專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)核病用藥評(píng)估試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物敏感性的試劑
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，全球約有20億人受結(jié)核分支桿菌感染，其中約有5000 萬(wàn)人感染了耐藥結(jié)核分支桿菌，使耐藥結(jié)核病例數(shù)明顯增多，結(jié)核患者中又有發(fā)生自然耐藥的危險(xiǎn)。耐藥 性和結(jié)核分支桿菌代謝的分子生物學(xué)研究將推動(dòng)新型藥物的開(kāi)發(fā)和建立適宜推廣的快速鑒定結(jié)核分支桿 菌耐藥基因類(lèi)型的方法，便于人們了解結(jié)核病患者的耐藥狀況，指導(dǎo)臨床的化療和防止耐藥菌的播散。
異煙肼(INH)作為抗結(jié)核治療的首選藥物，對(duì)結(jié)核病的有效控制發(fā)揮了重要作用。但近年來(lái)結(jié)核分支 桿菌對(duì)INH耐藥性以及多重耐藥的出現(xiàn)已成為抗結(jié)核治療中的重大障礙。研究表明，INH實(shí)際上是一個(gè)藥 物前體，需經(jīng)結(jié)核分支桿菌過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶活化后才發(fā)揮抗結(jié)作用，而過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶則 由katG基因所編碼。最新研究認(rèn)為KatG基因的變異(包點(diǎn)突變、缺失、插入等)導(dǎo)致的結(jié)核分枝桿菌過(guò)氧 化氫酶-過(guò)氧化物酶活性降低或缺失可以解釋90%以上的1朋耐藥。INH耐藥性結(jié)核分支桿菌中，KatG基因 突變較其完全缺失更為普遍，是結(jié)核菌耐INH的主要機(jī)制，其中315位密碼子AGC(Ser) —ACC(Th r)的點(diǎn) 突變與結(jié)核菌耐INH更為密切。這個(gè)突變點(diǎn)導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶活性較野生株降低50%左右，可以作為檢測(cè)結(jié) 核桿菌對(duì)異煙肼耐藥的簡(jiǎn)易指標(biāo)，從而可以了解結(jié)核病患者的耐藥狀況，指導(dǎo)臨床的治療和防止耐藥菌體 的播散。
RNA聚合酶的e亞基rpoB基因突變已作為MTB耐RFP的遺傳標(biāo)志，其中531位Ser ( TCG) —Leu(TTG) 氨基酸錯(cuò)義突變最常見(jiàn)，可以把檢測(cè)這個(gè)區(qū)域的突變作為一種檢測(cè)結(jié)核桿菌耐RFP簡(jiǎn)易、快速的方法。另 外由于異煙肼和利福平是臨床最常用的藥物，有作者報(bào)告90%-95%耐利福平株同時(shí)也耐異煙肼，因而單獨(dú) 進(jìn)行利福平敏感性分析也可作為耐多藥的篩選指標(biāo)。
鏈霉素是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，它主要作用于核糖體30S亞基，誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)讀，抑制轉(zhuǎn)譯過(guò) 程的開(kāi)始，干擾轉(zhuǎn)譯過(guò)程中的校對(duì)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮抗菌作用。研究表明，結(jié)核分枝桿菌耐 受SM與編碼核糖體30S亞基，S12蛋白的rpsL基因和編碼16SrRNA的rrs基因突變有關(guān)。臨床分離耐SM 菌株約有80%可見(jiàn)rpsL和(或)rrs基因突變，其中rpsL的突變率高于rrs。 rspL基因最常見(jiàn)的是43位 密碼子突變，使Lys密碼子(MG)突變成精氨酸(Arg)，也可見(jiàn)88位密碼子發(fā)生同樣的突變，rspL的突 變常引起高水平的耐藥。rrs突變常發(fā)生于915區(qū)和530環(huán)區(qū)，它常引起中等水平的耐藥。少數(shù)耐SM結(jié)核 分枝桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)雙位點(diǎn)的突變，如rspL43位密碼子和rrs513位密碼子突變，rpsL88位和rrs904 位突變。
embB為結(jié)核桿菌arabinosyltransferase (阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶)蛋白編碼基因，主要作用是在阿拉伯 糖代謝通路中將阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移，促進(jìn)肺結(jié)核病菌的細(xì)胞壁的生物合成。阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶 (arabinosyltransferase)是肺結(jié)核病菌的細(xì)胞壁的生物合成所需的一種酶，基因的突變或過(guò)度表達(dá)可導(dǎo) 致持續(xù)合成阿拉伯聚糖而耐藥。研究發(fā)現(xiàn)embB基因具有單核苷酸多態(tài)性,其中最常見(jiàn)的是位點(diǎn)306的突變。 該酶在306位點(diǎn)發(fā)生改變,使酶與乙胺丁醇(EMB)不能作用，從而使結(jié)核桿菌對(duì)乙胺丁醇產(chǎn)生抗性。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心頒布的《中國(guó)人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對(duì)與 結(jié)核病藥物敏感性相關(guān)基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國(guó)人群適用性等進(jìn)行綜合分析評(píng)估 后，KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、rpsL基因的L43A位點(diǎn)和e油B基因的第306個(gè)密 碼子通過(guò)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心認(rèn)定，可用于檢測(cè)評(píng)估結(jié)核病藥物敏感性。
基于KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、rpsL基因的L43A位點(diǎn)和embB基因的第306 個(gè)密碼子的基因型可用來(lái)評(píng)估個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物敏感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物 敏感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測(cè)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)和rpsL基因的L43A位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特 異性熒光探針對(duì)；
檢測(cè)embB基因的第306個(gè)密碼子基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；
熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子 水等)。
PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、Exo I酶、去離子水等)；
DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子
水等)。
本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、rpsL基 因的L43A位點(diǎn)和embB基因的第306個(gè)密碼子而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這些位點(diǎn)DNA片段的引物對(duì)。 設(shè)計(jì)這類(lèi)引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。
所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)和rpsL基因的 L43A位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這些SNP位點(diǎn)基因型的Taqraan探針對(duì)。設(shè)計(jì)這 類(lèi)探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。
所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)embB基因的第306個(gè)密碼子基因型而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異 性檢測(cè)出這個(gè)密碼子基因型的DNA測(cè)序引物。設(shè)計(jì)這類(lèi)引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。DNA測(cè)序 引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括
1. 熒光定量PCR反應(yīng)套裝
10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液3^1，
25mM dNTP混合液0.3pl，
25mM MgQ2溶液1. 8pl，
5units/nl Taq DNA聚合酶0. 075^1，
20MM特異性引物對(duì)每條引物各0.225n1,
10MM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25^1，
去離子水15.975^1。
2. PCR反應(yīng)套裝
10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5^1,
25mM dNTP混合液0.2^1，
25mM MgCl2溶液1.5^1，
5units/pl Taq DNA聚合酶0. 125^1,
20一 APOE基因特異性引物對(duì)每條引物各0.25iil，
去離子水19. 175"。
3. PCR產(chǎn)物純化套裝 lunits/Vl SAP酶O. 75|_il，. 10units/Vl Exol酶0. 375^1， 去離子水3.875nl。
4. 測(cè)序反應(yīng)套裝
25% BigDye mix l|il， 3.2nM DNA測(cè)序引物 125mM EDTA溶液lpl，
100%乙醇溶液15nl, 70%乙醇溶液30[il， HIDI溶液8pl， 去離子水2pl。
本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠(chǎng)商所建議的條件。
實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)的體系為總體積lOjxl，包含濃度為 20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6pl 25mMMgCl2 溶液、0. 025pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20nM的有義引物和反義引物各0. 225pl、，的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25nl，去離子水5.325iul。
在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、 30秒， 60°C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: PCR擴(kuò)增反應(yīng) 使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)套裝。
反應(yīng)的體系為總體積25nl，包含濃度為12. 5ng/nl的DNA模板lpl、10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5pl，25mM dNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1, 20^M特異性引物對(duì)每 條引物各0.25^1，去離子水19.175^1。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94。C、 12分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C、 30秒，60 。C、 30秒，72°C、 30秒，然后進(jìn)行72。C、 IO分鐘。
步驟4: PCR產(chǎn)物純化
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化套裝，反應(yīng)體系為總體積25^1，包含PCR產(chǎn)物20^1， lunits/nl SAP 酶O. 75^1, 10units/nl Exol酶0.375pl，去離子水3. 875^1。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37。C、 15分鐘，72"、 20分鐘。
步驟5: DNA測(cè)序反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)套裝，反應(yīng)的體系為總體積5pl,包含PCR純化產(chǎn)物1^1,25% BigDye mix 1^1， 3.2nMDNA測(cè)序引物lnl，去離子水2^1。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98°C 、2分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的96°C 、30秒，55 °C 、 30秒，60°C、 4分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15pl,于室溫下沉淀15分鐘；在4°C以3650 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30^1，以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8nl，放入測(cè)序儀中。
步驟6:基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的密碼子的基因型。
實(shí)施例2.對(duì)病人進(jìn)行結(jié)核病藥物敏感性評(píng)估的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)病人基因組DNA的AKatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、 rpsL基因的L43A位點(diǎn)和embB基因的第306個(gè)密碼子進(jìn)行檢測(cè)，確定這些位點(diǎn)的基因型。
步驟3:個(gè)體結(jié)核病藥物敏感性的評(píng)估分析
通過(guò)對(duì)病人基因型的分析，出具個(gè)體結(jié)核病藥物敏感性的評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè) 病人結(jié)核病藥物敏感性的有效性，可供醫(yī)師參考調(diào)整病人的用藥方式和劑量。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物敏感性的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)和rpsL基因的L43A位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、檢測(cè)embB基因的第306個(gè)密碼子基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)緩沖液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等等。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)針對(duì)KatG基因的S315T 位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、rpsL基因的L43A位點(diǎn)和embB基因的第306個(gè)密碼子而設(shè)計(jì)，能特異性 擴(kuò)增出包含這些位點(diǎn)DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)KatG基因的S315T 位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)和rpsL基因的L43A位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這 些SNP位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)不i」要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)embB基因的第306個(gè) 密碼子基因型而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出這個(gè)密碼子基因型的DNA測(cè)序引物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) 熒光定量PCR反應(yīng)套裝10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液3nl， 25mMdNTP混合液0.3^1， 25mMMgC12 溶液1. 8pl， 5unitS/Vl Taq DNA聚合酶0.075nl, 20MM特異性引物對(duì)每條引物各0.225pl， lOiaM特異 性熒^;探針對(duì)每條探針各0.25^，去離子水15.975^1。2) PCR反應(yīng)套裝IOXPCR反應(yīng)緩沖液2.5pl， 25mM dNTP混合液0.2p1, 25mMMgC12溶液1.5pl， 5units/^ilTaqDNA聚合酶0.125jxl， 20pM特異性引物對(duì)每條引物各0.25nl，去離子水19.175pl。3) PCR產(chǎn)物純化套裝lunits/^l SAP酶0.75jlU， lOunits/jilExoI酶0.375nl，去離子水3.875^1。4) 測(cè)序反應(yīng)套裝25%BigDyemix lpl， 3.2|_iM DNA測(cè)序引物l)al， 125mMEDTA溶液lpl， 100% 乙醇溶液15|il, 70%乙醇溶液30^1， HIDI溶液8^1，去離子水2pl。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物敏感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)和rpsL基因的L43A位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、檢測(cè)embB基因的第306個(gè)密碼子基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。通過(guò)檢測(cè)KatG基因的S315T位點(diǎn)、rpoB基因的S531L位點(diǎn)、rpsL基因的L43A位點(diǎn)和embB基因的第306個(gè)密碼子的基因型，來(lái)分析評(píng)估個(gè)體對(duì)結(jié)核病藥物的敏感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101363799SQ20071004469
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司