一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂肪酶基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂肪酶基因的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明針對(duì)具有特定催化性能和用途的目標(biāo)脂肪酶，通過(guò)全基因組脂肪酶基因挖掘，分類、催化特性預(yù)測(cè)得到候選基因；將候選基因分別在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)分別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體活性進(jìn)行篩選，獲得具有特定催化性能的華根霉脂肪酶基因，并在重組大腸桿菌中進(jìn)行活性表達(dá)制備。最終獲得了編碼僅在包涵體狀態(tài)下表現(xiàn)酯合成活性和甲醇解活性的脂肪酶的基因。本發(fā)明方法將顯著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因獲得的效率，對(duì)于其他酶的篩選和制備也提供了有價(jià)值的參考。
【專利說(shuō)明】一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂肪 酶基因的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂肪酶基因的 方法，尤其是一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂肪酶基因并在重組大 腸桿菌中重組表達(dá)的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶又稱三酰基甘油水解酶（EC3. 1. 1.3)，是一種廣泛應(yīng)用的水解酶類，能夠在 水相中催化水解底物酯鍵，有些脂肪酶也可以在非水相中催化酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)等。 微生物脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于很多工業(yè)，如油脂工業(yè)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等。 目前已有數(shù)百種微生物脂肪酶報(bào)道，并且許多已經(jīng)商品化，但是，由于脂肪酶種類的廣泛多 樣性，不同脂肪酶的催化特性，如催化活性（酯合成活性、水解活性、甲醇解活性）、底物特 異性、位置選擇性、立體選擇性等有著顯著的差異。為滿足不同行業(yè)對(duì)特定特性脂肪酶的需 求，進(jìn)一步挖掘微生物脂肪酶資源，開發(fā)和制備特定活性的脂肪酶仍然具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。本發(fā)明從具有特定基因資源的微生物出發(fā)，欲采用結(jié)合生物信息學(xué)和特異性篩選技術(shù)， 基于微生物全基因組的脂肪酶基因挖掘，分類、催化特性預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，通過(guò)分別檢測(cè)大腸 桿菌外源表達(dá)可溶蛋白和包涵體的不同催化特性的篩選技術(shù)，獲得具有特定特性的新型華 根霉脂肪酶基因，并在重組大腸桿菌中進(jìn)行活性表達(dá)制備。
[0003] 由于微生物特性和篩選方法的限制，通過(guò)傳統(tǒng)微生物篩選方法獲得特定特性脂肪 酶，進(jìn)而開發(fā)新型脂肪酶基因資源的效率一般不高。近年來(lái)，現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)為深度開發(fā) 微生物基因資源提供了可能，通過(guò)對(duì)特定微生物的全基因組測(cè)序，挖掘其中相關(guān)基因的方 法已被研究者所采用。華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC N〇:M201021是從我國(guó)傳統(tǒng)微 生物載體--大曲中分離得到的一株絲狀真菌，用于白酒生產(chǎn)，具有顯著的催化酯化合成 和酯水解的能力，表明其含有豐富的脂肪酶，其中一種脂肪酶已被分離并克隆表達(dá)。但進(jìn)一 步研究發(fā)現(xiàn)，一種外源表達(dá)的華根霉脂肪酶并不具有野生華根霉膜結(jié)合脂肪酶催化酯合成 的能力，表明華根霉中可能存在其他活性表現(xiàn)形式的脂肪酶。目前該菌株全基因組測(cè)序已 經(jīng)完成（Genome Announcements, 2013, 1 (2) : e00195_12)，為進(jìn)一步挖掘華根霉脂肪酶基因 資源提供了可能。現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)及相關(guān)軟件也為脂肪酶基因資源的挖掘提供了有效 的手段。
[0004] 此外，脂肪酶的催化特性最終還是由活性測(cè)定來(lái)確定。而脂肪酶的活性測(cè)定方法 較多，常用的方法有橄欖油指示劑滴定法、對(duì)硝基苯脂肪酸酯（p-NP)法、有機(jī)相酯合成法、 甲醇水解法等。這些方法分別反映了脂肪酶的不同催化性能，而且不同方法測(cè)得的活性間 并不具有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。僅通過(guò)一種活性測(cè)定篩選方法，欲得到不同催化特性的新型脂 肪酶通常是比較困難的。因此，針對(duì)特定目標(biāo)，有必要選擇適當(dāng)?shù)幕钚詼y(cè)定方法以篩選特定 催化特性的脂肪酶。
[0005] 通常具有活性的酶，包括野生酶及外源表達(dá)酶，均為可溶性蛋白；而不溶性蛋白， 如大腸桿菌外源表達(dá)的包涵體，通常不表現(xiàn)出酶的活性，需復(fù)性后才可能表現(xiàn)相應(yīng)的活性。 本發(fā)明基于華根霉基因組資源，主要針對(duì)脂肪酶催化酯合成和水解反應(yīng)的不同性能，分別 對(duì)候選脂肪酶基因大腸桿菌外源表達(dá)可溶蛋白和包涵體進(jìn)行不同活性檢測(cè)和篩選，以獲得 具有特定特性的新型華根霉脂肪酶基因，進(jìn)而在重組大腸桿菌中進(jìn)行活性表達(dá)制備。本發(fā) 明方法將顯著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因獲得的效率，對(duì)于其他特性脂肪酶的篩 選和制備也提供了有價(jià)值的技術(shù)方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)脂肪酶及其催化特性的多樣性，克服現(xiàn)有脂肪酶篩選方法針 對(duì)性不強(qiáng)、效率不高的問(wèn)題，提供一種基于全基因組結(jié)合生物信息學(xué)特異性篩選華根霉脂 肪酶基因的方法，基于華根霉全基因組序列結(jié)合生物信息學(xué)挖掘潛在的候選脂肪酶基因， 將候選基因分別在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)分別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體部分的活性進(jìn)行篩 選，獲得具有特定催化性能的華根霉脂肪酶基因。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括以下步驟：
[0008] (1)根據(jù)華根霉全基因組基因注釋獲得潛在的脂肪酶和酯酶基因，并對(duì)脂肪酶和 酯酶進(jìn)行分類，選擇已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，與所得華根霉基因組中潛在 的脂肪酶和酯酶基因進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性較高的脂肪酶或酯酶基因，預(yù)測(cè)其催化 特性，作為候選基因；
[0009] (2)將候選基因建立脂肪酶基因文庫(kù)，在大腸桿菌中表達(dá)，分別檢測(cè)可溶蛋白和包 涵體的不同催化特性，篩選獲得具有特定催化特性的華根霉脂肪酶基因。
[0010] 本發(fā)明技術(shù)方案還可以包括將篩選獲得的具有特定特性的華根霉脂肪酶基因在 重組大腸桿菌中進(jìn)行活性表達(dá)，制備相應(yīng)酶制劑。具體地，是根據(jù)大腸桿菌表達(dá)的蛋白活性 形式，分別對(duì)可溶蛋白或不可溶蛋白（包涵體）進(jìn)行處理，制備相應(yīng)酶制劑。
[0011] 步驟（1)所述具有特定功能的華根霉，是從我國(guó)傳統(tǒng)微生物載體一大曲中分離 得到的一株絲狀真菌華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021。該菌株用于白酒生 產(chǎn)，具有顯著的催化酯化合成和酯水解的能力，可產(chǎn)多種脂肪酶。其全基因組已測(cè)序完成， 參見文獻(xiàn) Genome Announcements, 2013, 1 (2) : e00195_12,基因注釋參見 http: //genome. igi. doe. gov/Rhichl/Rhichl. home, html〇
[0012] 步驟（1)所述采用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行脂肪酶基因篩選及催化特性預(yù)測(cè)，優(yōu)選根 據(jù)基因注釋獲得所有潛在的脂肪酶和酯酶基因，并利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行脂肪酶和酯酶 的分類；選擇已知的具有特定催化特性的脂肪酶的基因，與華根霉基因組中潛在的脂肪酶 和酯酶基因進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇確定同源性較高的脂肪酶或酯酶基因，預(yù)測(cè)其催化特性， 建立脂肪酶候選基因庫(kù)。
[0013] 所述已知的具有特定催化特性的脂肪酶可以是用于生物柴油合成的米根霉脂 肪酶（Rhizopus oryzae Lipase, R0L)和/或用于非水相有機(jī)合成的南極假絲酵母脂肪 酶B(Candida antarctica Lipase B，CALB)和/或用于食品加工的尖孢鐮刀菌脂肪酶 (Fusarium oxysporum Lipase, F0L、F0L1)等。
[0014] 步驟（2)優(yōu)選以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主，以pET-22b為表達(dá)載體。
[0015] 步驟（2)所述分別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體的不同催化特性，是根據(jù)脂肪酶不同的 催化特性和用途，采用不同的脂肪酶活性測(cè)定方法，如橄欖油指示劑滴定法測(cè)定脂肪酶水 解活性（參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT23535-2009脂肪酶制劑）、有機(jī)相酯合成法測(cè)定脂肪酶合成活性 (參考 Bioprocess and Biosystems Engineering, 2007, 30 (3) :147-155 中描述的方法）、 甲醇水解法測(cè)定脂肪酶甲醇解活性（參考Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101(4) :328-333中描述的方法）。檢測(cè)對(duì)象同時(shí)包括重組大腸桿菌可溶和不可溶蛋 白（包涵體）表達(dá)產(chǎn)物。
[0016] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供兩個(gè)應(yīng)用上述方法篩選得到的華根霉脂 肪酶基因，核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所示。
[0017] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基因（A06672)編碼的脂肪酶，以大腸桿 菌BL21(DE3)為宿主，以pET-22b為表達(dá)載體時(shí)，表達(dá)得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水 解活性^2U/mg)和較低的合成活性（0.029U/mg)，包涵體部分則同時(shí)具有脂肪酶水解活性 (108U/mg)、合成活性（0.42U/mg)和甲醇解活性（201.7U/mg)。
[0018] 進(jìn)一步地，所述包涵體的獲得方法優(yōu)選將帶有目的基因的pET-22b轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落接入含Amp抗性的5mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，于 37 °C 200rpm培養(yǎng)3-4個(gè)小時(shí)作為種子液；向1LLB液體培養(yǎng)基中加入3試管種子液， 37°C 200rpm培養(yǎng)4-5個(gè)小時(shí)，加入IPTG至終濃度0. 4mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，28°C 180rpm誘導(dǎo) 3-5小時(shí)，離心收集菌體，在適當(dāng)?shù)木彌_液中超聲破碎，離心后沉淀即為包涵體蛋白。所得包 涵體可直接作為催化非水相酯合成或醇解反應(yīng)的脂肪酶使用。
[0019] 所述核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示的基因（A07506)編碼的脂肪酶，以大腸桿 菌BL21(DE3)為宿主，以pET-22b為表達(dá)載體時(shí)，表達(dá)得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水 解活性（201U/mg)和較低的合成活性（0.015U/mg)，包涵體部分則也具有脂肪酶水解活性 (78U/mg)和較低的合成活性（0.042U/mg)與甲醇解活性（19.0U/mg)。
[0020] 進(jìn)一步地，所述可溶性蛋白的獲得方法優(yōu)選將帶有目的基因的pET-22b轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落接入含Amp抗性的5ml LB液體培養(yǎng)基的試管 中，于37°C 200rpm培養(yǎng)3-4個(gè)小時(shí)作為種子液，1L LB液體培養(yǎng)基中加入3試管種子液， 30°C 200rpm培養(yǎng)1小時(shí)，加入IPTG至終濃度0. 4mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，16°C 180rpm誘導(dǎo)2小 時(shí)，離心收集菌體，在適當(dāng)?shù)木彌_液中超聲破碎，離心后得到的上清液即為脂肪酶溶液。
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] (1)本發(fā)明針對(duì)具有特定催化功能的目標(biāo)脂肪酶，利用微生物全基因組數(shù)據(jù)和生 物信息學(xué)工具進(jìn)行脂肪酶基因的初步篩選；根據(jù)脂肪酶的不同催化功能和用途，分別采用 不同的脂肪酶活性分析方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選具有特定催化功能的脂肪酶?？捎行p輕實(shí)驗(yàn) 工作量，針對(duì)性強(qiáng)，篩選效率較高。
[0023] (2)通常情況下，有活性的酶包括野生酶及外源表達(dá)酶，均為可溶性蛋白；而不溶 性蛋白，如大腸桿菌外源表達(dá)的包涵體，則不表現(xiàn)酶活。由于脂肪酶可以催化水相、油水界 面以及有機(jī)相（非水相）介質(zhì)中的反應(yīng)，因此，不溶于反應(yīng)體系中的脂肪酶，例如包涵體，也 有可能表現(xiàn)出某些催化能力。本發(fā)明根據(jù)脂肪酶的催化功能，針對(duì)大腸桿菌外源表達(dá)時(shí)可 能出現(xiàn)的不同蛋白形式，包括可溶蛋白和不可溶蛋白（包涵體），均進(jìn)行活性篩選分析，有 效地提高了獲得目的基因及蛋白的可能性?？杀苊鈨H僅分析可溶性蛋白活性時(shí)，漏掉特定 基因編碼的酶具有多種不同催化功能的情況。例如SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所示序 列編碼的酶，在篩選過(guò)程中，如果放棄分析包涵體的不同催化活性，即使基因功能分析預(yù)測(cè) 其具有甲醇解活性，在測(cè)不到具體活性的情況下，則還是無(wú)法挖掘、確定所述酶的甲醇解活 性。而本發(fā)明通過(guò)對(duì)包涵體進(jìn)行活性分析，最終確定所述酶還具有甲醇解活性，并發(fā)現(xiàn)在可 溶與不可溶狀態(tài)下不同催化特性的活力不同。
[0024] 本發(fā)明方法將顯著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因獲得的效率，對(duì)于其他酶 的篩選和制備也提供了有價(jià)值的參考。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1基于華根霉全基因組的脂肪酶基因挖掘
[0026] 基于華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021 全基因組數(shù)據(jù)（GenBank 編號(hào)ANKS00000000)，通過(guò)Augustus軟件與Genemark軟件工具分別對(duì)測(cè)序后全基因組序 列數(shù)據(jù)進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)基因序列與各數(shù)據(jù)庫(kù)NR、PFAM、⑶D、KEGG、COG、SwissProt 及TrEMBL·進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的功會(huì)泛注釋信息(http://genome, jgi. doe. gov/Rhichl/ Rhichl. home, html)。從基因注釋中共發(fā)現(xiàn)119個(gè)酯酶基因和123個(gè)脂肪酶基因，其中部分 基因既屬于酯酶又屬于脂肪酶。
[0027] 實(shí)施例2預(yù)測(cè)具有目的酶功能的脂肪酶候選基因的確定
[0028] 分別選擇用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae Lipase, R0L， 氨基酸序列如GeneBank :BAG16821. 1所示），用于非水相有機(jī)合成的南極假絲酵母脂肪 酶 B (Candida antarctica Lipase B，CALB，氨基酸序列如 NCBI UniProtKB/Swiss-Prot: P41365.1所示），用于食品加工的尖孢鐮刀菌脂肪酶（Fusarium oxysporum Lipase, F0L 和F0L1氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示）作為目標(biāo)酶，將華根霉基因 組中的脂肪酶和酯酶基因與目標(biāo)酶基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)。在使用標(biāo)準(zhǔn)Blastp比對(duì)過(guò) 程結(jié)果不理想時(shí)，使用更為靈敏的Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST,有利于發(fā)現(xiàn) 遠(yuǎn)親物種的相似蛋白或某個(gè)蛋白家族的新成員。以Query cover、Score、Identities和 Positives為指標(biāo)進(jìn)行分析，選擇最有可能的目的酶候選基因。針對(duì)各目標(biāo)酶主要候選基因 及比對(duì)參數(shù)如表1所示，其中，針對(duì)米根霉脂肪酶R0L，最有可能的候選脂肪酶基因依次為 A07506、A06672 和 A03113(http://genome, jgi. doe, gov/pages/search-for-genes. isf ? organism = Rhichl)。
[0029] 表1各目標(biāo)酶候選基因及比對(duì)參數(shù)
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種特異性篩選脂肪酶基因的方法，其特征在于，是基于華根霉全基因組序列結(jié)合 生物信息學(xué)篩選潛在的脂肪酶基因候選基因，將候選基因分別在大腸桿菌中表達(dá)，通過(guò)分 別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體部分的不同催化活性進(jìn)行篩選，獲得具有特定催化性能的華根霉 脂肪酶基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟： (1) 根據(jù)華根霉全基因組基因注釋獲得潛在的脂肪酶和酯酶基因，并對(duì)脂肪酶和酯酶 進(jìn)行分類，選擇已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，與所得華根霉基因組中潛在的脂 肪酶和酯酶基因進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性較高的脂肪酶或酯酶基因，預(yù)測(cè)其催化特性， 作為候選基因； (2) 將候選基因建立脂肪酶基因文庫(kù)，在大腸桿菌中表達(dá)，分別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體 的不同催化特性，篩選獲得具有特定催化性能的華根霉脂肪酶基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述華根霉是華根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述已知的具有特定催化特性的脂肪酶 包括用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶、用于非水相有機(jī)合成的南極假絲酵母脂肪酶B、用 于食品加工的尖抱鎌刀菌脂肪酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述分別檢測(cè)可溶蛋白和包涵體 的不同催化特性，是根據(jù)脂肪酶不同的催化特性和用途，采用不同的脂肪酶活性測(cè)定方法； 包括橄欖油指示劑滴定法測(cè)定脂肪酶水解活性、有機(jī)相酯合成法測(cè)定脂肪酶合成活性、甲 醇水解法測(cè)定脂肪酶甲醇解活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2)以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主， 以pET-22b為表達(dá)載體。
7. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述方法篩選得到的華根霉脂肪酶基因，其特征在于，核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 或 SEQ ID NO. 2 所示。
8. 權(quán)利要求8所述基因在制備酶制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK104195151SQ201410375196
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】王棟, 徐巖, 喻曉蔚 申請(qǐng)人:江南大學(xué)