴增該dna片段。選擇擴增條件以使得擴增甚至在引物未精確匹配目標(biāo)序列的情況下發(fā)生?；蛘撸?或其部分)可以使用已知基因作為探針從由植物寄生線蟲物種制備的gdna或cdna文庫克隆。用于進行pcr和由文庫進行克隆的技術(shù)是已知的。在實施例中提供了來自目標(biāo)植物寄生線蟲的dna片段可以基于預(yù)先由其它物種克隆的基因序列分離的方法的進一步細(xì)節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識到，多種技術(shù)可用于分離與預(yù)先由其它物種分離的基因?qū)?yīng)的來自目標(biāo)植物寄生線蟲的基因片段。實施例本發(fā)明人在此確定了用于通過向植物寄生的線蟲提供雙鏈核糖核酸分子防治植物寄生線蟲的方法和選擇編碼這些雙鏈核糖核酸分子的序列的方法。在攝食時發(fā)揮作用以抑制線蟲中的生物功能的雙鏈核糖核酸分子可以例如導(dǎo)致以下的一種或多種特性：線蟲生長的下降、線蟲發(fā)育的抑制或者生存力或卵產(chǎn)生的下降。這些特性的任一種或任意組合可導(dǎo)致有效抑制植物感染或移殖，且在植物病原線蟲的情況中，導(dǎo)致植物疾病的抑制和/或疾病癥狀嚴(yán)重性的降低。實施例1毛根產(chǎn)生方案對于大豆a3244(易感的)或pi88788(抗性的)毛根，毛根土壤桿菌菌株k599(ncppb2659；ncppb,sandhutton,york,uk)在lb(luriabertani)或酵母提取物和蛋白胨(yep)培養(yǎng)基上生長和維持。酵母提取物是自溶的酵母的水溶性部分。自溶小心地進行控制以保持天然存在的b復(fù)合維生素。酵母提取物通常通過在富含碳水化合物的植物培養(yǎng)基中生長面包酵母(baker’syeast)(酵母屬的種)制備。酵母在水中收獲、洗滌和重懸浮，酵母在其中發(fā)生自溶，即利用酵母的酶自體消化。酵母提取物是這一自溶作用的全部可溶部分。自溶活性通過加熱步驟終止。所獲得的酵母提取物過濾透明并通過噴霧干燥干燥成粉末。使用毛根土壤桿菌菌株d1產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因西紅柿mountainspring(易感的)或freshmountainplus(抗性的)毛根培養(yǎng)物的方法是相似的，除了使用包含酵母提取物、nacl、胰蛋白胨、l-谷氨酸、磷酸鉀、硫酸鎂和生物素的mgl培養(yǎng)基外。大豆種子通過在受控條件下接觸氯氣12-16小時進行表面消毒，接著在清潔空氣罩中通氣至少30分鐘。種子在含有1/4ms(murashige&skoog,1962)的皮氏培養(yǎng)皿中發(fā)芽。6天齡幼苗的胚軸或子葉使用手術(shù)刀切割，且切割的子葉隨后浸入新生長的含目標(biāo)dna構(gòu)建體的毛根土壤桿菌培養(yǎng)物中并真空滲透。子葉在用于種子發(fā)芽的相似條件下培養(yǎng)，除了抗生素頭孢噻肟加入到1/4ms瓊脂培養(yǎng)板中以防止毛根土壤桿菌隨后生長過度。不定根與用毛根土壤桿菌接種的胚軸或子葉切開。假定轉(zhuǎn)化的根在包含3％蔗糖+3g/lbasta和頭孢噻肟的gamborg'sb-5瓊脂(gamborg等，1976)上培養(yǎng)。通過選擇存活的根轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中并保持在無光、大約24-30℃的溫度下在培養(yǎng)箱中的gamborg'sb-5瓊脂上。通常每2-4周切割一段根尖并轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。實施例2毛根材料上的線蟲生物分析在選擇毛根系后，用于植物線蟲生物分析的根轉(zhuǎn)移到含gamborg'sb-5培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)基板上并使其生長大約兩周以在用根結(jié)線蟲(rkn)的第二階段幼蟲接種之前提供用于線蟲感染的充足組織。單個的毛根尖置于感染板上。通常，大約20個板用于轉(zhuǎn)化的根與scn或rkn反應(yīng)的病原性測試。各板包含來自單獨整合的轉(zhuǎn)化根。包含轉(zhuǎn)化的(空載體)scn-易感或rkn-易感的對照的另外20個板和包含轉(zhuǎn)化的scn-抗性或rkn-抗性對照的另外20個板包括在測試中。所采用的方案主要是narayanan等，1999的方案，具有小的改進。板用大約450滅菌南方根結(jié)線蟲j2s接種并在26-28℃孵育。在用南方根結(jié)線蟲接種后大約兩周，感染的大豆毛根從瓊脂板移除并計數(shù)蟲癭的數(shù)目。蟲癭評分參照如下的評定標(biāo)準(zhǔn)基于對大小的評估進行評定：最小的蟲癭得分為1，且隨著蟲癭面積變得更大，蟲癭評分提高。蟲癭評定標(biāo)準(zhǔn)的實例如圖2中所示。然后1-4的標(biāo)度用于評定試驗中各板上的各蟲癭。也在42天針對西紅柿毛根中的rkn感染對卵數(shù)目評分(例如，參見表4)。在感染后42天，板進行微波處理并過篩以收集根。然后根在10％漂白溶液中混合并傾到一系列篩上以去除根碎片并收集卵。從各板去除卵并計數(shù)，且根進行稱重。制備滅菌的scn和rkn幼蟲以用于毛根培養(yǎng)系統(tǒng)。滅菌scnj2如下產(chǎn)生：收集清潔的大豆胞囊線蟲卵(即除去土壤和其它碎片的卵)并置于包含30ml的10％漂白溶液的50ml離心管中。漂白溶液溫和攪拌并然后使其沉降2-3分鐘。該管再次溫和攪拌以重懸浮卵并然后以1000rpm離心1分鐘。在無菌罩下，漂白溶液移入容器中，且25ml的無菌水加入卵管中。該管在無菌罩下重新加蓋，溫和攪拌以重懸浮卵和以1000rpm離心1分鐘。在無菌罩下，將這一液體傾出且再將25ml的無菌水置于管中。該管在無菌罩下重新加蓋，并重復(fù)攪拌和離心過程。用無菌水洗滌卵的這一過程重復(fù)大約4次以將漂白劑從卵徹底漂洗掉。在無菌罩下最后漂洗之后，除去液體以遺留大約1-2ml的卵濃縮物。滅菌卵通過在靜置在5mm硫酸鋅溶液中深度恰覆蓋濾紙表面的潮濕濾紙上孵育卵而進行孵化。在2-3天后，j2幼蟲收集在濾紙下的溶液中。j2幼蟲進行離心并進一步使用洗必泰滅菌(atkinson等，1996)。滅菌rkn幼蟲通過將切碎的rkn感染的根置于具有足夠量的10％漂白溶液的攪拌機中收集卵而制備。攪拌機以5秒間隔開關(guān)。這一過程重復(fù)5-8次。然后根漿通過一系列篩，其中卵和小碎片收集在500微米篩中。將任何殘留的漂白溶液從這一卵/碎片徹底漂洗掉。20毫升的卵/碎片加入50ml錐形管中且20ml的40％蔗糖溶液加入管底，達到40毫升的總體積。這一溶液然后以3750rpm離心5分鐘以將卵與碎片分離。在離心后，將卵移出并徹底漂洗以除去任何殘留的蔗糖溶液。然后將卵置于包含用恰好足夠的加氣自來水潤濕的濾紙以覆蓋卵的孵化盤中。1-2天后，j2幼蟲收集在濾紙下的溶液中。j2幼蟲進行離心并進一步使用洗必泰滅菌(atkinson等，1996)。實施例3適合通過rna干擾廣譜防治根結(jié)線蟲物種的根結(jié)線蟲目標(biāo)基因表1描述了具有高核苷酸保守性的關(guān)鍵線蟲基因核苷酸序列(預(yù)測的或編碼的多肽列于表2中)，其有助于根結(jié)線蟲類的基于rnai的廣譜防治。但是這些序列與非目標(biāo)生物體(如人類、宿主植物和有益昆蟲)中的關(guān)鍵基因具有足夠的核苷酸差異以在暴露于線蟲dsrna時降低對這些另外的生物體產(chǎn)生毒性的可能性。為確認(rèn)特征秀麗隱桿線蟲基因的南方根結(jié)線蟲直系同源基因，使用blast程序套裝(altschul等，1990)進行同源性檢索。使用秀麗隱桿線蟲基因(wormpep)的預(yù)測蛋白質(zhì)序列，tblastn用于檢索大豆胞囊線蟲成簇(clustered)est和其它由genbank獲得的序列以及最近產(chǎn)生的專有基因組勘測序列(genomesurveysequences)。追蹤bitscore、e-值和％同一性。對于作為靶標(biāo)，秀麗隱桿線蟲基因必須以至少e-10或更高的e-值具有與南方根結(jié)線蟲中的直系同源基因或同源序列的tblastn匹配。具有scnrnai正向直系同源基因的rkn基因賦予高優(yōu)先級。表1：核苷酸根結(jié)線蟲目標(biāo)序列表1中所列的序列與各種根結(jié)線蟲中的類似(例如，直系同源的或同源的)est和其它序列對比如下：seqidno:1對比：根結(jié)線蟲est,爪哇根結(jié)線蟲gb|bi324357.1|(98％同一性,1630-2138),花生根結(jié)線蟲gb|bi747188.1|(99％同一性,1687-2157),北方根結(jié)線蟲gb|bm884829.1|(92％同一性,947-1461),南方根結(jié)線蟲gb|bm882920.1|(98％同一性,1880-2131),奇特伍德根結(jié)線蟲gb|cb933476.1|(87％,1707–2060；94％,2166-2239)。seqidno:3對比：根結(jié)線蟲est,南方根結(jié)線蟲gb|cf980444.1|(99％同一性,1-662),南方根結(jié)線蟲gb|cf980487.1|(98％同一性,24-654),南方根結(jié)線蟲gb|ck984584.1|(94％同一性,1-662),南方根結(jié)線蟲gb|ck984580.1|(94％同一性,1-692),南方根結(jié)線蟲gb|ck984571.1|(94％同一性,1-691),南方根結(jié)線蟲gb|ck984607.1|(95％同一性,1-633),南方根結(jié)線蟲gb|cf980817.1|(94％同一性,1-633),南方根結(jié)線蟲gb|ck983672.1|(95％同一性,44-626),南方根結(jié)線蟲gb|cn443018.1|(95％同一性,33-611),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736305.1|(97％同一性,222-725),北方根結(jié)線蟲gb|cf803679.1|(88％同一性,1-645),北方根結(jié)線蟲gb|cf803689.1|(88％同一性,1-644),北方根結(jié)線蟲gb|cf803678.1|(88％同一性,1-645),南方根結(jié)線蟲gb|cn443180.1|(90％同一性,1-519),爪哇根結(jié)線蟲gb|bi745534.1|(95％同一性,277-477；92％同一性,481-692)。seqidno:5對比：根結(jié)線蟲est,花生根結(jié)線蟲gb|cf357444.1|(99％同一性,1-552),北方根結(jié)線蟲gb|cf357444.1|(92％同一性,892-1425),北方根結(jié)線蟲gb|cn577502.1|(91％同一性,879-1425),北方根結(jié)線蟲gb|bu094011.1|(94％同一性,1-438),花生根結(jié)線蟲gb|bi747707.1|(100％同一性,1208-1425),南方根結(jié)線蟲gb|aw829176.1|(92％同一性,662-879)。seqidno:7對比：根結(jié)線蟲est,花生根結(jié)線蟲gb|cf358371.1|(100％同一性,912-1520),花生根結(jié)線蟲gb|bi501616.1|(99％同一性,1324-1846),花生根結(jié)線蟲gb|bi746542.1|(96％同一性,1288-1848),南方根結(jié)線蟲gb|aw829423.1|(96％同一性,1390-1851),南方根結(jié)線蟲gb|aw871188.1|(96％同一性,1461-1851),南方根結(jié)線蟲gb|cn443525.1|(98％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|cn443511.1|(98％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984263.1|(98％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984287.1|(98％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984492.1|(96％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984445.1|(96％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984390.1|(96％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|ck984366.1|(96％同一性,1-256),南方根結(jié)線蟲gb|bi703863.1|(96％同一性,1745-1851),南方根結(jié)線蟲gb|be239094.1|(96％同一性,1783-18549)。seqidno:9對比：根結(jié)線蟲est,南方根結(jié)線蟲gb|cf099482.1|(99％同一性,1-678),花生根結(jié)線蟲gb|bi745992.1|(100％同一性,1-503),花生根結(jié)線蟲gb|bi863117.1|(99％同一性,1-452),南方根結(jié)線蟲gb|be239183.1|(99％同一性,351-741),南方根結(jié)線蟲gb|bm880799.1|(99％同一性,147-504)。seqidno:11對比：根結(jié)線蟲est,同一性98-100％的3’-區(qū)域678-1122中多于100南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲est的集合。seqidno:13對比：無檢測的根結(jié)線蟲est匹配。seqidno:15對比：根結(jié)線蟲est,花生根結(jié)線蟲gb|bi745894.1|(97％同一性,2611-3101),北方根結(jié)線蟲gb|bm883184.1|(91％同一性,2079-2556),奇特伍德根結(jié)線蟲gb|cb933531.1|(85％同一性,2472-2990),北方根結(jié)線蟲gb|cn574157.1|(88％同一性,2827-3225)。seqidno:17對比：無檢測的根結(jié)線蟲est匹配。seqidno:19對比：根結(jié)線蟲est,m.paranaensisgb|ck426467.1|(99％同一性,61-714),南方根結(jié)線蟲gb|bm880509.1|(99％同一性,248-789),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736965.1|(96％同一性,243-746),南方根結(jié)線蟲gb|bm881612.1|(99％同一性,370-827；100％同一性,266-325),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736194.1|(96％同一性,246-721),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg737132.1|(96％同一性,243-663),南方根結(jié)線蟲gb|bm880760.1|(99％同一性,393-732；100％同一性,259-392),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736127.1|(96％同一性,243-600)。seqidno:21對比：根結(jié)線蟲est,爪哇根結(jié)線蟲gb|bi744615.1|(98％同一性,300-700),南方根結(jié)線蟲gb|cn443444.1|(100％同一性,1-237)。seqidno:23對比：根結(jié)線蟲est,爪哇根結(jié)線蟲gb|be578613.1|(97％同一性,1-606),花生根結(jié)線蟲gb|bi747271.1|(98％同一性,1-504),南方根結(jié)線蟲gb|cd749365.1|(97％同一性,27-600),爪哇根結(jié)線蟲gb|bi143067.1|(99％同一性,1-437),北方根結(jié)線蟲gb|cf370648.1|(91％同一性,1-599),北方根結(jié)線蟲gb|bm902290.1|(91％同一性,73-621),北方根結(jié)線蟲gb|cn572891.1|(85％同一性,259-667)。seqidno:25對比：根結(jié)線蟲est,南方根結(jié)線蟲gb|cd749648.1|(100％同一性,1-690),南方根結(jié)線蟲gb|cf099489.1|(99％同一性,15-676),花生根結(jié)線蟲gb|bi746205.1|(97％同一性,203-644)。seqidno:40對比：根結(jié)線蟲est,m.paranaensisgb|ck426467.1|(98％同一性,130-783),南方根結(jié)線蟲gb|bm880509.1|(99％同一性,317-858),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736965.1|(96％同一性,312-815),南方根結(jié)線蟲gb|bm881612.1|(90％同一性,325-896；100％同一性),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736194.1|(96％同一性,315-790),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg737132.1|(96％同一性,312–732),南方根結(jié)線蟲gb|bm880760.1|(90％同一性,328-801),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736127.1|(95％同一性,312-669)。seqidno:42對比：根結(jié)線蟲est,南方根結(jié)線蟲gb|cd749648.1|(99％同一性,1-675),南方根結(jié)線蟲gb|cf099489.1|(99％同一性,1-661),花生根結(jié)線蟲gb|bi746205.1|(96％同一性,185-629)。seqidno:44對比：根結(jié)線蟲est,爪哇根結(jié)線蟲gb|bg735889.1|(98％,1-255),爪哇根結(jié)線蟲gb|bg736205.1|(93％,103-201)。表2列出了由表1的核苷酸序列編碼的預(yù)測氨基酸序列。表2：rkn氨基酸序列表2的氨基酸序列與各種線蟲物種中的假定的直系同源的或同源的氨基酸序列對比如下：seqidno:2與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性，71％馬來絲蟲(b.malayi),65％秀麗隱桿線蟲,66％c.briggsae。seqidno:4與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,60％大豆胞囊線蟲,47％秀麗隱桿線蟲,48％c.briggsae,44％馬來絲蟲。seqidno:6與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,94％馬來絲蟲,93％秀麗隱桿線蟲,92％c.briggsae。seqidno:8與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,62％馬來絲蟲,67％秀麗隱桿線蟲,66％c.briggsae。seqidno:10與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,68％馬來絲蟲,69％秀麗隱桿線蟲,69％c.briggsae。seqidno:12與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,78％o.volvulus,78％馬來絲蟲,71％秀麗隱桿線蟲,75％c.briggsae。seqidno:14與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,82％馬來絲蟲,83％秀麗隱桿線蟲,83％c.briggsae。seqidno:16與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,58％馬來絲蟲,53％秀麗隱桿線蟲,55％c.briggsae。seqidno:18與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,83％馬來絲蟲,86％秀麗隱桿線蟲,86％c.briggsae。seqidno:20與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,22％馬來絲蟲,26％秀麗隱桿線蟲,22％c.briggsae。seqidno:22與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,51％馬來絲蟲,49％秀麗隱桿線蟲,49％c.briggsae。seqidno:24與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,54％馬來絲蟲,55％秀麗隱桿線蟲,55％c.briggsae。seqidno:26與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性,66％馬來絲蟲,66％秀麗隱桿線蟲,68％c.briggsae。seqidno:41與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性:28％馬來絲蟲；30％秀麗隱桿線蟲；27％c.briggsae。seqidno:43與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性:70％馬來絲蟲；69％秀麗隱桿線蟲；69％c.briggsae。seqidno:45與其線蟲直系同源基因具有以下氨基酸同一性:77％秀麗隱桿線蟲；77％c.briggsae。實施例4:dsrna序列和用于基因表達的啟動子圖1顯示了用于選擇組合的化學(xué)物質(zhì)和紅色熒光(dsred標(biāo)記；例如，clontech,mountainview,ca)的毛根表達構(gòu)建體以產(chǎn)生具有靶向于目標(biāo)線蟲的存活、適合度或病原性的目標(biāo)基因(goi)的均勻表達的毛根的典型示意圖。goi可以是殺線蟲的核苷酸、蛋白質(zhì)或能夠產(chǎn)生殺線蟲劑(例如，代謝物)的蛋白質(zhì)，且通常是靶向于關(guān)鍵線蟲基因的雙鏈rna(dsrna)?？敲顾乜剐杂糜诩?xì)菌宿主內(nèi)的質(zhì)粒擴增。(草銨膦:草胺膦)耐受性通過在甘露堿合成酶啟動子和終止子控制下的bar基因的表達(草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶)賦予。goi可以通過由花椰菜花葉病毒35s啟動子(35s)或玄參花葉病毒(fmv)驅(qū)動的強組成型啟動子(例如seqidno:36-39)或通過多種植物啟動子之一(如泛素3啟動子)驅(qū)動，且可以使用終止子如e6、e9或章魚堿合成酶(ocs)終止子。紅色熒光蛋白dsred(matz等，1999)通常利用終止子如e6、e9或ocs終止子通過強組成型病毒啟動子或其它啟動子如擬南芥磷酸甘油酸變位酶啟動子(seqidno:35；mazarei等，2003)表達。表3:rkndsrna核苷酸序列和啟動子序列包含選擇表達盒和在細(xì)菌細(xì)胞中維持質(zhì)粒必需的元件的作物轉(zhuǎn)化基本載體用于裝配在與提供本發(fā)明的功能性的dna片段可操作地連接時提供調(diào)控活性的dna片段(啟動子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、3’utr)。這些dna片段的裝配可以使用重組dna
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法完成。能夠編碼有效dsrna分子的dna序列的實例是表3中的seqidno:27-30、seqidno:32和seqidno:47。實施例5:西紅柿毛根通過轉(zhuǎn)基因rnai抗南方根結(jié)線蟲的效力培養(yǎng)板用大約450個滅菌南方根結(jié)線蟲j2接種并在26-28℃孵育。在感染后42天，板進行微波處理并過篩以收集根。然后根在10％漂白溶液中混合并傾倒在一系列篩上以除去根碎片和收集卵。從各板除去卵并計數(shù)，且對根稱重。制備表達編碼例如kin-2、t26g10.1、cgh1、cpla或vha19的基因片段(例如，seqidno:27-30、seqidno:32或seqidno:46)的轉(zhuǎn)基因毛根培養(yǎng)物，且這些根測試rkn抗性。結(jié)果顯示于表4中，證明了減少rkn繁殖的效力。表4:典型dsrna構(gòu)建體的西紅柿毛根效力*使用t檢驗以0.1α具有相對于易感對照的統(tǒng)計顯著性降低。卵減少百分比是相對于空載體易感對照。利用分別具有或沒有矮牽牛前導(dǎo)序列35s(e35s或e35sp)seqidno:37和seqidno:38的增強的花椰菜花葉病毒35s啟動子、玄參花葉病毒(fmv)啟動子seqidno:36、d10.1(div10)啟動子seqidno:35和具有煙草花葉病毒ω翻譯增強子的花椰菜花葉病毒35s啟動子seqidno:39。表4中的數(shù)據(jù)表明，啟動子和目標(biāo)基因以及精確的基因片段影響抗rkn效力的水平。重要的是有可能使用以對抗本文公開的基因靶標(biāo)為目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因rnai途徑獲得抗rkn的高效力水平。實施例6:轉(zhuǎn)基因煙草全植物產(chǎn)生和南方根結(jié)線蟲(rkn)的分析表5：培養(yǎng)基成分制備用于預(yù)培養(yǎng)的外植體，例如通過在具有表面活性劑的10％clorox中對來自一月齡煙草植物的葉表面滅菌15分鐘，進行3x無菌dih2o洗滌。將葉切成0.5cm的小片并將60-70個葉片倒置在具有2ml4c005k液體培養(yǎng)基的ms104培養(yǎng)板上+2個滅菌濾板。這一預(yù)培養(yǎng)進行大約1-2天。然后外植體使用已用4c005k調(diào)節(jié)到1.2x109bac/ml(例如～1/5稀釋)的過夜的土壤桿菌培養(yǎng)物接種。2ml調(diào)節(jié)的土壤桿菌培養(yǎng)物直接加入預(yù)培養(yǎng)外植體的各板中，其然后孵育10分鐘。吸除土壤桿菌從使外植體盡可能干。培養(yǎng)板用滅菌濾板吸干并使其在24℃共培養(yǎng)2-3天。通過從濾紙上移除外植體并將它們均勻地隔置到選擇板上(10-12外植體/板)而將外植體轉(zhuǎn)移到用于選擇相的ms104+草銨膦5mg/l+羧芐青霉素500μg/ml上。在4-6周，將芽從愈傷組織切除(由各愈傷組織叢切除一個以確保獨立事件)并置于ms0+草銨膦+羧芐青霉素500μg/ml生根培養(yǎng)基上。還未發(fā)芽的愈傷組織可以切割成獨立愈傷組織塊并放回到新鮮ms104選擇培養(yǎng)板上以促進發(fā)芽。根通常在7-10天內(nèi)在假定轉(zhuǎn)化體上形成。此時，可以采取小的葉片并在ms104選擇培養(yǎng)基板上重生愈傷組織以確認(rèn)卡那霉素抗性(如果需要)。從生根的幼苗的根沖洗掉瓊脂，且植物盆栽在小罐中、良好灌溉和置于繁殖罩下2-3天。然后繁殖罩的蓋可以逐漸裂開以使幼苗受冷(hardenoff)而適應(yīng)環(huán)境條件。這稱作r0植物。將盆栽置于溫室中10周后，準(zhǔn)備從r0植物收獲r1種子。收集來自各r0植物的種子，并使其生長一周。然后每天用0.04％(草銨膦；bayercropscience)噴撒植物一周。按3:1的方式分離的植物被認(rèn)為具有單拷貝的插入且保持用于進一步的分析。種植和選擇r1種子后12周，r2種子準(zhǔn)備從r1植物收獲。收集、種植來自r1植物的種子并使其生長一周。然后每天用0.04％(草銨膦)噴撒植物一周。正確分離(在finale暴露后100％存活)的植物被認(rèn)為是純合的且保持用于效力測試和種子采集。對于各r2整合(integration)，植物亞群用線蟲感染以測定效力且使亞群生長以產(chǎn)生r3種子。r2植物的草銨膦選擇后三周，植物亞群每盆rknj2用5000蠕蟲形卵接種并評價8周后的蟲癭減少。r2植物的草銨膦選擇后12周，收獲植物亞群從而獲得r3種子?？梢砸灶愃频姆绞疆a(chǎn)生后續(xù)世代如r4、r5等。表6:示例dsrna構(gòu)建體的煙草全植株效力。p-goi5’-內(nèi)含子dsrnap-dsred株系蟲癭減少(％)e35spact7kin2afmv組合44*e35spact7kin2afmv134e35spact7kin2afmv273*e35spact7kin2afmv338*e35spact7kin2afmv458*e35spact7kin2afmv516*使用t檢驗以0.1α具有相對于易感對照的統(tǒng)計顯著性減少。表6中的數(shù)據(jù)表明，可以利用以本文中公開的基因靶標(biāo)為目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因rnai途徑使用另外的宿主植物物種(在該情況中即為煙草)在溫室中獲得抗rkn的高效力水平。**************本文中公開和要求保護的所有組合物和方法可以根據(jù)本公開制備和執(zhí)行而不需要過度的試驗。盡管本發(fā)明的組合物和方法按照前述的示范性實施方式進行說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，可以對組合物、方法和本文描述的方法的步驟或步驟順序進行變化、更換、改進和修改而不脫離本發(fā)明的實質(zhì)概念、精神和范圍。更具體地，很清楚，化學(xué)和生理相關(guān)的某些物質(zhì)可以替代本文中描述的物質(zhì)而獲得相同或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有這些類似替換和改進被認(rèn)為在所附權(quán)利要求限定的精神、范圍和概念內(nèi)。參考文獻下列參考文獻通過引用并入本文中：美國專利4,536,475；美國專利4,693,977；美國專利4,886,937；美國專利4,940,838；美國專利4,959,317；美國專利5,015,580；美國專利5,107,065；美國專利5,110,732；美國專利5,231,020；美國專利5,283,184；美國專利5,302,523；美國專利5,384,253；美國專利5,464,763；美國專利5,464,765；美國專利5,501,967；美國專利5,508,184；美國專利5,527,695；美國專利5,538,880；美國專利5,459,252；美國專利5,550,318；美國專利5,563,055；美國專利5,591,616；美國專利5,593,874；美國專利5,633,435；美國專利5,693,512；美國專利5,698,425；美國專利5,712,135；美國專利5,759,829；美國專利5,780,708；美國專利5,789,214；美國專利5,804,693；美國專利5,824,877；美國專利5,837,848；美國專利5,981,840；美國專利6,118,047；美國專利6,160,208；美國專利6,384,301；美國專利6,399,861；美國專利6,403,865。美國公開2002/0048814；美國公開2003/0018993；美國公開2003/0175965；美國公開2004/0029283；美國公開2006/0200878a1。aird等，plantcelltiss.org.cult.15:47–57,1988.altschul等，j.mol.biol.,215:403-410,1990.atkinson等，j.nematol.28:209-215,1996.ausubel等，in:currentprotocolsinmolecularbiology,john,wiley&sons,inc,newyork,1998.barker等，in:plantandsoilnematodes:societalimpactandfocusforthefuture,comm.natl.needsprioritiesnematol.,cooperativestateresearchservice,usdept.arig.soc.nematologists,1994.bevan等，nature,304:184-187,1983.broothaerts等，nature,433:629–633,2005.brutlag等，computersandchemistry,17:203-207,1993.david等，biotechnology2:73–76,1984.demeutter等，molplantpath6:321-325,2005.dellaporta等，in:chromosomestructureandfunction:impactofnewconcepts,18thstadlergeneticssymposium,11:263-282,1988.elbashir等，genesdev.,5(2):188-200,2001.ep0120516ep0122791gamborg等，invitro12473-478,1976.gheysen和fenoll,annu.rev.phytopathol.40:191-219,2002.gruber等，in:vectorsforplanttransformation,methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology,glickandthompson(eds.),crcpress,inc.,bocaraton,89-119,1993.hamilton和baulcombe,science,286:950-952,1999.hannon,nature,418:244–251,2002haymes等，in:nucleicacidhybridization,apracticalapproach,irlpress,washington,dc,1985.herrera-estrella等，nature,303:209-213,1983.hirel等，plantmolecularbiology,20:207-218,1992.horsch等，science,227:1229,1985.ikatu等，bio/technol.,8:241-242,1990.jefferson等，emboj.,6:3901-3907,1987.juergensen等，plantphysiol131:61-69,2003.kaeppler等，plantcellrep.,8:415–418,1990.katz等，j.genmicrobiol.,129:2703-2714,1983.klee等，bio/technol.,3:637-642,1985.matz等，nat.biotechnol.17:969–973,1999.mazarei等，plantmol.biol.53:513-5302003.mazarei等，molplantpath5:409-423,2004.mccarter等，genomebiology,4:r26,1-19,2003.mccarter,trendsinparasitology,20:462-468,2004.miki等，in:proceduresforintroducingfore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