專利名稱：用于標(biāo)記材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用微粒標(biāo)記材料的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
材料的標(biāo)記是一種用于鑒定物品的來源的重要特征。傳統(tǒng)上，通過材料的包裝來 實(shí)現(xiàn)上述標(biāo)記，在材料的包裝上可以提供關(guān)于生產(chǎn)商、內(nèi)容物以及所包裝材料的其它特征 的包裝信息。然而，在物品被拆開以后，所述信息會喪失。如果物品的使用者以后需要鑒 定材料的來源，則這是尤其麻煩的。當(dāng)物品出現(xiàn)故障時(shí)，可能會出現(xiàn)這樣的需要。標(biāo)記的 另一種用途是證明偽劣品或偽造品。對其標(biāo)記會是有利的物品的實(shí)例是服裝，鞋，香煙，手 表，銀行票據(jù)，涂料，炸藥，醫(yī)藥產(chǎn)品，食品，化妝品，動物以及農(nóng)產(chǎn)品如(盆栽)植物、插條 (cutting)、組織培養(yǎng)材料以及種子。在現(xiàn)有技術(shù)中，已描述了若干種利用微粒來標(biāo)記材料的系統(tǒng)。大多數(shù)這些系統(tǒng)使 用著色的或以其它方式標(biāo)記的微粒，其可以通過將微粒沉積在材料上的方式(因此提供功 能像條碼的系統(tǒng))或通過微粒本身的內(nèi)在特性來提供代碼。上述系統(tǒng)的實(shí)例(尤其)被描 述在US 3，772，099 (來自鑭系元素和硅酸鉀的發(fā)光微粒)、US 4，390，452 (形成著色層的 微粒)、WO 2003/052025 (摻雜有銪或鈰的YVO4或LaPO4的微粒)、WO 2002/46528 (用于形 成圖案的熒光微粒)、US 6，620，360 (多層微粒)以及US 6，455，157 (用微?！皹?biāo)條形碼”) 中。在WO 2005/118650中描述了一種系統(tǒng)，其中聚合物微粒摻雜有染料、稀土元素或具有 用于標(biāo)記材料的放射性。W0-A-90/14441描述了一種用于標(biāo)記材料的方法，其中通過用核酸標(biāo)記物來處理 材料使得足夠量的核酸附著于所述材料用于隨后的檢測。為了檢測，標(biāo)記物可以從所標(biāo)記 的材料中回收。在農(nóng)業(yè)方面在種子的情況下，材料的標(biāo)記是尤其重要的。在種子已被播種以后，種 子供應(yīng)商幾乎不可能鑒定種子是否源自供應(yīng)商的公司。在這種情況下，如上所述的現(xiàn)有技 術(shù)的微粒是沒用的或幾乎沒用的，因?yàn)樗鼈儗τ诜N子或正發(fā)育的幼苗有毒性，和/或它們 被溶解在其中播種種子的土壤中，和/或它們易于仿制，和/或已經(jīng)用于其它目的、其它種 子批、其它公司等，因而并不具有辨別力。因此，仍然需要可替換的標(biāo)記微粒，尤其用于種子的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明包括一種用于標(biāo)記對象的方法，該方法包括對所述對象施加包含交聯(lián) 聚合物和標(biāo)記成分的微粒，其中所述標(biāo)記成分從所述微粒的釋放通過微粒與外部刺激的接 觸被觸發(fā)，以及其中所述聚合物是碳水化合物或蛋白質(zhì)、或它們的組合。優(yōu)選地，在所述方 法中，外部刺激是酶，其能夠降解聚合物，或可替換地，標(biāo)記成分從所述微粒的釋放由靜電 相互作用的變化所引起，由例如PH的變化或鹽濃度的變化所引起。進(jìn)一步優(yōu)選的是一種微粒，其中所述微粒的聚合物選自由淀粉或淀粉的衍生物、纖維素或纖維素的衍生物、果膠或果膠的衍生物、以及明膠或明膠的衍生物組成的組。進(jìn)一步優(yōu)選的是一種微粒，其中交聯(lián)劑選自由二乙烯基砜、表氯醇、雙環(huán)氧化合物 如丙三醇二縮水甘油醚(甘油二縮水甘油醚，glycerol diglycidyl ether)或丁二醇二縮 水甘油醚(butanedioldiglycidyl ether)、三偏磷酸鈉以及己二酸、或它們的衍生物組成 的組。同樣優(yōu)選的是一種微粒，其中聚合物通過選自由過氧化物酶、漆酶、多酚氧化酶、 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、巰基氧化酶、賴氨酰氧化酶以及脂肪氧合酶組成的組 中的交聯(lián)酶來交聯(lián)。在所述微粒中，標(biāo)記成分優(yōu)選為染料或酶，更優(yōu)選為漆酶。優(yōu)選將所述標(biāo)記系統(tǒng)施 加于對象，其選自服裝、鞋、香煙、手表、銀行票據(jù)、涂料、炸藥、醫(yī)藥產(chǎn)品、食品、化妝品、動物 以及農(nóng)產(chǎn)品如(盆栽)植物、插條、組織培養(yǎng)材料以及種子，更優(yōu)選種子。本發(fā)明的一部分還是一種用于鑒定對象的方法，該方法包括以下步驟按照本發(fā)明的方法來標(biāo)記對象； 通過施加適當(dāng)?shù)耐獠看碳ひ詮乃鑫⒘ａ尫艠?biāo)記成分來鑒定所述對象；以及對標(biāo)記成分進(jìn)行測定。此外，本發(fā)明包括包含帶電荷的交聯(lián)聚合物和標(biāo)記成分的微粒在用于標(biāo)記對象中 的應(yīng)用，其中所述標(biāo)記成分從所述微粒的釋放通過微粒與外部刺激的接觸被觸發(fā)，以及其 中所述聚合物是碳水化合物或蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明涉及一種用于標(biāo)記對象或用于鑒定對象的試劑盒，包含-如本文定義的微粒；以及-用于降解聚合物的酶。另外，本發(fā)明涉及一種用于標(biāo)記對象或用于鑒定對象的試劑盒，包含-如本文定義的微粒；以及-用于釋放標(biāo)記成分的鹽。


圖I.A.綠豆和草種子，涂布有包含酚酞的WDV86-88顆粒以及未涂布的。B.干燥 BioSwitch顆粒的實(shí)例，即細(xì)磨的。圖2.綠豆和草種子，涂布有包含酚酞的WDV86-88顆粒以及未涂布的，在測試溶 液50mM碳酸鈉緩沖液(pHIO)中。圖3.在不同pH值下二甲酚橙的UV/Vis(紫外光/可見光)譜。圖4.在二甲酚橙與陽離子WDV86-88基質(zhì)之間相互作用的鹽依賴性。圖5.與未涂布的綠豆相比，包含二甲酚橙的WDV124凝膠顆粒涂布的綠豆。測試 溶液 A :5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)；溶液 B 在 5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)中的 50χ 稀釋的熱穩(wěn)定性 淀粉酶(Thermamyl Amylase)。圖6.兩步光標(biāo)記原理(構(gòu)思，concept)。圖7.上圖片與未涂布的綠豆相比，包含漆酶的WDV 124凝膠顆粒(凍干)涂布的 綠豆。測試溶液 A :5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)；溶液 B 在 5mM TRIS/HC1 (ρΗ8· 0)中的 50χ 稀釋 的熱穩(wěn)定性淀粉酶(Thermamyl Amylase) 0在環(huán)境溫度下，在10分鐘溫育以后，添加ABTS ；其后2分鐘獲取圖片。下圖片在右邊的兩個(gè)管包含游離的BioSwitch顆粒(即，未涂布在 種子上)。用來分解基于淀粉的BioSwitch基質(zhì)的淀粉酶僅允許在管B中反應(yīng)10分鐘。在 兩種情況下，其后均添加ABTS。圖8.與未涂布的綠豆相比，包含漆酶的WDV124凝膠顆粒(凍干)涂布的綠豆。測 試溶液 A:5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)；溶液 B:在 5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x 稀釋的熱穩(wěn)定 性淀粉酶(Thermamyl Amylase)。在環(huán)境溫度下，在10分鐘溫育以后添加ABTS ；分別在其 后8和210分鐘獲取圖像用于上圖片和下圖片。圖9.與未涂布的綠豆相比，包含漆酶的WDV124凝膠顆粒(風(fēng)干)涂布的綠豆。測 試溶液 A:5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)；溶液 B:在 5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x 稀釋的熱穩(wěn)定 性淀粉酶(Thermamyl Amylase)。在環(huán)境溫度下在10分鐘溫育以后添加ABTS ；分別在其后 30秒、2和15分鐘獲取圖像用于上圖片和下圖片。圖10.與未涂布的綠豆相比，包含漆酶(第2批次)的WDV124XF凝膠顆粒(凍 干)涂布的綠豆。測試溶液A :5mMTRIS/HCl(pH8. 0)；溶液B 在5mM TRIS/HC1 (pH8. 0)中的 50x稀釋的熱穩(wěn)定性淀粉酶(Thermamyl Amylase) 0在環(huán)境溫度下在10分鐘溫育以后添加 ABTS ；分別在其后1和5分鐘獲取圖像用于上圖片和中間圖片。下圖片示出了用ABTS溫育 的在測試溶液A中的經(jīng)涂布綠豆的特寫(close-up)。圖11.如在甜菜根(甜菜，beetroot)種子(左側(cè)圖片)和獨(dú)行菜種子(水芹種 子，garden cress seed)(右側(cè)圖片)上，即在種子本身上，在2、4以及7天(甜菜)以后， 或在1、2以及3天(獨(dú)行菜(水芹，cress))以后測得的漆酶活性。圖12.如在甜菜根種子(左側(cè)圖片)和獨(dú)行菜種子(右側(cè)圖片)上，即在種子本 身上，在2、4以及7天(甜菜)以后，或在1、2以及3天(獨(dú)行菜)以后測得的二甲酚橙的 存在。圖13.如在甜菜根種子(左側(cè)圖片)和獨(dú)行菜種子(右側(cè)圖片)上，即在種子本身 上，在2、4和7天(甜菜)以后，或在1、2和3天(獨(dú)行菜)以后測得的AZCL-直鏈淀粉。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的微粒包含交聯(lián)碳水化合物和/或蛋白質(zhì)，由低聚和聚合碳水化合物 和/或蛋白質(zhì)制成，其可以用作用于任何外部刺激如酶的底物(substrate)。因此可以使用 的碳水化合物是這樣的碳水化合物，如，例如，葡萄糖，果糖，蔗糖，麥芽糖，阿拉伯糖，甘露 糖，半乳糖，乳糖以及這些糖的低聚物和聚合物，纖維素，糊精如麥芽糊精，瓊脂糖，直鏈淀 粉，支鏈淀粉以及樹膠，例如瓜爾豆膠(guar)?？梢允褂玫牡鞍踪|(zhì)包括白蛋白、卵清蛋白、 酪蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白、球蛋白、氯化高鐵血紅素、血紅蛋白、肌紅蛋白以及小肽。優(yōu)選 地，使用從DP2以后的低聚碳水化合物或從DPlO以后的聚合碳水化合物。更具體地說，使用 > DP50的聚合碳水化合物，以及甚至更具體地說使用> DP75的聚合碳水化合物。這些聚 合碳水化合物可以是自然發(fā)生的聚合物如淀粉(直鏈淀粉、支鏈淀粉)，纖維素以及樹膠或 它們的衍生物，其可以通過磷酸化或氧化而形成。還可以使用其它聚合物(例如己內(nèi)酯)， 其可以被加入為了與例如待標(biāo)記材料更好的相容性。在蛋白質(zhì)的情況下，還可以使用從植 物或動物材料的水解產(chǎn)物獲得的蛋白質(zhì)。還可以使用適宜的碳水化合物的混合物(例如共 聚物)或蛋白質(zhì)的混合物。
可以使用合成聚合物，如，例如，乙烯基樹脂(polyvinyl)、聚乙烯 (polyethylene)、聚丙烯、以及類似化合物。 交聯(lián)聚合物的優(yōu)點(diǎn)在于通過在基質(zhì)中引入交聯(lián)所形成的載體的內(nèi)在穩(wěn)定性。具體 地說，交聯(lián)是醚鍵和/或酯鍵，其中對于酯鍵來說，磷酸酯是優(yōu)選的。另一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)在 于，交聯(lián)提供了交聯(lián)聚合物的三維晶格，其中用作標(biāo)記的成分可以被“填入”。此外，成分的 選擇，即，聚合物和交聯(lián)劑的選擇會影響載體的三維結(jié)構(gòu)，因而將便于制備適用于一定尺寸 和/或一定電荷的分子的特定載體。從其構(gòu)造微粒的聚合物基質(zhì)可以構(gòu)造自容易獲得的和水溶性聚合物如多糖和 (水解)蛋白質(zhì)，并且這樣做時(shí)可以形成柔性基質(zhì)并且通過例如羧酸和/或陽離子基團(tuán)正和 /或負(fù)電荷將產(chǎn)生用于標(biāo)記成分的定制載體。這不可能利用多糖如殼多糖和/或殼聚糖來 完成。此外上述聚合物比迄今為止使用的殼多糖和殼聚糖要便宜得多。具有電荷是用于本 發(fā)明的聚合物的最重要特征。它將大大地促進(jìn)在標(biāo)記成分(其經(jīng)常是帶電荷分子)與聚合 物晶格之間復(fù)合物的形成。優(yōu)選地，聚合物是帶電荷的。這樣的電荷可以通過聚合物本身 來提供，但是如果聚合物并不具有正或負(fù)電荷，則可以作為聚合物的改性的結(jié)果或通過用 于交聯(lián)聚合物的交聯(lián)劑來弓丨入電荷。可以通過聚合物的共價(jià)交聯(lián)來完成基質(zhì)的形成?？梢允褂玫牡湫偷慕宦?lián)劑是化學(xué) 交聯(lián)劑如二乙烯基砜、表氯醇、雙環(huán)氧化合物如丙三醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油 醚、三偏磷酸鈉以及己二酸或它們的衍生物、或戊二醛等。交聯(lián)還可以通過酶作用，例如通 過利用來自由漆酶(其例如誘導(dǎo)果膠的交聯(lián))、過氧化物酶、多酚氧化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋 白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、巰基氧化酶、賴氨酰氧化酶以及脂肪氧合酶組成的組的酶而建立。如何 使用這些交聯(lián)劑或交聯(lián)酶的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的和/或已大量地描述在實(shí)驗(yàn)部分 中?？梢酝ㄟ^氧化、用陽離子官能團(tuán)或羧甲基基團(tuán)的取代和/或用例如乙?；鶊F(tuán)的 酯化來完成聚合物的改性。雖然在后者情況下沒有添加電荷，但它用來使聚合物更疏水以 便于聚合物與具有很少或沒有電荷的標(biāo)記成分復(fù)合。通常，在交聯(lián)和凝膠化以前改性聚合物。只要通過醚形成的交聯(lián)已經(jīng)完成，則可以 在交聯(lián)和凝膠化以后改性聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何改性在本發(fā)明中指定的聚合 物以向它們提供所述基團(tuán)。交聯(lián)聚合物的電荷可以是負(fù)的或正的，這取決于聚合物的類型、改性的類型以及 交聯(lián)的類型。有利地，聚合物具有相當(dāng)大的尺寸，S卩，30kD或更大。這便于在交聯(lián)以后容易形成 凝膠并且它便于形成能夠接收標(biāo)記成分的晶格。本發(fā)明的微粒通過交聯(lián)容易獲得的碳水化合物聚合物和/或蛋白質(zhì)來制備。優(yōu)選 地，如在實(shí)施例中所示，交聯(lián)的聚合物形成凝膠，其確保了微粒的長期穩(wěn)定性并且對于標(biāo)記 物品和材料的微粒易于進(jìn)一步使用。通常，制備微粒的方法如下a)提供聚合物；b)提供交聯(lián)劑或交聯(lián)酶并通過添加堿或酸來激活交聯(lián)劑；c)將交聯(lián)劑加入聚合物；應(yīng)當(dāng)明了，交聯(lián)劑的激活可以在混合聚合物和交聯(lián)劑以前發(fā)生，或者當(dāng)兩者已被混合時(shí)發(fā)生。這取決于所使用的交聯(lián)劑的類型和聚合物的類型；d)使交聯(lián)發(fā)生；e)使交聯(lián)聚合物凝膠化；f)洗滌凝膠以除去所有溶劑和未反應(yīng)的試劑；g)通過破壞凝膠以及可選地進(jìn)一步磨碎來從凝膠形成微粒；h)干燥微粒；以及i)用標(biāo)記成分加載載體。 這種方法便于形成適宜的根據(jù)本發(fā)明的微粒。在這種方法中，作為聚合物基材，還 可以使用蛋白質(zhì)和碳水化合物的混合物。以這種方式，形成了穩(wěn)定的并且可以用于根據(jù)本發(fā)明的各種用途的微粒。以下實(shí) 施例說明，當(dāng)被溶解時(shí)，甚至沒有當(dāng)被加熱或煮沸時(shí)，微粒將不會再次膠凝，并且它們不會 自發(fā)破裂，其將引起任何標(biāo)記成分的凌亂的釋放。微粒的尺寸取決于破壞和研磨方法。優(yōu)選通過迫使凝膠通過所期望的篩目大小的 篩來進(jìn)行破壞。如有必要，可以通過另外研磨篩過的顆粒來形成更細(xì)顆粒。載體的尺寸優(yōu) 選可以在從0. 5 μ m至100 μ m的范圍并且最佳尺寸將取決于它們所用于的具體應(yīng)用。通常 認(rèn)為，小微粒是優(yōu)選的用于其中應(yīng)看不見標(biāo)記的用途(如在銀行票據(jù)上)，其中在未限制能 見度或尺寸的情況下(如在種子包衣中)可以使用較大的微粒。認(rèn)為，標(biāo)記成分的加載是可能的，因?yàn)樾纬闪藦?fù)合物，這是由于交聯(lián)聚合物的帶電 荷基團(tuán)與感興趣的化合物上的帶電荷基團(tuán)之間的靜電相互作用。在使用中性成分和/或聚 合物的情況下，通過疏水基團(tuán)之間的靜水相互作用將很可能引起復(fù)合物形成。標(biāo)記成分可以具有任何尺寸和重量，只要微?？梢蕴峁┡c所述化合物的穩(wěn)定復(fù) 合，但它優(yōu)選具有小于50kD，更優(yōu)選小于30kD以及最優(yōu)選小于IOkD的重量。在酶、或其它 蛋白質(zhì)用作標(biāo)記成分的情況下，尺寸和重量可以容易地大于50kD。在微粒中獲得的標(biāo)記成 分將不會從所述微粒釋放，除非外部刺激改變載體的性能。這具有的優(yōu)點(diǎn)在于標(biāo)記成分不 會泄漏到環(huán)境中或用微粒標(biāo)記的物品上。刺激可以具有任何來源，只要它能夠打開載體或 減小標(biāo)記成分與微粒晶格的復(fù)合作用(絡(luò)合作用)，使得標(biāo)記成分將從微粒釋放?；旧?， 存在兩種可以采用的刺激，即通過微粒與標(biāo)記成分之間的靜電相互作用或通過聚合物的水 解。 可以通過pH、鹽濃度的變化或其它一般機(jī)制來實(shí)現(xiàn)靜電相互作用效應(yīng)。通常，這將 導(dǎo)致標(biāo)記成分與溶液中自由離子的交換?？梢越柚谒峄驂A、或優(yōu)選酶的作用來實(shí)現(xiàn)聚合 物鏈的水解。 在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明包括這樣的微粒，其中能夠觸發(fā)載體分解的外部 刺激是能夠降解聚合物的酶。在包埋的活性組分被釋放以后，能夠轉(zhuǎn)化上述聚合物的許 多酶是已知的，如淀粉酶、半纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、普魯蘭酶(支鏈淀粉酶)、阿 拉伯糖苷酶(arabinodase)、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶或肽酶或蛋白酶。標(biāo)記成分 與本發(fā)明的微粒復(fù)合的事實(shí)的優(yōu)點(diǎn)是不僅僅通過外部刺激的釋放而且標(biāo)記化合物由微 粒加以保存并且將不會受到環(huán)境影響而降解(當(dāng)然，除了如果存在外部刺激)的副作用 (side-effect)。此外，大多數(shù)可以用于生產(chǎn)微粒的聚合物沒有毒性，并且甚至是食品級成 分。
根據(jù)本發(fā)明，還可以提供兩種或更多種標(biāo)記成分。這可以通過以下來實(shí)現(xiàn)混合加 載有不同成分的微粒，或提供具有溶解于其中的兩種或更多種標(biāo)記成分的加載溶液用于加 載微粒(即，進(jìn)行上述方法的步驟(i))。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，僅當(dāng)施加外部刺激時(shí)，標(biāo)記物質(zhì)才從微粒釋放。因此，在經(jīng)標(biāo) 記的材料上的微粒將實(shí)際上是惰性的直到加載的標(biāo)記物質(zhì)被釋放。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包含具有標(biāo)記物質(zhì)的微粒的涂層可以非常很好地用 于施加在材料上，甚至經(jīng)常與食品接觸的表面上或易損壞的系統(tǒng)上，如(切莖(cut stem) 的)切花、植物根系(plantroot)、用作繁殖材料(propagating material)的插條、植物組 織培養(yǎng)材料、石棉或其它材料的營養(yǎng)支持和植物支持介質(zhì)等。利用根據(jù)本發(fā)明的涂層來涂 布這種類型的材料并不阻礙材料的功能(例如水或營養(yǎng)物吸入)，而仍然提供所期望的標(biāo) 記。根據(jù)本發(fā)明的涂層可以優(yōu)選用于涂布種子。種子經(jīng)常被提供有涂層以提供殺真菌 齊U、殺蟲劑、農(nóng)藥、營養(yǎng)物以及其它化合物，用于萌發(fā)幼苗、幼嫩植物和/或正發(fā)育作物。加 載有根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記成分的微?？梢匀菀椎厥┘又练N子，作為正常涂 層的一部分或在正 常涂層的工藝中，或作為分開的涂層?？商鎿Q地，微?？梢园ㄔ诜N子顆粒中或在施加至包 衣種子(顆粒種子，pelleted seed)的涂層中。顆粒是一種通用術(shù)語，其用于小顆?；蚣?xì) 粒，通常通過壓縮原始材料所產(chǎn)生的一種顆?；蚣?xì)粒。在種子處理中，造球是指將種子封裝 到粘土填料的球中，其大大改善種子的處理特性以及提供用于種子處理化學(xué)品的載體。造 粒混合物通常包含各種類型的有機(jī)或無機(jī)纖維、粘土和惰性的無機(jī)材料，以及還包含具有 內(nèi)部開放孔隙度的顆粒。其它常用類型的造?；旌衔锸钦惩僚c惰性原料的各種組合而沒有 添加纖維。本發(fā)明的微?？梢园ㄔ谑┘佑谕繉由系脑烨蚧旌衔镯敳恐??？商鎿Q地，因?yàn)?種子顆粒經(jīng)常涂布有聚合物薄膜涂層以將有益的化合物施加至種子，所以本發(fā)明的微粒還 可以被施加至涂層。另外，種子的涂層并不需要完全包住種子，如果若干微粒附著于種子就足夠了，使 得每個(gè)種子被標(biāo)記并易于通過測定標(biāo)記而被鑒定。先決條件是，微粒將對種子沒有害處，也 對正發(fā)育的幼苗沒有害處。此外，對于環(huán)境或當(dāng)它們最后處于可食用物質(zhì)(如植物的根部、 塊莖或其它部分)中時(shí)剩余微粒將不應(yīng)當(dāng)是有害的。根據(jù)本發(fā)明，這些目標(biāo)可以容易地達(dá) 到。可以用于微粒中的標(biāo)記物質(zhì)可以是可以被特異性識別的任何化合物。對于實(shí)際應(yīng) 用來說，優(yōu)選的標(biāo)記物質(zhì)利用容易、快速以及便宜的方法被特異性識別。這樣的標(biāo)記物質(zhì) 可以是光標(biāo)記，如天然染料，發(fā)色團(tuán)或熒光或磷光化合物，具有特定NIR吸收或熒光譜的化 合物，具有特定拉曼光譜的化合物，酶標(biāo)記，如漆酶、或任何其它酶，其不能降解微粒的聚合 物，生物聚合物如核苷酸序列，化合物如PH指示劑，或上述的任何組合。標(biāo)記物質(zhì)還可以是 這樣的物質(zhì)，其可以通過與被加入鑒定試樣中的其它化合物的特定的化學(xué)反應(yīng)或物理相互 作用加以鑒定?？梢杂脗鞲衅骰騻鞲衅飨到y(tǒng)特異性識別的物質(zhì)也可以用作標(biāo)記物質(zhì)。例如，酶，如漆酶，可以用作微粒中的標(biāo)記物質(zhì)。在適當(dāng)刺激(例如淀粉酶)以后， 微粒被降解，從而釋放酶。于是，存在標(biāo)記酶，其可以通過添加第二成分加以檢測。在漆酶 的情況下，第二成分將是ABTS，其是用于這種酶的模型底物。ABTS將被漆酶氧化并從無色 變色到綠色。在種子標(biāo)記的情況下，用本發(fā)明的微粒標(biāo)記的種子將被加入溶液，其包含用于降解微粒的刺激，例如，一種酶。然后，能夠與標(biāo)記反應(yīng)的反應(yīng)物被加入溶液并觀測(顯色) 反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用特定的反應(yīng)，其適合本發(fā)明的上述方案。如上所述，一個(gè) 實(shí)例是使用漆酶作為標(biāo)記以及ABTS作為反應(yīng)物，其它實(shí)例將是抗原和標(biāo)記抗體的組合；核 酸(其中反應(yīng)物被標(biāo)記)，其能夠雜交；等等。甚至可以具有三步反應(yīng)方案，其中標(biāo)記與反 應(yīng)物反應(yīng)，上述反應(yīng)物將產(chǎn)生一種產(chǎn)物，以及其中借助于第二反應(yīng)物可以檢測該產(chǎn)物。在實(shí)施例中將說明本發(fā)明的載體的制備和應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，本發(fā)明 并不限于所提及的具體實(shí)施方式
和應(yīng)用，而是可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的各種其它 實(shí)施方式來顯現(xiàn)本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1微粒(BioSwitch顆粒)的制備向2. 4克NaOH在480ml水中的溶液中加入120克馬鈴薯淀粉并通過在65°C下溫育 而進(jìn)行膠凝。當(dāng)?shù)矸郾煌耆芙鈺r(shí)，添加73ml縮水甘油三甲基氯化銨(70%，在水中)以引 入陽離子官能團(tuán)。在60°C下攪拌反應(yīng)混合物120分鐘。在冷卻至室溫以后，將Ig NaOH(溶 解在2ml水中)加入IOOml獲得的反應(yīng)混合物中。然后添加2ml丙三醇二縮水甘油醚用于 交聯(lián)的陽離子淀粉，接著攪拌15分鐘。將此溶液存儲在;TC下3天。在冷卻至室溫以后，使 獲得的凝膠施壓通過篩目大約為Imm2的篩，其后添加水，其容易被凝膠吸收。然后用乙醇 沉淀凝膠，隨后用乙醇洗滌兩次以及用丙酮洗滌一次，接著在凝膠干燥機(jī)中風(fēng)干。使用兩種類型的凝膠用于有關(guān)光標(biāo)記的實(shí)驗(yàn) 實(shí)施例2將酚酞或二甲酚橙加入凝膠WDV86-88中將大約200mg酚酞溶解在20ml乙醇中。添加2. 4g凝膠顆粒(WDV86-88)并使其 在劇烈搖動下溶脹。該溶液容易被凝膠吸收(在30秒內(nèi))。其后，凍干反應(yīng)混合物，產(chǎn)生大 約2. 2克干燥的白色凝膠顆粒。作為說明，描述了涂布有包含酚酞的WDV86-88顆粒的綠豆和草種子(圖1)。與未 涂布的顆粒相比，涂布有BioSwitch顆粒的CMC很難看出來。當(dāng)施用適當(dāng)?shù)臏y試溶液時(shí)，涂布與未涂布種子之間的明顯差異變得顯而易見(圖 2)。測試溶液導(dǎo)致從BioSwitch顆粒釋放酚酞。除了釋放以外，此測試溶液還導(dǎo)致pH的增 加(高于pH9，酚酞從無色變化至紅紫色)。雖然這種構(gòu)思是可行的，但缺點(diǎn)在于，在沒有外部觸發(fā)的情況下會釋放活性化合 物。此外，太容易仿制(使用酚酞的簡單涂布也將達(dá)到目的)。在攪拌下在IOml Milli Q水中，使50mg凝膠顆粒(WDV86-88)溶脹1小時(shí)。然后， 添加溶解在0. 5ml Milli Q中的1. 5mg染料二甲酚橙。所有的染料在15分鐘內(nèi)被凝膠吸 收(離子化(ionogenic)相互作用)。二甲酚橙與凝膠的結(jié)合導(dǎo)致染料從黃色變色到深紅色。
將氯化鈉加入0. 5ml合并有二甲酚橙的WDV86-88凝膠顆粒懸浮液中，以達(dá)到2ml 的最終體積，并具有以下NaCl的最終濃度:0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、以及IM0在攪拌30 分鐘以后，通過離心(5分鐘，3700rpm)從懸浮液除去凝膠顆粒。在獲得的透明上清液中的 二甲酚橙濃度通過測量在480. 2nm處的消光來確定。通過使用參比溶液，確定了在480. 2nm 處的1消光單位對應(yīng)于0.0625mg 二甲酚橙。發(fā)現(xiàn)，在此波長(等吸光點(diǎn))處沒有觀測到pH 對二甲酚橙的消光的實(shí)質(zhì)影響。分別在以下緩沖液(均為50mM)蘋果酸pH3. 0、乙酸鹽pH5. 0、MES pH6. 0,BisTRIS 丙烷(雙TRIS丙烷，BisTRIS propane) pH7. 0、以及BisTRIS丙烷pH9中確定來自二甲酚橙 的UV/Vis譜。在各種pH值下，利用最終濃度為0.03mg/ml的二甲酚橙，記錄了光譜。圖3中描述了在不同pH值下二甲酚橙的UV/Vis譜。由于它的四個(gè)負(fù)電荷(4個(gè) 羧基基團(tuán))，它是一種有趣的分子。因此，預(yù)期與陽離子BioSwitch基質(zhì)具有相當(dāng)良好的靜 電相互作用。此外，由于它可以在四個(gè)位置被質(zhì)子化/去質(zhì)子化，所以在不同的PH值下二 甲酚橙將具有不同的顏色。就光標(biāo)記而言，這使它成為一種有趣的化合物。以下描述二甲 酚橙的結(jié)構(gòu)式。 在480. 2nm的波長處，消光似乎不受pH的影響，使這成為等吸光點(diǎn)。在此pH下的 消光可以用于確定溶液中的二甲酚橙濃度。圖4中描述了鹽(NaCl)對二甲酚橙結(jié)合于WDV 86-88凝膠的影響。它表明，4個(gè) 負(fù)電荷導(dǎo)致與陽離子基質(zhì)的足夠的相互作用，尤其是在更低離子強(qiáng)度下。對于演示實(shí)驗(yàn)，將加載有二甲酚橙的凝膠顆粒施加至種子。然而，似乎是，當(dāng)5% CMC用來將BioSwitch顆粒涂布于綠豆時(shí)，大量的二甲酚橙已經(jīng)被釋放。在有或沒有淀粉 酶(其用來分解凝膠顆粒，以便釋放染料)的試管中沒有觀測到真正的區(qū)別。測量所使用 的CMC的電導(dǎo)率并發(fā)現(xiàn)為7. 2mS/cm，其對應(yīng)于0. IM NaCl的離子強(qiáng)度。為了降低涂層材料 的離子強(qiáng)度，使用2%的膠凝淀粉溶液用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3將二甲酚橙加入WDV124凝膠顆粒中在攪拌下，在380ml Milli Q中，使2. 5g的WDV124凝膠顆粒溶脹1小時(shí)。然后， 添加20ml的50mM MES/NaOH pH6緩沖液，接著添加在50ml Milli Q中的150mg 二甲酚橙。 幾乎所有的染料在30分鐘內(nèi)被凝膠吸收。二甲酚橙與凝膠的結(jié)合導(dǎo)致染料從黃色變色到 深紅色。其后，凍干凝膠，產(chǎn)生2克深紅色的粉末。 實(shí)施例4用加載有標(biāo)記的WDV86-88凝膠顆粒涂布種子或豆類
用5%的羧甲基纖維素(CMC)溶液濕潤種子(來自草、甜菜根或綠豆)。添加干燥 凝膠顆粒WVD86-88，由此目標(biāo)在于在種子上均勻分布加載有標(biāo)記的凝膠顆粒。這通過在加 入家用篩(household sieve)期間搖動種子來實(shí)現(xiàn)。其后，借助于鼓風(fēng)干燥器，干燥經(jīng)涂布 的種子。用包含酚酞的WDV124凝膠顆粒對綠豆的涂布如下進(jìn)行
用2%的膠凝淀粉溶液濕潤綠豆。添加干燥凝膠顆粒(WDV124)，由此目標(biāo)在于在 種子上均勻分布凝膠顆粒(大約0. 25mg顆粒/豆)。這通過在加入家用篩期間搖動種子來 實(shí)現(xiàn)。隨后，借助于鼓風(fēng)干燥器，干燥經(jīng)涂布的種子。在這種情況下用CMC涂布種子并沒有產(chǎn)生良好結(jié)果CMC的離子強(qiáng)度高于閾值，從 而導(dǎo)致染料的釋放。實(shí)施例5用WDV86-88和WDV124顆粒涂布的種子的釋放以及來自用WDV86-88和 WDV124顆粒涂布的種子的顯色反應(yīng)將少量的經(jīng)涂布的WDV86-88種子加入0. 5ml的50mM碳酸鈉pHIO中。將少量的 WD-124涂布的綠豆加入0. 5ml的50x稀釋的在5mM TRIS/HC1 pH8中的Thermamyl 120淀 粉酶(SigmaA3404)中。Thermamyl是一種商業(yè)上可獲得的淀粉酶，其能夠分解基于淀粉的 顆粒(導(dǎo)致所加入的活性化合物釋放)。通過將經(jīng)涂布的綠豆加入到相同的緩沖液中來進(jìn) 行對照實(shí)驗(yàn)，從而省略Thermamyl。通過溶液變成粉紅色來說明酚酞的存在。圖5說明⑴經(jīng)涂布與未涂布綠豆之間的差異，以及(ii)在存在或缺少淀粉酶的 情況下在二甲酚橙的釋放方面的差異。顯而易見的是，如果存在淀粉酶(其降解BioSwitch 基質(zhì)，從而釋放染料)，二甲苯酚僅被釋放在溶液中。在缺少淀粉酶的情況下，BioSwitch基質(zhì)不會被分解。然而，在試管中可以檢測二 甲酚橙。與用淀粉酶的實(shí)驗(yàn)相反，淀粉酶的缺少導(dǎo)致觀測到局部著色斑點(diǎn)完整的包含二甲 酚橙的BioSwitch顆粒。因此，染料未被釋放，而是保持牢固地結(jié)合于BioSwitch基質(zhì)。實(shí)施例6將漆酶加入WDV124凝膠顆粒中第一批次在攪拌下，在30ml的50mM Bis-TRIS pH6. 8中，使大約200mg的WDV124 凝膠顆粒溶脹1小時(shí)。隨后，添加IOml純化漆酶，pH被重新調(diào)節(jié)至6. 8，然后在攪拌下使凝 膠顆粒吸收上述酶30分鐘。用相同的50mM BisTRIS緩沖液洗滌凝膠顆粒一次，然后通過 離心(5分鐘，3700rpm)來收獲。使一半凝膠顆粒靜置以用空氣(30°C )干燥，另一半被凍干。第二批次借助于Retsch，研磨凝膠顆粒，直到大約80%的顆粒能夠通過0. 05mm 篩(凝膠代碼WDV124XT 超細(xì))。通過利用在FPLC系統(tǒng)上的200ml Sephadex G25柱，從 在20mM Bis-TRISpH6. 5中的50ml漆酶中除去鹽。將脫鹽漆酶收集在70ml緩沖液中并通 過0. 22Mm無菌過濾器過濾。在攪拌下，在30ml部分(demi)中，使250mg的WDV124XG顆粒 溶脹30分鐘，其后添加15ml的在20mM Bis-TRIS pH6. 5中的 1. 5mg/ml漆酶。在30分 鐘攪拌期間，上述酶被凝膠吸收。獲得的凝膠被凍干，產(chǎn)生細(xì)白粉末。實(shí)施例7用包含漆酶的WDV124 (XF)凝膠顆粒涂布綠豆用200mL的2 %膠凝淀粉溶液濕潤20粒綠豆。添加5mg干燥凝膠顆粒 (WDV124 (XF))，由此目標(biāo)在于在種子上均勻分布凝膠顆粒(大約0. 4mg顆粒/豆)。這通過 在加入家用篩期間搖動種子來實(shí)現(xiàn)。隨后，借助于鼓風(fēng)干燥器來干燥經(jīng)涂布的種子。
實(shí)施例8在經(jīng)涂布的綠豆上釋放和檢測漆酶_兩步反應(yīng)向試管中添加一粒經(jīng)涂布的綠豆和975mL溶液A或B (見下文)，接著在環(huán)境溫度 下溫育10分鐘。其后，添加25M15mg/mlABTS，其通過漆酶的作用被氧化，從而從無色變成綠 色。接著進(jìn)行顯色反應(yīng)(1-120分鐘)并及時(shí)在不同時(shí)刻獲取圖片(或用分光光度法測量 溶液的消光)。
測試溶液A = 5mM BisTRIS pH6. 5測試溶液B= 200x 稀釋的 Thermamyl 120 淀粉酶(SigmaA3404)，在 5mM Bis TRIS ρΗ6· 5 中活性化合物(漆酶)的檢測需要兩個(gè)步驟通過淀粉酶分解基質(zhì)；接著由漆酶催 化顯色反應(yīng)，從而使ABTS從無色變成綠色(圖6)。淀粉酶或ABTS的排他使用并不導(dǎo)致顯 色，即活性化合物的檢測兩種化合物均是需要的。圖7示出了從綠豆上的WDV124釋放活性化合物以后的顯色。這種構(gòu)思表明，為了 顯色，需要兩步反應(yīng)。ABTS或淀粉酶將排他地不會導(dǎo)致清晰均勻的顏色(僅ABTS導(dǎo)致藍(lán) 色/綠色的局部斑點(diǎn)，即完整的BioSwitch顆粒，其中ABTS被吸收并使得可以與結(jié)合的漆 酶局部地進(jìn)行反應(yīng))。圖8表明，用ABTS進(jìn)行的延長的溫育導(dǎo)致進(jìn)一步顯色。這表明，為了 顯強(qiáng)色，需要相對較長的時(shí)間。同時(shí)用凍干BioSwitch顆粒進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，用風(fēng)干顆粒重復(fù) 實(shí)驗(yàn)(圖9)。引人注目的是，與在用凍干顆粒的實(shí)驗(yàn)中相比，顏色變化更快得多。這說明，由于 凍干，漆酶已經(jīng)喪失部分其活性。超細(xì)磨碎顆粒WDV124XF被加載有漆酶(第二批次)，并進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)(圖10)。提供的結(jié)果形成這樣的證據(jù)，S卩，可以開發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)，其中需要兩個(gè)連續(xù)步驟以 釋放顏色。實(shí)施例9現(xiàn)場試驗(yàn)進(jìn)行了最初的現(xiàn)場試驗(yàn)，其中使用獨(dú)行菜和甜菜根種子作為測試材料。種子涂布 有包含BioSwitch凝膠顆粒的三種涂層，其中BioSwitch凝膠顆粒結(jié)合有二甲酚橙、漆酶或 AZCL-直鏈淀粉。AZCL可商業(yè)上獲得，用作淀粉酶試驗(yàn)。它是一種用于淀粉酶的基于直鏈 淀粉的底物；淀粉酶的活性導(dǎo)致從AZCL-直鏈淀粉釋放標(biāo)記，導(dǎo)致顯色。未涂布的種子用作 對照。對于所有樣品，在盆栽用土、泥炭以及(1 1 1)的混合物中，使5X15粒種子發(fā) 芽。在氣候室中，在20°C和80%相對濕度(16小時(shí)光明/8小時(shí)黑暗)下，進(jìn)行發(fā)芽。立即 分析發(fā)芽的種子的樣品，或存儲于-20°C。在第2、4以及7天分析甜菜根種子/籽苗(發(fā)芽開始于第2-3天)。在第1、2以及3天分析獨(dú)行菜種子/籽苗(發(fā)芽開始于第1天)?；旧先缦惹八枋龅膩磉M(jìn)行結(jié)合有BioSwitch的化合物的分析。對于現(xiàn)場試 驗(yàn)，降低分析的規(guī)模以便于使用96孔微孔板進(jìn)行測量。漆酶在緩沖液A或B中溫育5粒獨(dú)行菜種子或兩粒甜菜根種子20分鐘，接著在5000rpm 下離心1分鐘。在96孔微孔板中混合IOOmL上清液+IOOmL緩沖液+IOM 5mg/ml ABTS，然 后在不同時(shí)間點(diǎn)讀出在405nm處的消光。重復(fù)進(jìn)行測量，示出的結(jié)果是兩次測量結(jié)果的平 均值。
二甲酚橙在1ml 5mM TRIS/HAc緩沖劑pH8. 0緩沖液中溫育5粒獨(dú)行菜種子或兩粒甜菜根種子10分鐘，接著在5000rpm下離心1分鐘。將250M1上清液轉(zhuǎn)移到微孔板，然后讀出在 580nm處的消光。重復(fù)進(jìn)行測量；示出的結(jié)果是兩次測量結(jié)果的平均值。AZCL-直鏈淀粉在緩沖液A或B中，溫育三粒獨(dú)行菜種子或1粒甜菜根種子30分鐘，接著在 5000rpm下離心1分鐘。將250M1上清液轉(zhuǎn)移到微孔板，并讀出在595nm處的消光。重復(fù)進(jìn)行測量，示出的結(jié)果是兩次測量結(jié)果的平均值。進(jìn)行現(xiàn)場試驗(yàn)，以便表明在實(shí)踐中利用光標(biāo)記系統(tǒng)的可行性。獨(dú)行菜種子和甜 菜根種子均涂布有BioSwitch凝膠顆粒。種子被涂布有顆粒，其結(jié)合有二甲酚橙、漆酶或 AZCL-直鏈淀粉。對每種活性化合物表示結(jié)果。漆酶圖11示出了用涂布有漆酶的種子獲得的結(jié)果。結(jié)果表明，在已經(jīng)深翻(subsoil)種子四天以后仍然明顯地檢測到漆酶的活性。 對于獨(dú)行菜，這是僅在1-2天后的情況。二甲酚橙圖12示出了用涂布有二甲酚橙的種子獲得的結(jié)果。結(jié)果表明，在已經(jīng)深翻甜菜種子2天后檢測不到二甲酚橙達(dá)四天之久。對于獨(dú)行 菜在1天以后保持相同情況。對于獨(dú)行菜在第3天觀測到的信號是人工產(chǎn)物(或假象)，即 在所測量樣品中的非特異性濁度。AZCL-直鏈淀粉圖13示出了用涂布有AZCL-直鏈淀粉的種子獲得的結(jié)果。結(jié)果表明，在已經(jīng)深翻甜菜根種子2天以后，仍然可以明顯地檢測到AZCL-直鏈淀 粉的存在。在發(fā)芽4天和7天以后，測量值并不顯著高于對照，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)果中有許多變化。 對于獨(dú)行菜，發(fā)芽1-2天以后仍然可以檢測。根據(jù)結(jié)果，顯而易見的是，基于漆酶的本發(fā)明的光標(biāo)記構(gòu)思提供了最好的結(jié)果。雖 然這種構(gòu)思未加以優(yōu)化，但在種子已發(fā)芽數(shù)天以后漆酶仍然是可檢測的。綜上所述，可以說，已開發(fā)了功能光標(biāo)記構(gòu)思。該構(gòu)思包括BioSwitch基質(zhì)、標(biāo)記 化合物以及結(jié)合于化合物的檢測的釋放機(jī)制。作為標(biāo)記化合物，可以使用，例如，酶、酶的底 物、或熒光的有色化合物?？梢砸詢刹椒磻?yīng)來進(jìn)行釋放和檢測，該兩步反應(yīng)將偽冒的威脅降 低到最小程度。此構(gòu)思使得能夠標(biāo)記單獨(dú)的種子。如通過最初的現(xiàn)場試驗(yàn)所表明的，可以 在發(fā)芽深翻經(jīng)涂布的種子一定時(shí)間以后進(jìn)行標(biāo)記化合物的檢測。有趣的是，該構(gòu)思使得可以使用各種標(biāo)記。這使得最終用戶可以施用標(biāo)記的不同 組合來具體地標(biāo)記種子，例如來自一定的地表以上的土地(land aerial)、一定的種子類型 或一定的收獲。此外，不同的使用者可以使用不同的標(biāo)記來標(biāo)記他們自己的種子。
權(quán)利要求
用于標(biāo)記對象的方法，包括對所述對象施加包含交聯(lián)聚合物和標(biāo)記成分的微粒，其中，所述標(biāo)記成分從所述微粒的釋放通過所述微粒與外部刺激的接觸被觸發(fā)，以及其中，所述聚合物是碳水化合物或蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述外部刺激是能夠降解所述聚合物的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述標(biāo)記成分的釋放由靜電相互作用的變化所 引起，由例如PH的變化、溫度的變化、或鹽濃度的變化所引起。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合物選自由淀粉或淀粉的衍 生物、纖維素或纖維素的衍生物、果膠或果膠的衍生物、以及明膠或明膠的衍生物組成的 組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，交聯(lián)劑選自由二乙烯基砜、表氯醇、 雙環(huán)氧化合物如丙三醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油醚、三偏磷酸鈉以及己二酸、或 它們的衍生物組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合物通過選自由過氧化物酶、 漆酶、多酚氧化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、巰基氧化酶、賴氨酰氧化酶以及脂 肪氧合酶組成的組中的交聯(lián)酶或通過化學(xué)交聯(lián)劑來交聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述標(biāo)記成分選自天然染料；發(fā)色團(tuán) 或熒光或磷光化合物；具有特定NIR吸收或熒光譜的化合物；具有特定拉曼光譜的化合物； 酶標(biāo)記，如漆酶、或任何其它酶，其不能降解所述微粒的所述聚合物；生物聚合物如核苷酸 序列；化合物如PH指示劑；以及上述的任何組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述酶是漆酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述聚合物是帶電荷的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述標(biāo)記的對象選自服裝、鞋、香 煙、手表、銀行票據(jù)、涂料、炸藥、醫(yī)藥產(chǎn)品、食品、化妝品、動物以及農(nóng)產(chǎn)品如(盆栽)植物、 插條、組織培養(yǎng)材料以及種子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述對象是種子。
12.用于鑒定對象的方法，包括以下步驟a.使用根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法來標(biāo)記所述對象；b.通過施加適當(dāng)?shù)耐獠看碳ひ詮乃鑫⒘ａ尫潘鰳?biāo)記成分來鑒定所述對象；以及c.對所述標(biāo)記成分進(jìn)行測定。
13.包含交聯(lián)聚合物和標(biāo)記成分的微粒在用于標(biāo)記對象中的應(yīng)用，其中，所述標(biāo)記成分 從所述微粒的釋放通過所述微粒與外部刺激的接觸被觸發(fā)，以及其中，所述聚合物是碳水 化合物或蛋白質(zhì)。
14.用于標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求2以及4-11中任一項(xiàng)所述的對象或用于鑒定根據(jù)權(quán)利要求 12所述的對象的試劑盒，包含如在權(quán)利要求2以及4-9任一項(xiàng)中所定義的微粒；以及用于降解所述聚合物的酶。
15.用于標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求3-7以及9-11中任一項(xiàng)所述的對象或用于鑒定根據(jù)權(quán)利要 求12所述的對象的試劑盒，包含如在權(quán)利要求3-7以及9任一項(xiàng)中所定義的微粒；以及用于釋放所述標(biāo)記成分的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于標(biāo)記對象的標(biāo)記系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含含有交聯(lián)聚合物和標(biāo)記成分的微粒，其中所述標(biāo)記成分的釋放通過微粒與外部刺激的接觸被觸發(fā)，以及其中所述聚合物是碳水化合物或蛋白質(zhì)。
文檔編號G09F3/00GK101874262SQ200880105742
公開日2010年10月27日 申請日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者蘭道夫·彼得·哈佩, 約翰內(nèi)斯·威廉默斯·萊昂納德斯·博曼斯, 約翰內(nèi)斯·威廉默斯·蒂默曼斯, 羅納德·塔科·馬里納斯·范登杜爾 申請人:荷蘭應(yīng)用科學(xué)研究會(Tno)