一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法
【專利摘要】一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。其包括雞新城疫抗原液制備；雞傳染性法氏囊病抗原液制備；雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備。本發(fā)明的疫苗具有油包水、水包油雙重特性，兼具了疫苗的緩釋作用以及水溶性免疫增強劑、中藥多糖、鎮(zhèn)痛劑等共同作用的優(yōu)點；本發(fā)明大幅度提高了機體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力；本發(fā)明解決使用多種疫苗分次免疫造成雞群不良反應(yīng)，簡化免疫程序，降低投入成本；本發(fā)明所制備的疫苗適用于全年齡段雞，免疫1日齡雛雞可避免活苗免疫受母源抗干擾導致的免疫失敗或因毒力過強引起的免疫抑制，使用安全有效。
【專利說明】一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(Newcastledisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種烈性病毒性傳染病，是當今全球范圍內(nèi)最嚴重的家禽傳染病之一，也是我國所有雞病中危害最大的一種，被國際獸醫(yī)局(OIE)列為A類傳染病。目前，新城疫在我國全國范圍內(nèi)發(fā)病仍然比較普遍，它制約著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展及禽產(chǎn)品的出口，也對食品安全及人類健康存在潛在的危害。對于該病的控制，在發(fā)達國家以捕殺強毒感染群為主，同時結(jié)合疫苗接種；而對于廣大發(fā)展中國家，疫苗接種仍是控制該病的主要手段。隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的迅猛發(fā)展，對新城疫的防治越來越重要。
[0003]雞傳染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infection bursal disease virus, IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病，主要感染3~12周齡的青年雞，該病毒主要在法氏囊的淋巴細胞內(nèi)增殖，并且對其它免疫器官造成不同程度的損傷，最終導致雞的法氏囊萎縮而引起雞的免疫抑制。本病在臨床上可以導致體重減輕、生長緩慢和骨骼肌出血等癥狀，小于3周齡的雞則不會表現(xiàn)出明顯的臨床特征。但是，在亞臨床感染的雞法氏囊上也會有一些鏡檢病理變化和免疫抑制現(xiàn)象，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。本病可以導致雞本身對其他疾病的抵抗力減弱，并且干擾如新城疫、馬立克氏病和傳染性支氣管炎等病的疫苗的免疫效果。目前，IBDV疫苗的種類主要包括活疫苗、滅活疫苗、抗原抗體復合物疫苗、基因工程疫苗等。根據(jù)國內(nèi)外活疫苗的臨床使用情況來看，活疫苗雖然可以起到一部分保護作用，但是存在自身法氏囊萎縮的情況，從而導致自身免疫系統(tǒng)的紊亂 ，另外基因工程疫苗、抗原抗體復合物疫苗同樣存在保護率偏低的情況。滅活疫苗免疫雞只后可以產(chǎn)生較高的抗體，能夠有效的保護機體，但是目前國內(nèi)的法氏囊滅活疫因其免疫效果差或生產(chǎn)成本高，沒有得到廣泛推廣，各大種雞場使用的大多還是價格昂貴的進口疫苗。新城疫、雞傳染性法氏囊病是造成雛雞高死亡率的兩種重大傳染病，嚴重制約著養(yǎng)雞業(yè)的健康成長。做好這兩種疾病的防疫工作，特別是I日齡雛雞的防疫工作，是保證養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的前提。因此，開發(fā)一種即能用于成雞又能用于雛雞免疫預防這兩種疾病的安全、有效的疫苗已刻不容緩。針對養(yǎng)雞業(yè)上述問題，本項目的提出可以解決養(yǎng)雞業(yè)中成雞與雛雞新城疫、傳染性法氏囊病的免疫預防難題，降低行業(yè)內(nèi)疾病的流行，增加出欄率，為我國的養(yǎng)雞業(yè)保駕護航。
[0004]水包油包水乳化佐劑具有鋁膠佐劑、水包油佐劑和油包水佐劑的特點，與油包水乳化佐劑相比，其制備疫苗所需要的抗原濃度大大降低，另外因其具有水包油佐劑的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增強劑、中藥多糖和鎮(zhèn)痛劑(維生素)，在疫苗免疫機體時可以緩解疼痛，減少動物應(yīng)激，同時免疫增強劑、中藥多糖還具有提高免疫效果，預防疾病等功能。[0005]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細胞的各種活動。多糖類物質(zhì)是所有生命有機體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。
[0006]維生素是機體代謝中必不可少的有機化合物。機體猶如一座極為復雜的化工廠，不斷地進行著各種生化反應(yīng)。其反應(yīng)與酶的催化作用有密切關(guān)系。酶要產(chǎn)生活性，必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調(diào)節(jié)機體正常代謝的重要物質(zhì)。
[0007]黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質(zhì)，也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機物，是植物在長期自然選擇中產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降血壓等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑，這些抗氧化活性物質(zhì)可以減少和清除機體內(nèi)自由基，具有預防疾病的作用。
[0008]法氏囊素(bursin,BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa offabricius)中分離出來的一種活性三肽物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)為L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促進禽類和哺乳動物B淋巴細胞前體的分化、增殖，能提高B細胞系Daudi細胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP水平，加快B細胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進B細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成，從而使B細胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強。
[0009]本發(fā)明基于上述技術(shù)背景，提出一種雞傳染性法氏囊、雞傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，該疫苗主要由雞傳染性法氏囊、雞新城疫滅活抗原，加適量含免疫增強劑制成，劑型為水包油包水型。通過該方法制備的復合滅活疫苗，因其擁有水包油，油包水兩種特性，使得水溶性的維生素、中藥多糖、法氏囊素、中藥黃酮等免疫增強劑與鎮(zhèn)痛劑易于溶解，利于動物機體吸收，免疫時可降低動物應(yīng)激，減少動物痛苦，可提高動物福利；同時免疫增強劑可大大提高活疫苗的體液免疫，產(chǎn)生較高的中和抗體，大幅提高保護率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法的技術(shù)方案。
[0011]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)雞新城疫抗原液制備；
2)雞傳染性法氏囊病抗原液制備；
3)雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備:
將步驟I)得到的雞新城疫抗原液與步驟2)得到的雞傳染性法氏囊病抗原液進行無菌檢驗、病毒含量測定，檢驗合格后進行甲醛滅活，滅活檢驗合格后，將兩種滅活抗原液按體積比1:1混合均勻，得到抗原混合液，在每1000ml抗原混合液中加入I~2份免疫增強劑混合均勻，然后與桑 米特家畜水包油包水佐劑按體積比6:4進行乳化分裝制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗。[0012]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中雞新城疫抗原液制備包括以下步驟:
(1)種細胞的傳代與培養(yǎng):雞胚傳代細胞系DF-1細胞系經(jīng)胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；
(2)細胞適應(yīng)毒種的繁殖:取細胞適應(yīng)的新城疫病毒LaSota株毒種，接種于步驟(1)中已長成單層的雞胚傳代細胞中，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲細胞液；
(3)制苗用細胞的大規(guī)模培養(yǎng):將步驟(1)培養(yǎng)得到的種細胞懸浮液接種至轉(zhuǎn)瓶或細胞工廠中，加入細胞生長液置37~38°C進行培養(yǎng)；
(4)制苗用毒液的制備:取步驟(3)中已形成良好單層的雞胚傳代細胞系培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種步驟(2)得到的新城疫細胞適應(yīng)毒病毒懸液，吸附后加入維持液，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達75%以上時收獲毒液，-15°C以下保存，得到雞新城疫抗原液。
[0013]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中雞傳染性法氏囊病抗原液制備包括以下步驟:
(1)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):取雞胚成纖維傳代細胞系DF-1細胞系經(jīng)胰酶細胞分散液消化傳代，在培養(yǎng)瓶中以細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；
(2)細胞毒種的繁殖:取生產(chǎn)用傳染性法氏囊病毒HQ株，按維持液體積量的1%接種于已長成良好單層的雞胚成纖維傳代細胞中，置37~38°C在維持液中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲細胞液；
(3)制苗用毒液的繁殖:取步驟1)中已形成良好單層的細胞系培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種步驟2)得到的含1%法氏囊細胞適應(yīng)毒HQ株的維持液，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達75%以上時收獲毒液，-15°C以下保存，得到雞傳染性法氏囊病抗原液。
[0014]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中每份免疫增強劑含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~1Og和法氏囊素2~16mg，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:牛膝、茯苓、穿心蓮、黃芪、板藍根、生地、當歸、甘草和大黃。
[0015]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的細胞生長液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH為7.2~7.4，DO為30%~60%,含糖4.0g/L ;所述的維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH為7.4~7.6，DO為30%~50%,含糖4.0g/L0
[0016]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生素中含有維生素B2 15~35%、維生素C 20~40%、維生素D3 10~30%和維生素E10 ~30%ο
[0017]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥組合物由以下重量份的原料組成:牛膝10~30份、茯苓10~20份、穿心蓮20~30份、黃芪20~40份、板藍根10~30份、生地10~30份、當歸10~30份、甘草10~20份和大黃10~30份。
[0018]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:
a、按牛膝10~30份，茯苓10~20份，穿心蓮20~30份，黃芪20~40份，板藍根10~30份，生地10~30份，當歸10~30份，甘草10~20份，大黃10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即得粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0019]所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得:
將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈，按1:1比例加入pH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻漿，勻漿液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀,上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾,膜下液經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液，粗提液經(jīng)冷凍真空干燥得到法氏囊素。
[0020]本發(fā)明中新城疫病毒La Sota株毒種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，傳染性法氏囊病毒HQ株為現(xiàn)有病毒，已于2011年6月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，病毒的保藏編號為CGMCC N0.4935，現(xiàn)可在河南農(nóng)業(yè)大學禽病研究所購得，桑米特家畜水包油包水佐劑由珠海國年生物科技有限公司生產(chǎn)銷售。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1.本發(fā)明采用了新的疫苗佐劑，所制備的疫苗具有油包水、水包油雙重特性，兼具了疫苗的緩釋作用以及水溶性免疫增強劑、中藥多糖、鎮(zhèn)痛劑等共同作用的優(yōu)點。
[0022]2.本發(fā)明采用了有效的免疫增強劑，大幅度提高了機體的免疫力，提高體液免疫能力，刺激機體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力。
[0023]3.本發(fā)明采用了聯(lián)苗技術(shù)，一針可防治兩種傳染病，解決使用多種疫苗分次免疫造成雞群的不良反應(yīng)，簡化免疫程序，降低投入成本。
[0024]4.本發(fā)明所制備的疫苗適用于全年齡段雞，免疫I日齡雛雞可避免活苗免疫受母源抗干擾導致的免疫失敗或因毒力過強引起的免疫抑制，使用安全有效。
【具體實施方式】
[0025]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。[0026]實施例1:用DF-1細胞系培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病毒制備雞傳染性法氏囊病抗原液
(1)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):取雞胚成纖維傳代細胞系DF-1細胞系經(jīng)胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒；
(2)細胞毒種的繁殖:取生產(chǎn)用傳染性法氏囊病毒HQ株毒種，按維持液體積量的1%接種于已長成良好單層的雞胚成纖維傳代細胞中，置37~38°C在維持液中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲細胞液；
(3)制苗用毒液的繁殖:取步驟(1)中已形成良好單層的上述細胞系培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種步驟(2)得到的含1%法氏囊細胞適應(yīng)毒HQ株的維持液，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達75%以上時收獲毒液，-15°C以下保存。
[0027]所述的細胞生長液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH為7.2~7.4，DO為30%~60%，含糖4.0g/L ;所述的維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH為7.4~7.6，DO為30%~50%，含糖 4.0g/L。
[0028]實施例2用雞胚傳代細胞系和生物反應(yīng)器培養(yǎng)制備雞新城疫抗原液 (O生物反應(yīng)器的選擇:激流式反應(yīng)器AP-20，體積為7L。
[0029](2)細胞的選擇:雞胚傳代細胞系DF-1，適合雞新城疫病毒生長的傳代細胞系，無致癌性，購于美國菌種保藏中心；
(3)病毒毒株的選擇:選用雞新城疫病毒La sota株，可在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購得。
[0030](4)種細胞的培養(yǎng):利用方瓶進行DF-1細胞的培養(yǎng)，一般按1:3~1:5傳代，待細胞長滿單層后消化、計數(shù)，用于細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
[0031](5)細胞適應(yīng)毒種的繁殖:取細胞適應(yīng)的新城疫病毒毒種，接種于步驟(4)中已長成單層的雞胚傳代細胞DF-1中，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲病毒懸液。
[0032](6)繁殖病毒用細胞的懸浮培養(yǎng):首先準備生物反應(yīng)器:檢漏激流袋和灌注袋；采用滅菌PBS浸泡微載體過夜；校正溫度電極、pH電極和溶氧電極并進行高壓滅菌；組裝生物反應(yīng)器，注入細胞生長液，循環(huán)24小時進行系統(tǒng)的無菌檢驗。驗證合格后，步驟(4)培養(yǎng)得到的細胞懸浮液經(jīng)酶消化后接種反應(yīng)器進行懸浮培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)條件為:溫度37~38°C，pH7.0~7.6，溶解氧30%~60%，接種量為4~8X 109個細胞。每天監(jiān)測培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗?？刂婆囵B(yǎng)液中含糖量，當殘?zhí)堑陀趌g/L時，全部換液一次。
[0033](7)所述步驟(6)細胞生長液含90% DMEM/F12、10%胎牛血清，細胞生長液的pH為
7.2 ~7.4，DO 為 30% ~60%,含糖 4.0g/L。
[0034](8)病毒的培養(yǎng)與收獲:當細胞的葡萄糖消耗量最大時，視為細胞長至最大密度，按0.5%新城疫細胞適應(yīng)病毒懸液接種，換用維持液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度37~38°C，pH7.4~7.6，溶解氧30%~50%。種毒在灌注袋中的細胞上吸附Ih后開始循環(huán)。培養(yǎng)12h開始取樣，每2h取一次樣，測定葡萄糖消耗和病毒滴度，并及時補充培養(yǎng)基和葡萄糖。當糖耗為O時，視細胞絕大多數(shù)已病變，收獲病毒，凍融灌注袋內(nèi)細胞2次(裂解細胞)，測定病毒毒價，得到雞新城疫抗原液。
[0035](9)所述步驟(8)中的細胞維持液含98% DMEM/F12、2%胎牛血清，維持液的pH為7.4 ~7.6，DO 為 30% ~50%,含糖 4.0g/L。
[0036]實施例3中藥多糖和中藥黃酮的制備
a、按牛膝20份，茯苓15份，穿心蓮25份，黃芪30份，板藍根20份，生地20份，當歸20份，甘草15份，大黃20份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即得粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0037]該實施例步驟I)中也可以按牛膝10份，茯苓10份，穿心蓮20份，黃芪20份，板藍根10份，生地10份，當歸10份，甘草10份，大黃10份稱取各中藥原料，或按牛膝30份，茯苓20份，穿心蓮30份，黃芪40份，板藍根30份，生地30份，當歸30份，甘草30份，大黃30份稱取各中藥原料。`
[0038]實施例4:法氏囊素的制備
a、取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，pH7.2滅菌冷PBS洗凈。
[0039]b、稱量法氏囊重量，按1:1 (W:V)比例加入pH 7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行聞速勻楽.。
[0040]C、勻衆(zhòng)液中加入2.5%的胰蛋白酶,反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀。
[0041]d、上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾，膜下液即為法氏囊素粗提液。
[0042]e、將d中粗提液通過0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到法氏囊素。
[0043]實施例5:免疫增強劑制備
稱取中藥多糖60g、中藥黃酮50g、維生素組合IOg(其中維生B2 2.4g、維生素C 3.2g、維生素D3 1.Sg和維生素E 2.6g)、法氏囊素14mg;將上述各組分混合均勻作為一份計量使用。其中中藥多糖和中藥黃酮按照實施例3的步驟制得，法氏囊素按照實施例4的步驟制得。
[0044]該實施例中也可以按照中藥多糖30g、中藥黃酮60g、維生素組合Sg (其中維生B21.2g、維生素C 3.2g、維生素D3 2.4g和維生素E 1.2g)、法氏囊素2mg稱取各原料，或按照中藥多糖100g、中藥黃酮20g、維生素組合7g(其中維生B2 3.lg、維生素C 1.2g、維生素D31.8g和維生素E 0.9g)、法氏囊素16mg稱取各原料。
[0045]實施例6:—種雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備
a、無菌條件下，將實施例2制得的雞新城疫滅活后抗原液與實施例1制得的雞傳染性法氏囊滅活后看原液按1:1混合均勻，取混合后抗原按每1000ml加入實施例5中制備的免疫增強劑I或2份，混合均勻，使免疫增強劑完全溶解。
[0046]b、將6份量的含免疫增強劑的混合后的雞新城疫、雞傳染性法氏囊滅活抗原液加入乳化器中，調(diào)節(jié)乳化器轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為1500rpm，將4份量的桑米特水油水佐劑緩緩加入攪拌中的抗原液。
[0047]C、當油相加完時，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為3000rpm，繼續(xù)攪拌3_5分鐘。
[0048]d、乳化完全后，將乳化后疫苗無菌分裝制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗。
[0049]f、成品檢驗
按照《中華人民共和國獸藥典》(2010版)相關(guān)要求對成品進行相關(guān)檢驗，檢驗結(jié)果見表1:
表1成品檢驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟: 1)雞新城疫抗原液制備； 2)雞傳染性法氏囊病抗原液制備； 3)雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備: 將步驟I)得到的雞新城疫抗原液與步驟2)得到的雞傳染性法氏囊病抗原液進行無菌檢驗、病毒含量測定，檢驗合格后進行甲醛滅活，滅活檢驗合格后，將兩種滅活抗原液按體積比1:1混合均勻，得到抗原混合液，在每1000ml抗原混合液中加入I~2份免疫增強劑混合均勻，然后與桑米特家畜水包油包水佐劑按體積比6:4進行乳化分裝制成雞新城疫、傳染性法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中雞新城疫抗原液制備包括以下步驟: (1)種細胞的傳代與培養(yǎng):雞胚傳代細胞系DF-1細胞系經(jīng)胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒； (2)細胞適應(yīng)毒種的繁殖:取細胞適應(yīng)的新城疫病毒LaSota株毒種，接種于步驟(1)中已長成單層的雞胚傳 代細胞中，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲細胞液； (3)制苗用細胞的大規(guī)模培養(yǎng):將步驟(1)培養(yǎng)得到的種細胞懸浮液接種至轉(zhuǎn)瓶或細胞工廠中，加入細胞生長液置37~38°C進行培養(yǎng)； (4)制苗用毒液的制備:取步驟(3)中已形成良好單層的雞胚傳代細胞系培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種步驟(2)得到的新城疫細胞適應(yīng)毒病毒懸液，吸附后加入維持液，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達75%以上時收獲毒液，_15°C以下保存，得到雞新城疫抗原液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中雞傳染性法氏囊病抗原液制備包括以下步驟: (1)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):取雞胚成纖維傳代細胞系DF-1細胞系經(jīng)胰酶細胞分散液消化傳代，在培養(yǎng)瓶中以細胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒； (2)細胞毒種的繁殖:取生產(chǎn)用傳染性法氏囊病毒HQ株，按維持液體積量的1%接種于已長成良好單層的雞胚成纖維傳代細胞中，置37~38°C在維持液中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞病變率達75%以上時收獲細胞液； (3)制苗用毒液的繁殖:取步驟I)中已形成良好單層的細胞系培養(yǎng)瓶，棄去細胞生長液，接種步驟2)得到的含1%法氏囊細胞適應(yīng)毒HQ株的維持液，置37~38°C繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達75%以上時收獲毒液，_15°C以下保存，得到雞傳染性法氏囊病抗原液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中每份免疫增強劑含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、維生素6~IOg和法氏囊素2~16mg，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:牛膝、茯苓、穿心蓮、黃芪、板藍根、生地、當歸、甘草和大黃。
5.如權(quán)利要求2或3所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的細胞生長液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH為7.2~7.4，DO為30%~60%,含糖4.0g/L ;所述的維持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH為7.4~7.6，DO為30%~50%，含糖 4.0g/L。
6.如權(quán)利要求4所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生素中含有維生素B2 15~35%、維生素C 20~40%、維生素D3 10~30%和維生素E 10~30%。
7.如權(quán)利要求4所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥組合物由以下重量份的原料組成:牛膝10~30份、茯苓10~20份、穿心蓮20~30份、黃芪20~40份、板藍根10~30份、生地10~30份、當歸10~30份、甘草10~20份和大黃10~30份。
8.如權(quán)利要求4所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得: a、按牛膝10~30份，茯苓10~20份，穿心蓮20~30份，黃芪20~40份，板藍根10~30份，生地10~30份，當歸10~30份，甘草10~20份，大黃10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即得粗制中藥黃酮； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
9.如權(quán)利要求4所述的一種雞新城疫、法氏囊病二聯(lián)復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的法氏囊素通過以下步驟制得: 將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈，按1:1比例加入pH7.2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻漿，勻漿液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反復凍融3次，12000rpm離心20min,棄沉淀,上清用1000da截留分子量的超濾膜進行超濾,膜下液經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液，粗提液經(jīng)冷凍真空干燥得到法氏囊素。
【文檔編號】A61P31/14GK103585626SQ201310579887
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】張秀文, 李陽, 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 盛璐絲 申請人:浙江美保龍生物技術(shù)有限公司