專利名稱：融合殺蟲基因cryci及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一個編碼融合蛋白質的DNA序列，即編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質和編碼豇豆胰蛋白酶抑制劑以及將其進行連接的編碼昆蟲腸激酶切割序列的DNA序列，包含所說的DNA序列的植物表達載體，被所說的載體轉化的植物細胞，以及由所說的細胞產生的對昆蟲(特別是鱗翅目昆蟲)表現(xiàn)有高抗性且昆蟲難以對之產生耐受性的轉基因植物及其后代，包括植物任何組織。
背景技術：
利用生物技術手段可以獲得對特定害蟲有殺蟲作用的轉基因植物。其中，較為熟知的例子是應用蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurigiensis，以下簡稱Bt.)的伴胞殺蟲晶體蛋白基因。Bt.可產生對多種昆蟲有殺蟲作用的伴胞晶體蛋白質，這些蛋白質可以在低濃度情況下各自特異地殺死包括鱗翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和雙翅目(Dipterans)等一些作物害蟲(Klausner，Bio/Technology 2408-419)。這種生物殺蟲劑對植物和包括人在內的動物沒有毒害，而且不會污染環(huán)境。
基于Bt.殺蟲蛋白質的性質，多年前就已經生產了有關在商業(yè)上出售的含有Bt.產生的孢子及結晶蛋白質的商品殺蟲制劑(商品名為DIPEL和THURICIDE)。這種商品殺蟲劑可有效地對抗五十種以上的鱗翅目害蟲(Wilcox，et al.，Protein Engineering，Inouye and Sarmg.(Eds.)AcademicPress，NY，1968)。然而，使用Bt.殺蟲制劑的一個重要限制是由于所說的殺蟲蛋白質或δ-內毒素容易在環(huán)境中被降解，使生產上需要重復施用這種殺蟲制劑，大大增加了成本，從而為農業(yè)生產上的實際應用帶來困難。
為解決這個問題，科學家們經過了一系列關于可以表達Bt殺蟲蛋白質的抗蟲轉基因植物的研究(Umbeck等人，Bio/Technology，5262-266，1987；Vaeck等人，Nature 32833-37，1987；schhoff等人，Bio/Technology 5807-813，1987；Barton等人，PCT 89004868；郭三堆等人，CN95119563.8)。最后，Perlak等(Bio/Technology 8939-942，1990)和郭三堆等(CN 95119563.8，1995)利用Bt.殺蟲蛋白基因，按照植物優(yōu)化密碼子，采用人工合成的方法，獲得了可以在植物中高效表達的Bt.殺蟲蛋白質基因。并進一步構建了高效植物表達載體，轉入棉花、玉米、水稻等作物，獲得了抗蟲性穩(wěn)定、抗蟲率達80％以上的抗蟲轉基因作物。
另一類可用于抗蟲轉基因植物研究的生物分子是蛋白酶抑制劑(Proteinase Inhibitors，以下簡稱PIs)。PIs是一類可以抑制蛋白酶水解活性的蛋白質，小到由十幾個氨基酸組成，大到由幾百個氨基酸組成。動物、植物和微生物中都含有PIs。自然界中存在的PIs有四大類絲氨酸蛋白酶抑制劑，巰基蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑和天冬氨酰蛋白酶制劑。在植物中還沒有發(fā)現(xiàn)天冬氨酰蛋白酶抑制劑，它和金屬蛋白酶抑制劑都基本上沒有抗蟲性，而在抗蟲植物基因工程領域中，絲氨酸蛋白酶抑制劑和巰基蛋白酶抑制劑被證明是很有研究和應用價值。其中，一個較為常見的例子是屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑的豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpwa typsin inhibior，CpTI)。1987年，Hilder等首先報導了將CpTI基因導入煙草獲得了高效表達CpTI的抗蟲植株。用煙草夜蛾做殺蟲實驗，結果對煙草夜蛾抗性顯著(Hilder，V.A.etc.Nature 330，160-163，1987)。
作為生物殺蟲劑，單一蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質的殺蟲活性較為專一，而且靶昆蟲較易對之產生抗性(McGaughey W.H.，Science.229193-195，1985)。而蛋白酶抑制劑則殺蟲譜寬，而且害蟲很難直接產生抗性。但其殺蟲能力不如蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質。因而，為獲得昆蟲較難以對之產生抗性的，具有較強殺蟲能力的轉基因植物，郭三堆等人(ZL 98 1 02885)又嘗試了使蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白質及豇豆胰蛋白酶抑制劑兩種殺蟲基因在植物細胞內同時表達。這將在提高轉基因植物抗蟲能力的同時使昆蟲對轉基因植物產生耐受性的可能大大降低。但是，利用專利(ZL 981 02885)中所述的方法培養(yǎng)出來的轉基因抗蟲棉卻出現(xiàn)了兩個基因不同步表達的現(xiàn)象(康保珊等，棉花學報，17(3)131-136，2005)，這樣一來，增加了篩選兩種殺蟲基因同步高效表達轉基因植株的難度。為了避免上述情況發(fā)生，本發(fā)明嘗試了將CrylA和CpTI兩種蛋白質活性結構域編碼序列用一段寡核苷酸連接起來，構建出一個自然界本不存在的融合基因，并將構建表達載體并轉化植物，使轉基因植物表達出一種具有CrylA和CpTI兩種蛋白質活性的融合蛋白質，這將能保證在轉基因植物中，這兩種殺蟲機理不同的蛋白能以融合蛋白的形式達到完全同步表達，實現(xiàn)在提高轉基因植物抗蟲能力、拓寬其殺蟲譜的同時，使昆蟲對轉基因植物產生耐受性的可能性降低。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種將CrylA和CpTI兩種蛋白質活性結構域編碼序列進行融合，使之適合于在普通植物中表達的一種方案。根據(jù)這個方案，在本發(fā)明的一個實施方案的一個方面中，我們構建出針對鱗翅目害蟲的一個融合殺蟲蛋白質基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。該核苷酸序列所編碼蛋白質的氨基酸序列是SEQ ID NO2。此外，根據(jù)本發(fā)明的將兩種殺蟲蛋白活性結構域進行融合的方案，也可以利用SEQ ID NO8所示的核苷酸序列，將其它類型的殺蟲蛋白基因進行融合。但本領域的技術人員可以理解到，為本發(fā)明的目的，其它殺蟲蛋白活性結構域編碼序列可用SEQ ID NO8的核苷酸序列或其功能等同物進行有效連接。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施辦法，所提供的融合殺蟲蛋白質基因由三個部分組成針對鱗翅目害蟲有毒性作用的編碼Bt.殺蟲蛋白活性結構域的DNA序列；有廣譜抗蟲活性的編碼豇豆胰蛋白酶抑制劑活性結構域的DNA序列；連接上述兩段DNA序列的編碼昆蟲腸激酶(Enterokinase，EK)切割序列的寡核苷酸序列。
本發(fā)明所采用的Bt.殺蟲蛋白質基因是中國專利95119563.8中所描述的，采用植物優(yōu)化密碼子人工合成而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，該基因具有SEQ ID NO1中64-1824或1-1824號核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI基因)。特別是為達到本發(fā)明的目的而經過修飾的該基因。
本發(fā)明所采用的CpTI基因是中國專利ZL 98 1 02885中所描述的，通過PCR的方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一個實施步驟，該基因與天然CpTI基因的一個顯著區(qū)別是基因內部不含有EcoRI位點；并且，本發(fā)明所提供的CpTI基因首先與腸激酶切割位點編碼序列連接，連接體5’及3’端均帶有合適的限制性酶切位點。其中，基因5’端帶有XhoI位點，3’端帶有SalI位點。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所采用的腸激酶切割位點編碼序列具有SEQ ID NO1中1813-1830號核苷酸序列。所采用的CpTI基因具有SEQ ID NO1中1831-2112號核苷酸序列。本發(fā)明所采用的CpTI基因編碼的蛋白質屬于T/T型雙頭胰蛋白酶抑制劑。即每個蛋白酶抑制劑分子含有兩個胰蛋白酶的抑制活性中心。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及為在畢赤酵母中有效地表達上述融合殺蟲蛋白質所需之調節(jié)及控制元件。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明所構建的融合殺蟲基因酵母表達載體中，所說的5’端非編碼區(qū)包括AOX1啟動子及α因子分泌信號序列，3’端使用AOX1轉錄終止子。外源融合殺蟲蛋白基因表達盒線性整合至畢赤酵母基因組后，在誘導條件下，可高效分泌表達融合殺蟲蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及為在受體植物中有效地表達上述融合殺蟲蛋白質所需之調節(jié)及控制元件。
為了使外源殺蟲基因產物在植物細胞中在轉錄和翻譯水平上獲得有效表達，在包含編碼區(qū)的外源DNA序列側翼必須連接有適當?shù)谋磉_調節(jié)和控制元件。這些控制元件包括啟動子、增強子、終止子，轉錄產物的術翻譯部分、以及便于在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中篩選被轉化細胞的選擇標記基因等。常用的植物細胞轉錄啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子和根癌農桿菌T-DNA的胭脂氨酸合酶啟動子。這些啟動子在大多數(shù)植物細胞中都是有效的，但其插入位點和插入的拷貝數(shù)目不同，將對其下游的蛋白質編碼序列的轉錄和翻譯活性產生很大影響。
因而，本發(fā)明涉及翻譯增強序列、在任何讀碼情況下均能正確終止的多聯(lián)終止子序列、對轉錄過程得到的mRNA進行正確切割的加工序列等。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明所構建的融合殺蟲基因植物表達載體中，所說的5’端非編碼區(qū)由一個含加倍增強子的啟動子序列，一個Ω序列和一個Kozak序列組成。本發(fā)明優(yōu)選的是帶有加倍增強子元件的CaMV 35s啟動子。Ω序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白質基因編碼區(qū)的翻譯增強序列，該序列富集TTAAC序列，在蛋白質合成的翻譯過程中構成核糖體和rRNA結合位點(Richards et al，Eur.J.Biochem.84513-519，1987)。本發(fā)明使用的促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，Nucleic Acids Research 12857-872，1984；Cell，44283-292，1986)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，在本發(fā)明的融合殺蟲基因植物表達載體中，所說的3’端非編碼區(qū)包括一個多聯(lián)終止密碼子序列，一個mRNA切割和切割后加工序列和終止子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，設計并合成了直接連接于殺蟲融合基因3’端的多聯(lián)終止子序列，在該核苷酸的短序列中，包括有三個分別位于不同讀碼框中的終止密碼子。從而即使在對其左翼的結構基因序列的翻譯過程出現(xiàn)錯讀，也將得以正確終止。另外，3’端正確切割和加工序列進一步保證了蛋白質翻譯的正確終止。適用于本發(fā)明的融合殺蟲基因高效植物表達載體還包括Nopaline(Nos)基因的終止子。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的編碼序列之5’和3’端側翼序列是以化學方法合成的。
為了提高本發(fā)明的融合殺蟲基因在單子葉禾本科植物中的表達效率，可在結構基因與啟動子序列之間加入適當大小的內含子序列，例如，玉米醇脫氫酶基因的第一內含子(Gene andDevelopment 11183-1200，1987)、衍生于蓖麻油植物的過氧化氫酶基因的第一內含子(Tanaka et al.，Nucleic Acids Research 186767-6770，1990)等。
可使用本領域中已知的方法將本發(fā)明的適于在植物細胞中表達融合殺蟲蛋白質的基因構建體連接到任何一種可在細菌細胞或植物細胞中自我復制的載體上。這樣的載體例如包括衍生于大腸桿菌的質粒載體pUC18、pUC19(Gene 1031985)，以及經過不同的修飾而造成不同的多克降酶切位點的一系列統(tǒng)稱為pGEM的質粒載體(由Promega公司生產)。尤其是植物表達載體pBI101，pBI121以及PBI131系統(tǒng)(Jefferson，et al.，EMBO J.163901，1987)，等等。在本發(fā)明的一系列優(yōu)選實施方案中，攜帶上述本發(fā)明融合殺蟲基因構建體的載體是pUC19、PBI121.1等，后者特別適于作為制備植物表達載體的工具質粒載體。
當然，如前所述，為了正確地選擇和鑒定被轉化的植物細胞，本發(fā)明的上述重組的表達載體還進一步含有可選擇標記基因。所使用的選擇標記基因的兩側可帶有調節(jié)序列，以促使其在植物中的表達。適用的選擇標記基因是本領域內已知的。編碼選擇標記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達載體中，或者包含于轉化時同時應用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標記基因是新霉素磷酸轉移酶(NPT II)基因，包含于上述重組表達載體內，從而保證了對被轉化細胞或植株選擇的可靠性。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明進一步提供適于在植物細胞中表達融合殺蟲蛋白質及的植物表達載體，其中包含1).融合殺蟲蛋白質基因表達盒；a).5’端非編碼區(qū)；b).編碼融合殺蟲蛋白質的基因；c).3’端非編碼區(qū)。
2).來源于pBI 121.1的載體部分a).新霉素磷酸轉移酶基因(NptII)表達盒；b).起始復制子及與植物轉化相關的左右邊界序列等功能結構。
根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定；申請人已于2005年6月1日將轉化到大腸桿菌DH 5a宿主細胞中的本發(fā)明構建的融合殺蟲基因植物表達載體(pGBIf4ABC)保藏于中國微生物菌種保減管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.1382。
通過本發(fā)明所提示的融合殺蟲蛋白質的構建方案，所得到的符合SEQ ID NO.1的核苷酸序列，可以通過DNA重組技術鏈接到上面所描述的表達載體中，并使之轉入并整合到植物基因組中。而且融合殺蟲基因在目標植物中的表達可賦予該植物對害蟲，尤其是針對鱗翅目害蟲的殺蟲性。
應該指出，上面所描述的表達載體是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，并未限制本發(fā)明。凡是應用本發(fā)明所描述的殺蟲融合基因所構建的任何表達載體均包括在本發(fā)明之內。尤其是該融合殺蟲基因還可以通過與其它任何殺蟲基因重組或協(xié)同，以獲得殺蟲能力更強、殺蟲范圍更寬或這兩方面都得到加強的轉基因植物。包括如下的實現(xiàn)方式1.與其它一種或幾種殺蟲基因重組，構建多種殺蟲基因的表達載體并轉入植物；2.與其它一種或幾種殺蟲基因以相同或不同的方式融合，構建表達載體并轉入植物；3.與其它一種或幾種殺蟲基因相協(xié)同，分別構建植物表達載體，同時或分步到如同一種植物受體。
用相類似的方法，本發(fā)明構建的融合殺蟲基因還可以與其它目的基因進行重組或協(xié)同，以達到具有除殺蟲性以外的其它優(yōu)良性狀的轉基因植物，如抗病、抗逆基因等。也包括利用選擇標記基因而獲得利于篩選轉基因植株的轉基因植物等，例如抗除草劑基因。
為了在植物細胞中特別是整株植物中表達融合殺蟲蛋白質，以賦予整株植物及其種子和后代以殺蟲能力，必須使用適當?shù)姆椒▽瓷鲜龇椒ㄖ苽涞臄y帶本發(fā)明的融合殺蟲蛋白質的編碼序列的重組表達載體轉化或轉導到適當?shù)乃拗骷毎蛑参矬w內。
將攜帶外源基因的重組載體導人宿主植物或其細胞內的許多方法都是本領域技術人員熟知的。這些方法包括但并不僅限于1)使用農桿菌(Agrobacterium)作為植物病原體所介導的農桿菌轉化法(Agrobacterium Mediated transformation)、2)物理法，如基因槍法(Particle Bombardment & particle gun & Gene gun)、電擊融合法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纖維介導法(Silicon carbide fiber)、電泳法(Electrophoretictransfection)等。3)化學法，如PEG介導的轉化法、脂質體介導轉化法等。4)種質系統(tǒng)轉化法，如花粉介導法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導的轉化法。
本發(fā)明使用農桿菌轉化法將融合殺蟲基因轉化模式植物煙草；同時使用種質系統(tǒng)轉化法中改進的子房注射植物受精胚囊法(參見CN 95119563. 8， 1995；Zhou et al，Enzymol. Method.101433-451，1983)轉化棉花。
我們優(yōu)選棉花作為融合殺蟲基因轉化的受體植物。棉花作為一種經濟作物，我們無需考慮其作為食品的安全性問題；其次，在世界范圍內被廣泛種植的棉花每年因蟲害造成的經濟損失是十分巨大的；另外，目前已應用的單價抗蟲棉面臨著將來害蟲對之產生耐受性的潛在危險和由于殺蟲譜窄而導致棉田次要害蟲上升為主要害蟲。
因而，本發(fā)明涉及的融合殺蟲基因，包含所說融合殺蟲基因的植物表達載體，用所說的表達載體轉化植物細胞、組織和整株植物的方法，以及由此產生的對植物害蟲具有控制和毒殺能力的轉基因植物，特別是對鱗翅目昆蟲例如棉鈴蟲等具有顯著毒殺作用的轉基因棉花。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了產生對鱗翅目有毒性且害蟲對這種毒性較難以產生耐受性的植物的方法，該方法包括1).構建所說的融合殺蟲基因植物表達載體；2).用任何一種可行方法將步驟1)中得到的植物表達載體導入到植物細胞內，并由此獲得對多種害蟲有抗性或殺傷能力的轉基因植物及其后代，包括任何部分的植物組織。
這里應特別指出的是，雖然在本發(fā)明下述實施例中以轉基因棉花的產生舉例進一步詳細描述了本發(fā)明，但這絕不意味本發(fā)明制備的融合殺蟲基因的DNA序列及攜帶該DNA序列的重組表達載體只用于轉化和生產具有抗蟲能力的轉基因煙草和棉花。
因此，使用具有本發(fā)明所描述的特征的融合殺蟲基因表達載體，以本領域技術人員已知的任何一種方法導入任何植物或其組織或細胞中，以及由此而獲得的導入了外源融合殺蟲基因的，具有殺傷或控制植物敏感害蟲之能力的植物，其后代及其種子和植物部分，均包括在本發(fā)明之內。


本發(fā)明給出了九張附圖。
附圖1說明了融合殺蟲基因植物表達載體pGBIf4ABC的構成。在該載體中，主要包括兩個基因表達盒1個是標記基因nptII的表達盒，由nptII基因及其5’端的Nos啟動子和3’端的Nos終止子組成；另1個足融合殺蟲基因表達盒，由融合殺蟲基因cryci及其5’非編碼區(qū)(包括帶加倍增強子的35S啟動子，Ω序列和Kozak序列)和3’非編碼區(qū)(包括切割加工序列和Nos終止子)組成。這兩個表達盒以同向串聯(lián)的方式連接在一起。
附圖2說明了融合殺蟲基因酵母表達載體pPIC9KBC的構成。在表達載體pPIC9K的多克隆位點插入了融合基因。其5’端包括AOX1啟動子及α因子分泌信號序列，3’端使用AOX1轉錄終止子。
附圖3為重組酵母表達產物的SDS-PAGE分析結果，其中第1泳道為蛋白分子量標記，第2泳道為對照KM71誘導培養(yǎng)液上清，未出現(xiàn)目的帶，第3、4泳道為重組酵母誘導培養(yǎng)液上清，出現(xiàn)了與預期大小相符的目的帶。
附圖4為重組酵母誘導表達產物腸激酶酶解分析結果，第1泳道為蛋白分子量標記，第2泳道為未酶解的重組酵母誘導表達的融合蛋白，第3泳道為酶解后的重組酵母誘導表達的融合蛋白，經酶解后出現(xiàn)了大小分別為65KD和10KD的兩條蛋白帶。
附圖5為轉基因煙草植株的Southern Blot結果。EcoRI和Hind III為融合殺蟲基因cryci及其表達調控元件兩端的位點，轉基因植株中預期的雜交帶應與轉化質粒pGBIf4ABC所切的帶大小相同，為3.4kb。CK+泳道為酶解質粒pGBIfABC，CK-泳道為酶解非轉基因煙草基因組DNA，1-7泳道為酶解非轉基因煙草基因組DNA。1、4、5、6泳道均出現(xiàn)了與預期大小3.4kb相符的雜交條帶。
附圖6為轉基因煙草Western Blot結果。CK+泳道為標準的BT CrylA蛋白，CK-泳道為非轉基因煙草粗蛋白，1-7泳道為轉基因煙草粗蛋白。1、5、6泳道均出現(xiàn)了與融合殺蟲蛋白預期大小75KD相符的免疫雜交條帶。
附圖7轉基因棉花PCR檢測結果。泳道1的模板為質粒pGBIf4ABC，泳道2的模板為非轉基因棉花基因組DNA，泳道3-11為轉基因棉花基因組DNA，泳道12為DNA分子量標記。泳道3-11均出現(xiàn)了與預期大小1.1kb相符的雜交條帶。
附圖8為轉基因棉花斑點雜交分析結果。A6為質粒pGBIf4ABC，A5為非轉基因棉花基因組DNA，其余為轉基因棉花基因組DNA。A3、A4、B1、B2、B4、C2、C4、C5、C6均表現(xiàn)出較強的雜交信號。
附圖9轉基因棉花室內抗棉鈴蟲實驗結果。取轉基因棉花幼嫩葉片放置在培養(yǎng)皿中，用濕棉球保持葉片清鮮，每葉接2日齡的棉鈴蟲12頭，4天后觀察殺蟲結果并照相記錄。1為非轉基因棉花葉片，2為非轉融合殺蟲基因cryci棉花葉片。
具體實施例方式
給出以下實施例的目的是舉例詳細描述本發(fā)明，而不構成對本發(fā)明待批權利范圍的限制。在本發(fā)明技術特征和待批權利要求范圍內，本領域技術人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進。
實施例一編碼CpTI活性結構域DNA序列的獲得及其與編碼腸激酶切割序列的寡核苷酸片段的連接1.1編碼CpTI活性結構域DNA序列cpti的獲得以本實驗室構建的質粒pG4AC為模板，用合成引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4進行PCR擴增，結果得到282bp的DNA片段，PCR產物經加磷補平后，電泳回收純化。載體pUC19經EcoRI和HindIII雙酶切后，用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow大片段補平，電泳回收2.7kb大片段。將282bp的CpTI基因與此2.7kb片段連接后，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經Cracking篩選，得到重組子定名為pGCI。用BamHI+SalI和PstI+SalI進行雙酶切鑒定，證實了282hpPCR產物的插入。
1.2編碼腸激酶切割序列的寡核苷酸片段與cpti的連接化學合成所設計的單鏈寡核苷酸片段SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，將兩個片段等摩爾進行退火處理，獲得Xho I接頭。同時將質粒pGCI用BamHI和Pst雙酶切并脫磷后電泳回收約2.9kbDNA片段，與Xho I接頭連接，轉化大腸桿菌后，得到重組質粒pGC2，經Xho和SalI雙酶切及Xhol單酶切鑒定，證明帶有腸激酶切割位點編碼序列的XhoI接頭已插入到CpTI基因的5’端。以pGC2為模板，進行序列測定，證明該質粒中帶有正確的CpTI基因片段，并且腸激酶切割位點編碼序列正確地連接到CpTI基因的5’端。PGC2中所克隆CPTI基因序列見SEQ ID NO.7。
實施例二融合殺蟲基因及其植物表達載體構建2.1帶有融合殺蟲基因表達盒的構建本實施例所構建的融合殺蟲基因表達盒中包括以下基因表達調控元件5’端的帶有加倍增強子的35S啟動子、Ω序列及kozak序列，3’端的多聯(lián)終止序列、切割加工序列以及NOS終止子。這些表達調控元件除355啟動子和增強子之外都是通過化學方法人工合成的(詳見中國專利 CN 951 19563.8，1995)。在本實驗室所保存的帶有人工合成的Bt.殺蟲蛋白基因表達盒的質粒pG4AB中包括有這些元件。
用XhoI與SalI酶切質粒pGC2，電泳回收約300bP的CpTI基因片段。將此片段連接到經Xho I單酶切的質粒PG4AB上，得到重組質粒pGf4ABC，經XhoI和EcoRI雙酶切鑒定，證明CPTI以正確的方向連接到GFM CryIA的3’端，至此融合殺蟲基因CryCI已經按預先設計的方案構建成功，并且該融合基因受植物高效表達調控元件的控制。
2.2融合殺蟲基因植物表達載體的構建用HindIII和EcoRI雙酶切切下pGf4ABC中約3.5kb的融合殺蟲基因表達盒，克隆到經HindIII和EcoRI雙酶切后回收的pBI121.1大片段上，獲得重組質粒pGBIf4ABC。這就是所構建的融合殺蟲基因的植物表達載體。其質粒圖譜見附圖1。
實施例三融合殺蟲基因在畢赤酵母中的功能鑒定3.1融合殺蟲基因酵母表達載體的構建3.1.1Ω序列和Kozak序列的去除及與NCoI接頭的連接本實施例采用Invitrogene公司生產的畢赤酵母(P ichia)表達試劑盒，并采用其分泌型表達載體(pPIC9K)。質粒pPIC9K上含有一個270bp的a因子分泌信號，最終翻譯成90個氨基酸的信號肽，攜帶目的蛋白分泌到酵母細胞外。所以構建表達載體時，需要將外源基因編碼區(qū)的5’端連接到a因子分泌信號的3’端，并且必須在一個讀碼區(qū)內，否則會造成移碼，目的蛋白得不到表達。實施例二中構建的融合殺蟲基因克隆載體pGf4ABC在起始密碼子與355啟動子之間有一個68bp的Ω序列和Kozak序列，需將此序列去除，方可將融合基因的起始密碼子與a因子的3’端連接。否則，可能會造成非正常翻譯或翻譯終止而影響外源基因的表達。
化學合成所設計的單鏈寡核苷酸片段SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，將兩個片段等摩爾進行退火處理，獲得Nco I接頭。將質粒pGf4ABC用BamHI和Pstl(部分酶切)雙酶切后回收去掉Ω序列和Kozak序列后的約6.0kb的載體片段，與NcoI接頭連接，轉化大腸桿菌DH5a，得到質粒pGf4ABC(Ω-)，用NcoI和SacI進行雙酶切鑒定，結果表明Ω序列和Kozak序列已被NcoI接頭代替。
用Ncol和Sacl雙酶切質粒pGf4ABC(Ω-)，Klenow修平兩端后，電泳回收約2.4Kb的融合基因片段，平端接連到經SnaBI酶切的載體pPIC9K上，得到融合殺蟲基因分泌型酵母表達載體pPIC9KBC。其質粒圖譜見附圖2。
3.2酵母轉化及篩選質粒pPIC9KBC經電激轉化酵母細胞后，通過同源重組，目的基因可以整合到酵母基因組中(Sreekrishna等人，J.Basic Microbiol.，28265-278，1988)。在外源誘導物甲醇存在的條件下，AOXI(乙酸氧化酶)啟動子可以啟動其下游基因的表達(Ellis等人，Mol.Cell.Bio.，51111-1121，1985)，而且a因子信號肽可以指導表達產物進入酵母的分泌途徑，最終分泌到胞外。外原蛋白經過這樣的代謝途徑可以進行翻譯后修飾，例如糖基化、二流鍵的形成等，從而得到具有生物活性的蛋白。
首先用SalI消化質粒pPIC9KBC，使之線性化，酚/氯仿抽提純化后，電激轉化酵母受體菌his4 KM71。由于載體中沒有酵母復制起始子，所以HIS4基因必須整合進酵母基因組中才能表達，即只有整合了表達載體的酵母細胞才能在不加組氨酸(His)的基本培養(yǎng)基(MD)上生長，因此可以用基本培養(yǎng)基MD進行轉化子篩選。由于菌株KM71的甲醇利用型為Muts(Methanol utilization slow)，在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上，該菌株不會生長或生長極慢，當用pPIC9KBC進行轉化后，仍表現(xiàn)為Muts，故免去了對轉化子進行Mut表型的篩選。對獲得的His+Muts轉化子用融合基因檢測引物(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11)直接進行PCR篩選，獲得重組酵母。
3.3融合殺蟲基因在重組酵母中的表達及功能鑒定3.3.1融合殺蟲蛋白的誘導表達將重組酵母與未轉化酵母菌株KM71(對照)接種于BMGY培養(yǎng)基(以甘油為碳源)中培養(yǎng)，待其生長至飽和狀態(tài)(OD600＝10～20)，移BMGY，加入誘導培養(yǎng)基BMMY(甲醇為誘導物)誘導表達。誘導培養(yǎng)5-7天后，取上清進行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮蘭染色，結果重組酵母表達出了約75KD的融合殺蟲蛋白，而對照KM71無融合蛋白表達，見附圖3。
3.3.2融合殺蟲蛋白的腸激酶酶解分析取含有融合殺蟲蛋白的培養(yǎng)物上清，經硫酸銨沉淀并透析后，用腸激酶進行酶解，經SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)融合殺蟲蛋白被降解為約65kD和約10kD的兩個蛋白，見附圖4，分別與GFM CrylA和CpTI的分子量相同，說明該融合殺蟲蛋白可被腸激酶準確地切割。
3.3.3融合殺蟲蛋白的殺蟲活性分析將重組酵母菌株pPIC9K/KM71(有融合蛋白表達)與非轉化酵母菌株KM71(對照)的誘導培養(yǎng)物上清，經硫酸銨沉淀及透析后，加入到棉鈴蟲飼料中，用棉鈴蟲初孵幼蟲進行殺蟲活性測定，結果表明，用含有融合殺蟲蛋白的飼料飼喂棉鈴蟲，棉鈴蟲的校正死亡率為78.3％，而對照為4，4％，說明酵母中表達的融合殺蟲蛋白對棉鈴蟲具有毒殺作用，即融合殺蟲基因已在重組酵母中正確表達，并具有生物學功能。
實施例四融合殺蟲基因植物表達載體向模式植物煙草中的導入及鑒定4.1表達載體向農桿菌中的轉化提取質粒pGBIf4ABC，純化后，取2μg用凍融法轉化農桿菌LBA4404，挑取在卡那霉素平板上長出的菌落，用堿裂解法提取質粒，用EcoRI和Hind III進行雙酶切鑒定，結果與圖30相同，表明質粒pGBIf4ABC已轉入農桿菌LBA4404。
4.2煙草的轉化培養(yǎng)帶有質粒pGBIf4ABC的農桿菌，以煙草NC89無菌苗葉片為轉化受體，共培養(yǎng)3天后，轉到選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。十天后，轉化葉片開始長出愈傷組織，而對照非轉化葉片則逐漸變黃，最后死亡。再培養(yǎng)兩周后，愈傷組織開始分化芽。待芽長到2-3cm時轉入生根培養(yǎng)基中。十二天后，抗性芽開始生根。當再生植株長到7～8cm時，移入塑料缽中，獲得煙草轉化植株。
4.3轉基因煙草的分子檢測4.3.1轉基因煙草的PCR檢測提取煙草轉化植株葉片總DNA作為模板，用融合基因檢測引物(SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11)進行PCR擴增，瓊脂糖電泳在2.1kb的位置出現(xiàn)全長融合殺蟲基因條帶，初步證明融合殺蟲基因已經轉入煙草植株中。
4.3.2轉基因煙草的Southern Blot檢測取煙草轉化植株20μg基因組DNA，用EcoRI和Hind III，于37℃酶切過夜，酚氯仿抽提后，乙醇沉淀，以非轉基因植株為陰性對照，質粒pGBIf4ABC/EcoRI+Hind III為陽性對照，上樣電泳。轉膜后，以GFM crylA基因Pstl 1.4kb片段為探針雜交。EcoRI和HindIII為融合殺蟲基因cryCI及其表達調控元件兩端的位點，轉基因植株中預期的雜交帶為3.4kb，應與轉化質粒pGBIf4ABC所切的帶大小相同。Southern blot結果見附圖5，在1、4、5、6泳道均出現(xiàn)了人小與預期相符的雜交帶，進一步證明了融合殺蟲基因已整合到轉基因煙草植株中。
4.3.3轉基因煙草中融合殺蟲蛋白的表達檢測由于Bt晶體蛋白和CpTI都是堿溶性蛋白，放用PH9.5的CBS液提取上文所述轉基因煙草植株的總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，然后轉膜，用Bt晶體蛋白抗體進行免疫印跡。結果見附圖6，在1、5、6泳道均出現(xiàn)了大小約為75kD的免疫雜交帶，，正好是GFM CryIA(約65kD)與CpTI(約10kD)之和，表明融合殺蟲基因cryci已經在轉基因煙草中表達出了融合蛋白。
取轉基因煙草葉片提取粗蛋白，用Bt晶體蛋白抗體為一抗，進行ELISA檢測，融合蛋白表達量可達到1.43ug/g鮮重。
4.4轉基因煙草對敏感棉鈴蟲和抗性棉鈴蟲的殺蟲活性鑒定取轉基因煙草葉片，用2日齡的敏感棉鈴蟲進行殺蟲試驗，轉基因煙草的校正死亡率[注校正死亡率％＝(供試株幼蟲死亡率％-對照幼蟲死亡率％)/(1-對照幼蟲死亡率％)×100％]可達90％以上。
進一步取轉融合殺蟲基因煙草植株與轉單BT基因(GFM crylA)煙草植株葉片，用對Bt殺蟲蛋白(CrylA)已產生抗性的棉鈴蟲進行生物學殺蟲實驗，結果轉單BT基因(GFM crylA)煙草對抗性棉鈴蟲的校正死亡率只有22.2％，而轉融合殺蟲基因的煙草對抗性棉鈴蟲的校正死亡率仍可達77.7％。說明轉融合殺蟲基因的煙草可能會延緩害蟲對其產生抗性的進程。
4.5轉基因煙草的CpTI抑制活性檢測根據(jù)標準樣品(大豆胰蛋白酶抑制劑)的OD254值分別計算其Trypsin剩余活力，做出“標準樣品量——剩余活力”的標準曲線。用同樣的方法測出待測植物樣品中的trypsin剩余活力，對照標準曲線，即可得知在所測定的30ul轉基因植物蛋白提取液中CPTI對應于標準樣品的含量。經檢測，在融合殺蟲基因cryci高效表達的轉基因煙草中，表達出的融合蛋白具有對trypsin的抑制能力，即融合殺蟲蛋白中的CpTI片段保持了原有的活力，由此可以推斷，轉基因煙草的殺蟲活性并非是由GFM CrylA單獨作用的結果，而是融合蛋白的兩部分共同作用的結果。進一步可以得出結論，此融合蛋白不經蛋白酶消化也具有殺蟲活性。
實施例五植物受精胚囊注射法轉化棉花編碼融合殺蟲蛋白質的基因在植物中的高效表達對于產生轉基因植物是最為關鍵的，但是外源基因轉化植物是否能獲得成功，也是致關重要的環(huán)節(jié)。在本發(fā)明之前，本領域科技人員熟知的利用農桿菌介導法、基因槍法、PEG法、電激法等方法轉化植物雖然有許多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不僅受到實驗室條件和昂貴的儀器及費用極高等的限制，更重要的是上述方法都有一個不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生產上發(fā)揮著重要作用的優(yōu)良植物品種，由于基因型的不同，不能通過愈傷途徑再生成植株；或再生植株極為困難。在這樣時情況下，本實驗室通過植物受精膠囊注射轉化的技術或稱植物受精膠囊注射轉化法(CN 95119563.8)，成功地獲得了具有高抗蟲能力的抗蟲轉基因棉花。雖然本發(fā)明優(yōu)選棉花作為子房注射外源基因轉化植物受精膠囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因轉化植物受精胚囊技術的優(yōu)點在于1).適合于所有植物的基因型；2).方法簡單，有效；3).不受實驗室條件、儀器的限制，且費用低；4)速度快，一年內即可獲得轉基因植物種子及后代。
在本實例中，子房注射外源基因轉化植物受精胚囊的方法，是在棉花開花授粉后的大約10-24小時之間。如在珠心孔道封閉之前，用微量注射系統(tǒng)將外源基因溶液注射到子房內，外要材料即可通過珠孔和珠心孔道，逐漸擴散到或在珠心孔道封閉的過程中被擠壓到剛受精后的胚囊內。在受精卵分裂的過程中，外源基因被吸收整合到受精卵細胞的基因組中，從而完成外源基因導入和整合過程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對純度，在開花的前一天下午，將要在第二天開花的蕾用線扣緊，使花瓣不易張開，以使其自花授粉。開花后約10小時左右，即當天開花的晚6點鐘左右花粉管進入胚囊后，即可進行外源基因的注射。注射前將花瓣連同雄蕊剝去露出幼鈴，抹去幼鈴頂端的花柱，我們設計的微量注射系統(tǒng)吸取預冷的外源基因溶液，從抹掉幼鈴的頂端，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的插入空間，緩慢將注射裝置內的外源溶液注射到插入空間內。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內擴散，或由于珠心孔道在逐漸封閉而被擠壓進受精胚囊中而實現(xiàn)其整合。一般注射的外源基因溶液為10ul，總量約為0.25-0.5ug。當然，對于不同的作物可根據(jù)其子房內胚珠數(shù)目的多少，適當?shù)卦黾踊驕p少外源基因的注射量。外源基因注射后為了防止和減少幼鈴的脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時將所說注射外源基因的幼鈴所在的枝條頂端摘掉，以保持幼鈴的充分營養(yǎng)，從而將有利于成鈴和鈴內種子的發(fā)育。
實施例6轉融合殺蟲基因棉花的分子生物學檢測及酶活和抗蟲性測試應用實施例4.3的方法，對所獲得的轉基因棉花植株分別進行了PCR、斑點雜交分析以及抗棉鈴蟲實驗。其中PCR檢測的引物為SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。這些結果證實了融合殺蟲基因已轉入到了棉花基因組中并獲得了高效表達。其PCR檢測結果見附圖7，斑點雜交分析結果見附圖8，抗棉鈴蟲實驗結果見附圖9。
權利要求
1.編碼融合殺蟲蛋白質的基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.包含權利要求1的基因的酵母表達載體pPIC9表達載體pPIC9KBC。
3.包含權利要求1的基因的植物表達載體表達載體pGBIf4ABC。
4.保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCCNO.1382的植物表達載體pGBIf4ABC。
5.產生對鱗翅目害蟲有殺蟲性且害蟲對這種殺蟲性較難以產生耐受性的植物的方法，該方法包括1).構建權利要求3所述的植物表達載體；2).將步驟1)中得到的植物表達載體導入到植物細胞內，并由此獲得所述植物。
6.根據(jù)權利要求7的方法，其中獲得的所述植物是任何部分的植物組織。
7.根據(jù)權利要求7的方法，其中所說的植物是煙草和棉花。
全文摘要
本發(fā)明提供了一個融合殺蟲蛋白質基因cryci，該基因包含編碼蘇云金芽孢桿菌Cry1A活性結構域和編碼豇豆胰蛋白酶抑制劑CpTI活性結構域的DNA序列；提供了該融合殺蟲蛋白質基因的重組酵母和植物表達載體，重組酵母具有高效分泌表達融合殺蟲蛋白質的特性，轉基因植物也具有高效表達融合殺蟲蛋白質的特性。所說表達載體轉化酵母后，可產生對害蟲，尤其是鱗翅目害蟲有高殺蟲性的融合殺蟲蛋白質，并可被腸激酶酶解出兩個活性殺蟲蛋白質；所說表達載體轉化植物后，可產生對害蟲，尤其是鱗翅目害蟲有高殺蟲性的轉基因植物及其后代，并可延緩鱗翅目害蟲對Bt.Cry1A殺蟲蛋白產生抗性的進程。本發(fā)明特別提供了轉cryci基因煙草和棉花。
文檔編號C12N15/81GK1782084SQ20051007682
公開日2006年6月7日 申請日期2005年6月17日 優(yōu)先權日2005年6月17日
發(fā)明者郭三堆, 張銳, 武東亮 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 郭三堆, 張銳