抗人cd52免疫球蛋白的制作方法

文檔序號：1201060閱讀：489來源：國知局

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專利名稱：抗人cd52 免疫球蛋白的制作方法
抗人CD52免疫球蛋白本申請要求于2009年5月13日申請的美國臨時(shí)申請第61/177，837號的優(yōu)先權(quán)。該申請的公開內(nèi)容完整地引入本文以供參考。
背景技術(shù)：
⑶52是一種在各種正常和惡性淋巴樣細(xì)胞(例如T和B細(xì)胞)上大量(500，000 分子/細(xì)胞)發(fā)現(xiàn)的糖基化的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的細(xì)胞表面蛋白。參考，例如，Hale 等人，J Biol regul Homeost Agents 15 :386-391(2001) ；Huh 等人，Blood 92 Abstract 4199(1998) ；Eisner 等人，Blood 88:4684-4693(1996) ；Gilleece 等人，Blood 82 :807-812(1993) ；Rodig 等人，Clin Cancer Res 12 :7174-7179(2006) ；Ginaldi 等人， Leuk Res 22:185-191(1998)。⑶52在髓樣細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上以較低水平表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在成熟自然殺手(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和造血干細(xì)胞上幾乎不表達(dá)。Id.⑶52也由附睪及輸精管中的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，并由精子在通過生殖道期間獲得 (Hale 等人，2001，上文；Domagala 等人，Med Sci Monit 7 :325-331 (2001)) CD52 的確切生物功能仍不清楚，但一些證據(jù)暗示其可能涉及T細(xì)胞遷移和共刺激(Rowan等人，Int Immunol 7:69-77(1995) ；Masuyama等人，J Exp Med 189:979-989(1999) ；Watanabe 等人， Clin Immunol 120 :247-259 (2006)) Campath-IH (阿侖單抗(alemtuzumab)，Campath ，MabCampath )是一種人源化抗人CD52單克隆抗體，其顯現(xiàn)有效力的體外細(xì)胞毒作用(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC))。Campath 識別由成熟CD52蛋白的羧基端四個(gè)氨基酸及帶負(fù)電的GPI錨區(qū)的一部分所構(gòu)成的表位。因?yàn)槠滹@著的細(xì)胞毒作用，Campath 能夠在體內(nèi)消減CD52陽性細(xì)胞，并且其已被批準(zhǔn)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的一線及三線治療。已對Campath 在治療數(shù)種自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、肌炎和 Wegener' s疾病中的效用進(jìn)行了評價(jià)。然而，Campath 的最先進(jìn)研究在于治療復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥(MS)。相對于活性對照(Rebif ‘ (即干擾素β-Ia))，這些研究顯示出對復(fù)發(fā)時(shí)間的顯著改善。存在對額外治療劑和靶向⑶52的途徑的需求。

發(fā)明內(nèi)容
人源化免疫球蛋白本發(fā)明涉及一種對人類CD52(huCD5》具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白。其可包括鼠抗人CD52抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白具有與其它人源化免疫球蛋白不同，并且特別是與包括鼠抗人CD52抗體的CDRs的其它人源化免疫球蛋白不同的氨基酸序列。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白與人源化免疫球蛋白Campath 不同。在一些實(shí)施方式中，它們提供超過含有Campath 的⑶Rs的人源化抗體的優(yōu)點(diǎn)。本文所述的人源化免疫球蛋白可包括人源化重鏈和人源化輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO :3的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO: 16的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :4的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和含有SEQ ID N0:17的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 5的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :18的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :6的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 19 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs的重鏈；含有SEQ ID NO 7的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs) 的輕鏈和含有SEQ ID NO 20的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :8的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :21的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 9的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 22的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO: 10的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 23的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 11的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO : 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 25的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :137的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；或含有SEQ ID NO 13的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO J6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈序列。上述SEQ ID NOs中的⑶Rs由圖2和圖3指出并且在本文提供的表1_6中提及。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白包括輕鏈，其含有一個(gè)或多個(gè)(例如，所有三個(gè))選自SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO :29、 SEQ ID NO :30, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34, SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47和SEQ ID NO :48的⑶Rs ；以及重鏈，其含有一個(gè)或多個(gè)(例如，所有三個(gè))選自 SEQ ID NO 49,SEQ ID NO50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO 52,SEQ ID NO53,SEQ ID N0: 54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、 SEQ ID NO 72, SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74 禾口 SEQ ID NO :294 的 CDRs ；或此種輕鏈和此種重鏈；其中該人源化免疫球蛋白不是Campath 。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白包括輕鏈，其含有 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO :9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè) CDRs)；重鏈，其含有 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17,SEQ ID N0: 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26 或 SEQ ID NO 137 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)；或此種輕鏈和此種重鏈；其中該人源化免疫球蛋白不是Campath在一些實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白的骨架區(qū)相對于免疫球蛋白(由其得到輕鏈⑶Rs和重鏈⑶Rs)的骨架區(qū)具有至少50%的同源性。例如，該人源化免疫球蛋白的骨架區(qū)可與生殖系人類免疫球蛋白序列至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %、或者甚至100 %相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白的骨架區(qū)可衍生自或從IgG人類抗體可變區(qū)得到。在另一個(gè)實(shí)施方式中，CD52 為野生型人CD52。在又一實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白可與阿侖單抗競爭以結(jié)合至人 CD52，例如，其可結(jié)合至與阿侖單抗所要結(jié)合的表位相同的表位，或是與之重疊的表位。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的人源化輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化輕鏈包括選自 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31, SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO :48、或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs，其中人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，人源化輕鏈包括SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO :12或SEQ ID NO : 13的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的人源化重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化重鏈包括選自 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、 SEQ ID NO65,SEQ ID NO66、SEQ ID NO67,SEQ ID NO 68、SEQ ID NO69,SEQ ID N0: 70、SEQ ID N0:71、SEQ ID NO 72, SEQ ID NO :73, SEQ ID NO :74、和 SEQ ID NO :294、或其組合的Ig可變域的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化重鏈不是Campath⑧的人源化重鏈。在其它實(shí)施方式中，該人源化重鏈包括SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 17,SEQ ID N0: 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25、SEQ ID N0:26、或 SEQ ID NO :137 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)，其中該人源化重鏈不是Campath⑧的人源化重鏈。優(yōu)選地，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包括本發(fā)明的人源化輕鏈和本發(fā)明的人源化
重鏈二者。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種人源化免疫球蛋白，該人源化免疫球蛋白結(jié)合至人CD52上的與小鼠單克隆抗體所結(jié)合表位相同的表位或與小鼠單克隆抗體競爭或與其交叉競爭，該小鼠單克隆抗體包括SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 25 的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白結(jié)合至人CD52上的表位，該表位與這樣的小鼠單克隆抗體所
結(jié)合的表位重疊。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至人⑶52(例如，SEQ ID NO :104)上的表位的人源化免疫球蛋白，其包括至少成熟人類CD52序列的殘基1 (其中殘基1是成熟人類CD52序列的N端，S卩，N端甘氨酸[G]殘基；參見圖4)。該人源化免疫球蛋白可結(jié)合至包括至少成熟人類CD52序列的殘基1、3、4和5的表位(這些殘基分別是甘氨酸[G]、天冬酰胺[N]、天冬氨酸D)]、和蘇氨酸[T])。該人源化免疫球蛋白可結(jié)合至包括至少成熟人類 ⑶52序列的殘基1、2、3、4和5的表位(這些殘基分別為甘氨酸[G]、谷氨酰胺[Q]、天冬酰胺[N]、天冬氨酸[D]、及蘇氨酸[T])。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至人CD52 上的表位的人源化免疫球蛋白，該表位包括至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和9(這些殘基分別為谷氨酰胺⑷]、蘇氨酸[T]、和絲氨酸[S])。在一些實(shí)施方式中，表位包括至少成熟人類CD52序列的殘基7 0 )、8(Τ)和11(Ρ)。在一些實(shí)施方式中，表位包括至少成熟人類 CD52序列的殘基4 0))和11 (P)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至人CD52的人源化免疫球蛋白，其包括含有選自 SEQ ID NO :115, SEQ ID NO :118、和 SEQ ID NO :121 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)所述⑶Rs)的輕鏈，或含有選自SEQ ID NO :124, SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO: 130的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)所述⑶Rs)的重鏈，或此種輕鏈和此種重鏈二者。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有選自 SEQ ID NO :116, SEQ ID N0:119、和 SEQ ID NO 122 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)所述 CDRs)的輕鏈，或含有選自 SEQ ID N0:125、SEQ ID NO :128 JPSEQ ID NO :131 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)所述⑶Rs)的重鏈，或此種輕鏈和重鏈二者。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至人CD52的人源化免疫球蛋白，且其包括含有選自SEQ ID NO :117, SEQ ID N0:120、和SEQ ID NO 123的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)所述 CDRs)的輕鏈，或含有選自 SEQ ID NO :126、SEQ ID NO :129 JPSEQ ID NO :132 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)所述⑶Rs)的重鏈，或此種輕鏈和此種重鏈二者。在某些實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO :115、SEQ ID NO :118 禾口 SEQ ID NO :121 的 CDRs 的輕鏈，以及含有 SEQ ID NO 124,SEQ ID NO :127 和 SEQ ID NO: 130的⑶Rs的重鏈。在其它實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO 116, SEQ ID NO :119 禾口 SEQ ID NO 122 的 CDRs 的輕鏈，以及含有 SEQ ID NO 125,SEQ ID NO :128 禾口 SEQ ID NO :131的⑶Rs的重鏈。在其它實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白包括含有SEQ ID NO 117、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的輕鏈，以及含有 SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重鏈。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白與人源化免疫球蛋白Campath 不同。上述SEQ ID NOs :115-132的氨基酸序列提供于下文，并且是基于本文他處提供的表1-6中所報(bào)告的氨基酸序列。在這些氨基酸序列中，“X”表示任意氨基酸，且符號“/”表示相鄰該符號的氨基酸的其中一個(gè)(或任一個(gè))可存在于所指出位置(例如，K/R表示賴氨酸或精氨酸殘基存在于所指出位置，F(xiàn)/L/V指出苯丙氨酸、亮氨酸或纈氨酸殘基存在于所指出位置)。輕鏈CDR-I序列
K/RSSQSLL/V/IXS/TN/DGXS/TYLX(SEQ ID NO :115)K/RSSQSLL/V/IHS/TNGXS/TYLH(SEQ ID NO :116)RSSQSLVHTNGNS/TYLH(SEQ ID NO :117)輕鏈CDR-2序列XVSXXXS(SEQ ID NO :118)XVSXRXS(SEQ ID NO :119)MVSXRFS(SEQ ID NO :120)輕鏈CDR-3序列XQXXH/R/KF/L/V/IXX(SEQ ID NO :121)SQSXH/R/KF/L/V/IPX(SEQ ID NO :122)SQSXHVPF/P(SEQ ID NO :123)重鏈CDR-I序列GFXFXXYff/YMX(SEQ ID NO :124)GFTFXXYff/YMX (SEQ ID NO :125)GFTFTDYff/YMS(SEQ ID NO :126)重鏈⑶R-2序列XIRXKXBXYXTXYXXSVKG(SEQ ID NO :127)XIRXKXNXYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO :128)FIRNKANGYTTEYXXSVKG(SEQ ID NO :129)重鏈CDR-3序列TXXXY/F/ff(SEQ ID NO :130)TRYXY/F/WFDY(SEQ ID NO :131)TRYIF/WFDY(SEQ ID NO :132)本發(fā)明還涉及一種人源化輕鏈，其含有選自SEQ ID NO 115, SEQ ID NO :118、和 SEQ ID NO :121的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)該⑶Rs)；—種人源化輕鏈，其含有選自 SEQ ID NO :116,SEQ ID N0:119、和 SEQ ID NO 122 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該 CDRs)；或一種人源化輕鏈，其含有選自 SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :120 JPSEQ ID NO :123 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)。本發(fā)明還涉及一種人源化重鏈，其含有選自SEQ ID N0 124, SEQ ID NO :127、和 SEQ ID NO :130的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)該⑶Rs)；—種人源化重鏈，其含有選自 SEQ ID NO :125,SEQ ID NO :128 JPSEQ ID NO 131 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該 CDRs)；或一種人源化重鏈，其含有選自 SEQ ID NO 126,SEQ ID NO :1 、和 SEQ ID NO :132 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)。本發(fā)明的人源化輕鏈和人源化重鏈與人源化免疫球蛋白Campath 的人源化輕鏈和人源化重鏈不同。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(不考慮它們可能被另外限定的方式，例如，不考慮它們是否也以其CDRs的一個(gè)或多個(gè)的序列的方式來限定和/ 或通過它們與小鼠單克隆抗體或另一人源化免疫球蛋白的交叉反應(yīng)性來限定)(1)顯示出結(jié)合至糖基化和去糖基化CD52而無明顯偏好；( 顯示出對糖基化CD52的特異性結(jié)合；(3)顯示出對去糖基化CD52的特異性結(jié)合；或(4)相對于糖基化CD52顯示出對去糖基化者的結(jié)合偏好。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白對糖基化的人CD52相比于對非糖基化或去糖基化的人CD52具有更高的結(jié)合親和性。的確，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白顯示出對糖基化的人CD52的特異性結(jié)合。對非糖基化或去糖基化的人CD52的結(jié)合親和性可使用已經(jīng)用糖苷酶，例如使用內(nèi)切糖苷酶PNGase-F去糖基化的成熟人類CD52來確定。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含其N-連接的碳水化合物部分的成熟人類CD52上的表位。此碳水化合物部分是一種唾液酸化的、含聚乳糖胺的核心巖藻糖化的四天線型N-連接的低聚糖(Treumarm，Α.等人，(1995) J. Biol. Chem. 270 =6088-6099)。此表位也可包含至少成熟人類CD52序列的殘基 1，至少成熟人類⑶52序列的殘基3，至少成熟人類⑶52序列的殘基1、3、4和5，或至少成熟人類CD52序列的殘基1、2、3、4和5。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的鼠或嵌合抗體可具任意這些結(jié)合特征。還提供如在本文他處所定義的編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、人源化輕鏈或人源化重鏈的分離的核酸分子。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種(一個(gè)或多個(gè))分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中人源化輕鏈包含SEQ ID NO 3的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)且重鏈包含SEQ ID NO 16的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)；包含SEQ ID NO :4的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和包含SEQ ID N0:17的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO 5的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO 18的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO :6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO 19的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO :7的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO :20的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO :8的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO :21的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO :9的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO 22的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO :10的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs) 的輕鏈和包含SEQ ID NO 23的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO 11的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和包含SEQ ID NO :24的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO :25的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；包含SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO :137的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；或包含SEQ ID NO 13的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和包含SEQ ID NO 26的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)CDRs)的重鏈序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至與小鼠單克隆抗體所結(jié)合的人CD52上的表位相同的表位，該小鼠單克隆抗體包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO
124的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO :5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO :6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7 的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO :8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21 的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10 的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至人CD52上的表位，此表位與這樣的小鼠單克隆抗體所結(jié)合的表位重疊。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人CD52的殘基1的表位；該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人⑶52的殘基1、3、4和5的表位；該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人CD52的殘基1、2、3、4和5的表位；或者該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人 ⑶52的殘基7、8和9的表位。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和11。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基4和11。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白包括包含選自SEQ ID NO :115,SEQ ID N0:118、和SEQ ID NO :121的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的輕鏈，和/或包含選自SEQ ID NO 124,SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO :130的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的重鏈；包含選自 SEQ ID NO :116,SEQ ID NO :119 JPSEQ ID NO :122 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該 CDRs)的輕鏈，和 / 或包含選自 SEQ ID NO 125,SEQ ID N0:128、和 SEQ ID NO :131 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的重鏈；或者，包含選自SEQ ID N0:117、SEQ ID NO: 120、和SEQ ID NO :123的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的輕鏈，和/或包含選自 SEQ ID NO :126,SEQ ID NO :129 JPSEQ ID NO 132 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的重鏈。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白包括，包含SEQ ID NO :115,SEQ ID NO :118和SEQ ID NO :121的CDRs 的輕鏈，以及包含SEQ ID NO 124、SEQ ID NO :127和SEQ ID NO :130的CDRs的重鏈；包含 SEQ ID NO :116, SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的輕鏈，以及包含 SEQ ID NO 125,SEQ ID NO :128 和 SEQ ID NO 131 的 CDRs 的重鏈；或包含 SEQ ID NO :117、SEQ ID NO: 120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的輕鏈，以及包含 SEQ ID NO 126,SEQ ID NO :129 禾口 SEQ ID NO 132的CDRs的重鏈。本發(fā)明的該一個(gè)或多個(gè)核酸不編碼人源化免疫球蛋白Campath 。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一個(gè)或多個(gè)分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白對糖基化的人CD52相比于對非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的結(jié)合親和性，例如，顯現(xiàn)出對糖基化的人CD52的特異性結(jié)合。人源化免疫球蛋白可結(jié)合至包含其N-連接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人類CD52序列的殘基1，至少成熟人類CD52序列的殘基3，至少成熟人類CD52序列的殘基1、 3、4和5，或是至少成熟人類⑶52序列的殘基1、2、3、4和5。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼人源化輕鏈，該人源化輕鏈包含 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 13 的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)，其中該人源化輕鏈不是Campath @的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈，該人源化重鏈包含 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、 SEQ ID NO21,SEQ ID NO22,SEQ ID NO 23,SEQ ID NO24,SEQ ID NO25,SEQ ID NO: 26、或SEQ ID NO :137的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)，其中該人源化重鏈不是 Campath 的人源化重鏈。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼人源化輕鏈，該人源化輕鏈包含選自 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 44,SEQ ID NO 45,SEQ ID NO 46,SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO 48 或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼人源化重鏈，該人源化重鏈包含選自 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、 SEQ ID N0:71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74 JPSEQ ID NO :294、或其組合的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化重鏈不是Campath⑧的人源化重鏈。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼包含選自SEQ ID NO 115、SEQ ID N0:118、和SEQ ID NO 121的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈；包含選自SEQ ID NO :116, SEQ ID NO :119、和SEQ ID NO :122的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈；或包含選自SEQ ID NO 117,SEQ ID N0:120、和SEQ ID NO :123的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種分離的核酸分子，其編碼包含選自SEQ ID NO 124、SEQ ID N0:127、和SEQ ID NO 130的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化重鏈；包含選自SEQ ID NO :125, SEQ ID NO :128、和SEQ ID NO :131的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化重鏈；或包含選自SEQ ID NO 126,SEQ ID N0:129、和SEQ ID NO :132的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的人源化重鏈。本發(fā)明還涉及一種重組載體(例如，表達(dá)載體，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)，其包含編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(例如，人源化輕鏈和人源化重鏈)、人源化輕鏈、或人源化重鏈的核酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種重組載體，其包含編碼人源化免疫球蛋白的核酸，該人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO :3的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 16的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :4的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和含有SEQ ID NO: 17的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 5的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO: 18的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs) 的重鏈；含有SEQ ID NO 6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 19的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 7的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 20的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 8的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :21的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 9的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 22的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 10的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 23的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO: 11的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :24的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 25的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO :137的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；或含有SEQ ID NO 13的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈和含有SEQ ID NO J6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈。在其它實(shí)施方式中，重組載體包含編碼人源化輕鏈的核酸，其中該人源化輕鏈包含選自 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、 SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID N0:41、SEQ ID NO 42, SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO :48、或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，重組載體包含編碼人源化重鏈的核酸，其中該人源化重鏈包含選自 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、 SEQ ID NO 60, SEQ ID N0:61、SEQ ID NO 62, SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 71, SEQ ID NO 72, SEQ ID NO 73, SEQ ID NO :74、和 SEQ ID NO :294、或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含一個(gè)核酸分子的一個(gè)重組載體，或包含多個(gè)核酸分子的一對重組載體，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人 CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至與小鼠單克隆抗體所結(jié)合的人CD52上的表位相同的表位，該小鼠單克隆抗體包含SEQ ID N0:3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重
15鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO :7的輕鏈可變區(qū)和SEQID NO :20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 23 的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含一個(gè)核酸分子的一個(gè)重組載體，或包含多個(gè)核酸分子的一對重組載體，其編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至人 CD52上的表位，此表位與這樣的小鼠單克隆抗體所結(jié)合的表位重疊。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，或一對重組載體包含多個(gè)核酸分子，這些核酸分子編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人類 ⑶52的殘基1的表位；結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52的殘基1、3、4和5的表位；結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52的殘基1、2、3、4和5的表位；或結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52的殘基7、8和9的表位。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和 11。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基4和11。在一些實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，或一對重組載體包含多個(gè)核酸分子，這些核酸分子編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白包含含有選自SEQ ID NO 115,SEQ ID N0:118、和SEQ ID NO 121的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的一種輕鏈，和/或含有選自SEQ ID NO :124,SEQ ID NO :127 JPSEQ ID NO :130的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的一種重鏈；含有選自SEQ ID N0:116、SEQ ID N0:119、禾口 SEQ ID NO :122的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的一種輕鏈，和/或含有選自 SEQ ID NO :125,SEQ ID NO :128 JPSEQ ID NO :131 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該 CDRs)的一種重鏈；或含有選自 SEQ ID NO 117、SEQ ID NO :120 JPSEQ ID NO :123 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的一種輕鏈，和/或含有選自SEQ ID NO :126,SEQ ID NO :129、和SEQ ID NO :132的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的一種重鏈。在某些實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，或一對重組載體包含多個(gè)核酸分子，這些核酸分子編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO :115,SEQ ID NO :118 禾口 SEQ ID NO 121 的 CDRs 的輕鏈，和含有 SEQ ID N0:124、SEQ ID NO :127 禾口 SEQ ID NO :130 的 CDRs 的重鏈；含有 SEQ ID N0:116、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的輕鏈，和含有 SEQ ID NO :125、SEQ ID NO 128 和 SEQ ID NO :131 的 CDRs 的重鏈；或含有 SEQ ID NO 117、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的輕鏈，和含有 SEQ ID NO :126, SEQ ID NO 129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重鏈。在本發(fā)明的重組載體中的該一個(gè)或多個(gè)核酸不編碼人源化免疫球蛋白 Campath 0在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，或一對重組載體包含多個(gè)核酸分子，這些核酸分子編碼人源化重鏈和人源化輕鏈(其結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白)，其中該人源化免疫球蛋白對糖基化的人CD52相比于對非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的結(jié)合親和性，例如，顯現(xiàn)出特異于糖基化人CD52 的結(jié)合。人源化免疫球蛋白可結(jié)合至包含其N-連接碳水化合物部分的成熟人類CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人類CD52序列的殘基1，至少成熟人類CD52序列的殘基 3，至少成熟人類⑶52序列的殘基1、3、4和5，或至少成熟人類⑶52序列的殘基1、2、3、4和 5。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO 13 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO 16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID N0:26、或 SEQ ID NO :137 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的人源化重鏈，其中該人源化重鏈不是Campath 的人源化重鏈。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，其編碼包含選自SEQ ID N0 115、SEQ ID N0:118、和SEQ ID NO 121的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈；包含選自SEQ ID NO :116, SEQ ID NO :119、和SEQ ID NO :122的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈；或包含選自SEQ ID NO 117,SEQ ID N0:120、和SEQ ID NO :123的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化輕鏈，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含一個(gè)核酸分子，其編碼包含選自SEQ ID N0 124、SEQ ID N0:127、和SEQ ID NO 130的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化重鏈；包含選自SEQ ID NO :125, SEQ ID NO :128、和SEQ ID NO :131的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)的人源化重鏈；或包含選自SEQ ID NO 126,SEQ ID NO 129 和SEQ ID NO :132的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)的人源化重鏈，其中該人源化重鏈不是Campath⑧的人源化重鏈。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組載體為表達(dá)載體，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。在某些實(shí)施方式中，該載體是一種質(zhì)?；蚴遣《据d體(例如，腺病毒或AAV載體)。本發(fā)明還涉及一種包含編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(人源化輕鏈和人源化重鏈)、人源化輕鏈或人源化重鏈的(一個(gè)或多個(gè))核酸(例如，重組)的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含一種本發(fā)明的重組載體(例如，表達(dá)載體，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)。在特定的實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含一種編碼人源化輕鏈和人源化重鏈的核酸 (一個(gè)或多個(gè)核酸)，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，并且其中該人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID N0:3的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和含有SEQ ID NO 16的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 4的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)
17的輕鏈，和含有SEQ ID NO: 17的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :5的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID N0:18的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO 19的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :7的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :20的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO :8的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :21的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 9的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :22的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO: 10的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :23的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 11的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :24的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO: 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO 25的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的輕鏈，和含有SEQ ID NO :137的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；或含有SEQ ID NO 13的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs) 的輕鏈，和含有SEQ ID NO :26的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈序列。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至與小鼠單克隆抗體所結(jié)合的人CD52 上的表位相同的表位，該小鼠單克隆抗體包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和SEQID NO 16 的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5 的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :23的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至人CD52上的與此種小鼠單克隆抗體所結(jié)合的表位重疊的表位。在其它實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白結(jié)合至包含至少成熟人類CD52的殘基1的表位；結(jié)合至包含至少成熟人類CD52的殘基1、3、4和5的表位；結(jié)合至包含至少成熟人類 ⑶52的殘基1、2、3、4和5的表位；或者結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52的殘基7、8和9的表位。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和11。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基4和11。
在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白包含一種輕鏈，其含有選自SEQ ID NO 115, SEQ ID N0:118、和SEQ ID NO :121的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)，和/或一種重鏈，其含有選自SEQ ID NO :124, SEQ ID NO :127、和SEQ ID NO :130的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)；一種輕鏈，其含有選自SEQ ID NO 116, SEQ ID N0:119、和 SEQ ID NO :122的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)，和/或一種重鏈，其含有選自 SEQ ID NO :125,SEQ ID NO :128 JPSEQ ID NO :131 的一個(gè)或多個(gè) CDRs (例如，所有三個(gè)該 CDRs)；或一種輕鏈，其含有選自 SEQ ID N0:117、SEQ ID NO :120 JPSEQ ID NO :123 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)該⑶Rs)，和/或一種重鏈，其含有選自SEQ ID NO 126,SEQ ID NO :129、和SEQ ID NO :132的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)該CDRs)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO :115,SEQ ID NO :118和 SEQ ID NO 121 的 CDRs 的輕鏈和含有 SEQ ID NO :124、SEQ ID NO :127 和 SEQ ID NO :130 的 CDRs 的重鏈；含有 SEQ ID NO :116、SEQ ID NO :119、和 SEQ ID NO :122 的 CDRs 的輕鏈和含有 SEQ ID NO :125,SEQ ID NO 128 和 SEQ ID NO :131 的 CDRs 的重鏈；或含有 SEQ ID NO :117, SEQ ID NO :120 和 SEQ ID NO :123 的 CDRs 的輕鏈和含有 SEQ ID NO :126、SEQ ID NO 129 和 SEQ ID NO :132 的 CDRs 的重鏈。在其它實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈和人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，其中人源化輕鏈和人源化重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白，其中該人源化免疫球蛋白對糖基化的人CD52相比于對非糖基化或去糖基化的人CD52具有更大的結(jié)合親和性，例如，顯現(xiàn)出對糖基化的人CD52特異性結(jié)合。人源化免疫球蛋白可結(jié)合至包含其N-連接的碳水化合物部分的成熟人CD52上的表位。此表位也可包含至少成熟人類CD52序列的殘基1，至少成熟人類CD52序列的殘基3，至少成熟人類⑶52序列的殘基1、3、4和5，或至少成熟人類⑶52序列的殘基1、2、3、4和5。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化輕鏈的一種核酸分子，該人源化輕鏈包含 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 或 SEQ ID NO 13 的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)。該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈的一種核酸分子，該人源化重鏈包含SEQ ID NO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、或 SEQ ID NO 137的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)。該人源化重鏈不是Campath 的人源化重鏈。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化輕鏈的一種核酸，其中該人源化輕鏈包含選自 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQID NO 43,SEQ ID NO 44,SEQ ID NO 45,SEQ ID NO 46,SEQ ID NO :47、和 SEQ ID NO 48 或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs，其中該人源化輕鏈不是Campath⑧的人源化輕鏈。在其它實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼人源化重鏈的一種核酸，其中該人源化重鏈包含選自 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、 SEQ ID NO 71,SEQ ID NO 72,SEQ ID NO 73、SEQ ID NO :74、和 SEQ ID NO :294 或其組合的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化重鏈不是Campath⑧的人源化重鏈。本發(fā)明還涉及一種對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明人源化免疫球蛋白(例如，本發(fā)明的人源化輕鏈和人源化重鏈)的一個(gè)或多個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合人源化免疫球蛋白表達(dá)的條件下，借以表達(dá)人源化免疫球蛋白鏈并產(chǎn)生人源化免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括純化或分離人源化免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將純化或分離的人源化免疫球蛋白與生理上可接受的媒介物或載體結(jié)合以制備藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種對人CD52具有結(jié)合特異性的人源化輕鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明人源化輕鏈的一個(gè)或多個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合人源化輕鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)人源化輕鏈并產(chǎn)生人源化輕鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離人源化輕鏈。本發(fā)明還涉及一種對人⑶52具有結(jié)合特異性的人源化重鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明人源化重鏈的一個(gè)或多個(gè)重組核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合人源化重鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)人源化重鏈并產(chǎn)生人源化重鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離人源化重鏈。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(例如，包含本發(fā)明的人源化輕鏈和/或本發(fā)明的人源化重鏈)和生理學(xué)上可接受的媒介物或載體。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物包含一種單位劑量組合物。本發(fā)明還涉及一種會分泌對人CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的雜交瘤的生產(chǎn)方法，其包括將人CD52轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴細(xì)胞施用至品系與人CD52轉(zhuǎn)基因小鼠相同或類似的(例如，CDl)的非轉(zhuǎn)基因小鼠，由此得到免疫的非轉(zhuǎn)基因小鼠。該免疫的非轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞與永生細(xì)胞融合，從而制得雜交瘤。將該雜交瘤保持在其會分泌對人CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的條件下。在一些實(shí)施方式中，使用FACS分析以檢測會分泌對人 CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的雜交瘤。在其它實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠的品系和非轉(zhuǎn)基因小鼠的品系是相同的。在某些實(shí)施方式中，⑶52是野生型人⑶52。在一些實(shí)施方式中，CD52轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠是CDl鼠。在一些實(shí)施方式中，用于免疫的淋巴細(xì)胞是從人CD52轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟中得到的。在一些實(shí)施方式中，永生細(xì)胞選自SP2/0 Agl4細(xì)胞和NSl骨髓瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種通過本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的雜交瘤。選擇性地，由雜交瘤所分泌的單克隆抗體被收集，并可被進(jìn)一步純化(例如，大體上純化的，分離的)。在其它實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括確定由雜交瘤所分泌的單克隆抗體的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種治療需要治療的病人中的自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(參見例如，Nature Reviews Drug Discovery 6 75-92(2007))、血管炎(參見例如，Rheumatology 39 :229-237 (2000))、貝西氏病 (Behcet' s disease) (BD)(參見例如，Rheumatology 42 1539-1M4Q003))、狼疫及乳糜瀉(Vivas, S.，等人，N. Engl. J. Med. ,354(23) :2514-2515 (2006))、血管炎、干癬、肌炎、硬皮病、再生障礙性貧血、及結(jié)腸炎)的方法，其包括對病人施用有效量的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白。在另一方面，有效量的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白可與一種或多種免疫抑制劑一起施用以使需要此種治療的病人準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)體器官移植(Agarwal等人，Transplant Immunol. ,20 :6-11(2008))或 CD34+ 干細(xì)胞移植(Burt 等人，The Lancet, published online January 30，2009)。本發(fā)明還涉及一種治療需要治療的病人中的癌癥的方法，其包括對病人施用有效量的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種治療需要治療的病人中的多發(fā)性硬化癥的方法，其包括對病人施用有效量的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種治療需要治療的病人中的慢性淋巴細(xì)胞白血病的方法，其包括對病人施用有效量的本發(fā)明的人源化免疫球蛋白。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的給藥可包括人源化免疫球蛋白本身的給藥(例如，以藥物組合物形式)，編碼人源化免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)重組載體的給藥，或是包含編碼人源化免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)核酸(例如，一個(gè)或多個(gè)重組載體)和表達(dá)人源化免疫球蛋白的宿主細(xì)胞的給藥。本發(fā)明還涉及一種診斷選自自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、血管炎)、癌癥(例如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、移植(例如實(shí)體器官移植(例如腎臟移植)和干細(xì)胞移植)的疾病的方法，其包括使用本發(fā)明的人源化免疫球蛋白在體外檢定病人樣品。本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(例如，包含本發(fā)明的人源化輕鏈和/或本發(fā)明的人源化重鏈)、本發(fā)明的重組載體、或是本發(fā)明的宿主細(xì)胞，用于藥物，例如用于疾病治療和/或診斷，例如用于治療本文所敘述的疾病或病癥比如自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和狼瘡)、癌癥、淋巴細(xì)胞過度增殖癥狀(例如T或B 細(xì)胞惡性腫瘤，包括例如B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的白血病和例如非何杰金氏淋巴瘤的淋巴瘤)。參見，例如，Lundin, J.，等人，Blood，101 :4267-4272(2003) ；Rodig, SJ.，等人， Clinical Cancer Research, 12 (23) :7174-7179 (2006)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、人源化輕鏈或人源化重鏈、本發(fā)明的重組載體、或本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于制造用來治療本文所述的疾病或病癥(例如，自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、血管炎)、癌癥(例如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、和移植(例如實(shí)體器官移植(例如腎臟移植)和干細(xì)胞移植))的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種人源化抗人⑶52抗體，包括人輕鏈骨架區(qū)，其利用殘基36(Y) 和46 (L) (Kabat編號)已被替代的人Vk2_A18b基因。在一些實(shí)施方式中，殘基36為V或L 且殘基46為R。本發(fā)明還提供人源化抗人CD52抗體，包括人重鏈骨架區(qū)，其利用殘基47 (W) (Kabat編號)已被替代的人VH 3_23基因。在一些實(shí)施方式中，殘基47 (W)和49 (S) (Kabat編號)均被替代。在一些實(shí)施方式中，殘基47為L且殘基49為S。在其它實(shí)施方式中，殘基47為L且殘基49為A。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗人CD52抗體的EC5tl值，如在細(xì)胞結(jié)合檢定 (例如在實(shí)施例四中描述的檢定)中所確定，兩倍低于Campath-IH 抗體的EC5tl值。在多個(gè)實(shí)施方式中，人源化抗人CD52抗體的EC5tl值為IlnM或更低。在一些實(shí)施方式中，在來源于經(jīng)Campath-IH 治療的病人的血清的抗 Campath-IH 抗體的存在下，本發(fā)明的人源化抗人⑶52抗體結(jié)合至細(xì)胞上的⑶52。也就是說，在這樣的抗Campath-IH @抗體的存在下，本發(fā)明的人源化抗人CD52抗體在細(xì)胞上與⑶52的結(jié)合相比于Campath-IH 與⑶52的結(jié)合并未降低，或者其在這樣的抗 Campath-IH 抗體的存在下相比于Campath-IH 與⑶52的結(jié)合更少降低。本發(fā)明還提供一種人源化抗人CD52抗體以及本文提供的人源化抗人CD52抗體的血液和/或脾臟中淋巴細(xì)胞消減概況。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗人⑶52抗體使受試者的血清中TNF α、 IL-6和MCP-I中的一個(gè)或多個(gè)的循環(huán)水平增加。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗人CD52抗體降低受試者中的淋巴細(xì)胞水平至少30天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、或80天以上。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗人CD52抗體延遲疾病發(fā)病和/或降低疾病的嚴(yán)重度，如在小鼠EAE模型中通過臨床評分所測定。在一些實(shí)施方式中，在免疫原性檢定例如在實(shí)施例69或70中所描述的檢定中，本發(fā)明的人源化抗人⑶52抗體的免疫原性比Campath-IH 低。小鼠單克隆免疫球蛋白本發(fā)明還涉及對人CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆抗體(小鼠單克隆免疫球蛋白)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及對人CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆抗體，其包含含有SEQ ID NO 3的輕鏈和含有SEQ ID NO 16的重鏈；含有SEQ ID NO 4的輕鏈和含有SEQ ID NO 17的重鏈；含有SEQ ID NO 5的輕鏈和含有SEQ ID NO 18的重鏈；含有 SEQ ID NO :6的輕鏈和含有SEQ ID NO 19的重鏈；含有SEQ ID NO :7的輕鏈和含有SEQ ID NO 20的重鏈；含有SEQ ID NO 8的輕鏈和含有SEQ ID NO 21的重鏈；含有SEQ ID NO 9 的輕鏈和含有SEQ ID NO 22的重鏈；含有SEQ ID NO 10的輕鏈和含有SEQ ID NO 23的重鏈；含有SEQ ID NO 11的輕鏈和含有SEQ ID NO 24的重鏈；含有SEQ ID NO 12的輕鏈和含有SEQ ID NO 25的重鏈；或含有SEQ ID NO 13的輕鏈和含有SEQ ID NO 26的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，對人CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆抗體包含選自SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的輕鏈可變區(qū)，或選自 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24,SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的重鏈可變區(qū)，或者此種輕鏈可變區(qū)和此種重鏈可變區(qū)二者。本發(fā)明還涉及一種小鼠免疫球蛋白輕鏈，其包含SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12、或 SEQ ID NO :13 的可變區(qū)。
本發(fā)明還涉及一種小鼠免疫球蛋白重鏈，其包含SEQ ID NO 16, SEQ ID NO :17、 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22, SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25、或 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的小鼠單克隆抗體包含本發(fā)明的鼠抗體輕鏈和本發(fā)明的鼠抗體重鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種小鼠單克隆免疫球蛋白，其結(jié)合至與一種小鼠單克隆抗體所結(jié)合的人CD52上的表位相同的表位，該小鼠單克隆抗體包含SEQ ID NO 3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 23 的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO: 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種小鼠單克隆免疫球蛋白，其結(jié)合至人⑶52上的表位，該表位與這樣的小鼠單克隆抗體所結(jié)合的表位重疊。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種小鼠單克隆免疫球蛋白，其結(jié)合至人CD52上的包含至少成熟人類⑶52序列的殘基1的表位。該小鼠單克隆免疫球蛋白可結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52序列的殘基1、3、4和5的表位，可結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52序列的殘基1、2、3、4和5的表位，或者可結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和9的表位。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和11。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基4和11。本發(fā)明還涉及分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白輕鏈或小鼠免疫球蛋白重鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種分離的核酸分子，其編碼小鼠免疫球蛋白重鏈和小鼠免疫球蛋白輕鏈，它們結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆免疫球蛋白，其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈包含選自SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO 10, SEQ ID N0:11、SEQ ID NO :12 JPSEQ ID NO 13 的可變區(qū)，或者該小鼠免疫球蛋白重鏈包含選自 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的可變區(qū)，或者此種輕鏈和此種重鏈二者。在一些實(shí)施方式中，該分離的核酸編碼小鼠免疫球蛋白輕鏈，其包含選自SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、和 SEQ ID NO :13 的可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，該分離的核酸編碼小鼠免疫球蛋白重鏈，其包含選自SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、禾口 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種重組載體(例如，表達(dá)載體，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)，其包含編碼本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白(例如，小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈)、小鼠免疫球蛋白輕鏈、或小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為包含一個(gè)編碼小鼠單克隆免疫球蛋白的核酸的一個(gè)重組載體，或包含多個(gè)編碼小鼠單克隆免疫球蛋白的核酸的一對重組載體，該小鼠單克隆免疫球蛋白包含選自SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO 13 的輕鏈可變區(qū)，或選自 SEQ ID NO 16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO 26 的重鏈可變區(qū)，或者此種輕鏈可變區(qū)和此種重鏈可變區(qū)二者。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含編碼小鼠免疫球蛋白輕鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈包含 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO :13。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含編碼小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈包含 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、或 SEQ ID NO :26ο在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含編碼小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈結(jié)合在一起而形成對人 CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，該小鼠免疫球蛋白輕鏈包含選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 JPSEQ ID N0:13 的可變區(qū)，且該小鼠免疫球蛋白重鏈包含選自SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO 19,SEQ ID NO20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22,SEQ ID NO23,SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO :25 JPSEQ ID NO :26 的可變區(qū)。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組載體為一種表達(dá)載體，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。在某些實(shí)施方式中，載體為一種質(zhì)粒或是病毒載體(例如，腺病毒或AAV載體)。本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白(小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈)、小鼠免疫球蛋白輕鏈或小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸。例如，在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含一種本發(fā)明的重組載體(例如，表達(dá)載體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含一種編碼小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈和該小鼠免疫球蛋白重鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆免疫球蛋白，并且其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈包含選自 SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的可變區(qū)，且/或該小鼠免疫球蛋白重鏈包含選自SEQ ID NO 16,SEQ ID NO 17,SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23、SEQ ID N0: 24、SEQ ID NO :25 JPSEQ ID NO :26 的可變區(qū)，或二者皆具。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含一種編碼小鼠免疫球蛋白輕鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白輕鏈包含選自SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、
24SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、和SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含一種編碼小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸，其中該小鼠免疫球蛋白重鏈包含選自SEQ ID NO 16, SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種小鼠單克隆免疫球蛋白的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白(例如，小鼠免疫球蛋白輕鏈和小鼠免疫球蛋白重鏈)的一個(gè)或多個(gè)重組核酸(例如，重組載體)的宿主細(xì)胞)維持在適合小鼠單克隆免疫球蛋白表達(dá)的條件下，借以表達(dá)小鼠單克隆免疫球蛋白鏈并制備小鼠單克隆免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離小鼠單克隆免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種小鼠單克隆免疫球蛋白輕鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(包含編碼本發(fā)明的小鼠免疫球蛋白輕鏈的核酸)維持在適合該小鼠免疫球蛋白輕鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)輕鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離該輕鏈。本發(fā)明還涉及一種小鼠單克隆免疫球蛋白重鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(包含編碼本發(fā)明的小鼠免疫球蛋白重鏈的核酸)維持在適合該小鼠免疫球蛋白重鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)小鼠免疫球蛋白重鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離該小鼠免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明還涉及一種疾病(例如，自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、血管炎)，癌癥(例如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))，移植(例如實(shí)體器官移植(例如腎臟移植)和干細(xì)胞移植))的診斷方法，其包括使用本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白在體外分析病人樣品(例如，Lundin, J.等人，Blood, 101 :4267-4272(2003) ；Rodig，SJ 等人，Clin. Cancer res. , 12(23) ；7174-717179 (2006)) 嵌合免疫球蛋白本發(fā)明還涉及一種對人CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白。此種嵌合免疫球蛋白可包含本發(fā)明的任何小鼠單克隆免疫球蛋白的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :23的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)；或 SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種對人⑶52具有結(jié)合特異性的嵌合抗體，其包含選自SEQ ID NO 3的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :13的輕鏈可變區(qū)的輕鏈可變區(qū)序列，和/或選自SEQ ID NO :16 的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 19 的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 22 的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 25 的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :26的重鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明還涉及一種嵌合輕鏈，其包含選自SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO :13 的可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種嵌合重鏈，其包含選自SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18, SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25、禾口 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白包含本發(fā)明的嵌合輕鏈和本發(fā)明的嵌合重鏈二
者ο在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種結(jié)合至與小鼠單克隆抗體所結(jié)合的人CD52 上的表位相同的表位的嵌合免疫球蛋白，該小鼠單克隆抗體包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 6的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:23的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO :25的重鏈可變區(qū)；或SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0: 26的重鏈可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，該嵌合免疫球蛋白結(jié)合至人CD52上的表位，此表位與這樣的小鼠單克隆抗體所結(jié)合的表位重疊。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種嵌合免疫球蛋白，其結(jié)合至人CD52上的表位，該表位包含至少成熟人類CD52序列的殘基1。該嵌合免疫球蛋白可結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52序列的殘基1、3、4和5的表位，可結(jié)合至包含至少成熟人類⑶52序列的殘基 1、2、3、4和5的表位，或者可結(jié)合至人⑶52上的包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和 9的表位。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類⑶52序列的殘基7、8和11。在一些實(shí)施方式中，該表位包含至少成熟人類CD52序列的殘基4和11。本發(fā)明還涉及一種分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白、嵌合輕鏈或嵌合重鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種編碼嵌合重鏈和嵌合輕鏈的分離的核酸分子(一個(gè)或多個(gè)核酸分子)，嵌合重鏈和嵌合輕鏈結(jié)合在一起而形成對人CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白，其中該嵌合輕鏈包含選自SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID N0:12、和SEQ ID NO :13的可變區(qū)；且/或該嵌合重鏈包含選自SEQ ID NO 16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種編碼嵌合輕鏈的分離的核酸分子，該嵌合輕鏈包含 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、或 SEQ ID NO 13 的可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種編碼嵌合重鏈的分離的核酸分子，該嵌合重鏈包含 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21,SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :24、SEQ ID N0:25、或 SEQ ID NO :26 的
可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種重組載體(例如，表達(dá)載體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)，其包含編碼本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白(嵌合輕鏈和嵌合重鏈)、嵌合輕鏈、或嵌合重鏈的核酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明為一種包含編碼嵌合免疫球蛋白的核酸的重組載體(或包含多個(gè)核酸的一對重組載體)，該嵌合免疫球蛋白包含選自SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO : 13 的輕鏈可變區(qū)；或選自 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的重鏈可變區(qū)；或此種輕鏈和重鏈二者ο在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含編碼嵌合輕鏈的核酸，其中該嵌合輕鏈包含 SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12、或 SEQ ID NO :13 的可變區(qū)。在其它實(shí)施方式中，該重組載體包含編碼嵌合重鏈的核酸，其中該嵌合重鏈包含 SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20, SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO :22,SEQ ID NO :23,SEQ ID NO :24、SEQ ID N0:25、或 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組載體為一種表達(dá)載體，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。在某些實(shí)施方式中，載體為一種質(zhì)?；虿《据d體(例如，腺病毒或AAV載體)。本發(fā)明還涉及一種包含編碼本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白(嵌合輕鏈和嵌合重鏈)、嵌合輕鏈或嵌合重鏈的一個(gè)或多個(gè)核酸(例如，一個(gè)或多個(gè)重組載體)的宿主細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含一種本發(fā)明的重組載體(例如，表達(dá)載體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼嵌合輕鏈和嵌合重鏈的一個(gè)重組核酸 (或一對重組核酸)，其中該嵌合輕鏈和該嵌合重鏈結(jié)合在一起而形成對人類CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白，并且其中該嵌合輕鏈包含選自SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、 SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12、和SEQ ID NO : 13的可變區(qū)；且/或該嵌合重鏈包含選自SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24, SEQ ID NO :25 禾口 SEQ ID NO :26 的可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼嵌合輕鏈的重組核酸，其中該嵌合輕鏈包含選自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、和 SEQ ID NO :13 的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含編碼嵌合重鏈的重組核酸，其中該嵌合重鏈包含選自 SEQ ID NO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :25、和 SEQ ID NO 26
的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種嵌合免疫球蛋白的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白(例如，嵌合輕鏈和嵌合重鏈)的分離的核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合嵌合免疫球蛋白表達(dá)的條件下，借以表達(dá)嵌合免疫球蛋白鏈并制備嵌合免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離嵌合免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種嵌合輕鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明的嵌合輕鏈的核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合該嵌合輕鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)嵌合輕鏈并制備嵌合輕鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離該嵌合輕鏈。本發(fā)明還涉及一種嵌合重鏈的制備方法，其包括將本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含編碼本發(fā)明的嵌合重鏈的核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合該嵌合重鏈表達(dá)的條件下，借以表達(dá)嵌合重鏈并制備嵌合重鏈。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括純化或分離該嵌合重鏈。本發(fā)明還涉及一種選自自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、血管炎)、癌癥 (例如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血病)，和淋巴瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、和移植(例如實(shí)體器官移植(例如腎臟移植)和干細(xì)胞移植)的疾病的診斷方法，其包括使用本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白在體外分析病人樣品。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式在以下描述。一方面，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52 抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的輕鏈和重鏈分別包含在SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 16中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)；在SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :17中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；在SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 18中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；在SEQ ID NO :6禾口 SEQ ID NO 19中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；在SEQ ID NO 7禾口 SEQ ID NO :20中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)；在SEQ ID NO :8和SEQ ID NO :21中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)；在SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :22中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)；在SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 23中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；在SEQ ID NO 11禾口 SEQ ID NO :24中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；在SEQ ID N0:12禾口 SEQ ID NO :25中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)；在SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :137中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)；或在SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :26中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種結(jié)合至與上述單克隆抗體或抗原結(jié)合部分所結(jié)合的人CD52 上的表位相同的表位的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種與上述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分競爭的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種與上述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分交叉競爭的抗體。在一些實(shí)施方式中，任何上述抗體或抗原結(jié)合部分結(jié)合至包含SEQ ID NO :104的氨基酸序列。在一些相關(guān)的實(shí)施方式中，該抗體或部分至SEQ ID NO :104的結(jié)合可通過在
28SEQ ID NO 104的殘基4、7、8、或11中的一個(gè)或多個(gè)處的丙氨酸取代而減少。在一些實(shí)施方式中，抗體為一種人源化抗體、小鼠抗體、或嵌合抗體。在某些實(shí)施方式中，該抗體重鏈的骨架區(qū)利用VH3-72或VH3-23人類生殖系序列，且該抗體輕鏈的骨架區(qū)利用VK2A18b人類生殖系序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體包含重鏈(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及輕鏈(L) _CDR1、L_CDR2、和 L-CDR3，其氨基酸序列分別為 SEQ ID NOs :51、59、69、四、36、和 43 ；分別為 SEQ ID NOs :50、60、69、四、 37、和 43 ；分別為 SEQ ID NOs :50、61、68、29、38、和 43 ；分別為 SEQ ID NOs :50、61、69、29、 36、和 43 ；分別為 SEQ ID NOs :50、62、69、四、39、和 43 ；分別為 SEQ ID NOs :52、61、70、30、
40、和43 ；分別為 SEQ ID NOs :53、63、71、31、36、和 44 ；分別為 SEQ ID NOs :54、64、71、31、 36、和 45 ；分別為 SEQ ID NOs :55、63、72、31、36、和 46 ；分別為 SEQ ID NOs :56、65、73、32、
41、和47 ；分別為 SEQ ID NOs :56、65、294、32、41、和 47 ；或分別為 SEQ ID NOs :56、66、74、 33、41、和 48。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的輕鏈和重鏈分別包含SEQ ID NOs :3和16的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 4和17的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :5和18的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 6和19的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :7和20的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 8和21的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :9和22的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 10和23的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 11和M的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 12和25的氨基酸序列；或者分別包含SEQ ID NOs 13和26的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs 103和102的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :136 和138的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :137和138的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 139和147的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :149和155的氨基酸序列；分別包含 SEQ ID NOs :149和156的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :158和165的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs 158和166的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :159和165的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :159和166的氨基酸序列；分別包含SEQ ID NOs :161和166 的氨基酸序列；或分別包含SEQ ID NOs :163和166的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種結(jié)合至與上述單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分所結(jié)合的人CD52上的表位相同的表位的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種與上述單克隆抗體或抗原結(jié)合部分競爭的抗體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種與上述單克隆抗體或抗原結(jié)合部分交叉競爭的抗體。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆人源化抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs :272和273的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs :274和275的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs :276和278的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs :277和278的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs :279和280的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人⑶52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈和輕鏈分別包含SEQ ID NOs 281 和觀2的氨基酸序列，且無信號序列。本發(fā)明還提供結(jié)合至與這些人源化抗體的其中之一所結(jié)合的CD52上的表位相同的表位的抗體，和與這些人源化抗體的其中之一競爭或交叉競爭的抗體。在相關(guān)的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含一種這些人源化抗體的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的輕鏈包含選自SEQ ID NOs :102、138、145-148、153-157、和164-168的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的輕鏈包含選自SEQ ID NOs :273、275、278、觀0、和282的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種抗體輕鏈或其部分，其包含選自SEQ ID NOs :102,138, 145-148、153-157、164-168、273、275、278 J80、和282的氨基酸序列，且無信號序列若其存在。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈包含選自 SEQ ID NOs :103、136、137、139-144、149-152、和 158-163 的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體的重鏈包含選自SEQ ID NOs :272、274、276、277、279、和的氨基酸序列，且無信號序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種抗體重鏈或其部分，其包含選自SEQ ID NOs :103、136、137、139-144、149-152、158-163、272、274、276、277、279、和 281 的氨基酸序列，且無信號序列若其存在。在一些實(shí)施方式中，任何上述抗體可以為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子。在某些實(shí)施方式中，該IgG為IgGU IgG2、IgG3、或IgG4。在一些實(shí)施方式中，任何上述抗原結(jié)合部分可為單鏈抗體、Fv、Fab、Fab’、 F(ab' )2、Fd、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv 二聚體、雙抗體(diabody)、區(qū)域缺失抗體或單域抗體(dAb)。本發(fā)明還涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分，其中該抗體或抗原結(jié)合部分消減T 或B淋巴細(xì)胞，或其二者；與B淋巴細(xì)胞相較，優(yōu)先消減T淋巴細(xì)胞；增加TNF- α、IL_6、或 MCP-I的循環(huán)血清水平(例如，以至少5%、至少10%、至少50%、至少100%、或至少200% 的水平)；介導(dǎo)CD52表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；介導(dǎo)CD52表達(dá)細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)；盡管在阿侖單抗的中和抗體存在于病人中的情況下，結(jié)合至人⑶52 ；并且/或促進(jìn)人類T和/或B細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)(參見例如，Hederer等人，International Immunology 12:505-616(2000) ；Watanabe等人，Clinical Immunology 120 :247-259(2006)) ο本發(fā)明還涉及一種編碼任何上述抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分或任何上述抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的分離的核酸。在一些實(shí)施方式中，該分離的核酸包含選自SEQ ID NOs J83J85J87J88J90、和四2的重鏈核苷酸序列，或不具有編碼信號肽的序列的該核苷酸序列；選自SEQ ID NOs J84J86J89J91、和四3的輕鏈核苷酸序列，或是不具有編碼信號肽的序列的該核苷酸序列；或該重鏈核苷酸序列和該輕鏈核苷酸序列皆包含。在某些實(shí)施方式中，該分離的核酸包含重鏈核苷酸序列與輕鏈核苷酸序列，其分別選自SEQ ID NO :283和SEQ ID NO J84，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :285 和SEQ ID NO J86，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :287和SEQ ID NO :289，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :288和SEQ ID N0:289，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者皆不具有編碼信號肽的序列；以及分別選自SEQ ID NO :292和SEQ ID NO :293，二者皆不具有編碼信號肽的序列。本發(fā)明還涉及包含重鏈核苷酸序列的分離核酸以及包含輕鏈核苷酸序列的分離核酸用于制造治療需要此種治療的病人的藥物中的用途，其中該重鏈核苷酸序列和該輕鏈核苷酸序列分別選自SEQ ID NO :283和SEQ ID NO J84，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :285和SEQ ID NO :286，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自 SEQ ID NO :287和SEQ ID NO :289，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO: 288和SEQ ID NO :289，二者皆不具有編碼信號肽的序列；分別選自SEQ ID NO :290和SEQ ID NO :291，二者皆不具有編碼信號肽的序列；以及分別選自SEQ ID NO :292和SEQ ID NO: 四3，二者皆不具有編碼信號肽的序列。本發(fā)明還涉及一種重組載體，其包含(1)編碼任何上述抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸序列，( 編碼任何上述抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸序列，或(3) 二者。本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其包含編碼任何上述抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的第一核酸序列，該第一核酸序列可操作地連接至表達(dá)控制元件，和編碼該抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的第二核酸序列，該第二核酸序列可操作地連接至表達(dá)控制元件。本發(fā)明涉及一種抗人⑶52抗體或其抗原結(jié)合部分的制造方法，其包括將該宿主細(xì)胞維持在適合該抗體或部分表達(dá)的條件下，并且還涉及進(jìn)一步包括分離該抗體或部分的步驟的該方法。本發(fā)明涉及一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求第I-M項(xiàng)中任一項(xiàng)的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分以及藥學(xué)上可接受的媒介物或載體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種對需要的病人進(jìn)行治療的方法，其包括對病人施用有效量的任何上述的抗體或抗原結(jié)合部分，或上述組合物。在某些實(shí)施方式中，該病人正接受移植。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種對需要自體免疫疾病治療的病人進(jìn)行治療的方法，其包括對病人施用有效量的任何上述的抗體或抗原結(jié)合部分，或上述組合物。在某些實(shí)施方式中，該自體免疫疾病為，例如，多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種對需要癌癥治療的病人進(jìn)行治療的方法，其包括對病人施用有效量的任何上述抗體或抗原結(jié)合部分，或上述組合物。在某些實(shí)施方式中，該癌癥為，例如，淋巴瘤比如非何杰金氏淋巴瘤；白血病比如B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血??；T細(xì)胞惡性腫瘤，其中與B細(xì)胞相較，該抗體或部分優(yōu)先地消減T細(xì)胞；或?qū)嶓w腫瘤。在一些實(shí)施方式中，任一種上述治療方法進(jìn)一步包括對病人施用嗜中性細(xì)胞刺激劑或NK細(xì)胞刺激劑。在某些實(shí)施方式中，該刺激劑為G-CSF或GM-CSF。在一些實(shí)施方式中，任一種上述治療方法進(jìn)一步包括對病人施用T調(diào)節(jié)細(xì)胞刺激劑。在某些實(shí)施方式中，該刺激劑為雷帕霉素(rapamycin)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種對需要的病人抑制血管生成的方法，其包括對病人施用有效量的任何上述抗體或抗原結(jié)合部分。在某些實(shí)施方式中，該病人有實(shí)體腫瘤。在某些實(shí)施方式中，該病人有新血管形成。在某些實(shí)施方式中，該新血管形成在眼睛中。本發(fā)明還涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分用于制造用來治療有需要病人中的自體免疫疾病的藥物中的用途。而且，本發(fā)明涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分用于制造用來治療有需要病人中的癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分用于制造用來治療需要移植的病人的藥物中的用途。本發(fā)明涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分用于制造在需要的病人中治療新血管形成的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及任何上述抗體或抗原結(jié)合部分作為藥物的用途。

圖1A-1B是一種新的抗⑶52單克隆抗體的發(fā)展的示意表示。一般方案描述于圖 IA中，且鼠抗人⑶52抗體克隆及其同種型(isotype)的名稱顯示于圖IB中。圖2是多個(gè)鼠抗人⑶52 κ輕鏈序列(SEQ ID NOS 1-13)的氨基酸序列的排列。 Campath-IG是一種大鼠單克隆抗體，由此得到人源化Campath-IH抗體。圖3是多個(gè)鼠抗人⑶52重鏈序列(SEQ ID NOS 14-26)的氨基酸序列的排列。圖4是野生型CD52和10種突變的CD52蛋白(SEQ ID NOS :104-114，自上到下) 的排列。圖5A說明抗體4B10和7F11在表達(dá)⑶52丙氨酸掃描突變體的細(xì)胞上的基于FACS 的N端結(jié)合概況。圖5B說明抗體CF1D12、3G7、9D9、5F7、4G7、和IlCll在表達(dá)CD52丙氨酸掃描突變體的細(xì)胞上的基于FACS的中間區(qū)域結(jié)合概況。圖 5C 說明抗體 Campath-IH ( “Campath 1H，，)、2C3、12G6、禾口 23E6 在表達(dá) CD52 丙氨酸掃描突變體的細(xì)胞上的基于FACS的結(jié)合概況。圖5D描述使用嵌合單克隆抗體組探查的⑶52+/-N-連接糖基化的免疫印跡。 "C1H，，表示 Campath-IH 。圖6是顯示對于在CHO-Kl⑶52#67細(xì)胞上篩選的各種嵌合抗⑶52抗體的1. 5小時(shí)⑶C檢定結(jié)果的圖。結(jié)果顯示嵌合抗體4B10和7F11與Campath-IH 可比較或者優(yōu)于 Campath-IH ( ‘‘Campath 1H，，)。圖7是顯示對于在CHO-Kl⑶52#67細(xì)胞上篩選的針對⑶52的各種嵌合IgGl抗體的14小時(shí)ADCC檢定結(jié)果的圖。結(jié)果顯示嵌合抗體2C3和12G6與Campath-IH 可比較或者優(yōu)于 Campath-IH ( “Campath 1H，，)。圖8A-8C說明各種抗⑶52抗體與Campath-IH ( “C-1H”)抗體至規(guī)定的人類淋巴細(xì)胞群的比較結(jié)合。這些圖顯示通過FACS檢定所篩選的嵌合抗體的結(jié)合能力的級別。向最右端的曲線顯示最高結(jié)合能力，而向最左端的曲線則具有較低親和性。圖9A-9C 是說明在用嵌合抗體 7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或 5F7、或 Campath-IH ( “Cam”)給藥之后72小時(shí)在血液中的⑶4T細(xì)胞(圖9A)、⑶8T細(xì)胞(圖 9B)和⑶19B細(xì)胞(圖9C)的水平的圖。
圖10A-10C 是說明在用嵌合抗體 7F11、8G3、23E6、12G6、4B10、或 5F7、或 Campath-IH ( “Cam”)給藥之后72小時(shí)在脾臟中的CD4T細(xì)胞(圖10A)、CD8T細(xì)胞(圖 10B)和CD19B細(xì)胞(圖10C)的水平的圖。圖 11A-11C 是顯示在用嵌合抗體 2C3、9D9、4B10、3G7、或 11C11、或 Campath-IH (“Cam”)給藥之后72小時(shí)在血液中的CD4T細(xì)胞(圖11A)、CD8T細(xì)胞(圖11B)和CD19B 細(xì)胞(圖11C)的水平的圖。圖12是說明在使用7F11、4B10、或12G6嵌合單克隆抗體、或Campath-IH ("Campath")處理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活圖。圖13是說明在使用2C3、8G3、或23E6嵌合單克隆抗體、或Campath-IH (“Campath“)處理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活圖。圖14是說明在使用9D9或4B10嵌合單克隆抗體、或Campath-IH (“Campath，，) 處理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活圖。圖15是說明在使用2C3或IlCll嵌合單克隆抗體、或Campath-IH (“Campath”) 處理之后的存活小鼠百分比的Kaplan Meier存活圖。圖16是鼠抗人CD52抗體4B10重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 96)序列以及最接近匹配的人類生殖系序列(SEQ ID NO 97)和人源化重鏈可變區(qū)序列(SEQ ID NO 98)的排列。還示出鼠抗人⑶52抗體4B10輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 99)序列以及最接近匹配的人類生殖系序列(SEQ ID NO 100)和人源化輕鏈可變區(qū)序列(SEQ ID NO :101)的排列。圖17顯示人源化4B10重鏈(SEQ ID NO :103)和輕鏈(SEQ ID NO :102)可變區(qū)的序列。圖18是顯示人源化抗體4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化”)和嵌合抗體4B10同等地結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的圖。圖19是顯示人源化抗體4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化”)和嵌合抗體4B10對表達(dá) CD52的細(xì)胞介導(dǎo)同等的ADCC活性的圖。圖20是顯示人源化抗體4B10-H1/K1 ( "4B10-人源化”)和嵌合抗體4B10對表達(dá) CD52的細(xì)胞介導(dǎo)同等的CDC活性的圖。圖 21 是說明嵌合抗 CD52 抗體(12G6、7F11 和 4B10)、Campath_lH (‘‘Campath，，)、和人源化抗CD52抗體4B10-H1/K1 (“4B10人源化(H1/K1) ”)在雜合的huCD52轉(zhuǎn)基因小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)特性的圖。圖22A-22C是顯示在使用嵌合抗體4B10或人源化抗體4B10-H1/K1 ( “4B10_Hu”) 或Campath-IH ( “Campath”)給藥之后72小時(shí)血液中的⑶4T細(xì)胞(圖22A)、⑶8T細(xì)胞 (圖22B)及CD19B細(xì)胞(圖22C)的水平的圖。圖23是顯示抗CD52單克隆抗體的相對結(jié)合親和性的概括圖。圖M顯示人源化7F11重和輕(κ )鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且⑶Rs以粗體表示。圖25是顯示嵌合和人源化7F11抗體同等地結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖。X 軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖26A顯示人源化2C3重鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且⑶Rs以粗體表示。圖26B顯示人源化2C3輕(κ)鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭?br> 33殘基的氨基酸殘基其下面劃線，且CDRs以粗體表示。圖27A為顯示人源化和嵌合2C3抗體結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖。X軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖27B是顯示嵌合2C3抗體和一部分(subset)人源化2C3抗體同等地結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖。 X軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖28A顯示人源化12G6重鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)樾∈髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且⑶Rs以粗體表示。圖28B顯示人源化12G6輕(κ)鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且CDRs以粗體表示。圖四是顯示嵌合12G6抗體和一部分人源化12G6抗體同等地結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖。X軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖30A顯示人源化9D9重鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且⑶Rs以粗體表示。圖30B顯示人源化9D9輕(κ)鏈可變區(qū)序列?；貜?fù)突變?yōu)槭髿埢陌被釟埢湎旅鎰澗€，且CDRs以粗體表示。圖31是顯示嵌合的9D9抗體和一部分人源化9D9抗體同等地結(jié)合至表達(dá)⑶52的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)圖。X軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖32A 顯示 Campath-IH ( “C1H”)、嵌合 2C3 抗體、及人源化 2C3-SFD1/K12 抗體至初始人類T細(xì)胞和hu⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞的結(jié)合曲線。圖32B顯示Campath-IH (“C1H”)、嵌合9D9抗體、及人源化9D9抗體至初始人類T細(xì)胞和huCD52轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞的結(jié)合曲線。圖32C顯示Campath-IH ( “C1H”)、嵌合12G6抗體、及人源化12G6抗體至初始人類T細(xì)胞和hu⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞的結(jié)合曲線。圖33是顯示Campath-IH 、嵌合2C3及12G6抗體、和人源化2C3及12G6抗體至 huCD52表達(dá)的人類和轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞的相對結(jié)合效率的表。圖；34通過流式細(xì)胞術(shù)說明人源化抗CD52Campath_lH 、2C3、12G6、和9D9抗體至人類外周血單核細(xì)胞群的規(guī)定亞型的相對結(jié)合形式(pattern)。這些統(tǒng)計(jì)圖顯示，對于各種表達(dá)⑶52的人PBMC亞型，人源化抗⑶52抗體結(jié)合與Campath-IH 的結(jié)合相當(dāng)。X軸表示由結(jié)合的抗CD52抗體所放出的熒光，其中每一個(gè)峰的面積表示總細(xì)胞群。圖35是顯示嵌合及人源化7F11抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)同等的ADCC活性的圖。圖36是顯示嵌合及人源化7F11抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)⑶C活性的圖。圖37是顯示嵌合及人源化2C3抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC活性的圖。圖38是顯示嵌合及人源化2C3抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)⑶C活性的圖。圖39是顯示嵌合及人源化12G6抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC活性的圖。圖40是顯示嵌合及人源化12G6抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)⑶C活性的圖。圖41是顯示嵌合及人源化9D9抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC活性的圖。圖42是顯示嵌合及人源化9D9抗體對表達(dá)⑶52的細(xì)胞介導(dǎo)⑶C活性的圖。圖43是顯示人源化抗⑶52抗體在初始T細(xì)胞上的ADCC活性的圖。圖44是顯示人源化抗⑶52抗體在初始T細(xì)胞上的⑶C活性的圖。
圖45是顯示Campath-IH而非其它抗⑶52抗體的中和的圖，其使用包含抗 Campath-IH 中和抗體的CAMMS223研究人類血清樣品。血清樣品在第12個(gè)月(M12)和第 13個(gè)月(M13)取自代表性病人(MS-I)。圖 46A-46E 顯示在使用 Campath-ΙΗ (“Campath”)和人源化4B10-H1/K1 (“4B10，，) 抗體給藥之后72小時(shí)血液中的⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖 47A-47E 顯示在使用 Campath-ΙΗ (“Campath”)和人源化4B10-H1/K1 (“4B10，，) 抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞的水平。圖 48A-48E 顯示在使用 Campath-ΙΗ (“Campath”)和人源化4B10-H1/K1 (“4B10，，) 抗體給藥之后2小時(shí)的循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖 49A 和 49B 顯示在使用 Campath-ΙΗ ( "Campath")和人源化 4B10-H1/ Κ1( "4B10")抗體(mg/kg)給藥之后一段時(shí)期內(nèi)的循環(huán)淋巴細(xì)胞的再增殖。圖 50A-50E 顯示在使用人源化 7F11-SFD1/K2 ( "7F11 SFD1")和 7F11-SFD2/ K2( "7F11 SFD2，，)抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Β220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖 51Α-51Ε 顯示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11 SFD1")和 7F11-SFD2/ K2( "7F11 SFD2，，)抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Β220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖 52A-52F 顯示在使用人源化 7F11-SFD1/K2( "7F11 SFD1")和 7F11-SFD2/ K2( "7F11 SFD2”)抗體給藥之后2小時(shí)的循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖 53Α 和 5!3Β 顯示在使用人源化 7F11-SFD1/K2 ( "7F11 SFD1")和 7F11-SFD2/ K2( "7F11 SFD2”)抗體給藥(mg/kg)之后循環(huán)淋巴細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)的再增殖。圖54A和54B顯示在使用Campath-IH : ( “Campath”)、7F11_嵌合抗體、和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和B220+ B細(xì)胞的水平。圖55顯示給藥之后血液中Campath-ΙΗ ( “Campath”)、7F11_嵌合抗體和人源化7F11-SFD1/K2及7F11-SFD2/K2抗體在一段時(shí)間內(nèi)的水平。圖56A-56E顯示在使用2C3-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖57A-57E顯示在使用2C3-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖58A-58F顯示在使用2C3-SFD1/K12 ( “2C3”)抗體給藥之后2小時(shí)的循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖59顯示在使用2C3-SFD1/K12抗體給藥(mg/kg)之后循環(huán)的淋巴細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)的再增殖。圖60A-60E顯示在使用12G6-SFD1/K11抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖61A-61E顯示在使用12G6-SFD1/K11抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞的水平。圖62A-62F顯示在使用12G6-SFD1/K11 ( “12G6hu”)抗體給藥之后2小時(shí)的循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖63顯示在使用12G6-SFD1/K11抗體給藥(mg/kg)之后循環(huán)的淋巴細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)的再增殖。圖64A-64C顯示給藥之后血液中2C3-嵌合、2C3-SFD1/K12、12G6-嵌合、 12G6-SFD1/K1U9D9-嵌合、及9D9-H10/K12抗體在一段時(shí)間內(nèi)的水平。圖65A-65E顯示在使用9D9_H10/K12( “9D9”)抗體給藥之后72小時(shí)血液中的 ⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞的水平。圖66A-66E顯示在使用9D9_H10/K12( “9D9”)抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的 ⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、和巨噬細(xì)胞的水平。圖67A-67F顯示在使用9D9-H10/K12 (“9D9”)抗體給藥之后2小時(shí)循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖68顯示在使用9D9-H10/K12 ( “9D9”)抗體(mg/kg)給藥之后循環(huán)的淋巴細(xì)胞
在一段時(shí)間內(nèi)的再增殖。圖 69A-69D 顯示在使用 Campath-IH ( “Campath”)、2C3_SFD1/K12 ( “2C3”)、 12G6-SFD1/K11( “12G6”)、和9D9_H10/K12( “9D9”)抗體給藥之后72小時(shí)血液中的整體 (bulk)淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、和B細(xì)胞)和⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、 B220+B細(xì)胞及NK細(xì)胞亞型的水平。圖 70A-70D 顯示在使用 Campath-IH ( “Campath”)、2C3_SFD1/K12 ( “2C3”)、 12G6-SFD1/K11( “ 12G6”)、及9D9-H10/K12 ( “9D9”)抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、及B細(xì)胞)和⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B 細(xì)胞及NK細(xì)胞亞型的水平。圖 71A-71F 顯示在使用 Campath-IH 、2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、禾口 9D9-H10/K12抗體給藥之后2小時(shí)循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖72顯示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗體給藥之后72小時(shí)血液中的 ⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、和NK細(xì)胞的水平。圖73顯示在使用9D9-H10/K12及9D9-H11/K12抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的 ⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、和NK細(xì)胞的水平。圖 74A-74D 顯示在使用 12G6-SFD1/K11( “12G6K11”)和 12G6-SFD1/ K12( “12G6K12”)抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Β220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞的水平。圖 75A-7OT 顯示在使用 12G6-SFD1/K11( “12G6K11”)和 12G6-SFD1/ K12( “12G6K12”)抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、Β220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞的水平。圖 76 顯示在使用 9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、和 9D9-H18/K13 抗體給藥之后 72 小時(shí)血液中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、和B220+ B細(xì)胞)的水平。
圖 77A-77D 顯示在使用 9D9-H11/K12、9D9_H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖78 顯示在使用 9D9-H11/K12、9D9-H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗體給藥之后 72 小時(shí)脾臟中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、和B220+ B細(xì)胞)的水平。圖 79A-79D 顯示在使用 9D9-H11/K12、9D9_H16/K13、及 9D9-H18/K13 抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖 80A-80F 顯示在使用 909-!111/1(12、909-!116/1(13、及909-!118/1(13抗體給藥之后 2小時(shí)循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖 81A 和 81B 顯示給藥之后血液中 2C3-SFD1/K12、12G6-SFD1/K11、12G6-SFD1/ K12、9D9-H16/K13和9D9-H18/K13抗體在一段時(shí)間內(nèi)的水平。圖 82A-82F 顯示在使用 Campath-IH ( “Campath”)、2C3_SFD1/K11、12G6-SFD1/ Kl 1、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13或9D9-H18/K13抗體給藥之后血液中的細(xì)胞因子在48小時(shí)時(shí)間內(nèi)的水平。圖 83A-83E 顯示在使用 Campath-IH ( “Campath”)、2C3_SFD1/K11、12G6-SFD1/ 1(11、1266-5 01/1(12、909-!116/1(13或909-!118/1(13抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的整體淋巴細(xì)胞、⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞、和骨髓樣細(xì)胞的水平。圖 84A-84G 顯示在使用 Campath-IH (“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9_H16/K13 及12G6-SFD1/K12抗體給藥之后循環(huán)的CD4+和CD8+ T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)的再增殖。圖 85 顯示 FITC 標(biāo)記的 Campath-IH (“Campath”)、2C3_SFD1/K12 ("2C3 K12”)、 12G6-SFD1/K11( "12G6 Kll”)、12G6-SFD1/K12 ( “ 12G6 K12”)、9D9_H16/K13 ( “9D9 H16”)、及9D9-H18/K13( "9D9 H18”)抗體在脾臟中特異性地結(jié)合至hu⑶52淋巴細(xì)胞群的能力。圖 86A-86E 顯示在使用 Campath-IH ( ‘‘Campath”)、2C3_SFD1/K12、12G6-SFD1/ K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗體給藥之后72小時(shí)血液中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、和B220+ B細(xì)胞)和⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞及骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖 87A-87E 顯示在使用 Campath-IH ( ‘‘Campath”)、2C3_SFD1/K12、12G6-SFD1/ K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、和B220+ B細(xì)胞)和⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、NK細(xì)胞及骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖 88A-88F 顯示在使用 Campath-IH ( ‘‘Campath”)、2C3_SFD1/K12、12G6-SFD1/ K11、12G6-SFD1/K12、9D9-H16/K13、及9D9-H18/K13抗體給藥之后2小時(shí)循環(huán)細(xì)胞因子的水平。圖 89A-89D 顯示在使用 Campath-IH (‘‘Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9_H16/K13 及12G6-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)血液中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、及NK/骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖 90A-90D 顯示在使用 Campath-IH (‘‘Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9_H16/K13及12G6-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)脾臟中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、及NK/骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖 91A-91D 顯示在使用 Campath-IH (“Campath”)、2C3-SFD1/K12、9D9_H16/K13 及12G6-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)淋巴結(jié)中的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、及NK/骨髓樣細(xì)胞亞型的水平。圖92A顯示hu⑶52-KI/K0和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笾孝?+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、及NK/骨髓樣細(xì)胞亞型上的huCD52表達(dá)水平。圖92B顯示huCD52_KI/K0和huCD52 ⑶1轉(zhuǎn)基因小鼠中⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、及B細(xì)胞上的hu⑶52表達(dá)水平。圖93顯示相對于Campath-IH 對照組的來自各種制造來源(“小規(guī)?！焙汀按笠?guī)模”)的 12G6-SFD1/K12 與 2C3-SFD1/K12 抗體對 huCD52 的結(jié)合。圖94顯示在使用來自各種制造來源(“小規(guī)?！焙汀按笠?guī)?！?的12G6-SFD1/K12 和2C3-SFD1/K12抗體給藥之后72小時(shí)血液中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞和NK細(xì)胞)的水平。圖 95 顯示在給藥之后血液中的 2C3-SFD1/K12、9D9-H16/K13 和 12G6-SFD1/K12 抗體在一段時(shí)間內(nèi)的水平。圖96顯示在疾病進(jìn)展時(shí)期內(nèi)的2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12的EAE臨床評分。圖 97A 和 97B 顯示 CampathlH(“Campath”)、2C3_SFD1/K12 (“2C3”)、His435Ala 2C3-SFD1/K12( "H435A 2C3”)和 His310Ala/His435Gln 2C3-SFD1/K12( "H310A/H435Q 2C3”)結(jié)合至小鼠Fcfoi分子和人類Fcfoi分子的能力。圖98顯示在非轉(zhuǎn)基因小鼠中2C3-SFD1/K12( ‘‘2C3未修飾”)、2C3_SFD1/K12_修飾1 ( "2C3-Fc突變體1”)和2C3-SFD1/K12-修飾2 ( ‘‘2C3_Fc突變體2”)的體內(nèi)清除。圖 99 顯示在 huCD52 轉(zhuǎn)基因小鼠中 2C3-SFD1/K12 ( ‘‘2C3”)、2C3_SFD1/K12_ 修飾 1 ( "2C3-Fc突變體1”)和2C3-SFD1/K12-修飾2 ( ‘‘2C3_Fc突變體2”)的體內(nèi)清除。圖 100A 和 100B 顯示在使用 2C3-SFD1/K12 ( "2C3”)、2C3_SFD1/K12_ 修飾 1 ( "2C3-Fc突變體1”)、和2C3-SFD1/K12-修飾2 ( “2C3_Fc突變體2”)抗體給藥之后72 小時(shí)血液和脾臟中的整體淋巴細(xì)胞群(⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞、B220+ B細(xì)胞、和NK細(xì)胞)的水平。圖IOlA和IOlB是Biacore TlOO檢定的代表性傳感圖(sensorgrams)以確定人源化12G6-SFD1/K12抗體和通過丙氨酸掃描而產(chǎn)生的突變肽的表位特異性。圖IOlA顯示 12G6-SFD1/K12與MUT 8肽之間沒有結(jié)合，而圖IOlB顯示12G6-SFD1/K12與MUT 9肽之間
存在結(jié)合。圖102顯示對供體BMS486的TCR V β分析。使用Campath-IH⑧肽組986-989馴化(educated)的CD4+ T細(xì)胞表現(xiàn)出單一 Vβ (Vβ 3)的優(yōu)先增加。圖 103 顯示對供體 BMS^8 的 TCR V β 分析。使用 12G6-SFD1/K12 肽組 1066_67_68 和1083-84-85馴化的CD4+ T細(xì)胞表現(xiàn)出單一 Vβ (Vβ 20)的優(yōu)先增加。圖104A-104J顯示Campath-IH 免疫原性評估。對于單獨(dú)供體A-J的增殖反應(yīng)以 CPM顯示。X軸描述用于刺激自體CD4+ T細(xì)胞三次的肽組。各組T細(xì)胞使用以馴化抗原/ 肽組(特異性反應(yīng)，左邊條狀物，白色)、不相關(guān)的DR結(jié)合肽(中間條狀物，加條紋的)、或介質(zhì)(右邊條狀物，黑色)脈沖的自體DCs重復(fù)檢定三次。
圖105A-105J顯示12G6-SFD1/K12免疫原性評估。對于單獨(dú)供體A-J的增殖反應(yīng)以CPM顯示。X軸描述用于刺激自體CD4+ T細(xì)胞三次的肽組。各組T細(xì)胞使用以馴化肽組(特異性反應(yīng)，左邊條狀物，白色)、不相關(guān)的DR結(jié)合肽(中間條狀物，加條紋的)、或介質(zhì)(右邊條狀物，黑色)脈沖的自體DCs重復(fù)檢定三次。在沒有介質(zhì)對照檢定的小組中，左邊條狀物(白色)表示用馴化肽脈沖的DCs，右邊條狀物(加條紋的)表示用不相關(guān)肽脈沖的 DCs。圖106顯示2C3-SFD1 (SEQ ID NO :272)的全長人源化重鏈氨基酸序列和 2C3-K12(SEQ ID NO 273)的全長人源化輕鏈氨基酸序列。信號序列以粗體及斜體表示，且 ⑶Rs下面劃線。圖107顯示7F11-SFDl (SEQ ID NO :274)的全長人源化重鏈氨基酸序列和 7F11-K2(SEQ ID NO 275)的全長人源化輕鏈氨基酸序列。信號序列以粗體及斜體表示，且 ⑶Rs下面劃線。圖 108 顯示 9D9-H16(SEQ ID NO :276)和 9D9_H18(SEQ ID NO :277)的全長人源化重鏈氨基酸序列，以及9D9-K13(SEQ ID NO 278)的全長人源化輕鏈氨基酸序列。信號序列以粗體及斜體表示，且⑶Rs下面劃線。圖109顯示12G6-SFD1 (SEQ ID NO :279)的全長人源化重鏈氨基酸序列和 12G6-K12(SEQ ID NO :280)的全長人源化輕鏈氨基酸序列。信號序列以粗體及斜體表示，且⑶Rs下面劃線。圖110顯示4B10-H1 (SEQ ID NO :281)的全長人源化重鏈氨基酸序列和 4B10-K1(SEQ ID NO 282)的全長人源化輕鏈氨基酸序列。信號序列以粗體及斜體表示，且 ⑶Rs下面劃線。圖111顯示2C3-SFD1 (SEQ ID NO :283)的全長人源化重鏈核酸序列和 2C3-K12(SEQ ID NO J84)的全長人源化輕鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。圖112顯示7F11-SFDl (SEQ ID NO :285)的全長人源化重鏈核酸序列禾口 7F11-K2(SEQ ID NO J86)的全長人源化輕鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。圖 113 顯示 9D9-H16(SEQ ID NO 287)和 9D9_H18(SEQ ID NO 288)的全長人源化
重鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。圖114顯示9D9_K13(SEQ ID NO :289)的全長人源化輕鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。圖115顯示12G6-SFD1 (SEQ ID NO :290)的全長人源化重鏈核酸序列和 12G6-K12(SEQ ID NO :291)的全長人源化輕鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。圖116顯示4B10-H1 (SEQ ID NO 292)的全長人源化重鏈核酸序列和4B10-K1 (SEQ ID NO 293)的全長人源化輕鏈核酸序列。信號序列下面劃線，可變區(qū)為粗體，恒定區(qū)為斜體。
具體實(shí)施方式
⑶52是一種糖基化的、GPI錨定的細(xì)胞表面富含蛋白(每個(gè)細(xì)胞約切IO5個(gè)抗體結(jié)合部位)，其存在于至少95%的所有人類外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(Hale G，等人"The CAMPATH-1 antigen (CD52)，” Tissue Antigens，35 178-327 (1990))，但是不存在于造血干細(xì)胞。本發(fā)明涉及對人CD52或其部分具有結(jié)合特異性(例如，表位特異性) 或者選擇性地結(jié)合至人CD52或其部分的免疫球蛋白(抗CD52)。這些免疫球蛋白特異性地結(jié)合至⑶52，并且不會特異性地結(jié)合至非⑶52分子?？耿?2免疫球蛋白和⑶52之間的特異性結(jié)合可通過，例如，使用流式細(xì)胞術(shù)測定免疫球蛋白結(jié)合至CD52+細(xì)胞的EC5tl而確定。特異性結(jié)合可通過EC5tl范圍例如0. 5-10μ g/ml所表明。本文所敘述的免疫球蛋白可對所有或部分的人CD52具有結(jié)合特異性，其中人CD52是分離的和/或重組的人CD52，或是在表達(dá)人CD52的細(xì)胞表面上。此外，免疫球蛋白可對一種或多種形式的人CD52(例如，糖基化的人CD52 ；去糖基化的人CD52 ；非糖基化的人CD52 ；和等位基因變體(allelic variants)) 具有結(jié)合特異性。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白對自然生成的、內(nèi)源的或野生型的人CD52 具有結(jié)合特異性。野生型人CD52的氨基酸序列說明于圖4中(SEQ ID NO :104)。本文所述的免疫球蛋白可使用已知技術(shù)純化或分離?！凹兓被颉胺蛛x”的免疫球蛋白已與其來源(例如，細(xì)胞上層清液；在混合物中，例如在文庫的免疫球蛋白混合物中)的分子(例如，肽)分開，并且包含由本文所述方法或其它合適的方法所得到的免疫球蛋白。分離的免疫球蛋白包含大體上純的(基本上純的)免疫球蛋白，和通過化學(xué)合成、重組技術(shù)及其組合所制備的免疫球蛋白。更具體而言，本發(fā)明涉及抗人CD52免疫球蛋白、免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段(即，部分)、免疫球蛋白的輕鏈、免疫球蛋白的重鏈、和這些輕鏈或重鏈的片段。本發(fā)明還涉及成熟的免疫球蛋白或其鏈，例如糖基化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及未成熟的或前體免疫球蛋白(蛋白)。本發(fā)明還涉及編碼這些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，載體)，涉及包含此種核酸的載體及宿主細(xì)胞，涉及未成熟和成熟蛋白的制備方法，并且涉及免疫球蛋白的使用方法。本發(fā)明的免疫球蛋白可用于治療需要的受試者(例如，病人)，以根據(jù)需要消減受試者的淋巴細(xì)胞和其它CD52+細(xì)胞(例如，CD52+癌細(xì)胞)。本文所用的“淋巴細(xì)胞消減” 是一種通過減少循環(huán)的淋巴細(xì)胞群(例如，T細(xì)胞和/或B細(xì)胞)而造成淋巴細(xì)胞減少的免疫抑制類型。本發(fā)明的免疫球蛋白還可用于抑制血管生成，如下文進(jìn)一步所敘述。本發(fā)明的免疫球蛋白還可用于，例如，在先體外后體內(nèi)(ex vivo)應(yīng)用中使造血干細(xì)胞增加(參見,例如，Lim 等人，J Hematology & Oncology 1 :19(2008)) 自然產(chǎn)生的免疫球蛋白具有共同的核心結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)相同輕鏈(約MkD)和兩個(gè)相同重鏈(約55或70kD)形成一個(gè)四聚物。已知每一個(gè)鏈的氨基端部分是可變(V)區(qū)，并可以區(qū)分于各個(gè)鏈其余部分的更保守的恒定(C)區(qū)。在輕鏈的可變區(qū)(也稱為\域)內(nèi)是已知為J區(qū)的C端部分。在重鏈的可變區(qū)(也稱域)內(nèi)，除了 J區(qū)還有D區(qū)。免疫球蛋白中的大部分氨基酸序列變異限制在V區(qū)域中三個(gè)單獨(dú)的位置，其稱為高可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)，其直接涉及抗原結(jié)合。自氨基端開始，這些區(qū)域分別命名為⑶R1、⑶R2和⑶R3。這些CDRs由更保守的骨架區(qū)(FR)保持于所在處。自氨基端開始，這些區(qū)域分別命名為FR1、 FR2、FR3和FR4。CDR和FR區(qū)的位置以及編號系統(tǒng)已由Kabat等人(Kabat，Ε. Α.，等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U. S. Department of
40Health and Human Services,U. S. Government Printing Office(1991),Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol.，196,901-917(1987))，和 IMGT 編號系統(tǒng)(The International ImMunoGeneTics !information SsystemLefranc,M.-P. ,The Immunologist 7,132-136 (1999)定義?？蛇M(jìn)行視覺檢查和序列分析以鑒定⑶R邊界(boundaries)。對于本發(fā)明，⑶R序列通過使用 Kabat系統(tǒng)和IMGT系統(tǒng)而定義；也就是說，當(dāng)由該兩個(gè)系統(tǒng)定義的⑶Rs沒有完全重疊時(shí)，我們包括來自通過該兩個(gè)系統(tǒng)所定義的序列的所有殘基。依據(jù)重鏈的同種型，人類免疫球蛋白可分為類(classes)及亞類(subclasses)。類包括 IgG, IgM, IgA, IgD 和 IgE,其中重鏈分別為 gamma ( γ )、mu (μ )、alpha(a)、 delta( δ )或印silon( ε )型。亞類包括 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2，其中重鏈分別為Yl、Υ2, γ3, γ4, α 和α2型。選擇的類或亞類的人類免疫球蛋白分子可包含 kappa( κ )或 lambda( λ )輕鏈。參見例如 Cellular and Molecular Immunology, ffonsiewicz, Μ. J., Ed. , Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. , Philadelphia, PA 91991) ；Nisonoff, A. , Introduction to Molecular Immunology,2nd Ed. , Chapter 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc.，Sunderland, MA(1984)。本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白，，和“抗體”，其可互換使用，表示整體抗體和抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”——除非另外指出，否則這兩個(gè)術(shù)語在本文中可互換使用)。抗體的抗原結(jié)合片段可以是以，例如，單鏈抗體、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv 二聚體(PCT/US92/09665)、雙抗體、區(qū)域缺失抗體和單域抗體(dAbs)的形式。參見，例如，Nature Biotechnology 22(9) 1161-1165Q004)。包含VH和/或VL的抗原結(jié)合分子也在本發(fā)明之內(nèi)。在VH的情況下，該分子還可包含一個(gè)或多個(gè)CHl、鉸鏈(hinge)、CH2和CH3區(qū)。此種單鏈抗體也意在被包括在抗體的“抗原結(jié)合部分”該術(shù)語以內(nèi)?？贵w部分或片段可通過酶催化裂解或通過重組技術(shù)而制備。例如，可使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解以分別產(chǎn)生Fab或F(ab’)2片段。也可使用在天然終止部位的上游已引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的抗體基因?qū)⒖贵w制備為各種截短形式。例如，可將編碼 F(ab' )2片段的重鏈的重組構(gòu)建體設(shè)計(jì)為包含編碼重鏈的CH1域和鉸鏈區(qū)的DNA序列。優(yōu)選的抗原結(jié)合片段對野生型人CD52具有結(jié)合特異性。在另一方面，本發(fā)明提供一種本文所述的抗體或其部分的變體，其中該變體特異性地結(jié)合至人CD52，但以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸取代(例如，在CDR區(qū)、FR區(qū)、或恒定區(qū)中)而與參考抗體或其部分不同。例如，變體抗體在重鏈、重鏈可變區(qū)、輕鏈、或輕鏈可變區(qū)以至少90%、至少91%、至少93%、至少95%、至少97%或至少99%與參考抗體相同。多肽的序列相似性或一致性，其也稱為序列一致性，通常使用序列分析軟件來對其測定。蛋白分析軟件使用分配為各種取代、缺失和其它修飾(包括保守型氨基酸取代) 的相似性度量來匹配類似序列。舉例而言，GCG包含諸如“Gap”及“Bestfit”的程序，其可以以預(yù)設(shè)參數(shù)使用，以確定緊密相關(guān)的多肽(例如來自不同生物體種類的同源多肽)之間或是野生型蛋白與其突變蛋白之間的序列同源性或序列一致性。參見例如GCG 6.1版。也可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)利用預(yù)設(shè)或推薦參數(shù)來比較多肽序列。FASTA(例如，
41FASTA2和FASTA3)提供查詢序列與搜尋序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(alignment)和序列一致性百分比(Pearson，Methods Enzymo 1. 183 :63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol. Biol. 132 :185-219(2000)) 0當(dāng)將本發(fā)明的序列與包含大量來自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫比較時(shí)，另一種較佳的算法是計(jì)算機(jī)程序BLAST，特別是blastp或tblastn，其使用預(yù)設(shè)參數(shù)。參見例如 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990) ；Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389-402(1997)；本文中將其引入作為參考。根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)行的一種類型的氨基酸取代是將抗體中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸 (其可為化學(xué)反應(yīng)性的)變成另一種殘基(例如，但不限于丙氨酸或絲氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方式中，存在非經(jīng)典(non-canonical)半胱氨酸的取代。取代可在抗體的可變區(qū)中的⑶R 或骨架區(qū)中，或在抗體的恒定域中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，半胱氨酸為經(jīng)典的。可進(jìn)行的另一種類型的氨基酸取代是將抗體中的潛在蛋白分解部位移除。此種部位可出現(xiàn)于抗體的可變區(qū)中的CDR或骨架區(qū)中或出現(xiàn)于抗體的恒定區(qū)中。半胱氨酸殘基的取代和蛋白分解部位的移除會降低抗體產(chǎn)物中不均一性的風(fēng)險(xiǎn)，從而增加其均一性。另一種類型的氨基酸取代是通過改變殘基的一個(gè)或其二者而消除天門冬酰胺-甘氨酸對，其形成潛在的去酰胺化部位。在本發(fā)明的另一方面，可使用敘述于例如PCT公開W098/5^76和W000/34317中的技術(shù)將抗體去免疫化，以降低其免疫原性。可在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變型中進(jìn)行的另一種類型的氨基酸取代為保守型氨基酸取代?！氨Ｊ匦桶被崛〈笔且环N氨基酸殘基被具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性) 的側(cè)鏈R基的另一個(gè)氨基酸殘基所取代的取代。一般而言，保守型氨基酸取代大體上不會改變蛋白的功能性質(zhì)。在兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列因保守型取代而彼此不同的情況下，可向上調(diào)整序列一致性百分率或相似度，以修正取代的保守本質(zhì)。進(jìn)行此調(diào)整的方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所公知的。參見，例如 Pearson，Methods Mol. Biol. 243 :307-31 (1994)。具有類似化學(xué)性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸組的實(shí)例包括1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、和異亮氨酸；幻脂肪族-羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；幻含酰胺側(cè)鏈天門冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸力)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸、和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天門冬氨酸和谷氨酸；及7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守型氨基酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天門冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘撸Ｊ匦椭脫Q是在于kience 256 :1443-45(1992) (Gonnet等人)中所公開的PAM250對數(shù)似然矩陣(log-likelihood matrix)中具有正值的任何改變?！爸卸缺Ｊ匦汀敝脫Q是在PAM250對數(shù)似然矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分的氨基酸取代為以下那些(1) 降低對蛋白質(zhì)水解的敏感性，(2)減少對氧化反應(yīng)的敏感性，(3)改變對于形成蛋白復(fù)合物的結(jié)合親和性，例如，以增強(qiáng)抗體的ADCC和CDC活性，(4)賦予或修飾此種類似物的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)，但仍保留有對人CD52的特異性結(jié)合，(5)移除C端賴氨酸，以及(6)增加或移除糖基化部位。在一方面，本發(fā)明提供一種新型和新穎多肽，其是本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈，或者其是重鏈或輕鏈的含可變區(qū)的部分。此種多肽由于其可與相對(輕或重)抗體鏈配對以形成⑶52-結(jié)合分子而是有用的。
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人源化免疫球蛋白本文所述的是包含新穎的鼠抗人CD52抗體的CDRs的人源化免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白包含人源化輕鏈和人源化重鏈，其具有不同于抗CD52抗體的其它人源化類型(例如，Campath )的氨基酸序列的CDR氨基酸序列。本文所用的術(shù)語“人源化免疫球蛋白，，表示一種免疫球蛋白，其包含含有非人類來源的抗CD52抗體(此處也稱為供體抗體(例如，鼠的抗CD52抗體))的一個(gè)或多個(gè)輕鏈CDRs (CDR1、CDR2和CDR3)和一個(gè)或多個(gè)重鏈CDRs (CDR1、CDR2和CDR3)的鏈，以及至少一部分人類來源的免疫球蛋白(例如，來自人類來源的輕鏈和/或重鏈的骨架區(qū)，或骨架區(qū)與恒定區(qū)，例如具有或不具有骨架改變的CDR移植抗體)。本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包含至少一個(gè)⑶R，該⑶R不同于Campath 中存在的至少一個(gè)⑶R(例如，不同于相對應(yīng)的CDR)。參見，例如，Cabilly等人，美國專利第4，816，567號；Cabilly等人，歐洲專利第 0，125，023B1號；Boss等人，美國專利第4，816，397號；Boss等人，歐洲專利第0，120，694B1 號；Neuberger, M. S.等人，WO 86/01533 ；Neuberger, M. S.等人，歐洲專利第 0，194，276B1 號；Winter,美國專利第 5，225，539 號；Winter,歐洲專利第 0，239，400B1 號；Padlan, E.A.等人，歐洲專利申請第0，519，596 Al號。關(guān)于單鏈抗體，還可參見=Ladner等人，美國專利第 4，946，778 號；Huston，美國專利第 5，476，786 號；以及 Bird, R. Ε.等人，Science, 242 :423-4 (1988)。在一些實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白是一種去免疫化的抗體。參見，例如Carr等人，美國專利第7，264, 806號，其關(guān)于已被修飾以減少潛在T細(xì)胞表位的數(shù)量的去免疫化免疫球蛋白，由此減少免疫球蛋白在對人施用時(shí)引發(fā)免疫反應(yīng)的傾向。在特定的實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白包含一個(gè)或多個(gè)下列鼠單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈CDRs和一個(gè)或多個(gè)重鏈CDRs 小鼠8G3. 25. 3. 5、小鼠4G7. F3、小鼠9D9. A2、小鼠 11C11.C5、小鼠 3G7. E9、小鼠 5F7. 1. 1.4、小鼠 12G6. 15. 1.2、小鼠 23E6. 2. 2. 1、小鼠 2C3. 3. 8. 1、小鼠 7F11. 1. 9. 7、和小鼠 4B10. 1. 2. 4。在另一實(shí)施方式中，該人源化免疫球蛋白以相似于或者優(yōu)于Campath 的親和性結(jié)合至人CD52。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白具有本發(fā)明的鼠抗人CD52抗體的結(jié)合特異性(例如，具有對人CD52的特異性，具有相同或相似的表位特異性)，并且/或者其具有相同的抑制作用。人源化免疫球蛋白可具有本文所述的鼠抗人CD52 抗體或人源化抗人CD52抗體的結(jié)合特異性和/或抑制活性，以及/或本文所述的鼠抗人 CD52抗體或人源化抗人CD52抗體的表位特異性(例如，其可與鼠抗人CD52抗體競爭，或另一種人源化抗⑶52抗體(例如，Campath )競爭以結(jié)合至⑶52，且/或其可具有鼠或人源化抗人CD52抗體的抑制作用)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白具有鼠抗體8G3、4G7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11、和 4B10 中任一個(gè)的結(jié)合特異性、表位特異性和/或抑制活性。人類來源的人源化免疫球蛋白部分或免疫球蛋白鏈的部分(例如，骨架區(qū)；恒定區(qū))可從任何合適的人免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈獲得。例如，在人源化或嵌合抗體中的人類恒定區(qū)或其部分可從人類κ或λ輕鏈基因獲得，和/或從人類Y (例如，Yl、Y 2、 Υ3, Y 4), μ、α (例如，α 1、α2)、δ或ε重鏈基因獲得，包括等位基因變體。特定的恒定區(qū)(例如，IgGl)，其變體或其部分可被選擇以適合效應(yīng)功能(effector function) 0例如，突變的恒定區(qū)(變體)可被引入免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈中從而使得對Fc受體的結(jié)合和/或固定補(bǔ)體的能力最小化。(參見，例如，Winter等人，GB 2，209，757 B ；Morrison 等人，WO 89/07142 ;Morgan 等人，WO 94/29351, December 22，1994)。在一個(gè)實(shí)施方式中，人類骨架區(qū)在其結(jié)構(gòu)或序列中沒有變異或突變。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，骨架區(qū)為一種其序列中不具有突變或變異的生殖系骨架序列。本文所用的術(shù)語“生殖系”(germline)表示在抗體基因和基因片段經(jīng)由生殖細(xì)胞從母代傳至子代時(shí)抗體基因和基因片段的核苷酸序列和氨基酸序列。此生殖系序列與編碼成熟B細(xì)胞中抗體的核苷酸序列不同，成熟B細(xì)胞中抗體的核苷酸序列在B細(xì)胞成熟期間已被重組和超突變事件改變?！袄谩碧囟ㄉ诚档目贵w具有與該生殖系核苷酸序列或是與其指定的氨基酸序列最相配的核苷酸或氨基酸序列。與生殖系序列相比，此種抗體經(jīng)常是突變的。在其它實(shí)施方式中，人類骨架在其結(jié)構(gòu)或序列上具有來自生殖系序列的最少變異或突變(例如，少于3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)受體骨架殘基已被供體骨架殘基取代，以改善結(jié)合親和性，參見Queen等人，美國專利第5，530，101號)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白鏈的骨架中有限數(shù)量的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)氨基酸) 被選擇為與供體序列中這些位置的氨基酸相同(即，“回復(fù)突變”)，而不是與受體序列相同，以增加包含人源化免疫球蛋白鏈的抗體對人類CD52的親和力。人類骨架區(qū)(例如，重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的)優(yōu)選得自或衍生自與供體免疫球蛋白(鼠抗CD52抗體)的抗原結(jié)合區(qū)域的類似或相當(dāng)區(qū)域(例如，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))具有序列相似性的人類抗體可變區(qū)。人源化免疫球蛋白的人類來源部分的骨架區(qū)其它來源包括人類可變區(qū)一致性序列(參見例如，Kettleborough, C. A.等人，Protein Engineering 4:773-783(1991) ；Carter 等人 WO 94/04679 ；Carter 美國專利第 6，407，213 號))。例如，用于得到非人類部分的抗體供體序列的區(qū)域(例如，可變區(qū)的序列)可與人類序列相比較，如 Kabat, Ε. A.等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office (1991)中所述，以選擇人源化免疫球蛋白的人類部分的特定來源，例如，骨架區(qū)來源。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白鏈的骨架區(qū)得自，或衍生自與非人類供體的可變區(qū)具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約 75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %或至少約95 %的總序列一致性的人類Ig可變區(qū)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白鏈的骨架區(qū)得自或衍生自與非人類供體免疫球蛋白可變區(qū)的骨架區(qū)具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、或至少約95 %的總序列一致性的人類可變區(qū)骨架區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白的至少一個(gè)骨架區(qū)(FR)從人類來源抗體的一個(gè)或多個(gè)鏈獲得或由其衍生。于是，F(xiàn)R可包含由人類來源的一個(gè)或多個(gè)抗體(例如，由人類免疫球蛋白鏈，由人類一致性序列)獲得或衍生的FRl和/或FR2和/或FR3和/或 FR4。用于本發(fā)明的免疫球蛋白部分具有與它們的衍生來源免疫球蛋白或其變體相同或類似的序列。此種變體包含因一個(gè)或多個(gè)殘基的加入、缺失或取代(例如，保守型取代)而不同的突變體，例如，通過一個(gè)或多個(gè)加入、缺失或取代而與親本序列相差多至3、4、5、6、 7、8、9、或10個(gè)殘基。如上文所指出，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包含來自本文所述的一個(gè)或多個(gè)鼠抗CD52抗體(供體抗體)的一個(gè)或多個(gè)CDRs。可產(chǎn)生骨架區(qū)中的變化，例如用來自供體抗體相對應(yīng)位置的殘基來取代人類來源骨架區(qū)的殘基的那些變化?？僧a(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)突變，其包括骨架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入和取代。如果需要，可使用任何合適的方法(例如在WO 98/06248中所述，其整個(gè)教導(dǎo)并入本文做為參考)使人源化抗體或鏈中包含骨架突變，以及選擇突變部位。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，在一些情況下，鼠抗⑶52抗體的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs側(cè)面相接的殘基可能起作用，在一些情況下，可能直接或間接地為功能(例如，結(jié)合)所需要。因此，在一些實(shí)施方式中，與鼠骨架的一個(gè)或多個(gè)CDRs側(cè)面相接的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)側(cè)翼氨基酸)也包含于人源化免疫球蛋白中。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的人類重鏈骨架區(qū)利用人類VH3-72或 VH3-23生殖系序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的人類輕鏈骨架區(qū)利用人類 Vk2-A18b生殖系序列?？稍谶@些FR區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)殘基處選擇性地作出回復(fù)突變，如在下文工作實(shí)施例中所述，以改善人源化抗體的CD52結(jié)合親和性。“親和性”是一種專業(yè)術(shù)語，其描述結(jié)合相互作用的強(qiáng)度，并且通常是指免疫球蛋白對人類⑶52的結(jié)合整體強(qiáng)度。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有測得EC5tl值為小于10 μ g/ml (例如，通過流式細(xì)胞術(shù)所確定)的結(jié)合活性。在另一實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有測得EC5tl值小于 5. 0 μ g/ml，或小于1. 0 μ g/ml (例如，通過流式細(xì)胞術(shù)所確定)的結(jié)合活性。在一些實(shí)施方式中，免疫球蛋白以300nM至IpM (即，3x 10_7至Ix I(T12M)，優(yōu)選為50nM至IpM,更優(yōu)選為5nM至IpM且最優(yōu)選為InM至IpM的親和性(Kd ；Kd = Koff (kd)/ Kon(ka))結(jié)合至人CD52，例如，Ix 10_7M或更小、優(yōu)選為Ix 或更小、更優(yōu)選為Ix 1(Γ9Μ 或更小、有利地是Ix IO^ioM或更小且最優(yōu)選為Ix IO-11M或Ix IO^12M或更小的Kd ；和/或 5x KT1s-1 至 Ix ΙΟ、-1、優(yōu)選為 Ix KT2s-1 至 Ix IO-fV1、更優(yōu)選為 5χ ΙΟΥ1 至 Ix ΙΟΥ1 的 K。ff速率常數(shù)，例如切ΙΟ、—1或更小、優(yōu)選為Ix ΙΟ、—1或更小、有利地是Ix ΙΟ、-1或更小、更優(yōu)選為Ix ιοΛτ1或更小、更優(yōu)選為Ix KT5iT1或更小，且最優(yōu)選為Ix KTfV1或更小，如通過表面等離子共振(surface ρlasmon resonance)所確定。顯然對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，可使用各種方法以確定根據(jù)本文所提供的和本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法所制備的免疫球蛋白具有必要的特異性(例如，結(jié)合特異性，表位特異性)。例如，對人CD52具有結(jié)合特異性的本發(fā)明的人源化抗CD52免疫球蛋白的結(jié)合功能可使用任何合適的方法檢測，例如，監(jiān)測人源化免疫球蛋白與人類CD52之間復(fù)合物的形成 (例如，包含人類CD52的膜部分；攜帶人類CD52的細(xì)胞，例如人類T細(xì)胞、人類B細(xì)胞；包含并表達(dá)編碼人類CD52的核酸的CHO細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞；具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽)；包含人類CD52的實(shí)體支撐(support))的檢定。本發(fā)明的免疫球蛋白(例如，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白)結(jié)合至與特定的鼠、嵌合或人源化單克隆抗體所結(jié)合的人CD52上的表位相同的表位，或是結(jié)合至與特定的鼠、嵌合、或人源化單克隆抗體所結(jié)合的人類CD52上的表位重疊的人類CD52上表位的能力，可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的各種技術(shù)(包括，例如競爭性結(jié)合檢定)而容易地確定。這些可能涉及使用該特定抗體的標(biāo)記形式的使用，以及在本發(fā)明的免疫球蛋白存在和不存在的情況下對標(biāo)記的抗體對于人CD52的結(jié)合的檢測。本文所用的“表位”包含能夠特異性結(jié)合至免疫球蛋白的任何蛋白決定基。表位決定基一般由分子例如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面基(groupings)組成，并且一般具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。表位可以是“線性的”或“構(gòu)象性的”。在線性表位中，在蛋白和相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用點(diǎn)沿蛋白的一級氨基酸序列線性地出現(xiàn)。在構(gòu)象表位中，相互作用點(diǎn)跨越蛋白上彼此分開的氨基酸殘基而出現(xiàn)。一旦確定了抗原上的期望表位，例如使用本發(fā)明所描述的技術(shù)，可以產(chǎn)生針對該表位的抗體?；蛘撸诎l(fā)現(xiàn)過程中，抗體的產(chǎn)生和特征化可說明關(guān)于期望表位的信息。由此信息，可以接著競爭性地篩選結(jié)合至相同表位的抗體。達(dá)到此目的的一個(gè)方法是，進(jìn)行競爭性研究以發(fā)現(xiàn)彼此競爭性結(jié)合的抗體，即，競爭結(jié)合至抗原的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，為確定測試抗體是否結(jié)合至本發(fā)明人源化抗體的相同或重疊表位，我們使得本發(fā)明的抗⑶52抗體在飽和條件下結(jié)合至⑶52，接著測定測試抗體結(jié)合至 CD52的能力。如果測試抗體能夠與參考抗CD52抗體在同時(shí)間結(jié)合至CD52，則測試抗體相對于參考抗CD52抗體結(jié)合至不同的表位。然而，如果測試抗體不能在同時(shí)間結(jié)合至CD52，則測試抗體結(jié)合至相同表位、重疊表位、或是緊鄰由本發(fā)明抗CD52抗體所結(jié)合的表位的表位。此實(shí)驗(yàn)可使用ELISA、RIA、BIACORE 、或流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行。為測試抗⑶52抗體是否與其它抗CD52抗體交叉競爭，我們可在兩個(gè)方向使用上文所述的競爭方法，即，確定參考抗體是否阻礙測試抗體，以及反之。在某個(gè)實(shí)施方式中，實(shí)驗(yàn)使用BIAC0RE 進(jìn)行。表位分級(印itope binning)也可用于特征化本發(fā)明的抗體。術(shù)語“分級”是指基于抗體的抗原結(jié)合特征以將抗體分組的方法。一種基于其交叉競爭而“分級”抗體的高通量方法在國際專利申請第WO 03/48731號中描述?？梢酝ㄟ^允許未標(biāo)記形式的抗CD52 抗體“A”結(jié)合至對應(yīng)于CD52序列的合成肽或CD52陽性細(xì)胞而對“表位分級”進(jìn)行調(diào)查研究。接著加入標(biāo)記的第二抗CD52抗體“B”，我們可評價(jià)相對于其中細(xì)胞或合成肽未預(yù)先暴露于抗⑶52抗體“A”的對照樣品的標(biāo)記抗體量?；蛘?，抗⑶52抗體“A”和“B”均可標(biāo)記有不同的熒光染料或能夠檢測的化學(xué)劑，我們可使用能夠檢測標(biāo)記的設(shè)備來測定能夠同時(shí)吸引CD52肽的兩種標(biāo)記抗體的量，或通過流式細(xì)胞術(shù)測定同時(shí)吸引CD52陽性細(xì)胞的兩種抗體的量。Biacore和Octet技術(shù)使我們可以研究未標(biāo)記形式抗體的競爭性結(jié)合。未標(biāo)記抗體的這種利用是希望的，因?yàn)槟承┛贵w的化學(xué)修飾可折中結(jié)合活性。還可參見，Jia等人， J Immunol Methods 288 91-98(2004)中所描述的技術(shù)，其在進(jìn)行抗體分級中也有用。本文還提供人源化免疫球蛋白的部分，例如輕鏈、重鏈以及輕和重鏈的部分。這些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通過還原和/或裂解)，或由編碼具有期望性質(zhì)(例如，結(jié)合人類CD52，序列相似性)的免疫球蛋白或其鏈的部分的核酸來制備或表達(dá)。它們可由，例如，相關(guān)部分的重新合成而制備。包含人類和非人類來源的期望部分 (例如，抗原結(jié)合區(qū)、CDR、FR、C區(qū))的人源化免疫球蛋白可使用合成和/或重組核酸來制備，以制得編碼期望的人源化鏈的構(gòu)建體(例如，cDNA)。例如，為制備一部分免疫球蛋白 (例如，一部分鏈)，可在期望的位置引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子。為人源化可變區(qū)編碼的核酸(例如，DNA)序列可使用PCR突變誘發(fā)方法來構(gòu)建，以改變現(xiàn)有的DNA序列(參見例如，Kamman, M.，等人，Nucl. Acids Res. 17 :5404 (1989))。為新 CDRs 編碼的 PCR 引物可雜
46交至先前人源化可變區(qū)的DNA模板，其基于相同的或非常相似的人類可變區(qū)(Sato，K.，等人，Cancer Research 53:851-856(1993))。如果沒有相似的DNA序列用做模板，可由合成的寡核苷酸來構(gòu)建包含編碼可變區(qū)序列的序列的核酸(參見例如，Kolbinger, F.，Protein Engineering 8 :971-980 (1993))。編碼信號肽的序列也可引入核酸(例如，在合成時(shí)，在插入載體時(shí))。如果沒有信號肽序列(例如，通常而言不存在)，可使用來自其它抗體的信號肽序列(參見例如，Kettleborough, C. A.，Protein Engineering 4 :773-783 (1991))。使用這些方法、本文所述的方法或其它合適方法，變體可容易地被制造。本發(fā)明涉及一種人源化免疫球蛋白，其對人類CD52具有結(jié)合特異性，且包含人源化輕鏈和人源化重鏈和/或其部分。在一個(gè)實(shí)施例中，人源化免疫球蛋白包含一種含有 SEQ ID NO 3的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 16 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO 4的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 17的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO :5的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 18的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO 6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 19的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs(例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO :7的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO :20的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO :8的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO :21的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO :9的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO: 22的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO 10的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 23的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO 11的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè) ⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO : 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈；一種含有SEQ ID NO 12的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO :25的一個(gè)或多個(gè)CDRs (例如，所有三個(gè)CDRs)的重鏈；或一種含有SEQ ID N0:13的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的輕鏈和一種含有SEQ ID NO 26的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)的重鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包含重鏈(H)-OTRl、H-raR2、 H-CDR3，輕鏈(L)-CDRl、L-CDR2、和 L-CDR3，其氨基酸序列:a)分別是 SEQ ID NOs :51、59、 69、29、36、和 43 ；b)分別是 SEQ ID NOs :50、60、69、29、37、和 43 ；c)分別是SEQ ID NOs :50、 61、68、29、38、和 43 ；d)分別是 SEQ ID NOs :50、61、69、29、36、和 43 ；e)分別是 SEQ ID NOs 50、62、69、四、39、和 43 ;f)分別是 SEQ ID NOs :52、61、70、30、40、和 43 ;g)分別是 SEQ ID NOs :53、63、71、31、36、和 44 ;h)分別是 SEQ ID NOs :54、64、71、31、36、和 45 ;i)分別是 SEQ ID NOs :55、63、72、31、36、和 46 ； j)分別是 SEQ ID NOs :56、65、73、32、41、和 47 ；k)分別是 SEQ ID NOs :56、65、294、32、41、和 47，或 1)分別是 SEQ ID NOs :56、66、74、33、41、和 48。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白包含H-⑶R3和L-⑶R3，其序列a) 分別是 SEQ ID NOs 69 和 43 ；b)分別是 SEQ ID NOs 68 和 43 ；c)分別是 SEQ ID NOs 70 和 43 ；d)分別是 SEQ ID NOs 71 和 44 ；e)分別是 SEQ ID NOs 71 和 45 ；f)分別是 SEQ IDNOs 72 和 46 ；g)分別是 SEQ ID NOs 73 和 47 ；h)分別是 SEQ ID NOs :294 和 47 ；或 i)分別是 SEQ ID NOs 74 和 48。在另一實(shí)施方式中，人源化免疫球蛋白對人類CD52具有結(jié)合特異性，且包含一種輕鏈，該輕鏈包含選自 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、 SEQ ID NO 37,SEQ ID NO38、SEQ ID NO 39,SEQ ID NO 40、SEQ ID N0:41、SEQ ID NO: 42,SEQ ID NO 43,SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID N0:47、和SEQ ID NO :48、或其組合的一個(gè)或多個(gè)CDRs ；和一種重鏈，其包含選自SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、 SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 70, SEQ ID N0:71、SEQ ID NO 72, SEQ ID N0: 73、SEQ ID NO :74 JPSEQ ID NO :294、或其組合的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化免疫球蛋白不是Campath⑧。在另一實(shí)施例中，對人類CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白包含一種輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO 3,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :12 或 SEQ ID NO :13 的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)，和一種重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO 16, SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID N0:26、或 SEQ ID NO :137 的一個(gè)或多個(gè) ⑶Rs (例如，所有三個(gè)⑶Rs)，其中該人源化免疫球蛋白不是Campath ^本發(fā)明還涉及一種本文所述的人源化免疫球蛋白的人源化免疫球蛋白輕鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，該人源化免疫球蛋白輕鏈包含選自SEQ ID NO 27,SEQ ID NO 28、SEQ ID N0: 29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、 SEQ ID NO :47 JPSEQ ID NO :48、和其組合的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化免疫球蛋白輕鏈不是Campath⑧的輕鏈。例如，該人源化抗體具有L-⑶Rl、L-⑶R2、和L-⑶R3，其氨基酸序列:a)分別為SEQ ID NOs :四、36、和43 ；b)分別為SEQ ID NOs』9、37、和43 ；c)分別為 SEQ ID NOs 29、38、禾口 43 ；d)分別為 SEQ ID NOs 29、36、禾口 43 ；e)分別為 SEQ ID NOs 29、39、禾口 43 ；f)分別為 SEQ ID NOs :30、40、禾口 43 ；g)分別為 SEQ ID NOs :31、36、禾口 44 ；h) 分別為 SEQ ID NOs :31、36、禾口 45 ；i)分別為 SEQ ID NOs :31、36、禾口 46 ； j)分別為 SEQ ID NOs :32、41、禾口 47 ；或 k)分別為 SEQ ID NOs :33、41、禾口 48。本發(fā)明還涉及一種人源化重鏈，其包含選自SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、 SEQ ID NO63,SEQ ID NO64、SEQ ID NO 65,SEQ ID NO66,SEQ ID NO67,SEQ ID N0: 68、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :72、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :74、和SEQ ID NO J94、或其組合的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs，其中該人源化免疫球蛋白重鏈不是Campath⑧的重鏈。例如，該人源化抗體具有H-⑶R1、H_⑶R2、和H-⑶R3，其氨基酸序列 a)分別為 SEQ ID NOs :51、59、和 69 ；b)分別為 SEQ ID NOs 50、60、和 69 ；c)分別為 SEQ ID NOs :50、61、和 68 ；d)分別為 SEQ ID NOs :50、61、和 69 ；e)分別為 SEQ ID NOs :50、62、禾口 69 ；f)分別為 SEQ ID NOs :52、61、和 70 ；g)分別為 SEQ ID NOs :53、63、和 71 ；h)分別為 SEQ ID NOs :54、64、和 71 ；i)分別為 SEQ ID NOs :55、63、和 72 ； j)分別為 SEQ ID NOs :56、 65、和 73 ；k)分別為 SEQ ID NOs :56、65、和 294 ；或 1)分別為 SEQ ID NOs :56、66、和 74。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體包含一種輕鏈，其包含SEQ ID NOs :102、 138、145-148、153-157、和164-168其中一個(gè)的可變區(qū)(Vj序列。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，該人源化抗體包含一種輕鏈，其氨基酸序列包含SEQ ID NOs :273、275、278、觀0、和282其中之一或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體包含一種重鏈，其包含SEQ ID NOs :103、 136、137、139-144、149-152、和158-163其中一個(gè)的可變區(qū)(Vh)序列。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方式中，該人源化抗體包含一種重鏈，其氨基酸序列包含SEQ ID NOs :272、274、276、277、279、和281其中一個(gè)或由其組成。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體包含V1^PVy其氨基酸序列包含或由下列組成a)分別為 SEQ ID NOs :103 與 102 (4B10-H1/K1)；b)分別為 SEQ ID NOs :136 與 138 (7F11-SFD1/K2)；c)分別為 SEQ ID NOs :137 與 138 (7F11-SFD2/K2)；d)分別為 SEQ ID NO :139 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 139 與 146(2C3-SFD1/K11)；和分別為 SEQ ID NOs :139 與 147 (2C3-SFD1/K12))；e)分別為 SEQ ID NO :140 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)；f)分別為 SEQ ID NO :141 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)；g)分別為 SEQ ID NO :142 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)；h)分別為 SEQ ID NO :143 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)；i)分別為 SEQ ID NO :144 與 SEQ ID NOs :145-148 其中一個(gè)；j)分別為 SEQ ID NO :149 與 SEQ ID NOs :153-157 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 149 與 155(12G6-SFD1/K11)；分別為 SEQ ID NOs :149 與 156 (12G6-SFD1/K12)；禾口分別為 SEQ ID NOs 149 與 157 (12G6-SFD1/K13))；k)分別為 SEQ ID NO :150 與 SEQ ID NOs :153-157 其中一個(gè)；1)分別為 SEQ ID NO :151 與 SEQ ID NOs :153-157 其中一個(gè)；m)分別為 SEQ ID NO :152 與 SEQ ID NOs :153-157 其中一個(gè)；η)分別為 SEQ ID NO :158 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 158 與 165(9D9-H10/K12)；和分別為 SEQ ID NOs :158 與 166 (9D9-H10/K13))；ο)分別為 SEQ ID NO :159 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 159 與 165(9D9-H11/K12)；和分別為 SEQ ID NOs :159 與 166 (9D9-H11/K13))；ρ)分別為 SEQ ID NO :160 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)；q)分別為 SEQ ID NO :161 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 161 與 166(9D9-H16/K13))；
r)分別為 SEQ ID NO :162 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)；或s)分別為 SEQ ID NO :163 與 SEQ ID NOs :164-168 其中一個(gè)(例如，分別為 SEQ ID NOs 163 與 166 (9D9-H18/K13))。包含于括號的抗體在下列工作實(shí)施例中進(jìn)一步敘述。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體包含輕鏈(LC)和重鏈(HC)，其氨基酸序列包含或由下列組成a)分別為SEQ ID NOs :273和272 ；b)分別為SEQ ID NOs :275和274 ； c)分別為 SEQ ID NOs 278 和 276 ；d)分別為 SEQ ID NOs :278 和 277 ；e)分別為 SEQ ID NOs 280 和 279 ；或 f)分別為 SEQ ID NOs :282 ^P 281 本發(fā)明還提供一種抗人⑶52抗體(除了在現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些(如果有))，其結(jié)合至與本文舉例說明的抗體所結(jié)合的表位相同的表位，或與其競爭或交叉競爭。這些抗體可以是，例如，人源化的、嵌合的、或鼠抗體。例如，本發(fā)明提供一種抗人CD52抗體，其結(jié)合至與鼠抗體 8G3、4F7、9D9、11C11、3G7、5F7、12G6、23E6、2C3、7F11 和 4B10 以及這些鼠抗體的人源化和嵌合抗體的其中一個(gè)所結(jié)合的表位相同的表位，或與其中一個(gè)抗體競爭或交叉競爭。抗體結(jié)合至與參考抗體所結(jié)合的表位相同的表位的能力或與其競爭或交叉競爭的能力可如上文所述而確定。例如，我們發(fā)現(xiàn)由人源化抗體2C3-SFD1/K12和12G6-SFD1/K12所結(jié)合的CD52表位包含SEQ ID NO :104中的殘基7、8、和11，且由人源化抗體9D9-H16/K13 所結(jié)合的表位包含SEQ ID NO :104中的殘基4和11。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種抗CD52抗體，其結(jié)合至與那些人源化抗體所結(jié)合的表位相同的表位，或與其競爭或交叉競爭。如果希望，例如，為診斷或檢測目的(例如，成像以允許，比如治療監(jiān)測)，人源化免疫球蛋白(例如，其抗原結(jié)合片段)可包含可檢測的標(biāo)記。合適的可檢測標(biāo)記和人源化免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段的標(biāo)記方法為本領(lǐng)域所已知。合適的可檢測標(biāo)記包括，例如，放射性同位素(例如，銦-111、锝-99m或碘-131)、正電子發(fā)射型標(biāo)記(例如，氟-19)、順磁離子(例如，釓(III)、錳(II))、表位標(biāo)記(標(biāo)簽)、親和性標(biāo)記(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋標(biāo)記、酶、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。當(dāng)未使用標(biāo)記時(shí)，復(fù)合物形成(例如，在人源化免疫球蛋白和人類⑶52之間)可通過表面等離子共振、ELISA、FACS、或其它合適方法來確定。用于本發(fā)明的抗⑶52抗體也可經(jīng)由例如，化學(xué)反應(yīng)或基因修飾而共軛至其它部分(moieties)(例如，聚乙二醇化部分)，上述部分改善抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特性，例如半衰期。在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的抗CD52抗體可經(jīng)由例如，化學(xué)共軛或基因修飾(例如，將框內(nèi)細(xì)胞因子的編碼序列附加至抗體編碼序列，由此產(chǎn)生抗體細(xì)胞因子融合蛋白) 而連接至合適的細(xì)胞因子。本發(fā)明還涉及一種免疫偶聯(lián)，其中本發(fā)明的人源化免疫球蛋白(例如，其抗原結(jié)合片段)偶合至另一治療劑，例如生物活性化合物(例如，細(xì)胞因子、超抗原、細(xì)胞毒性劑和毒素)。例如，對人類CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白(例如，其抗原結(jié)合片段) 可偶合至生物蛋白，植物或細(xì)菌來源的分子(或其衍生物)、白介素-2抗體或白喉毒素抗體。小鼠單克隆免疫球蛋白如本文所述，已制造出對人類CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆免疫球蛋白。本發(fā)明的人源化和嵌合抗體可衍生自本發(fā)明的小鼠單克隆抗體。也就是說，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化和嵌合抗CD52抗體包含取自本發(fā)明小鼠單克隆抗體的序列，例如一個(gè)或多個(gè)CDR序列。本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白包含具有與已知的鼠抗CD52單克隆抗體的CDR氨基酸序列(例如，與CF1D12)不同的CDR氨基酸序列的輕鏈和重鏈。本文所用的術(shù)語“小鼠單克隆免疫球蛋白”表示一種包含鼠抗人CD52抗體的輕鏈 CDRs (L-CDR1、L-CDR2 和 L-CDR； )和重鏈 CDRs (H-CDR1、H_CDR2 和 H-CDR3)以及鼠來源的骨架區(qū)和恒定區(qū)的免疫球蛋白。小鼠單克隆免疫球蛋白是一種例如通過使用雜交瘤技術(shù)或重組方法所制備的單一特異性的均質(zhì)性(homogeneous)抗體。本發(fā)明涉及一種本文所述的小鼠單克隆免疫球蛋白，其包含小鼠單克隆免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段(即，部分)、小鼠單克隆免疫球蛋白的輕鏈、小鼠單克隆免疫球蛋白的重鏈、以及這些重鏈和輕鏈的片段。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，小鼠單克隆抗體是鼠 8G3. 25. 3. 5 (也稱為 GENZ 8G3. 25. 3. 5 或 8G3)、鼠 GMA 4G7. F3 (也稱為 4G7. F3 或 4G7)、鼠 GMA 9D9. A2 (也稱為 9D9. A2 或 9D9)、鼠 GMA 11C11. C5 (也稱為 11C11. C5 或 11C11)、鼠 GMA3G7. E9 (也稱為 3G7. E9 或 3G7)、鼠 5F7. 1.1.4(也稱為 GENZ 5F7. 1. 1. 4 或 5F7)、鼠 12G6. 15. 1. 2 (也稱為 GENZ 12G6. 15. 1. 2 或 2G6)、鼠 23E6. 2. 2. 1 (也稱為 GENZ 23E6. 2. 2. 1 或 23E6)、鼠 2C3. 3. 8. 1(也稱為 GENZ 2C3. 3. 8. 1 或 2C3)、鼠 7F11. 1. 9. 7 (也稱為 GENZ 7F11. 1.9. 7 或 7F11)、或是鼠 4B10. 1. 2. 4 (也稱為 GENZ 4B10. 1.2. 4 或 4B10)。本發(fā)明涉及一種成熟小鼠單克隆免疫球蛋白，例如經(jīng)過處理以移除重鏈和輕鏈信號肽之后的小鼠單克隆免疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種未成熟或前體蛋白，例如包含信號肽的小鼠免疫球蛋白輕鏈或小鼠免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明還涉及一種編碼這些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，載體)，涉及包含此種核酸的宿主細(xì)胞，并涉及這些未成熟和成熟蛋白的制造方法。對人類CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆免疫球蛋白的結(jié)合功能可使用任何合適方法檢測，例如，使用監(jiān)測小鼠單克隆免疫球蛋白與人類CD52 (例如，包含人類CD52的膜部分，或攜帶人類CD52的細(xì)胞，例如人類T細(xì)胞、人類B細(xì)胞、包含編碼人類CD52的核酸的 CHO細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞；具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽))之間復(fù)合物形成的檢定。本文還提供鼠免疫球蛋白的部分，其包含輕鏈、重鏈以及輕鏈和重鏈的部分。這些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通過還原和/或裂解)，或者編碼具有期望性質(zhì)(例如，結(jié)合人類CD52，序列相似性)的一部分免疫球蛋白或其鏈的核酸可被制備或表達(dá)。它們可通過，例如相關(guān)部分的重新合成所制備。包含鼠來源的期望部分(例如，抗原結(jié)合區(qū)域、CDR、FRjP /或C區(qū))的小鼠單克隆免疫球蛋白可使用合成和/或重組的核酸來制備，以制得編碼期望的單克隆免疫球蛋白鏈的構(gòu)建體(例如，cDNA)。為制備一部分鏈，可在期望位置引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子。也可將編碼信號肽的序列引入核酸(例如，在合成時(shí)，在插入載體中時(shí))。如果沒有天然信號肽序列，可使用來自其它抗體的信號肽序列(參見例如，Kettleborough, C. A.，Protein Engineering 4 :773-783 (1991))。使用這些方法、本文所述的方法或其它合適方法，可以很容易地制備出變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的小鼠單克隆免疫球蛋白包含含有SEQ ID NO 3的輕鏈和含有SEQ ID NO 16的重鏈；含有SEQ ID NO 4的輕鏈和含有SEQ ID NO 17的重鏈；含有SEQ ID NO 5的輕鏈和含有SEQ ID NO 18的重鏈；含有SEQ ID NO 6的輕鏈和含有 SEQ ID NO 19的重鏈；含有SEQ ID NO :7的輕鏈和含有SEQ ID NO :20的重鏈；含有SEQ ID NO 8的輕鏈和含有SEQ ID NO 21的重鏈；含有SEQ ID NO 9的輕鏈和含有SEQ ID NO 22 的重鏈；含有SEQ ID NO 10的輕鏈和含有SEQ ID NO 23的重鏈；含有SEQ ID NO 11的輕鏈和含有SEQ ID NO 24的重鏈；含有SEQ ID NO 12的輕鏈和含有SEQ ID NO 25的重鏈；或含有SEQ ID NO 13的輕鏈和含有SEQ ID NO 26的重鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及一種對人類CD52具有結(jié)合特異性的小鼠單克隆抗體，其包含選自 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、和 SEQ ID NO 13 的輕鏈可變區(qū)；以及選自 SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、和SEQ ID NO :26的重鏈可變區(qū)。如果希望，例如，為診斷或檢定目的(例如，成像)，小鼠單克隆免疫球蛋白(例如，其抗原結(jié)合片段)可包含可檢測標(biāo)記。合適的可檢測標(biāo)記和小鼠單克隆免疫球蛋白的標(biāo)記方法是本領(lǐng)域內(nèi)所已知的。合適的可檢測標(biāo)記包括，例如，放射性同位素(例如，銦-111、锝-99m或碘-131)、正電子放射型標(biāo)記(例如，氟_19)、順磁離子(例如，釓(III)、錳(II))、表位標(biāo)記(標(biāo)簽)、親和性標(biāo)記(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋標(biāo)記、酶、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。當(dāng)未使用標(biāo)記時(shí)，復(fù)合物形成(例如，在小鼠單克隆免疫球蛋白和 CD52之間)可通過表面等離子共振或其它合適的方法來確定。上述針對本發(fā)明的人源化抗體的所有合適方法和技術(shù)也可在本文中使用。嵌合免疫球蛋白如本文所敘述，已制造對人類CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白。該嵌合免疫球蛋白包含嵌合輕鏈和/或嵌合重鏈，其氨基酸序列不同于對人類CD52具有結(jié)合特異性的已知嵌合抗體的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語“嵌合免疫球蛋白，，是指一種重組蛋白，其包含含有衍生自一種物種的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)，該抗體優(yōu)選為鼠抗人CD52單克隆抗體，而抗體分子的恒定區(qū)衍生自不同物種的抗體，例如來自人類抗體。本發(fā)明涉及本文所述的嵌合免疫球蛋白，其包含嵌合免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段 (即，部分)、嵌合免疫球蛋白的嵌合輕鏈和嵌合重鏈以及這些嵌合輕鏈和重鏈的片段。本發(fā)明涉及一種成熟嵌合免疫球蛋白，例如經(jīng)過處理以移除重鏈和輕鏈信號肽之后的嵌合免疫球蛋白和/或涉及糖基化免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及一種未成熟或前體蛋白質(zhì)，例如包含信號肽的嵌合重鏈。本發(fā)明還涉及編碼這些未成熟或成熟蛋白的核酸分子(例如，載體)，涉及包含此種核酸的宿主細(xì)胞，并且涉及這些未成熟及成熟蛋白的制備方法。對人類CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白的結(jié)合功能可使用任何合適方法檢測，例如使用監(jiān)測嵌合免疫球蛋白與人類CD52 (例如，包含人類CD52的膜部分，或在攜帶人類CD52的細(xì)胞上，例如人類T細(xì)胞、人類B細(xì)胞、包含編碼人類CD52的核酸的CHO細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞、具有CD52氨基酸序列的肽(例如，合成肽))之間復(fù)合物形成的檢定。本文還提供嵌合免疫球蛋白的部分，其包含輕鏈、重鏈以及輕鏈和重鏈的部分。這些免疫球蛋白部分可得自或衍生自免疫球蛋白(例如，通過還原和/或裂解)，或者編碼具有期望性質(zhì)(例如，結(jié)合人類CD52，序列相似性)的一部分免疫球蛋白或其鏈的核酸可被制造或表達(dá)。它們可通過例如一部分的重新合成所制備。包含人類及非人類來源的期望部分 (例如，抗原結(jié)合區(qū)、CDR、FRjn /或C區(qū))的嵌合免疫球蛋白可使用合成和/或重組核酸來制備，以制得編碼期望的嵌合鏈的構(gòu)建體(例如，cDNA)。為制備一部分鏈，可在期望位置引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子。也可將編碼信號肽的序列引入核酸(例如，在合成時(shí)，在插入載體中時(shí))。如果沒有天然信號肽序列(例如，通常不存在)，可使用來自其它抗體的信號肽序列(參見例如，Kettleborough, C. A.，Protein Engineering 4 :773-783 (1991))。使用這些方法、本文所述的方法或其它合適方法，可以容易地制造出變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白包含SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 4的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)； SEQ ID NO :5的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO :6的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)； SEQ ID NO 8的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)和 SEQ ID N0:22的重鏈可變區(qū)；SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:23的重鏈可變區(qū)； SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO M的重鏈可變區(qū)；SEQ ID N0:12的輕鏈可變區(qū)禾口 SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)；或是SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種對人類CD52具有結(jié)合特異性的嵌合抗體，其包含選自以下部分的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO :4的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO: 5的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO :6的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 7的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO :8的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 9的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 10的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 12的輕鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 13的輕鏈可變區(qū)，以及選自以下部分的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 16的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 17的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 18的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 19的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 20的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 22的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 23的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 24的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO 26的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種嵌合輕鏈，其包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID N0:12、或 SEQ ID N0:13 的可變區(qū)。本發(fā)明還涉及一種嵌合重鏈，其包含SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25 或 SEQ ID NO 26 的可變區(qū)。如果希望，例如，為診斷或檢定目的(例如，成像)，嵌合免疫球蛋白(例如，其抗原結(jié)合片段)可包含可檢測的標(biāo)記。合適的可檢測標(biāo)記和嵌合免疫球蛋白的標(biāo)記方法是本領(lǐng)域內(nèi)所已知的。合適的可檢測標(biāo)記包含，例如，放射性同位素(例如，銦-111、锝-99m或碘-131)、正電子放射型標(biāo)記(例如，氟-19)、順磁離子(例如，釓(III)、錳(II))、表位標(biāo)記(標(biāo)簽)、親和性標(biāo)記(例如，生物素、抗生物素蛋白)、自旋標(biāo)記、酶、熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。當(dāng)未使用標(biāo)記時(shí)，復(fù)合物形成(例如，在嵌合免疫球蛋白和人類CD52之間)可通過表面等離子共振或其它合適的方法而確定。上文針對本發(fā)明的人源化抗體所敘述的所有合適方法和技術(shù)可在本文中使用。核酸和重組載體本發(fā)明還涉及一種分離的和/或重組的(包含，例如，基本上純的)核酸，其包含編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、人源化輕鏈、人源化重鏈、小鼠單克隆免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白輕鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈、嵌合免疫球蛋白、嵌合輕鏈或嵌合重鏈的序列。本文稱為“分離”或“純化”的核酸是已從其起源的基因組DNA或細(xì)胞RNA的核酸(例如，在它們存在于細(xì)胞中或存在于例如文庫的核酸混合物中時(shí))分離的核酸，并且包含通過本文所述的方法或其它合適方法所得到的核酸，包括大體上純的核酸，通過化學(xué)合成、通過生物和化學(xué)方法的組合所制備的核酸，和分離的重組核酸(參見例如，Daugherty, B. L.等人，Nucleic Acids Res. , 19(9) :2471-2476(1991) ；Lewis, Α. P. and J. S. Crowe, Gene,101 :297-302(1991))。本文稱為“重組”的核酸是通過重組DNA方法所制備的核酸，其包含通過依賴于人工重組方法的步驟而產(chǎn)生的那些核酸(例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和/或使用限制性酶克隆至載體中)?！爸亟M”核酸也為那些產(chǎn)生于在細(xì)胞自然機(jī)制過程中發(fā)生的重組事件，但在將設(shè)計(jì)的核酸引至細(xì)胞之后對其進(jìn)行選擇，以允許并使得期望的重組事件可發(fā)生。本發(fā)明還更具體地涉及一種分離的和/或重組的核酸，其包含編碼對人類CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核苷酸序列(例如，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白，其中非人類部分(例如，CDRs)衍生自鼠抗CD52單克隆抗體；本發(fā)明的小鼠免疫球蛋白；或本發(fā)明的嵌合免疫球蛋白，其中非人類部分(例如，\和 Vl)衍生自鼠抗CD52單克隆抗體)或其(例如，其重鏈或輕鏈)部分(例如，抗原結(jié)合部分))。本發(fā)明的核酸可用于制備對人類CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白、對人類CD52具有結(jié)合特異性的小鼠免疫球蛋白和對人類CD52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白。例如，一種核酸(例如，DNA (例如cDNA)，或RNA)或一個(gè)或多個(gè)編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的核酸可引入合適的構(gòu)建體(例如，重組載體)，以在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)一步操作序列或制備所編碼的免疫球蛋白。本發(fā)明還提供適合用于表達(dá)對人類⑶52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白、對人類CD52具有結(jié)合特異性的小鼠免疫球蛋白或?qū)θ祟怌D52具有結(jié)合特異性的嵌合免疫球蛋白的構(gòu)建體或載體(例如，表達(dá)載體)。多種載體為可得到的，其包括在宿主細(xì)胞中以單拷貝或多拷貝維持的載體，或整合至宿主細(xì)胞的染色體的載體?？蓪?gòu)建體或載體引入至合適的宿主細(xì)胞中，可制備出表達(dá)本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白的細(xì)胞并將其保持在培養(yǎng)物中。單個(gè)載體或多個(gè)載體可用于表達(dá)對人類CD52 具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白或嵌合免疫球蛋白。合適的表達(dá)載體，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，也可包含數(shù)個(gè)組成部分，包括，但不限于下列的一種或多種復(fù)制起點(diǎn)；選擇性標(biāo)記基因；一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件，例如轉(zhuǎn)錄控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子)、和/或一個(gè)或多個(gè)翻譯信號；用于膜靶向或分泌的信號序列或前導(dǎo)序列。在一個(gè)構(gòu)建體或載體中，信號肽序列可由構(gòu)建體或載體或其它來源提供。例如，可使用免疫球蛋白的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號來指導(dǎo)表達(dá)?？商峁﹩?dòng)子用于在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。啟動(dòng)子可以是組成型或是誘導(dǎo)型。例如，啟動(dòng)子可以可操作地連接至編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸，使得其指導(dǎo)所編碼的多肽的表達(dá)。多種適合于原核生物宿主的啟動(dòng)子(例如，大腸桿菌的lac、 tac、T3、T7啟動(dòng)子)和多種適合于真核生物宿主的啟動(dòng)子(例如，酵母醇脫氫酶(ADHl)、 SV40.CMV)是可得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子以表達(dá)本發(fā)明的抗CD52 抗體或其部分。此外，載體(例如，表達(dá)載體)通常包含選擇性標(biāo)記，以選擇攜帶載體的宿主細(xì)胞，并且在可復(fù)制載體的情況下，包含復(fù)制起點(diǎn)。編碼賦予抗生素抗性或抗藥性的產(chǎn)物的基因是通常的選擇性標(biāo)記并且可用于原核生物中(例如，內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、Tet基因(四環(huán)素抗性))和真核細(xì)胞中(例如，新霉素(neomycin) (G418或遺傳霉素 (geneticin))、gpt(霉酚酸)、氨芐青霉素、或潮霉素抗性基因)。二氫葉酸還原酶標(biāo)記基因允許在多種宿主中的甲氨蝶呤選擇。編碼宿主的營養(yǎng)缺陷標(biāo)記的基因產(chǎn)物的基因(例如， LEU2、URA3、HIS3)常用作酵母菌中的選擇性標(biāo)記。還包含病毒(例如，桿狀病毒)或噬菌體載體、和能夠整合至宿主細(xì)胞基因組的載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體)的使用。因此，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、人源化輕鏈、人源化重鏈、小鼠免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白輕鏈、小鼠免疫球蛋白重鏈、嵌合免疫球蛋白、嵌合輕鏈或嵌合重鏈。本發(fā)明還涉及一種分離的核酸分子，其編碼免疫球蛋白的抗原結(jié)合部分及其鏈。由本發(fā)明的核酸所編碼的多肽序列在上文和以下工作實(shí)施例中描述。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸和載體編碼本發(fā)明的重鏈(或其抗原結(jié)合部分)或輕鏈(或其抗原結(jié)合部分)。可使用包含編碼重鏈的核酸與編碼輕鏈的核酸的宿主細(xì)胞以制備包含重鏈和輕鏈(或抗體的抗原結(jié)合部分)的抗體?？蓪⒕幋a重鏈的核酸與編碼輕鏈的核酸置于單獨(dú)的表達(dá)載體中。也可將它們置于單個(gè)表達(dá)載體，受相同或不同的表達(dá)控制。參見例如，Cabilly美國專利第6，331，415號；Fang美國專利第7，662，623號。MKm CD52 H有Φ寺異+牛的免疫球g白的泡丨造方法本發(fā)明的另一方面涉及一種本發(fā)明的抗人CD52抗體的制造方法。本發(fā)明的抗體可，例如通過在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼抗體的一個(gè)或多個(gè)重組核酸而制備。宿主細(xì)胞可使用任何合適的方法制造。例如，可將本文所敘述的表達(dá)構(gòu)建體(例如，該一個(gè)或多個(gè)載體，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)引入至合適的宿主細(xì)胞，并且可在適合構(gòu)建體或載體表達(dá)的條件下維持所產(chǎn)生的細(xì)胞(例如，在培養(yǎng)物中，在動(dòng)物中，在植物中)。合適的宿主細(xì)胞可以是原核生物的，包括細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌(例如，菌種DH5 α (Invitrogen, Carlsbad, CA))，枯草桿菌(B. subtilis)和/或其它合適的細(xì)菌；真核生物細(xì)胞，例如真菌或酵母菌細(xì)胞(例如，巴氏畢赤酵母菌(Pichia pastoris)、曲霉菌(Aspergillus sp·)、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))，或其它低級真核細(xì)胞，和高級真核細(xì)胞例如來自昆蟲的那些細(xì)胞(例如，Drosophila Schnieder S2細(xì)胞、Sf9昆蟲細(xì)胞WO 94/26087(0' Connor)、TN5B1-4 (HIGH 5)昆蟲細(xì)胞 Qnvitrogen)，哺乳動(dòng)物(例如，COS 細(xì)胞，例如 C0S-1(ATCC Accession No. CRL-1650)和 C0S-7 (ATCC Accession No. CRL-1651)、 CH0(例如，ATCC Accession No. CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub, G.和 Chasin，LA.，Proc. Natl.Acac. Sci. USA,77(7) :4216-4220(1980)),293(ATCC Accession No. CRL-1573)、
55HeLa(ATCC Accession No. CCL-2)、CVl (ATCC Accession No. CCL-70)、TOP (Dailey，L.，等人，J. Virol. ,54 :739-749 (1985)) ,3T3.293T (Pear, W. S.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，90 :8392-8396 (1993))、NSO 細(xì)胞、SP2/0 細(xì)胞、HuT 78 細(xì)胞和類似細(xì)胞))，或植物 (例如，煙草、浮萍屬(浮萍)(Lemna (duckweed))、和藻類)，(參見，例如，Ausubel，F(xiàn).M·等人，eds. Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley &S ons Inc. (1993))。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞不是多細(xì)胞生物(例如，植物或動(dòng)物)的一部分，例如，其是分離的宿主細(xì)胞或者是細(xì)胞培養(yǎng)物的一部分。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸例如載體(例如，表達(dá)載體)的細(xì)胞。例如，可將編碼人源化免疫球蛋白的重鏈和輕鏈、小鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈、或嵌合免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的核酸(即，一個(gè)或多個(gè)核酸)，或包含此種核酸的構(gòu)建體(即，一個(gè)或多個(gè)構(gòu)建體，例如，一個(gè)或多個(gè)載體)通過適合于所選擇宿主細(xì)胞的方法(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔法、感染)引入至合適的宿主細(xì)胞中(其中所編碼的免疫球蛋白對人類CD52具有結(jié)合特異性)，且核酸被或變?yōu)榭刹僮鞯剡B接至一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件(例如，在載體中，在通過細(xì)胞中的處理所產(chǎn)生的構(gòu)建體中，整合至宿主細(xì)胞基因組中)?？蓪⑺拗骷?xì)胞維持在適合表達(dá)的條件下(例如，在誘導(dǎo)物、添加有適當(dāng)鹽類、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補(bǔ)充物等的合適培養(yǎng)基的存在下)，由此制備所編碼的多肽。如果希望，可將所編碼的蛋白(例如，人源化免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白)從，例如，宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基、或乳液中分離。此方法包含在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物(例如，煙草)的宿主細(xì)胞(例如，乳腺細(xì)胞)中的表達(dá) (參見,例如，WO 92/03918)。可制備融合蛋白，其中免疫球蛋白部分(例如，人源化免疫球蛋白；免疫球蛋白鏈)在N端位置、C端位置或融合蛋白內(nèi)部連接至非免疫球蛋白部分(即，在自然界未發(fā)現(xiàn)存在于免疫球蛋白的部分)。例如，一些實(shí)施方式中，可通過將編碼免疫球蛋白序列的核酸插入至合適的表達(dá)載體，例如PET載體(例如，pET-15b，Novagen)、噬菌體載體(例如，pCANTAB 5E，Pharmacia)、或其它載體(例如，pRIT2T蛋白A融合載體，Pharmacia) 而制備?？蓪⒌玫降臉?gòu)建體引入合適的宿主細(xì)胞中以表達(dá)。在表達(dá)時(shí)，可通過合適的親和基質(zhì)(affinity matrix)從細(xì)胞溶解產(chǎn)物分離或純化一些融合蛋白(參見，例如， Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. Μ.等人，Eds. , Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16. 4. 1-16. 7. 8(1991))。本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞，其包含編碼本文提供的免疫球蛋白(例如，本發(fā)明的人源化免疫球蛋白、人源化輕鏈或人源化重鏈、小鼠免疫球蛋白、鼠輕鏈或鼠重鏈、嵌合免疫球蛋白、嵌合重鏈、或嵌合輕鏈)的重組核酸。本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，其包含編碼免疫球蛋白的抗原結(jié)合部分或其鏈的重組核酸。在一些實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含本文所提及的本發(fā)明的重組載體(例如，表達(dá)載體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)。本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽鏈的制備方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括將本文所敘述的本發(fā)明的宿主細(xì)胞(例如，包含一個(gè)或多個(gè)編碼免疫球蛋白或多肽鏈(例如，本發(fā)明的輕鏈和重鏈、僅輕鏈、或僅重鏈)的分離的核酸的宿主細(xì)胞)維持在適合免疫球蛋白或多肽鏈表達(dá)的條件下。例如，宿主細(xì)胞可培養(yǎng)于基質(zhì)上或于懸浮液中。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包含純化或分離免疫球蛋白或多肽鏈的步驟。
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本發(fā)明還涉及一種通過噬菌體呈現(xiàn)法來制備免疫球蛋白的方法。例如，可淘選 CD52抗原上的天然抗體噬菌體展示庫。或者，可使用通過導(dǎo)向選擇的免疫球蛋白制備方法 (美國專利申請US 2006-0251658 Al.)?？僧a(chǎn)生圍繞例如已知的抗⑶52抗體的固定重鏈 (和/或輕鏈)⑶R3區(qū)域建立的定制庫(custom library)。重鏈和輕鏈的⑶Rl和⑶R2區(qū)域可來源于天然集合(naive repertoire) (Osburn 等人，Methods, 36 :61-68 (2005)) 在一個(gè)實(shí)施方式中，抗⑶52kFvs可由kFv天然抗體庫產(chǎn)生，此抗體庫用于獲得具有期望的結(jié)合性質(zhì)的鼠-人嵌合抗體?？蓪@些抗體庫進(jìn)行篩選以得到具有期望的結(jié)合性質(zhì)的抗體?？墒褂胇Fv噬菌體庫。例如，如在Vaughan等人(1996)中所述，可基本上依循一系列的重組人類⑶52上的重復(fù)選擇循環(huán)而從scFv引導(dǎo)選擇庫分離出識別人類⑶52的kFvs。簡而言之，在與抗體庫培養(yǎng)之后，預(yù)先偶合至順磁珠的固定化抗原，以及結(jié)合的噬菌體可通過磁分離而回收，而未結(jié)合的噬菌體則被沖掉。接著可將結(jié)合的噬菌體挽回，如在Vaughan 等人(1996)中所述，并重復(fù)選擇過程。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，文庫構(gòu)建為，由以單鏈形式融合至天然人類輕鏈可變區(qū)集合的鼠抗CD52抗體的整個(gè)重鏈可變區(qū)所組成。在選擇之后，鑒定出互補(bǔ)于小鼠重鏈可變區(qū)的人類輕鏈可變區(qū)池(pool)。接著構(gòu)建文庫，該文庫由以上選擇的人類輕鏈可變區(qū)集合所組成，該人類輕鏈可變區(qū)集合以單鏈形式融合至由天然人類CDRl和CDR2區(qū)域以及來自鼠抗CD52抗體重鏈可變區(qū)的固定CDR3區(qū)域所組成的嵌合重鏈可變區(qū)。在選擇CD52 結(jié)合物之后，選擇最佳結(jié)合克隆。6個(gè)CDR區(qū)域中的五個(gè)可以是人類來源，而重鏈可變區(qū)的 ⑶R-3可以與小鼠重鏈可變區(qū)的原先⑶R3相同。根據(jù)制造商建議，可使用偶合至DYNABEADS M-270胺(Dynal)的⑶52進(jìn)行選擇。或者，使用生物素化CD52的選擇可使用一級胺特定試劑琥珀酰亞胺基-6-(生物素氨基) 己酸酯(succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate)依循制造商說明書(EZ link NHS LC Biotin, Pierce)而制備。來自選擇的輸出可基于競爭檢定在高通量篩選中以細(xì)胞周質(zhì)制備品進(jìn)行測試，此競爭檢定測量存在于細(xì)胞周質(zhì)制備品中的scFvs競爭結(jié)合至CD52的能力?？蓪⒛軌蛟诟咄亢Y選中競爭的樣品進(jìn)行DNA測序，如在Vaughan等人(1996) 及Osburn等人(1996)所敘述?？寺〗又鴮槐磉_(dá)和純化為scFvs或IgGs，并評估其結(jié)合CD52、中和CD52或其組合的能力，例如，使用檢定如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)檢定和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)檢定。經(jīng)純化的scFv制備品可接著如WO 01/66754的實(shí)例3中所述來制備。純化scFv制備品的蛋白濃度使用BCA方法(Pierce)來測定?？墒褂妙愃品椒ㄒ院Y選固定免疫球蛋白重鏈或輕鏈(或Vh或VJ的最佳配對者(相對鏈)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種分泌對人類CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的雜交瘤的制造方法，其包括將⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴細(xì)胞施用至具有與人類CD52轉(zhuǎn)基因小鼠相同的品系(例如，CDl)的非轉(zhuǎn)基因小鼠，由此產(chǎn)生免疫型非轉(zhuǎn)基因小鼠。該免疫型非轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞與永生細(xì)胞接觸，由此產(chǎn)生融合細(xì)胞，并將該融合細(xì)胞維持在產(chǎn)生分泌對人類CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的雜交瘤的條件下，由此產(chǎn)生分泌對人類CD52具有結(jié)合特異性的單克隆抗體的雜交瘤。^^ ^^ ^^^ ^
本發(fā)明還涉及包含毒素部分或毒素的免疫球蛋白。合適的毒素部分包含毒素(例如，表面活性毒素，細(xì)胞毒素)。毒素部分或毒素可使用任何合適的方法連接或結(jié)合至免疫球蛋白。例如，毒素部分或毒素可直接或經(jīng)由合適的連接體(linker)共價(jià)地結(jié)合至免疫球蛋白。合適的連接體可包含不可裂解或可裂解的連接體，例如，PH可裂解的連接體或包含細(xì)胞酶(例如，細(xì)胞酯酶、細(xì)胞蛋白酶例如組織蛋白酶B)裂解部位的連接體。此種可裂解連接體可用于制備在免疫球蛋白內(nèi)化后能釋出毒素部分或毒素的免疫球蛋白?？墒褂枚喾N方法以將毒素部分或毒素連接或結(jié)合至免疫球蛋白。所選擇的特定方法將取決于毒素部分或毒素以及所要連接或結(jié)合的免疫球蛋白。如果需要，可使用包含末端官能團(tuán)的連接體來連接免疫球蛋白與毒素部分或毒素。一般，結(jié)合是通過將包含反應(yīng)官能團(tuán)(或被修飾以包含反應(yīng)官能團(tuán))的毒素部分或毒素與連接體或是直接與免疫球蛋白反應(yīng)而完成。共價(jià)鍵通過使包含(或被修飾以包含)化學(xué)部分或官能團(tuán)(其在適當(dāng)?shù)臈l件下可與第二化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)由此形成共價(jià)鍵)反應(yīng)而形成。如果需要，可使用任何合適的方法將適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)化學(xué)基團(tuán)加至免疫球蛋白或至連接體。(參見，例如，Hermanson, G. T. , Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, CA(1996) ·)。許多合適的反應(yīng)化學(xué)基團(tuán)組合為本領(lǐng)域內(nèi)所已知，例如胺基可與親電子基團(tuán)例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵素(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)、及其類似物反應(yīng)。硫醇可與馬來酰亞胺、碘乙酰(iodoacetyl)、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫代-2-硝基苯甲酸硫醇(5-thiol-2-nitrobenzoic acid thio) (TNB-硫醇)、及其類似物反應(yīng)。醛官能團(tuán)可偶合至含胺或含酰胼分子，且疊氮基可與三價(jià)磷基團(tuán)反應(yīng)以形成氨基磷酸酯或磷酰亞胺連接。向分子中引入活化基團(tuán)的合適方法為本領(lǐng)域內(nèi)所已知(參見例如，Hermanson, G. T.， Bioconjugate Techniques，Academic Press San Diego，CA(1996))0合適毒素部分和毒素包括，例如，類美坦素(maytansinoid)(例如，美登素醇(maytansinol)，例如，DMl，DM4)、紫杉烷、加利車霉素(calicheamicin)、倍癌霉素 (duocarmycin)、或其衍生物。類美坦素可以為，例如，美登素醇或美登素醇類似物。美登素醇類似物的實(shí)例包含具有經(jīng)修飾的芳香環(huán)(例如，C-19-去氯基(decloro)、C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基)的那些和在其它位置具有修飾(例如，C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、 C-14-羥甲基或乙酰氧基甲基、C-15-羥基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-去甲基、4， 5-脫氧基)的那些。美登素醇和美登素醇類似物敘述于，例如，美國專利第5，208，020號和第6，333，410號中，其內(nèi)容并入本文做為參考。美登素醇可使用，例如，N-琥珀酰亞胺基 3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(也已知為N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸酯(或 SPP)) >4-琥珀酰亞胺基-氧代羰基(2-吡啶二硫基)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SDPB)、2亞氨基硫烷O iminothiolane)、或S-乙?；《狒己现量贵w或抗體片段。紫杉烷可以是，例如，紫杉醇、泰索帝(taxotere)、或新穎紫杉烷(參見，例如，WO 01/38318)。加利車霉素可以是，例如，一種溴-復(fù)合加利車霉素(例如，0、0、或Y溴-復(fù)合)、一種碘-復(fù)合加利車霉素(例如，α、β、或Y碘-復(fù)合)，或是其類似物和模擬物。溴-復(fù)合加利車霉素包含I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR 和Kl-BR0碘-復(fù)合加利車霉素包含11-1、12-1、13-1、Jl-I、J2-I、Ll-I和Kl-BR0加利車霉素及其變體、類似物、模擬物在，例如美國專利第4，970，198 ；5, 264，586 ；5, 550，246 ； 5，712，374、和5，714，586號中描述，其各自內(nèi)容均并入本文做為參考。倍癌霉素類似物(例如，KW-2189、DC88、DC89 CBI-TMI、及其衍生物)在，例如美國專利第5，070，092號、美國專利第5，187，186號、美國專利第5，641，780號、美國專利第5，641，780號、美國專利第 4，923，990號、和美國專利第5，101，038號中描述，其各自內(nèi)容均并入本文做為參考。其它毒素的實(shí)例包含，但不限于抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(5-fluorouraci 1 decartazine))，烷化劑(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、thio印a苯丁酸氮芥、CC-1065 (參見美國專利第 5，475，092、5，585，499、5，846，545 號)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂霉素C、和順式-二氯二氨鉬(II) (DDP) 順鉬)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(先前為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(先前為放線菌素)、博萊霉素、光神霉素、絲裂霉素、嘌呤霉素氨茴霉素(puromycin anthramycin) (AMC))、倍癌霉素及其類似物或衍生物，和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿 (vincristine)、長春喊(vinblastine)、紫杉酉享、auristatins (例如，auristatin E)禾口類美坦素，及其類似物或同系物)。毒素也可以是表面活性毒素，例如是自由基產(chǎn)生者(例如，含硒毒素部分)的毒素，或是含放射性核素部分的毒素。合適的含放射性核素部分包括，例如包含放射性碘 (1311 或 1251)、釔(90Y)、镥(177Lu)、錒 Q25Ac)、鐠、砹(211At)、錸(186Re)、鉍(212Β 或 213Bi)、銦(IlUn)、锝(99mTc)、磷(32P)、銠(188 )、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、鉻 (51Cr)、氯(36C1)、鈷(57Co 或 58Co)、鐵(59! )、硒(75 )、或鎵(67Ga)的部分。毒素可以是來自細(xì)菌來源的蛋白、多肽或肽，例如，白喉毒素、假單胞菌外毒素 (PE)和植物蛋白，例如，蓖麻毒素A鏈(RTA)、核糖體失活蛋白(RIPs)白樹毒素(gelonin)、商陸抗病毒蛋白、肥皂草素(saporin)、* dodecandron，考慮用作毒素。設(shè)計(jì)以結(jié)合、使失去作用、促進(jìn)負(fù)責(zé)產(chǎn)生特定的靶蛋白的mRNA的降解或是防止其生成的核酸反義化合物也可用作毒素。反義化合物包含單或雙鏈的反義RNA或DNA、寡核苷酸、或是其類似物，其可特定地雜交至單獨(dú)的mRNA種類，并防止該mRNA種類的轉(zhuǎn)錄和/或RNA加工和/或編碼的多肽的翻譯，由此造成各編碼多肽的量減少。Ching，等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 10006-10010 (1989) ；Broder,等人，Ann. Int. Med. 113 604-618(1990) ；Loreau，等人.，F(xiàn)EBS Letters 274 :53-56 (1990)。有用的反義療法包括例如Veglin TM(VasGene)和 0GX-011(Oncogenix)。毒素也可以是一種光活性劑。合適的光活性劑包括卟啉類物質(zhì)，例如卟吩姆鈉、綠卟啉、二氫卟酚E6、血卟啉衍生物本身、酞菁、初卟啉(etiopurpurins)、替沙林 (texaphrin)、及其類似物。毒素可以是一種結(jié)合細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)的抗體或抗體片段。此種抗體或抗體片段可指向指定的亞細(xì)胞區(qū)室或目標(biāo)。例如，抗體或抗體片段可結(jié)合一種細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)，其選自erbB2、 EGFR、BCR-ABL、p21Ras、半胱天冬氨酸酶3、半胱天冬氨酸酶7、Bcl_2、p53、細(xì)胞周期蛋白E、 ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV型膠原酶、組織蛋白酶L以及其它敘述于Kontermann，R. Ε.， Methods, 34 :163-170(2004)中(其全文內(nèi)容并入本文做為參考)的細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)。治療方法和組合物本發(fā)明的抗體有用于免疫抑制和免疫消融。抗體靶向CD52表達(dá)細(xì)胞(例如，T和 B細(xì)胞)并減少(或如本文所用的“消減”)需要的受試者中它們的數(shù)量。淋巴細(xì)胞消減可用于治療多種疾病和癥狀，例如發(fā)炎、自體免疫疾病和癌癥(例如，淋巴細(xì)胞(B或T細(xì)胞)惡性腫瘤)。參見，例如，Reiff，A.，Hematology, 10(2) =79-93(2005)?？墒褂帽景l(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分治療的疾病和癥狀的實(shí)例包括但不限于，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植體抗宿主疾病(GVHD)、炎性腸道疾病、血管炎、貝西氏病、韋格納肉芽腫病 (Wegener ‘ s granulomatosis)、修格蘭氏癥候群(Sjogren‘ s syndrome)、葡萄膜炎、干癬、硬皮病、多肌炎、I型(自體免疫類)糖尿病、自體免疫細(xì)胞減少癥(例如，自體免疫嗜中性粒細(xì)胞減少癥、輸血依賴性難治型PRCA、白血病和淋巴瘤例如具有巨大腫瘤的非何杰金氏淋巴瘤和B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病。據(jù)此，本發(fā)明的方面為通過對需要的受試者(例如，具有自體免疫疾病、血癌的病人，或是將要接受移植的病人)施用有效量的本發(fā)明的抗體，用于淋巴細(xì)胞消減的方法和用于治療發(fā)炎、自體免疫疾病或癌癥的方法。還可預(yù)防性地施用該抗體以防止發(fā)炎開始或是自體免疫疾病或癌癥的復(fù)發(fā)。例如，可施用本發(fā)明的抗體作為調(diào)理療法的一部分，以使病人準(zhǔn)備進(jìn)行移植(例如，干細(xì)胞移植、同種異體T細(xì)胞自體移植輸注、或?qū)嶓w器官移植)。本發(fā)明的一些抗⑶52抗體優(yōu)選靶向某些⑶52+細(xì)胞群。一個(gè)可能的解釋是，這些抗體所結(jié)合的表位包含CD52蛋白上的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物基團(tuán)，并且此種碳水化合物基團(tuán)在一種細(xì)胞類型所表達(dá)的⑶52上比在另一種類型所表達(dá)的⑶52上更為普遍。例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于B細(xì)胞，抗體7F11、5F7、3G7、和IlCll以更大的程度消減T細(xì)胞。因此，這些抗體的人源化和嵌合形式可用于治療T細(xì)胞惡性腫瘤，且免疫抑制副作用比較溫和。因?yàn)楸景l(fā)明的抗體靶向⑶52表達(dá)細(xì)胞，抗體也可用于消減T細(xì)胞和B細(xì)胞以外的 ⑶52+細(xì)胞類型。例如，研究已顯示，血管白細(xì)胞(VLC)和Tie2+單核細(xì)胞-表達(dá)高水平⑶52 的髓樣細(xì)胞-促進(jìn)腫瘤血管新生并且有助于針對抗VEGF療法的腫瘤抗性。Pulaski等人， J. Translational Med. 7 =49(2009) 本發(fā)明的抗CD52抗體由此可通過靶向VLC和Tie2+ 單核細(xì)胞而用于抑制腫瘤血管新生。為此目的，抗⑶52抗體可系統(tǒng)地或局部地在新血管形成部位，例如腫瘤部位給藥。抗CD52抗體治療可與標(biāo)準(zhǔn)癌癥治療例如化療、手術(shù)、或放射共同使用，或與另一種靶向治療例如抗VEGF抗體治療共同使用。抗CD52抗體治療可用于治療，例如，乳腺癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌、和任何其它抗VEGF抗體的癥狀?？笴D52 抗體治療也可用于其它新血管形成病癥，包括非腫瘤血管新生癥狀。本發(fā)明的抗體可單獨(dú)施用至個(gè)體(例如，人類)或與另一種制劑(例如，免疫抑制劑)在聯(lián)合治療中共同施用。該抗體可在施用額外的制劑之前，一起或之后施用。在一些實(shí)施方式中，額外的制劑為，例如，消炎化合物例如柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，另一種非類固醇消炎化合物，或類固醇消炎化合物。在一些實(shí)施方式中，該額外制劑為另一種淋巴消減抗體，例如另一種抗CD52抗體、抗CD20抗體、抗BAFF抗體、抗BAFF-R抗體、和類似物。在一些實(shí)施方式中，該額外制劑為，例如，細(xì)胞因子(例如，IL-7)、抗細(xì)胞因子受體抗體，或可溶性受體，其扭轉(zhuǎn)、操作、和/或加強(qiáng)在抗CD52抗體所介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞消減之后發(fā)生的重建過程(參見，例如，Sportes 等人，Cytokine Therapies :Ann. N. Y. Acad. Sci. 1182 觀-38(2009))。在另一實(shí)施方式中，合成肽模擬物可與本發(fā)明的免疫球蛋白共同給藥。研究已顯示，阿侖單抗引起的淋巴細(xì)胞消減由嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞所介導(dǎo)(Hu 等人，Immunology 1 :260_27(K2009)。因此，在聯(lián)合治療的實(shí)施方式中，可在抗⑶52抗體療法之前、期間或之后對病人施用刺激嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的制劑，以增強(qiáng)抗體治療。刺激嗜中性粒細(xì)胞和/或NK細(xì)胞包括，但不限于，⑴增加其分裂速率，⑵增加對應(yīng)于抗 CD52 抗體的同種型的 Fc 受體 G^i^n，F(xiàn)cYRIIIa*FcYRIIIb、FcYRII、FcYRUnFcaRI) 的細(xì)胞表面表達(dá)，(3)調(diào)動(dòng)并增加循環(huán)細(xì)胞的數(shù)量，(4)募集細(xì)胞至靶部位(例如，腫瘤、發(fā)炎、或組織損傷部位)，(5)以及增加其細(xì)胞毒性活性。刺激嗜中性粒細(xì)胞和/或NK細(xì)胞的制劑的實(shí)例包括，例如，粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，LEUKINE 或沙格司亭(sargramostim)和莫拉司亭(molgramostim))；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(例如， NEUP0GEN 或非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭、和來格司亭(Ienograstim))；干擾素-Y (例如，ACTIMMUNE ) ； CXC趨化因子受體4 (CXCR4)拮抗劑(例如，M0Z0BIL 或普樂沙福(plerixafor))；和C)(C趨化因子受體2 (CXCM)拮抗劑?？啥ㄆ诒O(jiān)測病人的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)以確保最佳的治療效果。也可在抗CD52抗體治療開始之前測量病人的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)?？苫诓∪说氖戎行粤＜?xì)胞數(shù)調(diào)整刺激物的量。如果病人的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)較正常者較低，則可使用較高劑量的刺激物。在嗜中性粒細(xì)胞減少癥(其可由使用抗CD52抗體治療而引起)期間，也可使用較高劑量的嗜中性粒細(xì)胞刺激物以最大化抗CD52抗體的效^ ο因?yàn)槭戎行粤＜?xì)胞和/或NK刺激改善抗CD52抗體治療的效力，聯(lián)合治療的此實(shí)施方式使得我們可對病人使用較少的抗體并維持相似的治療效果。使用較少的抗CD52抗體同時(shí)維持治療效果可幫助減少抗CD52抗體的副作用，其包括病人對施用的抗體的免疫反應(yīng)以及二次自體免疫(在抗CD52抗體治療期間或之后出現(xiàn)的自體免疫)的發(fā)展。聯(lián)合治療的此實(shí)施方式也可用于腫瘤環(huán)境，例如，在病人具有嗜中性粒細(xì)胞減少癥時(shí)。在聯(lián)合治療的另一實(shí)施方式中，我們可使用調(diào)節(jié)T細(xì)胞的刺激物來增強(qiáng)抗CD52 抗體治療。我們的數(shù)據(jù)顯示，相較于其它CD4+T細(xì)胞，抗CD52抗體以更低的程度消減 CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞。調(diào)節(jié)T細(xì)胞(也已知為“Treg”或抑制T細(xì)胞)是一種能夠通過接觸依賴性或接觸非依賴性(例如，細(xì)胞因子產(chǎn)生)機(jī)制抑制其它淋巴細(xì)胞的增殖和/或功能的細(xì)胞。已敘述數(shù)種類型的調(diào)節(jié)T細(xì)胞，包括γ δ T細(xì)胞、自然殺手T(NKT)細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、和雙陰性CD4XD8T細(xì)胞。參見，例如，Bach等人，Immunol. 3 189-98 (2003)。⑶4+⑶25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞曾稱為“自然發(fā)生”調(diào)節(jié)T細(xì)胞；它們表達(dá)⑶4、 ⑶25和叉頭(ForWiead)家族轉(zhuǎn)錄因子R)xP3 (叉頭盒。因此，在聯(lián)合治療的此實(shí)施方式中，我們可在抗⑶52抗體治療之前、期間或之后施用刺激⑶4+⑶25+FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的制劑，以在淋巴細(xì)胞消減之后扭轉(zhuǎn)免疫系統(tǒng)的組成。制劑可，例如，活化那些T細(xì)胞，穩(wěn)定和/或擴(kuò)充細(xì)胞群，移動(dòng)和增加細(xì)胞循環(huán)，和/或募集細(xì)胞至靶部位。此種制劑的實(shí)例為雷帕霉素、活性或潛伏性 TGF- β (例如，TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、和 TGF- β 5)、 IL-10、IL-4、IFN-α、維生素 D3、地塞米松(dexamethasone)、和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)(參見，例如，Barrat 等人，J. Exp. Med. 195 :603-616(2002) ；Gregori 等人， J Immunol. 167 :1945-1953(2001) ;Battaglia 等人，Blood 105:4743-4748(2005); Battaglia 等人，J. Immunol. 177 :8338-8347 (2006))。在本發(fā)明中，治療疾病的抗CD52抗體的有效量為幫助治療的受試者達(dá)到一個(gè)或多個(gè)期望臨床終點(diǎn)的量。例如，對于狼瘡(其表現(xiàn)包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、皮膚紅斑狼瘡、CNS狼瘡、心血管表現(xiàn)、肺表現(xiàn)、肝表現(xiàn)、血液表現(xiàn)、胃腸表現(xiàn)、肌肉骨骼表現(xiàn)、新生兒紅斑狼瘡、兒童全身性紅斑狼瘡、藥物誘發(fā)性紅斑狼瘡、抗磷脂癥候群、和引起狼瘡癥狀的補(bǔ)體缺乏癥候群；參見，例如，Robert G. Lahita，Editor, Systemic Lupus Erythematosus, 4th Ed. , Elsevier Academic Press，2004)，臨床終點(diǎn)可通過監(jiān)測受影口向的器官系統(tǒng)(例如，狼瘡性腎炎的血尿及/或蛋白尿)和/或使用提供數(shù)個(gè)器官系統(tǒng)間的疾病嚴(yán)重性的綜合分?jǐn)?shù)的疾病活動(dòng)指數(shù)(例如，BILAG、SLAM、SLEDAI, ECLAM)來測定。參見，例如，Mandl 等人，"Monitoring patients with systemic lupus erythematosus，，in Systemic Lupus Erythematosus,4th edition,pp. 619-631,R. G. Lahita,Editor,Elsevier Academic Press, (2004)。在自體免疫疾病、多發(fā)性硬化癥(其包含復(fù)發(fā)緩解型、二次進(jìn)展型、原發(fā)進(jìn)展型、和進(jìn)展復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化癥((Lublin等人，Neurology 46 (4)，907-11 (1996))的另一實(shí)施例中，診斷是通過，例如在檢測例如核磁共振成像(MRI)、脊髓穿刺、誘發(fā)電位檢測、和血液樣品實(shí)驗(yàn)室分析的協(xié)助下通過征狀史和神經(jīng)檢查而作出的。在MS中，治療目標(biāo)是降低復(fù)發(fā)的頻率和嚴(yán)重性、預(yù)防因疾病進(jìn)展而產(chǎn)生的障礙、和促進(jìn)組織修復(fù)(Compston and Coles, 2008)。因此，幫助達(dá)到與該目標(biāo)一致的臨床終點(diǎn)的抗CD52抗體量是用于治療的抗體的有效量。為了使免疫原性降至最低，優(yōu)選通過本發(fā)明的治療方法和組合物使用人源化抗體來治療患者。在不需要重復(fù)給藥的情況下，對患者施用本發(fā)明的鼠人類嵌合抗體也是合適的。可使用本發(fā)明的抗體來治療先前已經(jīng)用Campath-IH 治療并且已經(jīng)形成 Campath-IH 的中和抗體的個(gè)體(例如，Campath-IH -難治療的個(gè)體)。例如，人們可以治療患有自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、狼瘡、血管炎)和/或癌癥(例如，白血病(例如，慢性淋巴細(xì)胞白血病)、淋巴癌(例如，非何杰金氏淋巴瘤))、先前已用Campath-IH 治療(例如，使用一個(gè)或多個(gè)Campath-IH 治療療程)和已經(jīng)形成Campath-IH 中和抗體的個(gè)體，其中中和抗體會降低進(jìn)一步的Campath-IH 治療效力。我們已經(jīng)顯示，本發(fā)明的人源化抗體(例如，人源化2C3、12G6和9D9)盡管在阿侖單抗的中和抗體的存在下也可結(jié)合至人類CD52。在另一個(gè)實(shí)施方式中，人們可以用本文所述的特定的人源化抗體與一種本文所述的其它人源化抗體來治療已經(jīng)變得難以治療的個(gè)體。本發(fā)明的抗體可以以單一的單位劑量或多劑量在健康照顧提供者認(rèn)為合適的任何時(shí)間點(diǎn)給藥。劑量可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法所決定，并可依據(jù)，例如個(gè)體年齡、敏感性、耐受度和整體健康情況而定?？墒褂酶鞣N給藥路徑，其包括，但不限于，腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下注射)、口服(例如，飲食)、局部(locally)、表面 (topical)、吸入(例如，支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)或口部吸入、鼻內(nèi)滴劑)、或直腸，依據(jù)要治療的疾病或病癥而定。腸胃外給藥可以是一種優(yōu)選的給藥模式。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用與Campath-IH⑧相同的給藥方案對患者施用本發(fā)明的抗體(例如，針對慢性淋巴細(xì)胞白血病的Campath-IH 給藥方案)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，以一種方案對患有自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥(MQ)的患者施用本發(fā)明的抗體，其中該方案包括第一周期的抗體給藥，接著至少再一個(gè)抗體周期，其中各個(gè)治療周期包括連續(xù)數(shù)天應(yīng)用1-5個(gè)劑量，并且其中各個(gè)治療周期與下一個(gè)周期分隔至少I-M個(gè)月(例如， 12個(gè)月)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過包括5個(gè)每日劑量抗體的第一周期抗體接著至少再一抗體治療周期(其中該治療在第一周期之后12個(gè)月發(fā)生，并且治療包括連續(xù)數(shù)天施用的3個(gè)劑量的抗體)來治療患有多發(fā)性硬化癥的患者。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患有MS 的病人僅再治療一次，已經(jīng)觀察到重新開始的(renewed)MS活動(dòng)性的跡象(參見，例如WO 2008/031626，其教導(dǎo)整體地并入本文以作參考)。在一些實(shí)施方式中，如果患有更晚期形式的MS或更惡化形式的其它自體免疫疾病(例如血管炎；參見，例如，Walsh等人，Arm Rheum Dis 67 1322-1327(2008))的患者早在他們最后的療程之后經(jīng)歷復(fù)發(fā)，可能需要進(jìn)行更頻繁的治療療程(例如，每四個(gè)月、每六個(gè)月)?？筛鶕?jù)治療臨床醫(yī)生的職業(yè)判斷，使用這樣的臨床醫(yī)生可獲得的任何方法確定重新開始的MS活動(dòng)性的跡象。對于臨床醫(yī)生，目前有多種技術(shù)來診斷重新開始的MS活動(dòng)性，包括但不限于，通過臨床方法(神經(jīng)性障礙的復(fù)發(fā)或惡化)或通過大腦或脊髓的核磁共振成像(MRI)。如醫(yī)學(xué)從業(yè)者所公知，通過MRI檢測的疾病活動(dòng)性可通過Tl (加強(qiáng)或非加強(qiáng)的)或T2加權(quán)成像上新的腦或脊椎病變的出現(xiàn)，或通過這樣的病變的體積增長而顯示出。因?yàn)镸S的診斷方法在不斷發(fā)展，預(yù)期未來可能有另外的方法將檢測到重新開始的MS活動(dòng)性(例如，磁化傳遞率或MR-光譜)。用于檢測重新開始的 MS活動(dòng)性的特定診斷方法不是對主張權(quán)利的本發(fā)明的限制。在某些實(shí)施方式中，為了確定任何給定患者是否需要再治療和對該患者再治療的最佳時(shí)間點(diǎn)，在治療周期之后以固定的間隔重復(fù)進(jìn)行MRIs。通常而言，在疾病臨床地再次顯現(xiàn)之前進(jìn)行再治療是有利的。制劑可依據(jù)所選擇的給藥途徑而不同(例如，溶液、乳液)。包含將施用的抗體的適當(dāng)組合物可以生理上可接受的媒介物或載體而制備。組合物可包括多劑量或者可以是單一單位劑量的組合物。對于溶液或乳液，合適的載體包括，例如，水溶液或醇/水溶液、乳液或懸浮液，包含鹽水或緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物可包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡萄糖與氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發(fā)性油(fixed oil)。靜脈內(nèi)媒介物可包括各種添加劑、防腐劑、或流體、營養(yǎng)或電解質(zhì)補(bǔ)充劑(參見，通常而言， Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences，17th Edition， Mack Publishing Co. ， PA, 1985)。對于吸入，化合物可以是溶解的或是裝載至合適的給藥用分配器(例如，霧化器 (atomizer)、氣霧器(nebulizer)或壓力氣霧劑分配器)。診斷方法和組合物本發(fā)明的免疫球蛋白也可用于研究和診斷應(yīng)用的多種方法。例如，它們可用于檢測、分離、和/或純化人類CD52或其變體(例如，通過懸浮液中親合純化或其它合適方法例如流式細(xì)胞術(shù)，例如，用于細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞)，和研究人類CD52結(jié)構(gòu)(例如，構(gòu)象)和功能。對于體外應(yīng)用，其中抗體的免疫原性不是考慮的重點(diǎn)，除了人源化抗體，本發(fā)明的鼠抗體和嵌合抗體將是有用的。本發(fā)明的免疫球蛋白可用于診斷應(yīng)用(例如，體外、先體外后體內(nèi))。例如，可使用本發(fā)明的人源化免疫球蛋白來檢測和/或測量樣品中(例如，在組織或體液(比如帶有人類⑶52的發(fā)炎滲出物、血液、血清、腸液、組織)中表達(dá)人類⑶52的細(xì)胞上)人類⑶52的水平。樣品(例如，組織和/或體液)可從個(gè)體獲得，且本文所述的免疫球蛋白可以以合適的免疫學(xué)方法使用以檢測和/或測量人類CD52表達(dá)，包括方法比如流式細(xì)胞術(shù)(例如，用于懸浮液中的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞)，酶聯(lián)免疫吸附檢定(ELISA)，包括化學(xué)發(fā)光檢定、放射免疫檢定、和免疫組織學(xué)方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種檢測樣品中人類⑶52的方法，其包含在適合免疫球蛋白對人類CD52特異性結(jié)合的條件下將樣品與本發(fā)明的免疫球蛋白接觸并檢測所形成的
63抗體-CD52復(fù)合物。在應(yīng)用該方法時(shí)，本文所述的免疫球蛋白可用于分析正常組織相對于發(fā)炎組織(例如，來自人類)的人類CD52反應(yīng)性和/或表達(dá)(例如，免疫組織學(xué)地)，以檢測例如，炎性腸道疾病(IBD)、自體免疫疾病(例如多發(fā)性硬化癥和狼瘡)、癌癥(例如非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、或其它癥狀與增加的人類CD52表達(dá)(例如，在受感染的組織中)之間的關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明的免疫球蛋白允許在正常組織和發(fā)炎組織中進(jìn)行評估人類CD52的存在的免疫方法，通過該方法可評估疾病存在、疾病進(jìn)程和/或抗人CD52 治療在疾病(例如，發(fā)炎性疾病)治療中的效用。此外，在通過消減性抗CD52治療抗體的治療之后，可使用免疫球蛋白來檢查組織，以估計(jì)該消減多有效以及以確定⑶52表達(dá)是否有任何的下調(diào)(Rawstrom等人.， Br. J. Heam.，107 148-153 (1999))。除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員所普遍理解的意義相同的意義。示例方法和物質(zhì)在下文中敘述，盡管與本文所述的方法和物質(zhì)相似或等同的方法和物質(zhì)也可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試中。本文所提及的所有出版物和其它參考文獻(xiàn)整體地并入本文做為參考。在沖突情況下，本說明書包括定義為優(yōu)先。雖然本文引用數(shù)個(gè)文件，此引用并不構(gòu)成以下認(rèn)可任何這些文件構(gòu)成為本領(lǐng)域內(nèi)公知常識的一部分。本說明書和權(quán)利要求通篇中，詞語“包含(comprise)”或變形例如“包含(comprise^comprising)”將被理解為包含所述整體或整體組但不排除任何其它整體或整體組。材料、方法、和實(shí)施例僅僅是說明性的而不意在限制。示例實(shí)施例1 鼠抗人⑶52抗體的產(chǎn)生下列工作實(shí)施例中的鼠抗人⑶52抗體通過使用來自⑶1背景的人類⑶52轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞免疫CDl株小鼠而產(chǎn)生(圖1A)，其中轉(zhuǎn)基因小鼠的鼠B細(xì)胞和T細(xì)胞表面上的人類CD52呈現(xiàn)通過流式細(xì)胞術(shù)而證實(shí)。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠具有與免疫小鼠相同的背景 (CDl)，來自轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞在細(xì)胞表面上以天然形式呈現(xiàn)人類CD52為獨(dú)特的、非己抗原，免疫的非轉(zhuǎn)基因小鼠初始朝人類CD52發(fā)起抗體反應(yīng)。為收集人類CD52轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞，將小鼠安樂死，取出脾臟并經(jīng)由通過注射器而制備單細(xì)胞懸浮液。接著通過腹膜內(nèi)(i. P.)注射用收集的人類CD52陽性脾細(xì)胞以每只小鼠ΙΟΟμ 1中切IO6個(gè)與或者不與弗氏完全佐劑(Freund' s Complete Adjuvant) 一起對CDl小鼠免疫。在使用弗氏不完全佐劑，腹膜內(nèi)注射，用轉(zhuǎn)基因小鼠人類CD52陽性脾細(xì)胞以每只鼠100μ 1中切IO6個(gè)第一次免疫之后，每兩周對小鼠給予兩次加強(qiáng)劑量 (booster dose) 0對于所有小鼠，在免疫之前對每只小鼠收集眼出血100-200微升于黃色蓋血清分離管中，以確定基礎(chǔ)水平反應(yīng)性，在每輪免疫之后一周收集以確定基礎(chǔ)水平反應(yīng)性，并在每輪免疫之后一周收集以確定抗人⑶52特異性免疫反應(yīng)。將對CHO Kl細(xì)胞(被改造以表達(dá)人類⑶52蛋白)，而不對親代CHO Kl細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的抗人⑶52反應(yīng)性(通過FACS檢測)的小鼠處死，在無菌條件下收集血液并收集脾臟以產(chǎn)生雜交瘤。通過在免疫之后3-4 天使用非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞-系SP2/0 Agl4或NSl骨髓瘤細(xì)胞作為融合伴侶(fusion partner)而產(chǎn)生雜交瘤。將融合細(xì)胞放置于包含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的完全生長培養(yǎng)基中以產(chǎn)生雜交瘤。對許多雜交瘤上清液篩選后，選擇數(shù)個(gè)產(chǎn)生特異性抗人CD52抗體的
64克隆，并對其進(jìn)一步亞克隆以得到克隆群體。按比例增加產(chǎn)生抗人CD52抗體的雜交瘤克隆以進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)展。實(shí)施例2 鼠抗人⑶52抗體的重鏈和輕鏈的PCR分析通過測試雜交瘤上清液其抗人⑶52反應(yīng)性的存在而鑒定數(shù)個(gè)鼠抗人⑶52單克隆抗體(圖1B)。選擇單獨(dú)的克隆并通過PCR克隆和測序來鑒定小鼠的重鏈可變序列和輕鏈可變序列。與YTH 34. 5 HL(即，Campath IG κ (大鼠)和試劑抗體CF1D12 (CF1D12 κ) (Invitrogen Life Science ^Technologies)相比較的輕鏈序列示于圖2中。類似地，與YTH 34. 5HL和試劑抗體CF1D12相比較的重鏈序列示于圖3中。鑒定出總共10個(gè)獨(dú)特的輕鏈可變序列和11個(gè)獨(dú)特的重鏈可變序列。如果包括 Campath⑧和CF1D12，則在抗人⑶52抗體的輕鏈內(nèi)，鑒定出7個(gè)獨(dú)特的⑶R-I區(qū)(表1)，8 個(gè)獨(dú)特的CDR-2區(qū)(表幻和7個(gè)獨(dú)特的CDR-3區(qū)(表3)。表1:輕鏈CDR-I序列
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的輕鏈和重鏈包括在以下中找到的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)a)分別在SEQIDNOs 3 禾口 16 中；b)分別在SEQIDNOs 4 禾口 17 中；c)分別在SEQIDNOs 5 禾口 18 中；d)分別在SEQIDNOs 6 禾口 19 中；e)分別在SEQIDNOs 7 禾口 20 中；f)分別在SEQIDNOs 8 禾口 21 中；g)分別在SEQID NOs 9和22中；h)分別在SEQ ID NOs 10 禾口 23 中；i)分別在SEQ ID NOs 11 禾口 24 中； j)分別在 SEQ ID NOs 12 禾口 25 中;k)分別在SEQ ID NOs 12和137中；或 1)分別在 SEQ ID NOs 13 禾口 26 中。
2.一種單克隆抗人CD52抗體，或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合至與權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分所結(jié)合的人類CD52上的表位相同的表位。
3.一種單克隆抗人CD52抗體，或其抗原結(jié)合部分，其與權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分競爭或交叉競爭。
4.如權(quán)利要求1、2、或3所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述抗體是人源化抗體、鼠抗體、或嵌合抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述重鏈的骨架區(qū)利用 VH3-72或VH3-23人類生殖系序列，并且其中所述輕鏈的骨架區(qū)利用VK2 AlSb人類生殖系序列。
6.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述抗體包括重鏈 (H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，和輕鏈(L)-CDR1、L-CDR2、和 L-CDR3，其氨基酸序列為a)分別為SEQ ID NOs :51、59、69、29、36、和 43 ；b)分別為SEQ ID NOs :50、60、69、四、37、和 43 ；c)分別為SEQ ID NOs :50、61、68、四、38、和 43 ；d)分別為SEQ ID NOs :50、61、69、四、36、和 43 ；e)分別為SEQ ID NOs :50、62、69、29、39、和 43 ；f)分別為SEQ ID NOs :52、61、70、30、40、和 43 ；g)分別為SEQ ID NOs :53、63、71、31、36、和 44 ；h)分別為SEQ ID NOs :54、64、71、31、36、和 45 ；i)分別為SEQ ID NOs :55、63、72、31、36、和 46 ； j)分別為 SEQ ID NOs :56、65、73、32、41、和 47 ；k)分別為 SEQ ID NOs :56、65、四4、32、41、和 47 ；或 1)分別為 SEQ ID NOs :56、66、74、33、41、和 48。
7.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的輕鏈和重鏈 a)分別包括SEQ ID NOs :3和16的氨基酸序列；b)分別包括SEQID NOs 4和17的氨基酸序列；c)分別包括SEQID NOs :5和18的氨基酸序列；d)分別包括SEQID NOs 6和19的氨基酸序列；e)分別包括SEQID NOs :7和20的氨基酸序列；f)分別包括SEQID NOs 8和21的氨基酸序列；g)分別包括SEQID NOs 9和22的氨基酸序列；h)分別包括SEQID NOs 10和23的氨基酸序列；i)分別包括SEQID NOs 11和24的氨基酸序列；j)分別包括SEQ ID NOs 12和25的氨基酸序列；或 k)分別包括SEQ ID NOs 13和26的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述重鏈和所述輕鏈a)分別包括SEQID NOs :103和102的氨基酸序列；b)分別包括SEQID NOs :136和138的氨基酸序列；c)分別包括SEQID NOs 137和138的氨基酸序列；d)分別包括SEQID NOs :139和147的氨基酸序列；e)分別包括SEQID NOs :149和155的氨基酸序列；f)分別包括SEQID NOs 149和156的氨基酸序列；g)分別包括SEQID NOs 158和165的氨基酸序列；h)分別包括SEQID NOs :158和166的氨基酸序列；i)分別包括SEQID NOs :159和165的氨基酸序列； j)分別包括SEQ ID NOs 159和166的氨基酸序列； k)分別包括SEQ ID NOs :161和166的氨基酸序列；或 1)分別包括SEQ ID NOs :163和166的氨基酸序列。
9.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs 272和273的氨基酸序列，且無信號序列。
10.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs :274和275的氨基酸序列，且無信號序列。
11.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs 276和278的氨基酸序列，且無信號序列。
12.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs 277和278的氨基酸序列，且無信號序列。
13.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs 279和觀0的氨基酸序列，且無信號序列。
14.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈和輕鏈分別包括SEQ ID NOs 281和282的氨基酸序列，且無信號序列。
15.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的輕鏈包括選自SEQ ID NOs 102、138、145-148、153-157、和 164-168 的氨基酸序列。
16.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的輕鏈包括選自SEQ ID NOs 273、275、278、觀0、和282的氨基酸序列，且無信號序列。
17.一種抗體輕鏈或其部分，包括選自SEQ ID NOs :102、138、145-148、153-157、 164-168、273、275、278、觀0、和282的氨基酸序列，且無信號序列若其存在。
18.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈包括選自SEQ ID NOs 103、136、137、139-144、149-152、和 158-163 的氨基酸序列。
19.一種單克隆抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體的重鏈包括選自SEQ ID NOs :272、274、276、277、279、和281的氨基酸序列，且無信號序列。
20.一種抗體重鏈或其部分，包括選自 SEQ ID NOs :103、136、137、139-144、149-152、 158-163、272、274、276、277、279、和的氨基酸序列，且無信號序列若其存在。
21.如權(quán)利要求1-8、15、16、和18中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中所述抗體是IgGl、 IgG2、IgG3、或 IgG4 分子。
22.如權(quán)利要求1-16、18和19中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合部分，其中所述抗原結(jié)合部分是單鏈抗體、Fv、Fab、Fab，、F (ab，)2、Fd、單鏈Fv分子(scFv)、雙特異性單鏈Fv 二聚體、雙抗體、區(qū)域缺失抗體或單域抗體(dAb)。
23.如權(quán)利要求1、2或3所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分結(jié)合至包括SEQ ID NO :104的氨基酸序列，并且任選地，所述抗體或抗原結(jié)合部分至 SEQ ID NO 104的結(jié)合通過在SEQ ID NO :104的殘基4、7、8、和11中的一個(gè)或多個(gè)處的丙氨酸取代而減少。
24.如權(quán)利要求1-16、18、和19中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分具有選自以下的一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)a)消減T或B淋巴細(xì)胞，或二者；b)與B淋巴細(xì)胞相比，優(yōu)先地消減T淋巴細(xì)胞；c)增加TNF-α、IL-6、或MCP-I的循環(huán)血清水平；d)介導(dǎo)CD52表達(dá)細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；e)介導(dǎo)CD52表達(dá)細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)；f)在阿侖單抗的中和抗體的存在下結(jié)合至人⑶52；和g)促進(jìn)人類T或B淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，或促進(jìn)二者中的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。
25.一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-16、18、和19中任一項(xiàng)所述的抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分，或所述抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分。
26.如權(quán)利要求25所述的分離的核酸，其中所述分離的核酸包括a)選自SEQID NOs =283,285,287,288,290, Ρ 292的重鏈核苷酸序列，或不具有編碼信號肽的序列的所述核苷酸序列；b)選自SEQID NOs J84J86J89J91、和四3的輕鏈核苷酸序列，或不具有編碼信號肽的序列的所述核苷酸序列；或c)a)和b) 二者的核苷酸序列。
27.如權(quán)利要求沈所述的分離的核酸，其中所述分離的核酸包括選自以下的重鏈核苷酸序列和輕鏈核苷酸序列a)分別選自SEQID NO :283和SEQ ID NO J84，二者均不具有編碼信號肽的序列；b)分別選自SEQID NO :285和SEQ ID NO J86，二者均不具有編碼信號肽的序列；c)分別選自SEQID NO :287和SEQ ID NO J89，二者均不具有編碼信號肽的序列；d)分別選自SEQID NO :288和SEQ ID NO J89，二者均不具有編碼信號肽的序列；e)分別選自SEQID NO :290和SEQ ID NO J91，二者均不具有編碼信號肽的序列；和f)分別選自SEQID NO :292和SEQ ID NO :293，二者均不具有編碼信號肽的序列。
28.一種包含重鏈核苷酸序列的分離的核酸和一種包含輕鏈核苷酸序列的分離的核酸用于制備藥物中的用途，所述藥物用來治療需要治療的病人，其中所述重鏈核苷酸序列和所述輕鏈核苷酸序列a)分別選自SEQID NO :283和SEQ ID NO J84，二者均不具有編碼信號肽的序列；b)分別選自SEQID NO 285和SEQ ID NO J86，二者均不具有編碼信號肽的序列；c)分別選自SEQID NO 287和SEQ ID NO J89，二者均不具有編碼信號肽的序列；d)分別選自SEQID NO :288和SEQ ID NO J89，二者均不具有編碼信號肽的序列；e)分別選自SEQID NO :290和SEQ ID NO J91，二者均不具有編碼信號肽的序列；和f)分別選自SEQID NO :292和SEQ ID NO :293，二者均不具有編碼信號肽的序列。
29.一種重組載體，其包括(1)編碼權(quán)利要求1-16、18、和19中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸序列、(2)編碼權(quán)利要求1-16、18、和19中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸序列、或(3) 二者。
30.一種宿主細(xì)胞，其包括編碼權(quán)利要求1-16、18、和19中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的第一核酸序列，所述第一核酸序列可操作地連接至表達(dá)控制元件，和編碼所述單克隆抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的第二核酸序列，所述第二核酸序列可操作地連接至表達(dá)控制元件。
31.一種制造抗人CD52抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，包括將權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞維持在適合所述抗體或其抗原結(jié)合部分表達(dá)的條件下。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，進(jìn)一步包括分離所述抗體或其抗原結(jié)合部分。
33.一種組合物，包括權(quán)利要求1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，以及藥學(xué)上可接受的媒介物或載體。
34.一種用于治療需要治療的病人的方法，包括對所述病人施用有效量的權(quán)利要求 1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分、或權(quán)利要求33所述的組合物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述病人正接受移植。
36.一種用于治療需要治療的病人中的自體免疫疾病的方法，包括對所述病人施用有效量的權(quán)利要求1_16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分、或權(quán)利要求 33所述的組合物。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述自體免疫疾病為多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、或血管炎。
38.一種用于治療需要治療的病人中的癌癥的方法，包括對所述病人施用有效量的權(quán)利要求1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分、或權(quán)利要求33 所述的組合物。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述癌癥為白血病。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述癌癥為淋巴瘤。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述癌癥為T細(xì)胞惡性腫瘤，并且相較于B細(xì)胞，所述抗體或抗原結(jié)合部分優(yōu)先地消減T細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述癌癥為實(shí)體腫瘤。
43.如權(quán)利要求34、36、或38所述的方法，進(jìn)一步包括對所述病人施用嗜中性粒細(xì)胞或 NK細(xì)胞刺激劑。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述刺激劑為G-CSF或GM-CSF。
45.如權(quán)利要求34、36、或38所述的方法，進(jìn)一步包括對所述病人施用T調(diào)節(jié)細(xì)胞刺激劑。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述刺激劑為雷帕霉素。
47.一種在需要的病人中抑制血管生成的方法，包括對所述病人施用有效量的權(quán)利要求1-16、18、19、和21-M中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述病人有實(shí)體腫瘤。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述病人有新血管形成。
50.如權(quán)利要求1-16、18、19、和21-M中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分用于制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療需要治療的病人中的自體免疫疾病。
51.如權(quán)利要求1_16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分用于制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療需要治療的病人中的癌癥。
52.如權(quán)利要求1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分用于制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療需要移植的病人。
53.如權(quán)利要求1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分用于制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療需要治療的病人中的新血管形成。
54.如權(quán)利要求1-16、18、19、和21- 中任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分用作藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對人類CD52具有結(jié)合特異性的人源化免疫球蛋白、小鼠單克隆抗體及嵌合抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種人源化免疫球蛋白輕鏈和人源化免疫球蛋白重鏈。本發(fā)明還涉及包含編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白輕鏈或重鏈的序列的分離核酸、重組載體及宿主細(xì)胞，并涉及人源化免疫球蛋白的制備方法。該人源化免疫球蛋白可用于治療用途以治療，例如，自體免疫疾病、癌癥、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性硬化癥及慢性淋巴細(xì)胞白血病。
文檔編號A61K39/395GK102459628SQ201080031266
公開日2012年5月16日申請日期2010年5月13日優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者B.L.羅伯茨, S.尚卡拉, W.H.布龍迪克, W.M.西德爾斯申請人:基酶有限公司

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該技術(shù)已申請專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：B.L.羅伯茨;S.尚卡拉;W.H.布龍迪克;W.M.西德爾斯
技術(shù)所有人：基酶有限公司
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