一株生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵方法
【專利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及一株生防芽孢桿菌的發(fā)酵方法，尤其是一種生防芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵方 法，屬于發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】： 生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、安全的農(nóng)產(chǎn)品是人們對(duì)農(nóng)業(yè)的要求，農(nóng)業(yè)也面臨著由化學(xué)時(shí)代向無(wú)公害、綠 色和有機(jī)時(shí)代的過(guò)渡。目前，在我國(guó)由于農(nóng)產(chǎn)品中大量農(nóng)藥殘留，導(dǎo)致急性或慢性中毒事件 時(shí)有發(fā)生，少量農(nóng)藥進(jìn)入人體也損害機(jī)體健康誘發(fā)多種疾病，化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用還 造成了水土資源的嚴(yán)重污染。發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)，生產(chǎn)綠色、安全食品已成為大勢(shì)所趨。微生物 生防制劑是當(dāng)前國(guó)家提倡應(yīng)用于防治植物病害的農(nóng)用生物制劑，具有如下特點(diǎn)：⑴安全環(huán) 保；⑵可持續(xù)控制有害生物；⑶對(duì)土傳病害的防治效果優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥。我國(guó)"十二五"規(guī)劃 對(duì)環(huán)境資源保護(hù)和人民生活健康水平等方面提出更高要求，減少化學(xué)農(nóng)藥使用，大力發(fā)展 生物制劑勢(shì)在必行，這是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切問(wèn)題。
[0003] 目前，微生物生防制劑與化學(xué)農(nóng)藥相比防治成本較高是阻礙其推廣應(yīng)用的一個(gè)重 要原因。因此從提高微生物生防制劑的發(fā)酵水平著手，降低發(fā)酵成本以促進(jìn)其推廣是迫切 需要解決的問(wèn)題。這一研究方向符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求，符合植物病害可持續(xù)治 理的的目標(biāo)，對(duì)提高食品安全和環(huán)境健康等方面具有重要意義，具有良好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社 會(huì)效益。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢(shì)生物種群，具有良好生防潛能及商品性 能，是重要的生防菌資源。生防芽孢桿菌具有以下優(yōu)點(diǎn)：高效，殺菌譜廣；具有預(yù)防和治療 的雙重作用，在發(fā)病前使用可保護(hù)植株免受病原菌的侵染，在發(fā)病后酌量使用可控制病害 蔓延，優(yōu)于傳統(tǒng)的三環(huán)唑；對(duì)環(huán)境和作物安全；劑型合理，固體制劑具有活菌數(shù)多、攜帶方 便、實(shí)用性強(qiáng)、保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)；價(jià)格適中，節(jié)約成本，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益；從多方位點(diǎn)進(jìn) 行殺菌抑菌，病原難以產(chǎn)生抗藥性；抗逆性強(qiáng)，對(duì)高溫、酸堿和紫外線耐性較強(qiáng)，有廣闊的應(yīng) 用前景；誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗病性。此外，它還可以在作物表面產(chǎn)生一些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素類物質(zhì) 如分裂素、吲哚乙酸等，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。作為一種較為理想的生防菌，枯草芽孢桿 菌目前已在水稻、玉米、小麥、大豆、辣椒、棉花、番茄等農(nóng)作物上顯示出較好的防治效果。目 前，國(guó)內(nèi)外已有一些枯草芽孢桿菌研制成為生物農(nóng)藥投放到市場(chǎng)上，如我國(guó)大面積推廣應(yīng) 用的增產(chǎn)菌系列產(chǎn)品就是由多種芽孢桿菌組成的混合菌劑，在全國(guó)推廣應(yīng)用多年，累計(jì)應(yīng) 用面積超過(guò)10億畝耕地，取得良好的抗菌防病效果。
[0004] 目前，市場(chǎng)上的枯草芽孢桿菌制劑多采用液相深層發(fā)酵技術(shù)。液相深層發(fā)酵，投資 大，成本高，技術(shù)要求高，產(chǎn)生廢液多，污染嚴(yán)重。而固相發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程跟微生物在自 然環(huán)境中所發(fā)生的微生物反應(yīng)相似，固相發(fā)酵工藝相比液相發(fā)酵具有以下特點(diǎn)：⑴生產(chǎn)成 本低，固相發(fā)酵工藝可以利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的副產(chǎn)品進(jìn)行發(fā)酵，避免了液相發(fā)酵原材料價(jià) 格較高的不足。以農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中的副產(chǎn)物做固相發(fā)酵基質(zhì)，不僅提高了農(nóng)產(chǎn)品加工副 產(chǎn)物的利用價(jià)值，還具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益；⑵發(fā)酵終產(chǎn)物中菌體含量高。固相發(fā)酵終產(chǎn)物中 菌體含量能達(dá)到l〇 nCFU/g水平，而液相發(fā)酵終產(chǎn)物中菌體含量基本在101° CFU /ml水平； ⑶沒(méi)有廢物排放；⑷發(fā)酵過(guò)程能耗低。固相發(fā)酵避免了液態(tài)發(fā)酵的不足，適宜工業(yè)化生產(chǎn)， 日益受到人們的重視。
[0005] 本發(fā)明中，我們利用農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中的副產(chǎn)物麥麩、豆渣、菇渣作為生防芽孢桿 菌固體發(fā)酵基質(zhì)，優(yōu)化生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵工藝，提高發(fā)酵水平，從而降低生產(chǎn)成本， 促進(jìn)生防菌劑的推廣使用，以達(dá)到減少化學(xué)農(nóng)藥使用的目的。這一固相發(fā)酵技術(shù)對(duì)于除了 生防芽孢桿菌以外的其他生防細(xì)菌的固態(tài)發(fā)酵具有非常大的借鑒意義，從而能更好的促進(jìn) 生防菌劑的推廣使用，而且對(duì)提高食品安全和環(huán)境健康等方面具有重要意義，具有良好的 經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是為了解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的，目的在于提供一種生防芽孢桿菌利用農(nóng)產(chǎn) 品加工過(guò)程中的副產(chǎn)物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù) 方案。
[0007] -株生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟：制備生防芽孢桿 菌的種子液；以體積質(zhì)量比5~15ml/100g將所述種子液接入到固相發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度 25~37°C，相對(duì)濕度50~90%，PH 6. 2~8. 5條件下培養(yǎng)48~72小時(shí)，得到生防芽孢桿 菌的固相發(fā)酵產(chǎn)物，其中所述固相發(fā)酵培養(yǎng)基由農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中的副產(chǎn)物、碳源、氮源、 鹽和水按質(zhì)量比1 :(〇· 1~0.7):(0. 17~1. 1):(0.01~0.05) :(1.2~6. 4)混合組成， 高壓濕熱滅菌〇. 5~1小時(shí)，冷卻后得到。
[0008] 本發(fā)明公開(kāi)的以辣椒疫病為靶標(biāo)的生防菌株高效篩選方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具 有的積極效果在于： 本發(fā)明提供的一株生防芽孢桿菌的固相發(fā)酵方法有效的提高了生防芽孢桿菌的固相 發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，對(duì)生產(chǎn)工藝和設(shè)備要求低，有益于實(shí)現(xiàn)生防芽孢桿菌的工業(yè)化生 產(chǎn)，促進(jìn)生防菌劑的使用，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用；有效解決了液相深層發(fā)酵投資大，成本高， 技術(shù)要求高，產(chǎn)生廢液多，污染嚴(yán)重的問(wèn)題，有益于環(huán)境保護(hù)；由于使用農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中 的副產(chǎn)物作為固相發(fā)酵載體，可以循環(huán)利用，減少了固相發(fā)酵廢渣的排放量，有利于環(huán)保。
[0009]
【具體實(shí)施方式】： 在本發(fā)明的各實(shí)施例中使用的菌株是生防芽孢桿菌菌株TB1335,保存于天津市植物保 護(hù)研究所農(nóng)業(yè)微生物發(fā)酵研究室，對(duì)外可免費(fèi)提供。
[0010] 〈實(shí)施例1> (1)將生防芽孢桿菌TB1335接種在LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)24h，之后 接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中。液態(tài)種子培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，PH7. 2， 培養(yǎng)時(shí)間16h，得到種子液。
[0011] (2)將麥麩、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按質(zhì)量比1 : 0. 22:0. 08:0. 09: 0. 01:1. 2加入250ml錐形瓶中，調(diào)PH6. 8,高壓濕熱滅菌0. 5h，冷卻至室 溫，接入6%質(zhì)量份的種子液，混合均勻，28°C，相對(duì)濕度60%條件下培養(yǎng)48h。
[0012] (3)發(fā)酵產(chǎn)物處理：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物用于分析發(fā)酵水平，分析后將固態(tài)基質(zhì) 烘干可以回用于固體發(fā)酵。
[0013] 〈實(shí)施例2> (1)將生防芽孢桿菌TB1335接種在LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)24h，之后 接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中。液態(tài)種子培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，PH7. 2， 培養(yǎng)時(shí)間16h，得到種子液。
[0014] (2)將麥麩、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按質(zhì)量比1 :0. 5:0. 16:0. 13: 0. 03:1. 7加入250ml錐形瓶中，調(diào)PH6. 8,高壓濕熱滅菌0. 5h，冷卻至室溫，接入6%質(zhì)量份 的種子液，混合均勻，28°C，相對(duì)濕度60%條件下培養(yǎng)48h。
[0015] (3)發(fā)酵產(chǎn)物處理：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物用于分析發(fā)酵水平，分析后將固態(tài)基 質(zhì)烘干可以回用于固體發(fā)酵。
[0016] 〈實(shí)施例3> (1)將生防芽孢桿菌TB1335接種在LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)24h，之后 接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中。液態(tài)種子培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，PH7. 2， 培養(yǎng)時(shí)間16h，得到種子液。
[0017] (2)將麥麩、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按質(zhì)量比1 :0.7:0. 6:0. 5: 0. 05:5加入250ml錐形瓶中，調(diào)PH6. 8,高壓濕熱滅菌0. 5h，冷卻至室溫，接入6%質(zhì)量份的 種子液，混合均勻，28 °C，相對(duì)濕度60%條件下培養(yǎng)48h。
[0018] (3)發(fā)酵產(chǎn)物處理：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)物用于分析發(fā)酵水平，分析后將固態(tài)基質(zhì) 烘干可以回用于固體發(fā)酵。
[0019] 〈實(shí)施例4> (1)將生防芽孢桿菌TB1335接種在LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)24h，之后 接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中。液態(tài)種子培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，PH7. 2， 培養(yǎng)時(shí)間16h，得到種子液。
[0020] (2)將麥麩、可溶性淀粉、牛肉膏、玉米粉、ΚΗ2Ρ04和水按質(zhì)量比1 :0. 5:0. 16:0. 13: 0. 03:1. 7加入250ml錐形瓶中，調(diào)PH7. 5,高壓濕熱滅菌