專利名稱：抗帕金蟲的高免血清及制備方法和貝類體內(nèi)帕金蟲的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測貝類體內(nèi)帕金蟲的方法，具體地說，涉及一種抗帕金蟲的高免血清及其制備方法，以及間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)檢測貝類體內(nèi)帕金蟲的方法。
背景技術(shù)：
帕金蟲(perkinsus marinus)是寄生在貝類體內(nèi)的一種原生動(dòng)物，是導(dǎo)致海水養(yǎng)殖貝類病害最常見的病原生物之一。最初于1946年在美洲牡蠣體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而在我國直到1997年才在櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、皺紋盤鮑、菲律賓蛤仔體內(nèi)檢測到帕金蟲。帕金蟲屬于原生動(dòng)物亞界中的頂復(fù)門、帕金蟲綱、帕金蟲目、帕金蟲科、帕金蟲屬。
Ray的液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基檢測法(Fluid ThioglycollateMedium，F(xiàn)TM)(A culture technique for the diagnosis of infectionswith Dermocystidium marinum.Mackin，Owen，and Collier，in oyster.Science，1952b，116360-361)是目前廣泛應(yīng)用的帕金蟲檢測技術(shù)。將活貝類樣品稱重后，取全部或部分軟體部，勻漿，放到50mL三角燒瓶中，加入20mL滅菌的液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基和100μL氯霉素混勻，然后在培養(yǎng)基表面輕輕覆蓋2mL制霉菌素，室溫下黑暗培養(yǎng)7天；培養(yǎng)結(jié)束后，在1500r/min條件下離心10分鐘，去掉上清液，加入20mL、2mol/L的NaOH，60℃恒溫消化2-6小時(shí)；消化后在1500r/min條件下離心10分鐘，去掉上清液；用去離子水10mL溶解，混勻，1500r/min條件下離心10min；如此清洗3次后，樣品可以在0.2％的NaN3中冷藏儲(chǔ)存。帕金蟲計(jì)數(shù)前，加入1mL的盧哥氏染液，充分混勻，帕金蟲被染成黑色。此時(shí)在光學(xué)顯微鏡下，清晰可見黑色帕金蟲。在液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基中，帕金蟲只生長而不繁殖，所以可以對(duì)貝類體內(nèi)的帕金蟲進(jìn)行定量。
Dangan和Roberson應(yīng)用抗體標(biāo)記和熒光染色技術(shù)，發(fā)展了一種比液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基技術(shù)更靈敏的方法(Bindingspecificities of mono-and polyclonal antibodies to the protozoanoyster pathogen Perkinsus marinus.Disease of Aquatic Organism，1993，159-22)，可以將少量的帕金蟲檢測出來，甚至可以檢測環(huán)境水體中帕金蟲的存在。Fong等提供了一種合成帕金蟲DNA探針的方法(Small subunit ribosomal RNA gene sequence of the oysterparasite Perkinsus marinus.Molecule Marine Biology Biotechnology，1993，2346-350)，這一技術(shù)具有種的特異性，能夠?qū)⑴两鹣x同其他微生物區(qū)分開來。這些技術(shù)固然精確，但都不如液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基方法簡便，易于操作，但是液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基方法工作量比較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種貝類體內(nèi)帕金蟲的快速檢測方法。
為完成上述目的，本發(fā)明首先提供一種抗帕金蟲的高免血清的制備方法，該方法包括帕金蟲的培養(yǎng)與純化步驟，在該步驟中，取出貝類軟體部分，研磨，加入液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基，在室溫黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)1周后，分別使用網(wǎng)目數(shù)為30～140的紗絹以網(wǎng)目數(shù)由高至低的方式對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行3～4次帕金蟲純化；免疫及分離血清步驟，在該步驟中，將培養(yǎng)液中的帕金蟲定量到105～107個(gè)/mL，在體重為1.5～2.5千克的雄兔背部采用4～6點(diǎn)注射的方式免疫，共免疫3～5次，免疫間隔為8～12天，在最后一次免疫的7天后采血，分離血清，得到抗帕金蟲的高免血清。
在上述制備方法的帕金蟲的培養(yǎng)與純化步驟中，優(yōu)選使培養(yǎng)液分別通過網(wǎng)目為135、75、40的紗絹進(jìn)行帕金蟲的純化。
在上述制備方法的免疫及分離血清步驟中，優(yōu)選將培養(yǎng)液中的帕金蟲定量到106個(gè)/mL，共免疫5次，免疫間隔為10天。
本發(fā)明還提供根據(jù)上述制備方法得到的抗帕金蟲的高免血清。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的抗帕金蟲的高免血清，可以用于檢測貝類體內(nèi)的帕金蟲。
本發(fā)明建立的間接ELISA檢測方法，首先是在培養(yǎng)和純化帕金蟲，以及制備抗帕金蟲的高免血清的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。本發(fā)明所提供的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法包括(1)取貝類的軟體組織，研磨得到勻漿液，加入包被液，將所得混合液加入到酶標(biāo)反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，濕盒過夜；(2)用洗滌液洗板；(3)用封閉液封閉，洗滌；(4)加上1∶3000～1∶5000倍稀釋的按上述方法制備的抗帕金蟲的高免血清，洗滌；(5)加上酶標(biāo)二抗，洗滌；(6)加顯色液，避光顯色；(7)終止液終止顯色；(8)酶標(biāo)儀測定OD492值。
在本發(fā)明的檢測方法中所使用的抗帕金蟲的高免血清優(yōu)選是1∶4000倍稀釋的。
在本發(fā)明的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法中所使用的試劑分別為包被液pH9～10的碳酸鹽緩沖液；封閉液含0.5％脫脂乳的pH7～8的磷酸鹽緩沖液；洗滌液含0.05％Tween-20的pH7～8的磷酸鹽緩沖液；顯色液Na2HPO4溶液、檸檬酸溶液與鄰苯二胺的混合液，臨用時(shí)加H2O2；終止液H2SO4。
在上述貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法中，所使用的陽性對(duì)照為經(jīng)液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的已純化的帕金蟲，陰性對(duì)照為貝類的組織勻漿液，按1000單位/mL加青霉素和鏈霉素，無菌過濾得到。
本發(fā)明的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法可用于大批量檢測貝類體內(nèi)帕金蟲。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在檢測帕金蟲的高免血清特異性強(qiáng)、反應(yīng)效價(jià)高；檢測時(shí)間短，一般15個(gè)小時(shí)即可檢出結(jié)果；樣品無需無菌化處理；操作簡便易行，可以標(biāo)準(zhǔn)化為產(chǎn)品；檢測成本低廉，適于推廣；可以進(jìn)行大批量檢測，用于流行病學(xué)調(diào)查。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明優(yōu)選采用的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法包括(1)取貝類的軟組織，研磨得到勻漿液，加入與該勻漿液等體積的包被液，將所得混合液加入到酶標(biāo)反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，加入量100μL/孔，于4℃濕盒過夜；(2)用洗滌液洗板三次，每次震蕩洗滌1分鐘；(3)用200μL/孔的封閉液封閉，于37℃封閉1小時(shí)，洗滌；(4)加上1∶4000倍稀釋的由上述方法制得的抗帕金蟲的高免血清，100μL/孔，于37℃經(jīng)1小時(shí)，洗滌；(5)加上酶標(biāo)二抗，100μL/孔，于37℃經(jīng)1小時(shí)，洗滌；(6)加顯色液，100μL/孔，于37℃避光顯色10分鐘；(7)用50μL/孔的終止液終止顯色；(8)用酶標(biāo)儀測定OD492值。
在本發(fā)明的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法中所使用的試劑優(yōu)選分別為包被液pH9.6、0.05M的碳酸鹽緩沖液；封閉液含0.5％脫脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖液；洗滌液含0.05％的Tween-20的pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖液；顯色液將10.3mL的0.2M Na2HPO4溶液和9.7mL的0.1M檸檬酸溶液混合，加上10mg的鄰苯二胺，臨用時(shí)加15μL的30％的H2O2；終止液2M的H2SO4。
以下通過實(shí)施例的方式具體說明本發(fā)明抗帕金蟲的高免血清的制備方法以及使用所制備的抗帕金蟲的高免血清間接ELISA檢測貝類體內(nèi)帕金蟲的方法。
制備實(shí)施例(抗帕金蟲的高免血清的制備)帕金蟲的培養(yǎng)與純化取出貝類軟體部分，研磨，加入液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基，在室溫黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)1周后，使培養(yǎng)液分別通過網(wǎng)目為135、75、40的紗絹進(jìn)行帕金蟲的純化。
免疫及分離血清將培養(yǎng)液中的帕金蟲采用液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基檢測法定量到106個(gè)/mL，在2千克左右的新西蘭雄兔背部采用6點(diǎn)注射的方式免疫，共免疫5次，免疫間隔為10天，在最后一次免疫的7天后采血，分離血清，得到抗帕金蟲的高免血清，備用。
應(yīng)用實(shí)施例(貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測)取5個(gè)貝類樣品(樣品1～5)進(jìn)行體內(nèi)帕金蟲檢測，每個(gè)貝類的處理方法和檢測方法相同。從1個(gè)貝類體內(nèi)取1克軟體組織，研磨得到約1mL勻漿液，加上1mL碳酸鹽緩沖液(pH9.6，0.05M)，將所得混合液加入到聚乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，每個(gè)樣品重復(fù)兩個(gè)孔，100μL/孔，4℃濕盒過夜。
用含0.05％Tween-20的pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖液洗板三次，300μL/孔，每次震蕩洗滌1分鐘，將板甩干。
用含0.5％脫脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖液封閉反應(yīng)板，200μL/孔，于37℃經(jīng)1小時(shí)，洗板三次。
用含0.5％脫脂乳的pH7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖液將上述制備實(shí)施例得到的抗帕金蟲的高免血清進(jìn)行1∶4000倍稀釋，100μL/孔，于37℃經(jīng)1小時(shí)，洗板三次。
加上酶標(biāo)二抗，100μL/孔，于37℃經(jīng)1小時(shí)，洗板三次。
加上鄰苯二胺-過氧化氫顯色液，100μL/孔，于37℃避光顯色10分鐘。
用50μL/孔的2M H2SO4終止液終止顯色。
用酶標(biāo)儀測定OD492值，結(jié)果見表1。
對(duì)于每一個(gè)樣品，整個(gè)檢測過程15小時(shí)即可完成。
在同一塊酶標(biāo)板上同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照與樣品的檢測。其中，空白對(duì)照是在孔內(nèi)不加入抗帕金蟲的高免血清，陽性對(duì)照是使用經(jīng)液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的已純化的帕金蟲，陰性對(duì)照是使用貝類的組織勻漿液，按1000單位/mL加青霉素和鏈霉素，無菌過濾得到。本次實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照OD492值為0.054，陰性對(duì)照OD492值為0.212。
表1 貝類樣品的OD492值

帕金蟲檢測的結(jié)果判定根據(jù)所得到的OD492值，使用下述公式判定樣品中帕金蟲的存在(樣品OD492值-空白OD492值)/(陰性O(shè)D492值-空白OD492值)≥2上述比值大于或等于2者表明樣品為陽性，即樣品內(nèi)存在帕金蟲。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測方法，當(dāng)樣品OD492值大于或等于0.37時(shí)即為陽性。
另外，在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照、樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照可以在同一酶標(biāo)板上完成，每塊酶標(biāo)板可在15小時(shí)內(nèi)同時(shí)檢測至少40個(gè)樣品，因此可以用很短的時(shí)間進(jìn)行大批量的檢測。
權(quán)利要求
1.一種抗帕金蟲的高免血清的制備方法，該方法包括帕金蟲的培養(yǎng)與純化步驟，在該步驟中，取出貝類軟體部分，研磨，加入液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基，在室溫黑暗狀態(tài)下培養(yǎng)1周后，分別使用網(wǎng)目數(shù)為30～140的紗絹以網(wǎng)目數(shù)由高至低的方式對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行3～4次帕金蟲純化；免疫及分離血清步驟，在該步驟中，將培養(yǎng)液中的帕金蟲定量到105～107個(gè)/mL，在體重為1.5～2.5千克的雄兔背部采用4～6點(diǎn)注射的方式免疫，共免疫3～5次，免疫間隔為8～12天，在最后一次免疫的7天后采血，分離血清，得到抗帕金蟲的高免血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗帕金蟲的高免血清的制備方法，其中，在帕金蟲的培養(yǎng)與純化步驟中，使培養(yǎng)液分別通過網(wǎng)目為135、75、40的紗絹進(jìn)行帕金蟲的純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗帕金蟲的高免血清的制備方法，其中，在免疫及分離血清步驟中，將培養(yǎng)液中的帕金蟲定量到106個(gè)/mL，共免疫5次，免疫間隔為10天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的制備方法得到的抗帕金蟲的高免血清。
5.貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法，該方法包括(1)取貝類的軟體組織，研磨得到勻漿液，加入包被液，將所得混合液加入到酶標(biāo)反應(yīng)板的反應(yīng)孔內(nèi)，濕盒過夜；(2)用洗滌液洗板；(3)用封閉液封閉，洗滌；(4)加上1∶3000～1∶5000倍稀釋的權(quán)利要求4所述的抗帕金蟲的高免血清，洗滌；(5)加上酶標(biāo)二抗，洗滌；(6)加顯色液，避光顯色；(7)用終止液終止顯色；(8)用酶標(biāo)儀測定OD492值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法，其中所使用的抗帕金蟲的高免血清是1∶4000倍稀釋的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法，其中所使用的試劑分別為包被液pH9～10的碳酸鹽緩沖液；封閉液含0.5％脫脂乳的pH7～8的磷酸鹽緩沖液；洗滌液含0.05％Tween-20的pH7～8的磷酸鹽緩沖液；顯色液Na2HPO4溶液、檸檬酸溶液與鄰苯二胺的混合液，臨用時(shí)加H2O2；終止液H2SO4。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的貝類體內(nèi)帕金蟲的間接ELISA檢測方法，其中所使用的陽性對(duì)照為經(jīng)液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的已純化的帕金蟲，陰性對(duì)照為貝類的組織勻漿液，按1000單位/mL加青霉素和鏈霉素，無菌過濾得到。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗帕金蟲的高免血清的制備方法，并提供檢測貝類體內(nèi)帕金蟲的方法。本發(fā)明采用純化的液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)并純化帕金蟲，通過免疫制備高免血清，并使用所制備的抗帕金蟲的高免血清建立間接ELISA方法檢測貝類體內(nèi)帕金蟲。本發(fā)明所需儀器設(shè)備簡單，檢測成本低、檢測時(shí)間短、可以進(jìn)行大批量樣品檢測，能夠滿足有關(guān)研究單位、質(zhì)檢部門批量檢測貝類體內(nèi)帕金蟲的要求。
文檔編號(hào)G01N33/547GK1779463SQ200410091370
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者樊景鳳, 梁玉波, 宋立超, 張喜昌 申請人:國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心