專利名稱：犬科動物抗犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝，尤其是提供了一種犬科動物抗犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝及制劑，用于犬科動物相應(yīng)重要疫病的緊急預(yù)防與治療，屬于生物制品研制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在我國隨著犬、貉、狐等犬科毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，每年毛皮動物養(yǎng)殖數(shù)量達幾百萬只。但是，許多犬科動物重要疫病如犬瘟熱、犬細小病毒病、犬傳染性肝炎(狐貍腦炎)、犬傳染性喉氣管炎、犬流感、犬副流感、犬冠狀病毒病、犬鉤端螺旋體病等疫病的不斷發(fā)生嚴重威脅著犬及毛皮經(jīng)濟動物的健康，每年為此造成的經(jīng)濟損失巨大。同時，一些人獸共患疾病也直接威脅著人類的健康。
在實際生活中控制這些疫病的有效辦法是對動物進行疫苗的免疫預(yù)防接種，但由于現(xiàn)有疫苗保護率不高，免疫效果不理想，加之在飼養(yǎng)管理方面還存在不完善的環(huán)節(jié)，因此不能完全控制這些疾病在犬科動物中的發(fā)生和流行。
目前，國內(nèi)外已有多種抗細菌毒素、抗病毒血清或免疫球蛋白制劑應(yīng)用于臨床，用于疾病的緊急預(yù)防與治療，如抗狂犬病血清、破傷風抗毒素血清、白喉抗毒素血清等。我國已經(jīng)有人研制了抗犬、貉、狐及貓的抗病毒免疫球蛋白制劑，但都是免疫馬屬動物制備的，必須經(jīng)過酶切后去除免疫球蛋白的Fc片段，否則容易引起異源蛋白過敏，工藝復(fù)雜。另外，血液制品在制備過程中，由于病毒的復(fù)制或動物感染其它病毒性疾病，可能會造成血液污染某些病毒，如不進行適當處理，則會給使用血液制品制劑帶來安全隱患，因此，在血液制品制備過程中必須有妥善的病毒滅活工藝步驟，但目前為此，在動物用血液制品的制備工藝上還未見有病毒去除、滅活的技術(shù)方法應(yīng)用于生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種犬科動物抗犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供了上述制備工藝生產(chǎn)的生物制劑，用于該科犬、貉、狐、狼等動物重要疫病的緊急預(yù)防與治療。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下以一種或幾種引起犬科動物重要疫病的病原，如犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬鉤端螺旋體病原體等，經(jīng)犬、猴、貓等動物原代、傳代細胞或細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖后，經(jīng)減毒或細菌滅活后，加入佐劑制成免疫原，按一定程序?qū)θ苿游镞M行免疫，分離血清，滅活病毒，并按一定工藝制成單一或聯(lián)合高免血清或抗體制劑。
所述犬科動物主要是指犬、貉、狐、狼等。
具體制備方法包括以下步驟1.免疫原的制備以一種或幾種引起犬科動物重要疫病的病原，如犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬鉤端螺旋體等病原體包括強毒株和弱毒株，經(jīng)合適的細胞如犬、貓、猴原代細胞或傳代細胞(MDCK細胞、F81細胞、Vero細胞)和細菌培養(yǎng)基(如柯索夫培養(yǎng)基等)進行培養(yǎng)增殖，使病毒滴度達104個TCID50/0.1mL以上或細菌細菌濃度達2×109個/mL以上后，經(jīng)減毒或細菌滅活處理，與免疫佐劑按1~9∶1的比例混合制成免疫原。制備單一或聯(lián)合血清時將所制免疫原單獨或幾種混合后對犬、貉、狐等犬科動物進行免疫。
2.動物免疫選用經(jīng)檢查健康合格的犬科動物進行免疫。免疫分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段，一般基礎(chǔ)免疫2針，強化免疫1針，采用肌肉或皮下多點注射途徑，每個針次間隔14-30天，免疫原用量根據(jù)所用免疫原滴度而定。
3.采血及血清分離一般在強化免疫后14-30之間進行試血，測定抗體效價，如達到要求，即可大量采血。采血采用頸靜脈或股靜脈放血法，用導管將血液采集到預(yù)先裝有少量滅菌生理鹽水的離心瓶中，待血塊收縮完全后置4℃過夜，離心收取血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.成品制備及檢定將收獲的高免血清經(jīng)過濾除菌，制成半成品。將半成品進行效價測定后，按一定效價進行稀釋或濃縮，直接分裝冷藏，制成冷凍高免血清制劑，也可加入一定量的保護劑后分裝凍干，制成凍干高免血清制劑；還可將半成品經(jīng)鹽析、透析的方法提取出抗體，并按前述方法制成冷藏抗體制劑及凍干抗體制劑。所制制劑經(jīng)抽樣進行無菌檢驗合格后可作為成品登記保存。
本發(fā)明采用犬科動物免疫制備犬科動物重要疫病高免血清及制劑，積極效果在于由于動物種屬一致，不會出現(xiàn)異源蛋白過敏問題，因此在生產(chǎn)上可直接使用高免血清，或經(jīng)簡單鹽析方法制成抗體，而不需要酶解、消化等步驟，工藝簡化，降低成本。本發(fā)明在制備工藝中還提出了一種血液制品去除、滅活病毒的工藝步驟，用此法對血清處理后，可滅活所有脂包膜病毒，消除了高免血清制劑因污染病毒可能帶來的安全隱患。利用本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝制備的高免血清制劑，使用后可使機體立即獲得免疫保護能力，用于預(yù)防和治療犬科動物重要疫病，具有療效顯著，臨床癥狀消失迅速，無毒副作用特點，藥物制劑容易保存，便于運輸，保質(zhì)期限長，生產(chǎn)工藝簡單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
為表明本發(fā)明在緊急預(yù)防和治療犬科動物重要疫病方面的積極效果，通過以下臨床數(shù)據(jù)給予證明某犬隊發(fā)生細小病毒性腸炎，全群64條犬，10條發(fā)病，確診后立即對其余54條犬進行本發(fā)明血清緊急預(yù)防注射，每條犬肌肉注射2mL/天，連續(xù)注射2-3天，經(jīng)觀察未再發(fā)現(xiàn)犬發(fā)病。
本發(fā)明制劑可用于犬瘟熱、犬細小病毒性腸炎、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎、犬副流感等犬科動物重要疫病的緊急預(yù)防與治療。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實施例1以犬制備的犬科動物用抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清制劑1.免疫原制備將犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接種MDCK細胞，犬細小病毒接種F81細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。犬瘟熱病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培養(yǎng)3-5天收毒，犬細小病毒培養(yǎng)2-3天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將5種病毒液分別稀釋至病毒滴度均大于104.0個TCID50/0.01mL后混勻，按病毒液∶佐劑＝1-9∶1的比例加入鋁膠或弗氏佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的犬作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量1-2mL/條，第2針2-3mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為3-5mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
實施例2以狐貍制備的犬科動物用抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清制劑1.免疫原制備將犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接種MDCK細胞，犬細小病毒接種F81細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。犬瘟熱病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培養(yǎng)3-5天收毒，犬細小病毒培養(yǎng)2-3天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將5種病毒液分別稀釋至病毒滴度均大于104.0個TCID50/0.01mL后混勻，按病毒液∶佐劑＝1-9∶1的比例加入鋁膠或弗氏佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的狐貍作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量1-2mL/條，第2針2-3mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為3-5mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
實施例3以貉制備的犬科動物用抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清制劑1.免疫原制備將犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接種MDCK細胞，犬細小病毒接種F81細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。犬瘟熱病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培養(yǎng)3-5天收毒，犬細小病毒培養(yǎng)2-3天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將5種病毒液分別稀釋至病毒滴度均大于104.0個TCID50/0.01mL后混勻，按病毒液∶佐劑＝1-9∶1的比例加入鋁膠或弗氏佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的貉作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量1-2mL/條，第2針2-3mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為3-5mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒和副流感病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
實施例4以犬制備的犬科動物用抗犬瘟熱、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清制劑1.免疫原制備將犬瘟熱病毒、犬腺病毒I、II型病毒接種MDCK細胞，犬細小病毒接種F81細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。犬瘟熱病毒、犬腺病毒培養(yǎng)3-5天收毒，犬細小病毒培養(yǎng)2-3天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將4種病毒液分別稀釋至病毒滴度均大于104.0個TCID50/0.01mL后混勻，按病毒液∶佐劑＝1-9∶1的比例加入鋁膠或弗氏佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的犬作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量1-2mL/條，第2針2-3mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為3-5mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量細胞中和試驗和微量血凝抑制試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，犬腺病毒、犬細小病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬瘟熱、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖。
抗犬瘟熱、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱、犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎和犬細小病毒性腸炎聯(lián)合抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
實施例5以犬制備的犬科動物用抗犬瘟熱高免血清制劑1.免疫原制備將犬瘟熱病毒接種MDCK細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)3-5天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將病毒液稀釋至病毒滴度大于104.0個TCID50/0.01mL后，按病毒液∶佐劑＝9∶1的比例加入鋁膠佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的犬作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量0.5-1mL/條，第2針1-2mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為2-3mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量細胞中和試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256，此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量細胞中和試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬瘟熱病毒中和抗體效價不低于1∶256。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬瘟熱高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖。
抗犬瘟熱抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬瘟熱抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
實施例6以犬制備的犬科動物用抗犬細小病毒性腸炎高免血清制劑1.免疫原制備將犬細小病毒接種F81細胞，37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)2-3天收毒，反復(fù)凍融后離心去除細胞碎片，取樣測定病毒滴度。將病毒液稀釋至病毒滴度大于104.0個TCID50/0.01mL后，按病毒液∶佐劑＝9∶1的比例加入鋁膠佐劑，制成免疫原，4℃保存。
2.動物免疫挑選經(jīng)檢驗健康的犬作為受試動物。分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段進行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。
基礎(chǔ)免疫2針，第1針用量0.5-1mL/條，第2針1-2mL/條，間隔14天，第2針免疫1個月后試血測定抗體效價，根據(jù)效價確定加強免疫的時機及免疫劑量。
強化免疫1針，一般在基礎(chǔ)免疫結(jié)束后1個月進行，免疫劑量為2-3mL/條，在強化免疫后14天和30天時試血測定抗體效價，當抗體效價達峰值后安排采血。
3.采血及血清分離采用頸靜脈或股靜脈放血，血液用滅菌離心瓶收集，采血前在離心瓶中加入少量滅菌生理鹽水，采血時使生理鹽水充分潤壁。采血結(jié)束后將離心瓶置室溫放置，待血塊凝固并收縮后放入4℃冷室過夜，之后5000rpm離心30分鐘，分離收獲血清。
4.病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時。
5.半成品與成品制備及標準檢測a.將同一批收獲的高免血清混合后，用0.22μm濾膜過濾除菌，即獲得制品原液。
b.通過微量血凝抑制試驗檢測制品原液抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮血清，使血清中犬細小病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。此即為制備聯(lián)合高免血清的半成品。
c.將同一批收獲的高免血清混合后，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達50％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，用與血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨濃度達33％，室溫靜置1小時后4000rpm離心15分鐘，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小時，再用PBS透析24小時，收獲透析袋內(nèi)液體，用0.22μm濾膜過濾除菌，此即為制備聯(lián)合抗體制劑的半成品。通過微量血凝抑制試驗檢測抗體效價，并根據(jù)效價稀釋或濃縮抗體溶液，使抗體溶液中犬細小病毒血凝抑制抗體效價不低于1∶128。
d.上述半成品經(jīng)檢定合格后，可直接分裝或加入保護劑后制成冷藏制劑或凍干制劑。
抗犬細小病毒高免血清冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬細小病毒高免血清凍干注射劑取半成品按血清∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。
保護劑配方10-20％明膠+40-50％蔗糖。
抗犬細小病毒抗體冷藏注射劑取半成品經(jīng)無菌分裝后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。
抗犬細小病毒抗體凍干注射劑取半成品按抗體∶保護劑＝7∶1的比例加入保護劑后無菌分裝，每瓶5ml，經(jīng)冷凍干燥后封口即得。保護劑同上。
其它項應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版凍干注射液項。
權(quán)利要求
1.一種犬科動物抗犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝，包括以下步驟1)免疫原的制備以一種或幾種引起犬科動物重要疫病的病原，經(jīng)與病毒增殖相適應(yīng)的犬或貓、猴原代細胞或傳代細胞以及與細菌增殖相適應(yīng)的細菌培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖，使病毒滴度達104個TCID50/0.1mL以上或細菌細菌濃度達2×109個/mL以上后，經(jīng)減毒或細菌滅活處理，與免疫佐劑按1~9∶1的比例混合制成免疫原，制備單一或聯(lián)合血清時將所制免疫原單獨或幾種混合后對犬、貉、狐等犬科動物進行免疫；2)動物免疫選用經(jīng)檢查健康合格的犬科動物進行免疫；3)采血及血清分離強化免疫后14-30天之間進行試血，測定抗體效價并采血；4)病毒滅活在收獲的高免血清中加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐溫80，在24℃放置至少6小時，或加入終濃度為0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小時；5)成品制備及檢定將收獲的高免血清經(jīng)過濾除菌后，進行效價測定并按一定效價進行稀釋或濃縮，或經(jīng)硫酸銨鹽析法提取抗體，得本發(fā)明產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征在于步驟1)中犬科動物重要疫病的病原選自犬瘟熱、犬細小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠狀病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬鉤端螺旋體等病原體，包括強毒株和弱毒株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備工藝，其特征在于步驟2)中的免疫分基礎(chǔ)免疫和強化免疫兩個階段，一般基礎(chǔ)免疫2針，強化免疫1針，采用肌肉或皮下多點注射途徑，每個針次間隔14-30天，免疫原用量根據(jù)所用免疫原滴度而定。
全文摘要
本發(fā)明提供一種犬科動物抗犬科動物重要疫病高免血清的制備工藝及制劑，是以一種或幾種引起犬科動物重要疫病的病原，經(jīng)犬、猴、貓等動物原代、傳代細胞或細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖后，加入佐劑制成免疫原，按一定程序?qū)θ苿游镞M行免疫，分離血清，滅活病毒，并按一定工藝制成單一或聯(lián)合高免血清或抗體制劑。由于動物種屬一致，不會出現(xiàn)異源蛋白過敏問題，在生產(chǎn)上可簡化工藝，降低成本。本發(fā)明制劑使用后可使機體立即獲得免疫保護能力，用于預(yù)防和治療犬科動物重要疫病，具有療效顯著，臨床癥狀消失迅速，無毒副作用特點，藥物制劑容易保存，便于運輸，保質(zhì)期限長，生產(chǎn)工藝簡單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1729996SQ20051001701
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月3日
發(fā)明者夏咸柱, 黃耕, 王承宇, 高玉偉, 楊松濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所