專利名稱：一種誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法
一種誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，屬于特產(chǎn)植物育種領(lǐng)域。
二、背景技術(shù)鹽潰是限制植物生長和降低其產(chǎn)量最主要的非生物脅迫因素之一，大面積的鹽潰化土地嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，通過培育和篩選新的耐鹽經(jīng)濟植物，并對現(xiàn)有鹽潰化土壤的生態(tài)環(huán)境進行改良是沿海灘涂開發(fā)的理想途徑之一。培育和篩選耐鹽的植物突變體是培育新品種的第一步。
作為能源植物的大戟科植物續(xù)隨子是很有開發(fā)潛力的經(jīng)濟植物，其種子含油量高達43. 3% 47. 0%，且續(xù)隨子油主要脂肪酸成分以C16、C18脂肪酸為主，與理想柴油替代品的分子組成相類似，因此續(xù)隨子是生產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良種類。續(xù)隨子雖然是甜土植物，但是其種子適宜在低于O. 5%的NaCl溶液中萌發(fā)。因此，培育和篩選耐鹽的續(xù)隨子突變體是很有希望的。
培育和篩選耐鹽突變體過程通常是先采用雜交、轉(zhuǎn)基因、誘變等方法產(chǎn)生突變材料，再通過含NaCl的基質(zhì)或鹽潰化大田進行耐鹽鑒定。然而，雜交和轉(zhuǎn)基因操作過程較復(fù)雜，程序繁瑣，工作量大，成本也較大。再加之，植物的耐鹽性是一個復(fù)雜的數(shù)量遺傳性狀， 僅僅依靠一個或兩個耐鹽基因的過量表達遠遠不能達到培育高耐鹽品種的目的。相比較， 人工誘變育種具有成本低、使用方便、誘變作用專一性較強等特點。其中尤以化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯較為常用，能誘發(fā)產(chǎn)生高密度的系列等位基因點突變，而且后代較易穩(wěn)定遺傳， 一般到F3代就可穩(wěn)定。
產(chǎn)生的大量突變材料必須經(jīng)過耐鹽鑒定，才能得到耐鹽突變體。通常采用的耐鹽鑒定方法是利用NaCl基質(zhì)或鹽潰化大田進行耐鹽定向篩選。但是NaCl基質(zhì)鹽分較單一， 與實際的大田鹽潰土壤鹽分相差很大，因此利用NaCl基質(zhì)篩選出的突變材料適應(yīng)性較小。 由于鹽潰化大田土壤成分較復(fù)雜，為今后研究耐鹽突變體的耐鹽機理帶來不便，因此利用鹽潰化大田直接篩選耐鹽突變體也存在一定缺陷。
為了改良鹽潰化土壤的生態(tài)環(huán)境，進一步開發(fā)沿海灘涂，選擇具有優(yōu)勢的經(jīng)濟植物，培育并篩選出具有耐鹽適應(yīng)性的新品種，就成了當(dāng)下之需。然而，如何提高培育和篩選經(jīng)濟植物耐鹽品種的效率尤其是解決快速產(chǎn)生耐鹽突變體材料的問題就成了關(guān)鍵。本發(fā)明即著眼于此問題，選擇具有生物能源利用價值的經(jīng)濟植物續(xù)隨子作為材料，并將甲基磺酸乙酯誘變與模擬基質(zhì)篩選相結(jié)合，創(chuàng)立了快速篩選續(xù)隨子耐鹽突變體的方法。
三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，解決了耐鹽續(xù)隨子誘變和篩選效率低的問題。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案為首先用甲基磺酸乙酯對續(xù)隨子種子進行誘變處理，然后利用模擬基質(zhì)水溶液對經(jīng)過誘變處理的續(xù)隨子種子進行種子萌發(fā)的耐鹽篩選，最后利用模擬基質(zhì)水溶液對篩選出的發(fā)芽的續(xù)隨子進行生長期間的耐鹽篩選，最終獲得耐鹽突變體。
具體包括如下幾個步驟步驟一、用甲基磺酸乙酯對續(xù)隨子種子進行誘變處理將續(xù)隨子種子用濃度為O. 2-2. 0% (w/v)的甲基磺酸乙酯溶液進行浸泡誘變處理12小時即獲得了經(jīng)過誘變處理的續(xù)隨子種子。
步驟二、利用模擬基質(zhì)水溶液進行續(xù)隨子種子萌發(fā)期間的耐鹽篩選鑒定經(jīng)過步驟一誘變處理獲得的續(xù)隨子種子在流水中沖洗5次，每次I小時。然后將沖洗后的種子播種于裝有蛭石的盆缽里，播種深度為I厘米。盆缽里澆灌霍格蘭氏營養(yǎng)液，室溫條件下暗培養(yǎng)3天，然后再澆灌含有以下成分的模擬基質(zhì)水溶液0. 9%(w/v)氯化鈉、O. 07% (w/v)硫酸鈉、O. 12% (w/v)氯化鎂、O. 08% (w/v)硫酸鉀、O. 05% (w/v)氯化I丐、O. 008% (w/ V)碳酸氫鈉，繼續(xù)暗培養(yǎng)。10天后觀察出芽情況。
步驟三、利用模擬基質(zhì)水溶液進行生長期間的耐鹽篩選鑒定將步驟二得到的發(fā)芽的續(xù)隨子轉(zhuǎn)移至室溫和自然光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)。以盆缽中的蛭石干燥為度，每澆兩次霍格蘭營養(yǎng)液，就要澆一次模擬基質(zhì)水溶液0. 9% (w/v)氯化鈉、 O. 07% (w/v)硫酸鈉、O. 12% (w/v)氯化鎂、O. 08% (w/v)硫酸鉀、O. 05% (w/v)氯化鈣、O. 008% (w/v)碳酸氫鈉，共培養(yǎng)2個月。最終保持良好生長狀態(tài)者(以莖粗和葉綠為標(biāo)準(zhǔn))即為篩選到的耐鹽突變體。
本發(fā)明的有益效果如下(I)誘變材料是能源植物續(xù)隨子，而續(xù)隨子是較有潛力的能源植物，創(chuàng)立篩選其耐鹽突變體的方法為培育續(xù)隨子耐鹽新品種提供研究基礎(chǔ)。
(2)模擬基質(zhì)中添加的離子成分濃度固定且明確已知，因此具備與真實鹽潰土壤相近的離子多樣性。利用這種模擬基質(zhì)作為篩選介質(zhì)，不僅可以解決NaCl基質(zhì)鹽分較單一的缺點，而且由于其離子濃度和成分固定、明確，為后續(xù)的耐鹽機理解析提供便利。
(3)本發(fā)明將兩種優(yōu)勢方法相結(jié)合，即甲基磺酸乙酯誘變與模擬基質(zhì)定向篩選相結(jié)合來篩選耐鹽突變體，誘變頻率高，目標(biāo)明確，操作成本低廉，使用方便，篩選效率較高。
四具體實施方式
I、不同濃度的甲基磺酸乙酯誘變續(xù)隨子種子之后的自然發(fā)芽和活力情況試驗方法將甲基磺酸乙酯加入到O. lmol/L、pH=7. 2的磷酸鹽緩沖液中，配制成2. 0% (w/v)的甲基磺酸乙酯溶液，并將此溶液依次稀釋成1.5% (w/v)U% (w/v),O. 5% (w/v),O. 2% (w/v) 的甲基磺酸乙酯溶液。分別用上述不同濃度的甲基磺酸乙酯溶液浸泡續(xù)隨子種子12小時， 進行誘變處理。以不加甲基磺酸乙酯的磷酸緩沖液處理種作為對照。每個甲基磺酸乙酯濃度處理100粒種子。所有經(jīng)過甲基磺酸乙酯溶液或者磷酸鹽緩沖液處理的續(xù)隨子種子在流水中沖洗5次，每次I小時。
(I)續(xù)隨子種子經(jīng)過甲基磺酸乙酯誘變處理之后，種子發(fā)芽率的確定經(jīng)誘變處理的種子，放在鋪有用去離子水弄濕的濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在溫度25°C、光照條件為12h/12h光暗交替，進行種子萌發(fā)試驗，每天記錄并統(tǒng)計種子的萌發(fā)數(shù)，記錄 15天內(nèi)的結(jié)果。
種子活力指數(shù)Va= (SsXO. 2+SrXO. 8) XGi;
權(quán)利要求
1.一種誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于續(xù)隨子種子經(jīng)過甲基磺酸乙酯誘變處理之后再用模擬基質(zhì)水溶液對經(jīng)過誘變處理的續(xù)隨子種子進行種子萌發(fā)的耐鹽篩選，最后利用模擬基質(zhì)水溶液對篩選出的發(fā)芽的續(xù)隨子進行生長期間的耐鹽篩選，最終獲得耐鹽突變體。
2.如權(quán)利要求I所述的誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于用于誘變處理的甲基磺酸乙酯的濃度為O. 2-2. 0% (w/v)，用于甲基磺酸乙酯誘變處理的時間為 12小時。
3.如權(quán)利要求I或2所述的誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于 所述的經(jīng)過甲基磺酸乙酯誘變處理之后的續(xù)隨子種子經(jīng)過流水5次、每次I小時沖洗去除殘留的甲基磺酸乙酯之后播種于裝有蛭石的盆缽里，播種深度為I厘米；盆缽里澆灌霍格蘭氏營養(yǎng)液，室溫條件下暗培養(yǎng)3天，然后再澆灌含有氯化鈉、硫酸鈉、氯化鎂、硫酸鉀、氯化鈣和碳酸氫鈉的模擬基質(zhì)水溶液，繼續(xù)暗培養(yǎng)，10天后調(diào)查出芽情況；將出芽的續(xù)隨子轉(zhuǎn)移至室溫光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)；以播種容器內(nèi)的蛭石干燥為度，每澆兩次霍格蘭營養(yǎng)液， 澆一次含有氯化鈉、硫酸鈉、氯化鎂、硫酸鉀、氯化鈣和碳酸氫鈉的模擬基質(zhì)水溶液，共2個月；最終保持良好生長狀態(tài)者(以莖粗和葉綠為標(biāo)準(zhǔn))即為篩選到的耐鹽突變體。
4.如權(quán)利要求3所述的誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于所述的模擬基質(zhì)水溶液包含0· 9% (w/v)氯化鈉、O. 07% (w/v)硫酸鈉、O. 12% (w/v)氯化鎂、 O. 08% (w/v)硫酸鉀、O. 05% (w/v)氯化I丐和 O. 008% (w/v)碳酸氫鈉。
5.如權(quán)利要求4所述的誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于用于誘變處理的甲基磺酸乙酯的濃度為1% (w/v)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲基磺酸乙酯誘變續(xù)隨子種子并篩選耐鹽突變體的方法，其特征在于續(xù)隨子種子經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變與模擬基質(zhì)定向篩選相結(jié)合獲得續(xù)隨子耐鹽突變體。利用甲基磺酸乙酯對續(xù)隨子種子進行誘變處理，再利用模擬基質(zhì)進行種子萌發(fā)和生長期間的耐鹽篩選鑒定，選擇最佳的甲基磺酸乙酯誘變濃度與時間以及定向選擇壓。最佳甲基磺酸乙酯誘變濃度和時間分別為0.2%(w/v)和12小時，模擬基質(zhì)水溶液含0.9%(w/v)氯化鈉、0.07%硫酸鈉、0.12%氯化鎂、0.08%硫酸鉀、0.05%氯化鈣、0.008%碳酸氫鈉。本發(fā)明通過甲基磺酸乙酯誘變與模擬基質(zhì)定向選擇相結(jié)合選育出續(xù)隨子耐鹽突變體，為能源植物續(xù)隨子耐鹽育種提供了新的參考方法。
文檔編號A01H1/06GK102907317SQ20121043676
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者張衛(wèi)明, 孫力軍, 姚正穎, 陸長梅 申請人:中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所