枯草芽孢桿菌產(chǎn)綠原酸的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵菌株高產(chǎn)綠原酸的新發(fā)酵方法，具體涉及一種以已經(jīng)生 長(zhǎng)4-5個(gè)月的新鮮紅薯葉為發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分和所用菌株為自身有能力產(chǎn)綠原酸的一 株內(nèi)生細(xì)菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠原酸(CGA)或3-咖啡?？崴?3-caffeoylquinic acid，3_CQA)是一種縮酸酸， 由咖啡酸與奎尼酸組成，通常通過(guò)莽草酸途徑產(chǎn)生，在植物如杜仲、金銀花、野菊花中存在。 研究表明，綠原酸有各種藥效作用包括抗氧化、抗菌、抗過(guò)敏、抗癌、降低血糖、抗乙肝B病毒 等作用，以及廣泛用于中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥、日用化工和食品等。綠原酸可稱作是一種植物黃金， 可從許多藥用植物中提取，但其技術(shù)復(fù)雜且得率并不高，還會(huì)對(duì)植物本身帶來(lái)?yè)p害?，F(xiàn)少有 報(bào)道從其中能分離得到產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生真菌，相較而言，產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生細(xì)菌鮮有報(bào)道。
[0003] 本實(shí)驗(yàn)室從金銀花葉中分離得到一株自身可以產(chǎn)綠原酸的內(nèi)生細(xì)菌Bacillus subtilis RP5。相比從植物和其內(nèi)生真菌中提取綠原酸而言，可以節(jié)約大量的成本和時(shí)間。 雖然找到了一種有效而可替代的微生物來(lái)源，但其發(fā)酵產(chǎn)量并不高，找到一種新型發(fā)酵產(chǎn) 綠原酸的方法尤為重要。
[0004] 紅薯葉含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它不僅含有蛋白質(zhì)、氨基酸、胡蘿卜素、維生素和一些 重要的礦物元素，而且富含許多生物活性物質(zhì)如活性多糖、黃酮類(lèi)化合物和綠原酸。但是這 種豐富而廉價(jià)的資源并未得到大量的利用。紅薯葉中含有豐富的綠原酸等酚類(lèi)物質(zhì)和大量 的蛋白質(zhì)、多糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明利用其作為發(fā)酵RP5的培養(yǎng)基以生產(chǎn)綠原酸是一種非常 可取的選擇。
[0005] 由于綠原酸的合成是一種碳素依賴的苯丙烷代謝途徑，高濃度的碳源可造成細(xì)胞 的高滲透壓，在這種脅迫下可產(chǎn)生較高濃度的刺激代謝產(chǎn)物。因此本發(fā)明提供了不同濃度 的蔗糖對(duì)產(chǎn)綠原酸的影響。與此同時(shí)，由于碳源、氮源在產(chǎn)綠原酸的緊密聯(lián)系，氨態(tài)氮的利 用比硝態(tài)氮的利用更有利于綠原酸的積累。在植物和內(nèi)生菌中肯定能含有類(lèi)似的產(chǎn)綠原酸 的途徑，因此培養(yǎng)基的氮源本發(fā)明采用銨態(tài)氮。
[0006] 本發(fā)明利用新鮮紅薯葉為發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)材料，進(jìn)行了對(duì)培養(yǎng)基的組成成分及 含量的優(yōu)化探究，以增加 RP5發(fā)酵產(chǎn)綠原酸的能力，發(fā)現(xiàn)該種發(fā)酵方法的確能夠大幅度增加 菌株RP5合成綠原酸的產(chǎn)量。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定了該發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分的含量及此種 發(fā)酵方法下綠原酸的前體和兩種異構(gòu)體的變化。該發(fā)明可為綠原酸的大規(guī)模生產(chǎn)提供數(shù)據(jù) 支持和理論依據(jù)，也加快了植物內(nèi)生細(xì)菌和紅薯葉資源的綜合利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單，快速的新發(fā)酵方法，大幅度提高原本可以產(chǎn)綠 原酸及其異構(gòu)體的菌株合成綠原酸的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌Bacillus subtilis RP5,該菌株對(duì) 人體無(wú)害且能產(chǎn)綠原酸，且已于2015年6月14日送交保藏。
[0010] 保藏日期:2015年6月14日，并于2015年6月19日鑒定結(jié)果為存活。
[0011] 保藏編號(hào)：CCTCC NO: Μ 2015367
[0012] 分類(lèi)命名：Bacillus subtilis RP5
[0013] 保藏單位名稱:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。
[0014] 保藏單位地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)
[0015] 本發(fā)明為產(chǎn)綠原酸的菌株提供一種新方法的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及含量，其特征是采 用已經(jīng)生長(zhǎng)4-5個(gè)月的新鮮紅薯葉為基礎(chǔ)材料，結(jié)合添加碳、氮源及其它重要離子。然后利 用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)綠原酸含量進(jìn)行定量測(cè)定，利用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)對(duì)培養(yǎng)基和 發(fā)酵液中綠原酸前體及異構(gòu)體進(jìn)行定性定量檢測(cè)，確保本發(fā)明的可操作性。
[0016] 1植物材料和發(fā)酵培養(yǎng)基 新鮮甘薯葉（已經(jīng)生長(zhǎng)4-5月）采摘自成都。取200克新鮮甘薯葉剪碎制成勻漿，煮沸10 分鐘，然后單層紗布過(guò)濾，添加蒸餾水至1L，得到甘薯葉粗提液。一部分溶液通過(guò)微型過(guò)濾 器(0.45μπι)過(guò)濾除菌備用。但此種方法發(fā)酵得到綠原酸的產(chǎn)量比高壓蒸汽滅菌得到的產(chǎn)量 要低，因此本發(fā)明采取高壓蒸汽滅菌115 °C，20min?；A(chǔ)液體培養(yǎng)基0-1)確定為蔗糖(40)， 大豆蛋白胨(10)，氯化銨(5)，硫酸銅(0.04)以及新鮮紅薯葉(200)。 _7] 2菌株和培養(yǎng)條件 在我們先前的研究中，Bacillus subtilis RP5分離來(lái)源于金銀花葉。斜面保存于-4°C 土豆培養(yǎng)基(PDA)以及-40°C，40%甘油管中。液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)采用250ml三角瓶中加入100ml 液體培養(yǎng)基，接種量2%并在37°C，200rev mirT1的轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)28h。
[0018] 3綠原酸提取方法 將菌株RP5活化后接種于100ml紅薯葉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)28h(37°C，200rev mirT1)。離心(5000g，20min)，取上清液，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH至4，以保持綠原酸的穩(wěn)定性，加入 等體積70%乙醇超聲波處理(40°C，10min)以加快液質(zhì)轉(zhuǎn)化從而加快提取效率，然后靜止過(guò) 夜。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至20ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)PH至2-3,接著加入等體積乙酸乙酯 萃取三次，每次lh，取乙酸乙酯層真空濃縮至幾乎干，加入5ml色譜甲醇完全溶解，用有機(jī)濾 膜過(guò)濾，除去樣品中的不溶物制備成待測(cè)樣品溶液。
[0019] 4高效液相色譜HPLC分析 HPLC同時(shí)測(cè)定初始發(fā)酵(PDB)和紅薯葉作為新的發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)發(fā)酵液中綠原酸含量。 發(fā)酵液中綠原酸總產(chǎn)量可達(dá)54.60mg Γ1，是RP5初始發(fā)酵（1.58mg Γ1)的23.90倍。
[0020] 5液質(zhì)聯(lián)用LC-MS分析綠原酸前體和異構(gòu)體 應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用方法，根據(jù)它們的裂解規(guī)律和信號(hào)強(qiáng)度以及報(bào)道的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，能分離 綠原酸的四種前體標(biāo)品肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸和奎尼酸以及兩種異構(gòu)體新綠原酸-4-咖 啡?？崴?4-CQA)，隱綠原酸5-咖啡?？崴?5-CQA)。在四種前體中，肉桂酸酸轉(zhuǎn)化率最 高，可達(dá)100 %，對(duì)香豆酸酸、咖啡酸、奎尼酸分別為72.4 %，78.4%，33.3 %。兩種同分異構(gòu) 體可達(dá) 128.04mg Γ1 是初始發(fā)酵（1.74mg
[0021] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)。 1、本發(fā)明中新的發(fā)酵方法所運(yùn)用的發(fā)酵培養(yǎng)基可以大幅度提高RP5產(chǎn)綠原酸的能力。 其發(fā)酵液中綠原酸總產(chǎn)量可達(dá)54.60mg Γ1，是RP5初始發(fā)酵（1.58mg Γ1)的23.90倍。總綠 原酸的產(chǎn)量包括綠原酸及其兩種同分異構(gòu)體可達(dá)128.04mg Γ1是初始發(fā)酵（1.74mg Γ1)的 31.74倍。其效果極其顯著。 2、 本發(fā)明中利用的紅薯葉來(lái)源廣泛，價(jià)格非常低廉，容易獲取。此外培養(yǎng)基的組成成 分如蔗糖，大豆蛋白胨，氯化銨，硫酸銅也非常低廉易獲得。本實(shí)驗(yàn)綠原酸的提取方法也相 對(duì)簡(jiǎn)單。 3、 本發(fā)明可以應(yīng)用與其它植物和菌株，把微生物資源和植物資源綜合利用起來(lái)，真正 做到資源的合理開(kāi)發(fā)。為大規(guī)模產(chǎn)綠原酸提供可靠的前景。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1高效液相色譜HPLC分析。圖1 HPLC色譜圖：綠原酸(杜仲提取)標(biāo)品