抗腦缺血再灌注損傷的藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及丁酸梭菌的新用途，具體涉及丁酸梭菌在制備預(yù)防與治療腦缺血再灌注損傷組合物中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]中風(fēng)是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要疾病，目前已經(jīng)成為僅次于心臟病和癌癥的第三大致死原因。腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、恢復(fù)緩慢的特點(diǎn)，每年新增200萬(wàn)以上病例，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，且近年來(lái)逐漸有年輕化的趨勢(shì)。腦卒中而缺血性中風(fēng)的發(fā)病率約占中風(fēng)的60-80%，是腦卒中的主要類型缺血性腦中風(fēng)為最常見中風(fēng)類型。
[0003]腦缺血再灌注損傷是指各種原因造成的局部腦組織的缺氧缺血，使腦組織細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，在一定條件下恢復(fù)血液再灌注后，腦神經(jīng)細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重的現(xiàn)象。缺血性腦血管疾病是產(chǎn)生腦缺血再灌注損傷的主要病理因素之一。病理機(jī)制十分復(fù)雜。腦缺血損傷的病理生理機(jī)制尚未完全明確，大量研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能主要包括氧化應(yīng)激、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等，這幾種因素相互作用、相互影響，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，造成一系列病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，直接或者間接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡/死亡，加劇了腦損傷。由于腦缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜性，單一使用阻斷某一病理環(huán)節(jié)的藥物可能難以奏效。目前，臨床上對(duì)缺血性腦血管疾病治療主要有溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療兩大類。早期溶栓、抗凝治療為循證醫(yī)學(xué)確認(rèn)的有效治療方法，但也存在嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，在長(zhǎng)期恢復(fù)過(guò)程中效果不顯著。
[0004]“益生菌，，是活性的微生物，可以有效改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制病原菌，產(chǎn)生良好的健康效應(yīng)，目前已制備成藥品、保健品或飲品等益生菌制劑。通過(guò)改善腸道菌群調(diào)節(jié)和治療全身疾病現(xiàn)在越來(lái)越成為科學(xué)界的共識(shí)，臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)很多的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如自閉癥、抑郁癥，都與腸道菌群紊亂有密切的聯(lián)系，與人體的腦-腸軸有密切的關(guān)系，甚至有通過(guò)飲用酸奶減輕疾病癥狀的成功例子。腦-腸軸是一個(gè)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道菌群之間的復(fù)雜的雙向交互系統(tǒng)，越來(lái)越被人所熟知。但是，通過(guò)益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群防治腦缺血再灌注損傷國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。
[0005]丁酸梭菌屬(Clostridium butyricum)作為重要的益生菌，先前已廣泛地應(yīng)用來(lái)預(yù)防和治療腸炎、便秘等疾病。丁酸梭菌屬一般存在于土壤、動(dòng)物和人體的腸道中，是革蘭氏陽(yáng)性厭氧桿菌，能耐受胃酸進(jìn)入腸道，分泌腸粘膜再生和修復(fù)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)酪酸(丁酸)，修復(fù)受損傷的腸粘膜，消除炎癥，營(yíng)養(yǎng)腸道，對(duì)各種原因包括腸道細(xì)菌感染、腫瘤化療、外科手術(shù)等所致的腸道疾病具有良好的療效，人們對(duì)腦缺血再灌注損傷和腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)不足，科學(xué)工作者對(duì)這方面的研究也不多，到目前為止，尚未見丁酸梭菌防治腦缺血再灌注損傷的研究應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，創(chuàng)造性應(yīng)用丁酸梭菌到腦缺血再灌注損傷的防治上，進(jìn)而開發(fā)出預(yù)防或治療腦缺血再灌注損傷的益生菌制劑。本發(fā)明的目的是提供一種安全的、有效的防治腦缺血再灌注損傷的丁酸梭菌菌株及益生菌制劑和制備方法。
[0007]本發(fā)明提供一株具有防治腦缺血再灌注損傷的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) WZMClO 18 菌株。
[0008]本發(fā)明丁酸梭菌為丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) WZMC1018 菌株，已于 2014年10月22日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCCUfta:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.9830。
[0009]本發(fā)明丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMClO 18具有下述生物學(xué)特征:
[0010](I)菌落形態(tài):呈乳白色，圓形稍凸，邊緣不規(guī)則，直徑I?3mm，表面略有光澤，液體培養(yǎng)基中有氣泡產(chǎn)生；
[0011](2)個(gè)體形態(tài):為G+芽孢桿菌，菌體呈直或彎桿狀，0.6?1.2 X 3.0?7.0 μ m，端圓，單個(gè)、成對(duì)、短鏈、偶見長(zhǎng)絲狀菌體；
[0012](3)生理生化特征:麥芽糖(+);甘露醇(+);棉子糖(+);乳糖(+);核糖(+);淀粉(+)。
[0013]培養(yǎng)最適條件:厭氧下生長(zhǎng)良好，有氧環(huán)境中不生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度35?40°C;最低生長(zhǎng)溫度25?28°C ;最高43?45°C ;生長(zhǎng)最適pH 6.5?7.0 ;pH 4.5?5.0或8.0?8.5不生長(zhǎng)。
[0014]本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供丁酸梭菌的一種新的制藥用途，即丁酸梭菌在制備防治腦缺血再灌注損傷益生菌制劑組合物中的應(yīng)用，該組合物可以為藥品、保健品和飲品等。
[0015]本發(fā)明是以有效劑量的丁酸梭菌WZMC1018菌株作為藥物活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、營(yíng)養(yǎng)劑等輔料，制成任何一種適合于治療與預(yù)防腦缺血再灌注損傷益生菌制劑，臨床上使用的劑型可以為顆粒劑、散劑、口服液、灌腸劑等。
[0016]本發(fā)明所指有效劑量是指以丁酸梭菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于IX 107CFU/g。
[0017]本發(fā)明所述丁酸梭菌是指活細(xì)胞的形式，益生菌制劑組合物包含的總活菌數(shù)不能低于 I X 107CFU/g，一般在 I X 108CFU/g 以上，最高可達(dá)到 I X 1012CFU/g 或 I X 1012CFU/g 以上。
[0018]本發(fā)明優(yōu)選的制劑工藝為，丁酸梭菌制劑的制備:將丁酸梭菌WZMC1018菌株種子液按重量I %接種量接入已滅菌后的含有重量蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，葡萄糖 2%，K2HPO4 0.2%, MgSO4.7H20 0.05%, MnSO4.4H20 0.02%，低聚果糖 0.3%，檸檬酸二銨0.2%液體培養(yǎng)基中，經(jīng)36°C?38°C厭氧發(fā)酵后，離心分離菌體，將菌體加入含有重量5 %的谷氨酸鈉和5 %多脂奶粉凍干保護(hù)液中，混合冷凍干燥后即可得到丁酸梭菌活菌菌粉，所得干燥菌粉，與藥用載體混合，即得到所述最終劑型益生菌組合物。制劑工藝并不局限于本發(fā)明所述，其它公知的制劑工藝均可以。藥用載體可以為低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等。
[0019]由于本發(fā)明首次公開了以丁酸梭菌WZMC1018菌株為藥物活性成份在制備治療與預(yù)防腦缺血再灌注損傷藥物中的應(yīng)用，因此，以丁酸梭菌WZMC1018菌株為活性成份與輔料組合制成藥劑，只要是該藥劑用于治療與預(yù)防腦缺血再灌注損傷，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]有效劑量是指以丁酸梭菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于I X 107CFU/g。
[0021]本發(fā)明所述丁酸梭菌制劑組合物包含的丁酸梭菌總活菌數(shù)不能低于IXlO7CFU/g，一般在 I X 108CFU/g 以上，最高可達(dá)到 I X 1012CFU/g 或 I X 1012CFU/g 以上。
[0022]本發(fā)明選用丁酸梭菌WZMC1018菌株來(lái)防治腦缺血再灌注損傷，療效顯著，并隨劑量的增加，療效加強(qiáng)，且未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0024]本發(fā)明首次揭示丁酸梭菌WZMC1018菌株在防治腦缺血再灌注損傷的用途，并提供丁酸梭菌制劑組合物的制備方法。本發(fā)明選用的丁酸梭菌WZMC1018菌株來(lái)源于人體，經(jīng)篩選、馴化和驗(yàn)證，安全性高，具有良好的生態(tài)互助性。本發(fā)明能明顯改善腦缺血再灌注損傷所致的腸道菌群失調(diào)，本發(fā)明能提高腦組織抗氧化酶活性、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶能力。丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物有丁酸等短鏈脂肪酸，通過(guò)血腦屏障，也能在腦內(nèi)發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)損傷作用。因此，本發(fā)明的丁酸梭菌制劑組合物可以作為防治腦缺血再灌注損傷的藥物，無(wú)毒副作用，使用方便，可作為營(yíng)養(yǎng)制劑和其他營(yíng)養(yǎng)素一起用于臨床患者的輔助治療，讓患者在平時(shí)飲食的過(guò)程中就能完成輔助治療，能夠大大減輕腦缺血再灌注損傷患者痛苦。
【具體實(shí)施方式】
[0025]丁酸梭菌制劑組合物的制備是首先制備丁酸梭菌菌粉，然后按照需要填加相應(yīng)輔料制成相應(yīng)的劑型，本發(fā)明以口服丁酸梭菌活菌散劑具體制備為例，說(shuō)明益生菌的制備方法，其它劑型的制備方法省略，不再一一說(shuō)明，具體制備劑型并不局限于下面所述的方法。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實(shí)施例1 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018菌株的分離與鑒定
[0027]以一名健康青年人的糞便作為分離樣品，在改良MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37°C厭氧條件下，48h涂布分離培養(yǎng)，獲得本發(fā)明所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) WZMClO 18，鑒定為丁酸梭菌屬。
[0028]改良MRS培養(yǎng)基的配方:蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HP042g，MgSO4.7H20 0.5g，MnSO4.4H20 0.2g，低聚果糖 3g，檸檬酸二銨 2g，瓊脂 15g，蒸餾水 1L，調(diào)pH至7.0，115°C滅菌15分鐘。
[0029]本發(fā)明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1018具有下述微生物學(xué)特征:
[0030](I)菌落形態(tài):呈乳白色，圓形稍凸，邊緣不規(guī)則，直徑I?3mm，表面略有光澤，液體培養(yǎng)基中有氣泡產(chǎn)生。
[0031](2)個(gè)體形態(tài):為G+芽孢桿菌，菌體呈直或彎桿狀，0.6?1.2X3.0?7.0 μ m，端圓，單個(gè)、成對(duì)、短鏈、偶見長(zhǎng)絲狀菌體。
[0032](3)生理生化特征:麥芽糖(+);甘露醇(+);棉子糖(+);乳糖(+);核糖(+);淀粉(+)。
[0033]培養(yǎng)最適條件:厭氧下生長(zhǎng)良好，有氧環(huán)境中不生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng)溫度35?40°C;最低生長(zhǎng)溫度25?28°C ;最高43?45°C ;生長(zhǎng)最適pH 6.5?7.0 ;pH 4.5?5.0或8.0?8.5不生長(zhǎng)。
[0034]本發(fā)明的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)WZMC1018，已于 2014 年 10 月 22 日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為