專利名稱:洋蔥伯克霍爾德氏菌sd7及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)(微生物農(nóng)藥)領(lǐng)域，具體涉及一種洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病原菌(包括真菌、細(xì)菌、病毒等)引起的植物病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，防治水稻、香蕉等重要植物病害的主要方法是使用殺菌劑。殺菌劑的大量使用，會(huì)增大病原菌抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，并且會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，對(duì)人畜健康也構(gòu)成威脅。生物防治是一種對(duì)環(huán)境友善的防治植物病害的新途徑。
植物周圍不僅存在病原菌，而且還存在著大量的非病原菌，其中有的還是病原菌的拮抗微生物。這些拮抗微生物可通過(guò)與病原菌的抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等機(jī)理來(lái)抑制病原菌，達(dá)到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物對(duì)環(huán)境安全，不像化學(xué)農(nóng)藥那樣造成環(huán)境污染以及對(duì)人畜的毒害，同時(shí)拮抗微生物不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，有些還具有 促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，且實(shí)際生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單。因此，利用拮抗微生物來(lái)防治植物病害的研究正越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的重視。目前，人們已經(jīng)分離到多種對(duì)各種不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己經(jīng)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段，產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)效益和環(huán)境效益。
人們對(duì)伯克霍爾德氏菌屬iBurkholderia)的研究較多，主要集中在應(yīng)用該屬內(nèi)的菌株生產(chǎn)酶或用于治理環(huán)境污染，如以下專利文獻(xiàn):公開(kāi)號(hào)1195373 (日本，中山美香等，
公開(kāi)日2004/03/24)的降解鹵代烴的微生物及其應(yīng)用；公開(kāi)號(hào)1484703 (日本，早出廣司，
公開(kāi)日2004/03/24)的葡萄糖脫氫酶和生產(chǎn)該脫氫酶的方法；公開(kāi)號(hào)1867676 (日本，山口將憲等，
公開(kāi)日2006/11/22)的鯊肌醇的制備方法；公開(kāi)號(hào)101198695 (德國(guó)，貝賽林等，
公開(kāi)日2008/06/11)的生產(chǎn)脂肪酶的方法；公開(kāi)號(hào)101153272 (中國(guó)，盛下放等，
公開(kāi)日2008/04/02)的一種鉛鎘抗性細(xì)菌及其用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法；公開(kāi)號(hào)102046778A (日本，古賀一治、增田紳吾，
公開(kāi)日2011/05/04)的降低植物體中的重金屬含量的細(xì)菌；公開(kāi)號(hào)101671636 (中國(guó)，郭軍康等，
公開(kāi)日2010/03/17)的一種抗重金屬植物促生菌制劑及其施用方法。以上文獻(xiàn)中都沒(méi)有涉及到植物病原菌生物防治的相關(guān)應(yīng)用。
在植物病害的生物防治方面，任嘉紅等發(fā)現(xiàn)吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007對(duì)楊樹(shù)潰瘍病具有防治效果(任嘉紅等.吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分離純化.微生物學(xué)通報(bào)，2010-06-20 ;任嘉紅等.吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007的發(fā)酵條件及其對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的防治效果.中國(guó)生物防治，2010-08-08 ;葉建仁等.一種吡咯伯克霍爾德氏菌及其在防治楊樹(shù)潰瘍病中的應(yīng)用.中國(guó)專利，2009-10-14);查傳勇等發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克霍爾德氏菌LulO-1能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)(查傳勇等.洋蔥伯克霍爾德氏菌LulO-1產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化.蠶業(yè)科學(xué)，2009-06-15)。
林善海等發(fā)現(xiàn)伯克霍爾德氏菌對(duì)香蕉褐緣灰斑病具有防治效果(林善海等，拮抗伯克霍爾德氏菌對(duì)香蕉褐緣灰斑病的生物防治試驗(yàn).中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集，2007-08-01)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中各種植物病原真菌和細(xì)菌引起的植物病害化學(xué)藥劑防治副作用大、生物防治藥物缺乏的缺陷，提供一種可抑制包括香蕉炭疽病菌和水稻紋枯病菌在內(nèi)的多種植物病原菌的廣譜生防菌株。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7，分類命名為:洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderiacepacia,于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCCN0.5384。該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本發(fā)明還提供了一種生物菌劑，該生物菌劑含有洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7或含有洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7發(fā)酵液(即培養(yǎng)液)經(jīng)過(guò)濾后的無(wú)菌濾液，所述無(wú)菌濾液優(yōu)選用洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)離心取得的上清再經(jīng)過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾獲得。
該洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7的培養(yǎng)方法，其特征在于發(fā)酵條件如下:LB培養(yǎng)基(酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 18 g、水1000 mL，pH 6.0 7.0)，裝液量100 mL，加入I mL 2 d齡的種子菌株(即每IOOmL LB培養(yǎng)基接種I mL 2 d齡的種子菌株)，以180 r/min在25°C條件下培養(yǎng)3 d。
洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7在制備防治植物病原真菌和/或細(xì)菌引起的植物病害中菌劑的應(yīng)用。所述植物病原真菌為水稻紋枯病菌香蕉炭疽病菌{CoIletotrichum musae)>稻痕病菌iPyricularia oryzae)>小麥赤霉病菌iGibberella zeae)、香蕉枯萎病菌oxysporum f.sp.cMeflse)、蒸枝霜疫霉菌iPeronophythora Iitchii)、甘鹿黑腐病菌iCeratocystis adiposum)和番爺葉霉病菌{Fulvia /1/7Ka);所述植物病原細(xì)菌為水稻白葉枯病菌CfefliAofflmas oryzae pv.0ryzae)和水稻細(xì)菌性條斑病菌(1.0ryzae pv.0ryzicola)0
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7的無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲的抑制率為88.79%，對(duì)菌核萌發(fā)的抑制率為90%。離體實(shí)驗(yàn)表明對(duì)水稻紋枯病的防效達(dá)90.0%，對(duì)苗期水稻紋枯病的防效為53.7%。同時(shí)，對(duì)香蕉果實(shí)炭疽病的室內(nèi)生防效果也達(dá)52.12%。因此，該菌株是一種對(duì)多種植物病原菌都具有強(qiáng)烈抑制作用的廣譜生防菌株，且具有對(duì)人畜無(wú)害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不容易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，能夠進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。


圖1.SD7菌株在LB培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)。
圖2.SD7菌株的16S rDNA序列與相近菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
圖3.洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7對(duì)香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果，其中I為只接種炭疽病菌的對(duì)照組CKl，2飛為洋蔥伯克霍爾 德氏菌SD7的無(wú)菌濾液處理后又接種炭疽病菌的實(shí)驗(yàn)組，6 7為僅加入洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7無(wú)菌濾液的對(duì)照組CK2。[0018]圖4.洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的防效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中I為SD7無(wú)菌液，2為SD7菌液，3為L(zhǎng)B培養(yǎng)液，4為井R霉素，5為無(wú)菌水對(duì)照。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7的篩選及鑒定
1、菌株的篩選
(I) 土壤樣品的采集
本實(shí)驗(yàn)從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)果園采集土樣，根據(jù)采集地的地形等采用5點(diǎn)取樣，取樣深度為耕作層或地表以下15 cm，取量200 250 g，每個(gè)地點(diǎn)采集的5個(gè)樣本均勻混合，裝入滅菌的封口聚乙烯袋，帶回實(shí)驗(yàn)室馬上分離。
(2)樣品懸浮液的制備
將土壤樣品加入滅菌水中激烈震蕩。樣品:水=1:9 (質(zhì)量與體積比)，如:10 g 土壤加入裝有90 mL滅菌水的三角瓶中所得懸浮液濃度為10'每種樣品各準(zhǔn)備5支裝有9mL滅菌水的試管按10倍梯度稀釋法，將上述濃度為KT1的懸浮液稀釋成10_2 10_6的系列濃度懸浮液，即從I號(hào)試管中吸取I mL懸浮液放入2號(hào)試管(盛有9 mL滅菌水)中，充分震蕩混勻，再?gòu)?號(hào)試管中吸取I mL懸浮液放入3號(hào)試管(盛有9 mL滅菌水)中，依此類推，直至第6支試管為止。
(3)分離方法
采用LB培養(yǎng)基( 酵母浸出粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 18 g、水1000 mL)。用移液器分別吸取上述不同稀釋度的溶液0.5mL，滴加于培養(yǎng)基平板上(3平板/稀釋度)，用滅菌的L型玻棒涂布均勻，稍晾干，作好標(biāo)記和日期，培養(yǎng)皿倒置，于25 28°C溫箱中培養(yǎng)2 3 d，將平板上長(zhǎng)出的單菌落挑出到新的培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對(duì)全部分離到的菌株(稱為待測(cè)菌株)進(jìn)行編號(hào)，然后對(duì)其拮抗活性進(jìn)行初篩和復(fù)篩，以獲得本專利菌株。
(4)拮抗菌的初篩和復(fù)篩
采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，檢測(cè)上述各種待測(cè)菌株對(duì)水稻紋枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培養(yǎng)好的水稻紋枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊，接種在PDA平板中央，再將已經(jīng)活化的各種待測(cè)菌株接種在水稻紋枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌的菌絲塊四周2 3cm處，每個(gè)PDA平板接種4個(gè)待測(cè)菌株，設(shè)置不接種待測(cè)菌株的對(duì)照，每處理3次重復(fù)。在25 28°C下培養(yǎng):T5 d，然后測(cè)量待測(cè)菌株與水稻紋枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌之間的抑菌帶寬度，作為拮抗活性強(qiáng)弱的指標(biāo)。
經(jīng)過(guò)上述初篩和復(fù)篩，獲得一株對(duì)水稻紋枯病菌和香蕉炭疽病菌等多種病原菌具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株，編號(hào)為SD7，保存?zhèn)溆谩?br>、SD7菌株的形態(tài)學(xué)和分子鑒定
(I)形態(tài)學(xué)觀察
在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落為圓形，乳白色，半透明，粘質(zhì)，邊緣較整齊，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，菌落變厚，中間隆起，且其菌體培養(yǎng)物較粘稠(圖1);液體LB培養(yǎng)能豐富生長(zhǎng)、菌液較渾濁。
(2)分子生物學(xué)和生理生化鑒定[0034]經(jīng)PCR反應(yīng)和特異片段的克隆測(cè)序，獲得SD7菌株的16S rDNA序列(SEQ IDN0:1):
將SD7菌株的16S rDNA序列用Blast軟件與從GenBank中搜索的已經(jīng)登錄 StJ Burkholderia cepacia (DQ387437)> Burkholderia vietnamiensis (AY741147)、Burkholderia anthina(AJ420880)'Burkholderia cenocepacia(FJ810079)'Burkholderiamultivorans ^Paenibacillus daeJeonensis (NRO25I7O)的 I6S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。
根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，測(cè)得SD7菌株的生理生化性狀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(表I)。
表I SD7菌株的生理生化注狀
權(quán)利要求
1.洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)SD7,于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC N0.5384。
2.權(quán)利要求
1所述洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7，其特征在于該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1 所示。
3.—種生物菌劑，其特征在于含有權(quán)利要求
1或2所述洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7或含有洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后的無(wú)菌濾液。
4.權(quán)利要求
1或2所述洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)條件如下:每IOOmL LB培養(yǎng)基加入ImL 2天齡的種子菌株，以180 r/min在25°C條件下培養(yǎng)3 d; LB培養(yǎng)基配方為:酵母浸出粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、瓊脂粉15 18g、水1000mL, pH 6.0 7.0。
5.一種權(quán)利要求
1或2所述洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7的應(yīng)用，其特征在于，洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7在制備防治植物病原真菌和/或植物病原細(xì)菌引起的植物病害菌劑中的應(yīng)用，所述植物病原真菌為水稻紋枯病菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄葉霉病菌；所述植物病原細(xì)菌為水稻白葉枯病菌或水稻細(xì)菌性條斑病菌 。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了洋蔥伯克霍爾德氏菌SD7及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用，該菌株于2011年10月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.5384。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)水稻紋枯病菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄葉霉病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌等均具有強(qiáng)烈的抑制作用，為廣譜拮抗菌，可用于防治多種植物病害，尤其是對(duì)香蕉果實(shí)炭疽病和水稻紋枯病的防治效果較好，且具有對(duì)人畜無(wú)害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不容易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，能夠進(jìn)行商業(yè)開(kāi)發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01P3/00GKCN102533593 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110423432
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月16日
發(fā)明者周而勛, 舒燦偉, 楊媚, 高艷麗, 張德濤, 彭正凱 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan