專利名稱：與水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子相聯(lián)的玉米h3c4啟動子,含有它的嵌合基因及轉(zhuǎn)化植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的5’端調(diào)節(jié)序列，它可使與所述調(diào)節(jié)序列異源的編碼感興趣蛋白質(zhì)的序列在單子葉植物中表達(dá)。本發(fā)明還涉及一種嵌合基因，該嵌合基因包含所述調(diào)節(jié)序列、編碼感興趣蛋白的異源序列，3’端調(diào)節(jié)序列，它可使單子葉植物細(xì)胞表達(dá)這一感興趣蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及含有所述嵌合基因的轉(zhuǎn)化單子葉植物，以及轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞所必需的方法。
在文獻(xiàn)中，已描述過可使感興趣蛋白質(zhì)編碼序列在植物中表達(dá)的多種不同啟動子，而且已能開發(fā)出商品化的基因工程修飾植物。啟動子序列所在基因可在植物中天然表達(dá)，特別是細(xì)菌、病毒或植物來源的啟動子，如核酮糖-雙磷酸羧化酶/氧化酶小亞基基因啟動子(US.4962028)或植物病毒基因(如白菜花花葉病病毒基因)的啟動子(US.5352605)。在植物中可表達(dá)異源基因的啟動子在下列專利或?qū)＠暾堉杏芯唧w描述US 5086169，EP0353908，US5139954，US5378619，US5563328，US5589583，US5633363，US5633439，US5633440，US5633447，US5635618，US5639948，US5639952。
但這些啟動子中的某些，更具體說是植物來源的啟動子在單子葉植物中不能發(fā)揮功能。
如我們已知的Arabidopsis sp組蛋白啟動子(專利申請EP0507698)在雙子葉植物如煙草、油菜、大豆中可特別有效地表達(dá)異源基因，但在單子葉植物如玉米中不能發(fā)揮其功能。
水稻肌動蛋白啟動子是已知的可在單子葉植物中表達(dá)異源基因的啟動子(US5641876)，需鑒定出異源序列在單子葉植物中表達(dá)所需的新的功能性5’調(diào)節(jié)序列仍是一個有待解決的問題。
本發(fā)明涉及一種新的DNA序列，它是可使單子葉植物細(xì)胞表達(dá)異源基因的一段5’端調(diào)節(jié)元件。按轉(zhuǎn)錄方向，所述DNA序列包括第一個DNA序列即玉米H3C4啟動子序列的功能片段，第二DNA序列即水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子序列的功能片段。
玉米H3C4啟動子序列由Brignon(plant.Mol.Biol.，221007-1015，1993)具體描述過，它是H3C4啟動子的AulI片段，約1kb，對應(yīng)于玉米H3C4組蛋白編碼序列內(nèi)相對于ATG的-7到-1029堿基。
水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子序列在專利US5，641，876中有具體敘述。
根據(jù)本發(fā)明，功能性片段，指任意衍生自玉米H3C4啟動子序列或水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子序列的DNA序列，它們能再現(xiàn)其源序列的功能。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，玉米H3C4啟動子序列的功能性片段包含SEQ.IO，NOI所描述的DNA序列或該其同源序列。較好的是，所述玉米H3C4啟動子序列的功能片段由SEQ.IO，NOI所描述的DNA序列構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子功能性片段含有SEQ.ID.NO2所描述的DNA序列或其同源序列，較好的是，所述水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子功能片段由SEQ.ID.NO2所描述的DNA序列構(gòu)成。
本發(fā)明的DNA序列，即5’端調(diào)節(jié)元件在第一和第二DNA序列之間還可包含某些中性DNA片段，它們通常是構(gòu)建本發(fā)明序列所必需的。這些DNA片段可包含多達(dá)30個堿基對，較好的是20個堿基對。根據(jù)本發(fā)明，這些中性DNA片段指基本上不修飾本發(fā)明序列中的第一和第二DNA序列的DNA片段。
根據(jù)本發(fā)明的一個較佳實施例，本發(fā)明的DNA序列包括SEQ.ID.NO3所表示的DNA序列或其同源序列。更好的是，本發(fā)明的序列是由SEQ.ID.NO3所表示的DNA序列構(gòu)成。
本發(fā)明的“同源”指與SEQ.ID.NO1、2或3號描述的參比DNA序列相比，存在一處或幾處序列修飾，且能再現(xiàn)上述序列功能的DNA序列。這些改變可按常用的突變技術(shù)得到，或者通過選擇能用于所述序列制備的合成寡核苷酸而得到。有益的是，與參比序列相比，同源程度至少達(dá)到70％。宜至少80％；較好的是至少達(dá)90％。
本發(fā)明涉及一種嵌合基因(或表達(dá)盒)，它包括一個編碼序列以及5’端和3’端位置上能在單子葉植物植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的異源性調(diào)節(jié)元件。其中5’端調(diào)節(jié)元件包含上述本發(fā)明DNA序列。
本發(fā)明的“植物細(xì)胞”指衍生自單子葉植物、能構(gòu)成未分化組織(如胼胝體)分化組織(如胚胎)單子葉植物諸部分；單子葉植株或種子的任何細(xì)胞。
本發(fā)明的“單子葉植物”指能進(jìn)行光合成的分化的多細(xì)胞生物體，更具體地說是作為動物飼料和人類食物等植物，如小麥、大麥、燕麥、水稻、玉米、高梁、甘蔗等。
根據(jù)本發(fā)明，還可能與本發(fā)明調(diào)節(jié)性啟動序列結(jié)合使用被置于編碼序列和啟動子之間的其它調(diào)控序列，如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(單份或雙份)的序列。此時，可被一中間序列分開，即，在轉(zhuǎn)錄方向上，包含一段植物質(zhì)體定域酶基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，這是植物質(zhì)體定域酶基因成熟N末端序列的一部分，接著是第二段植物質(zhì)體定域酶基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列，這也是植物質(zhì)體定域酶基因成熟N末端序列的一部分，就如在0508909申請中所描述。至于轉(zhuǎn)運(yùn)肽，包括Cornelissen等描述的煙草PR-1a基因的信號肽。
作為調(diào)節(jié)終止序列或聚腺苷酸化序列，可利用細(xì)菌來源的任何相應(yīng)序列，如根癌土壤桿菌的NOS終止子，或來源于植物的，如EP0633317申請中描述的組蛋白終止子。
本發(fā)明嵌合基因中的編碼序列可包括任何希望在單子葉植物細(xì)胞或植物中表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的編碼序列。
這可以是編碼可選擇標(biāo)記的基因，例如，賦予被轉(zhuǎn)化單子葉植物新農(nóng)學(xué)特性的基因，或改良被轉(zhuǎn)化單子葉植物農(nóng)學(xué)品質(zhì)的基因。
在編碼可選擇標(biāo)記的基因中，可提及的有抗生素抗性基因；耐除草劑(雙丙氨酰膦、草甘膦或異噁唑類)基因編碼易鑒別酶如GUS酶的基因；編碼色素或在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中調(diào)節(jié)色素產(chǎn)生的酶的基因。這些可選擇標(biāo)記基因在專利申請WO91/02071和WO95/06128中有具體描述。
在賦予被轉(zhuǎn)化單子葉植物新農(nóng)業(yè)特性的基因中，包括抗除草劑基因，抗殺蟲劑基因、抗病基因等。這些基因在專利申請WO91/02071和WO95/06128中有具體描述。
作為調(diào)節(jié)終止子和聚腺苷酸化序列，可采用任何細(xì)菌來源的相應(yīng)序列，如根癌土壤桿菌的NOS終止子，或植物來源的如組蛋白終止子。如申請EPo633317中所述。
本發(fā)明特別適合表達(dá)使被轉(zhuǎn)化單子葉植物細(xì)胞和植物抗特定除草劑的基因。抗除草劑基因中，包括抗雙丙氨酰膦的Bar基因，編碼抗除EPSPS除草劑(如草甘膦及其鹽類)的EPSPS的基因(US5094945，US4940835，US5188642，US4971908，US5145783，US5310667，US312910，US5627061，US5633435，F(xiàn)R2736926)，編碼草甘膦氧化還原酶(US5463175)的基因，或編碼抗除HPPD除草劑(如異噁唑類特別是isoxafutole(FR9506800，F(xiàn)R9513570)，二酮腈(EP496630，EP496631)或三酮，特別是sulcotrione(EP625505，EP625508，US5506195)等除草劑)的HPPD的基因。這些編碼抗除HPPD除草劑的HPPD的基因在專利申請WO96/38567中和公布的專利申請F(tuán)R9714264，(1997.11.7提交)中有描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
在編碼抗除EPSPS除草劑的EPSPS的基因中，特別應(yīng)提及的有編碼植物尤其是玉米EPSPS的基因，它在102和106存在兩處突變，在FR2736926專利申請中有所描述，以下稱雙突變EPSPS，或自土壤桿菌中分離的編碼EPSPS的基因，專利US5633435的ID2和ID3序列對其作了描述，以下稱CP4。
在編碼抗除HPPD除草劑的HPPD的基因中，特別應(yīng)提及的有WO96/38567專利申請中描述的假單胞菌和Arabidopsis的HPPD。
就編碼EPSPS或HPPD基因而言，更具體地說就上述基因而言，編碼這些酶的序列前面最好有一段編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，特別是專利US5510471或US5663448中所述的所謂優(yōu)選轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其內(nèi)容納入本文作參考。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明的嵌合基因，在轉(zhuǎn)錄方向上，包括上述本發(fā)明的5’端調(diào)節(jié)序列，它功能性地連結(jié)一個編碼融合蛋白即轉(zhuǎn)運(yùn)肽/感興趣蛋白的序列，后者功能性地連接3’端調(diào)節(jié)序列；嵌合基因內(nèi)的各元件如前所述，感興趣蛋白宜為抗除草劑的酶，更佳的是上述HPPD或EPSPS型的酶。
編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽/EPSPS融合蛋白的序列，特別是OTP/雙突變EPSPS的序列在專利US4940835，US5633448和FR2736926中有具體描述。
對OTP/CP4融合蛋白，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道如何采用專利US5633435中提到的CP4編碼序列，按照專利4940835，US5633488和FR2736926或下面實施例中所述操作方法來構(gòu)建相應(yīng)的基因。本發(fā)明還涉及一嵌合基因，它在轉(zhuǎn)錄方向上，包括可保證異源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的5’端調(diào)節(jié)序列，它功能性地連接一個編碼OTP/CP4融合蛋白的序列，后者又功能性地連接3’調(diào)節(jié)序列。該5’端調(diào)節(jié)元件不僅包括上述本發(fā)明的5’端調(diào)節(jié)元件，還包括可使異源性基因在雙子葉或單子葉植物(特別是前面提到的那些植物)的植物細(xì)胞中表達(dá)的各種適宜的調(diào)節(jié)元件，這些是本領(lǐng)域?qū)I(yè)已知或?qū)⒅摹?br> 編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽/HPPD融合蛋白的序列在專利申請WO96/38567中有所描述。
本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的克隆或表達(dá)載體，至少含有一種上述嵌合基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明的載體除含有上述嵌合基因外，至少還含有一個復(fù)制起始點(diǎn)。該載體可由通過引入本發(fā)明嵌合基因而被轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒組成，轉(zhuǎn)化單子葉植物和植物細(xì)胞的這些載體是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的，文獻(xiàn)中也有大量描述。本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞的載體優(yōu)選質(zhì)粒。
本發(fā)明又一主題是通過整合至少一個上述核酸片段或嵌合基因來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，用本發(fā)明的載體通過任何適宜的已知方法可以得到這種轉(zhuǎn)化。
所述方法包括用附著有DNA序列的顆粒轟擊細(xì)胞或細(xì)胞組織。另一種方法是采用插入到根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒中或發(fā)根土壤桿菌的Ru質(zhì)粒中的嵌合基因轉(zhuǎn)移到植物中。其它方法包括顯微注射、電穿孔，PEG直接沉淀法等。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人可根據(jù)植物或植物細(xì)胞性質(zhì)選擇合適的方法。
本發(fā)明又一主題是被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物，它們含有至少一種上述本發(fā)明的嵌合基因。
本發(fā)明還包括含有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的植株，特別是由轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生而成的植株。可依據(jù)植物種類和性質(zhì)采用合適方法可以得到這種再生。
對單子葉植物再生和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，可具體參考Gordon-Kamm，W.J.等(玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)化和能育轉(zhuǎn)基因植物再生，The Plant Cell，第2卷，603-618，1990年7月)，以及以下專利和專利申請US5177010，US5187073，EP267159，EP604622，EP672752，US4945050，US5036006，US5100792，US5371014，US5478744，US5484956，US5508468，US5538877，US5554798，US5489520，US5510318，US204253，US5405765，EP442，174，EP486233，EP486234，EP539563，EP674725，WO91/02071和WO95/06128。
本發(fā)明還涉及由上述轉(zhuǎn)化植物和轉(zhuǎn)化植物的種子培養(yǎng)和/或雜交而得的轉(zhuǎn)化植物。
當(dāng)本發(fā)明的嵌合基因含有編碼耐特殊除草劑的酶的序列時，本發(fā)明還涉及在所述嵌合基因所轉(zhuǎn)化植物或種子種植所在區(qū)域控制雜草的方法，該方法是向所述區(qū)域施用對所述雜草有毒的除草劑，但基本不影響用所述本發(fā)明嵌合基因轉(zhuǎn)化的植物或種子，所述嵌合基因中含有編碼耐這種除草劑酶的序列。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明嵌合基因轉(zhuǎn)化的植物的培養(yǎng)方法，該嵌合基因含有編碼耐特定除草劑的酶的序列。培養(yǎng)方法是在適合種植所述植物的田中播種所述轉(zhuǎn)化植物的種子，在這塊田中，當(dāng)有野草存在時，施用對野草由毒的所述特定除草劑，當(dāng)達(dá)到要求的成熟度時收獲所培養(yǎng)的植物，并任選地，從收獲的植物中分離出種子。
在上述兩種方法中，可在播種前，種植物出苗前和出苗后施用本發(fā)明所述特定除草劑。
較好的是，耐除草劑的酶為一種合適的EPSPS，此時除草劑是草甘膦或其鹽；或酶為HPPD，除草劑則選自異噁唑類，特別是isoxafutole，二酮腈或三酮，特別是sulcotrione。
下列實施例闡明本發(fā)明而不限制本發(fā)明范圍。
1.構(gòu)建帶有HPPD編碼序列的嵌合基因制備下列質(zhì)粒以構(gòu)建一個表達(dá)盒，它包括與水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)(ActI)含子5’端非翻譯區(qū)組合的玉米H3C4組蛋白啟動子，ActI的描述見McElroy D等、植物分子生物學(xué)15257-268.1990，它指導(dǎo)了熒光假單胞菌OTP-HPPD基因的表達(dá)。
pRPA-RD-195質(zhì)粒pRPA-RD-195由質(zhì)粒pUC-19衍生而來，含一個修飾多克隆位點(diǎn)。以下互補(bǔ)寡核苷酸1和2在65℃雜交5分鐘，隨后經(jīng)30分鐘緩慢冷卻至30℃Oligo 4:5'AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTACCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'Oligo 5:5'CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGCAGGTCGACTC TAGGG3'用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段在制造商推薦的標(biāo)準(zhǔn)條件下延伸各寡核苷酸3’端，使雜交的寡核苷酸成為雙鏈。將得到的雙鏈寡核苷酸連結(jié)到預(yù)先用限制性內(nèi)切酶EcoRl和HindⅢ消化的pUC-19質(zhì)粒中，用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段使其成為鈍端。如此得到一個克隆質(zhì)粒，它包含一個多克隆位點(diǎn)，故有助于引入表達(dá)盒到根癌土壤桿菌的質(zhì)粒載體中(

圖1)。
pRPA-RD-2010在質(zhì)粒pRPA-RD-159中插入pRPA-RD-159的“啟動子H4A748-OTP-雙突變EPSPS基因”。
質(zhì)粒pRPA-RD-195用限制性內(nèi)切酶SacⅠ消化，用牛小腸堿性磷酸酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化。質(zhì)粒pRPA-RD-173(在專利FR2736926中有描述)用限制必酶SacⅠ消化，并純化含有EPSPS基因的DNA片段，連接到以上制備的質(zhì)粒pRPA-RD-195中，得到的克隆含有幾個獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)，位于該雙突變的EPSPS基因的兩側(cè)。
pRPA-RD-1002構(gòu)建一個OTP-HPPD表達(dá)盒用于單子葉植物。質(zhì)粒pRP-P含有連接熒光假單胞菌HPPD優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(OTP)，其后為胭脂氨酸合成酶的聚腺苷酸化位點(diǎn)，如WO96/38567專利申請中所述。質(zhì)粒pRP-P的組成如下-優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(OTP)，見專利US5510471和US5633448中所述；該OTP由171bp的Helianthus annuus的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽構(gòu)成(Waksman G等1987核酸研究157181)，后面是66bp的Zea masy的酮糖-1，5-二磷酸羧化酶成熟部分/氧化酶小亞基(Lebran等1987核酸研究154360)，其后是150bp的Zea mays核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶/小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽，故以上組合總共是387bp。
-編碼熒光假單胞菌HPPD的區(qū)域，參見專利申請WO96/38567，和-胭脂氨酸合成酶(nos)終止子基因(分離自pTi 37的nos基因的聚腺苷酸化區(qū)，250bp，Bevan M等，核酸研究11.369-385)。
質(zhì)粒pRP-P用限制性酶BstEll消化，再用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段處理成鈍端，再用限制性酶NcoI消化。純化得到含有約1.5kb的OTP-HPPD編碼序列的DNA片段。前面得到的質(zhì)粒pRPA-RD-2010用限制性酶BlpI消化，隨后用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段處理，以得到鈍端片段，再用限制性酶NcoI消化。純化所得DNA片段，它包含質(zhì)粒載體的序列，即與5’非翻譯區(qū)和水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)含子組合的啟動子H3C4，并純化NOS聚腺苷酸化位點(diǎn)。將兩個純化片段連結(jié)以產(chǎn)生OTP-HPPD表達(dá)盒，它包含了玉米H3C4組蛋白啟動子，與5’端外翻譯區(qū)和水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)含子組合(Actl 5’UTR+內(nèi)含子1)，控制結(jié)合了NOS聚腺苷酸化位點(diǎn)的OTP-HPPD編碼區(qū)的表達(dá)。
2.構(gòu)建帶有編碼雙突變體EPSPS序列的嵌合基因。
pRPA-RD-1010構(gòu)建OTP-雙突變EPSPS表達(dá)盒用于單子葉植物。
質(zhì)粒pRPA-RD-109含有大腸桿菌β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，該基因受與Mc Elroy D描述(植物分子生物學(xué)(5257-268.1990)的水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)含子和5’端非翻譯區(qū)相組合的玉米H3C4組蛋白啟動子的控制。該質(zhì)粒模式圖見圖3。用限制性酶NcoI和EcoRI消化質(zhì)粒pRPA-RD-109，純化得到含有該載體序列、GUS基因，NOS聚腺苷酸化位點(diǎn)的大DNA片段(約5kb)。用限制性酶NcoI和EcoRI消化質(zhì)粒pRPA-RD-2010，純化得到含有與5’端非編碼區(qū)和水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)含子相組合的H3C4啟動子的DNA片段(約1.6kb)。連結(jié)此二個純化DNA片段，產(chǎn)生OTP-雙突變EPSPS表達(dá)盒，它包括與5’端非翻譯區(qū)和水稻肌動蛋白基因第一內(nèi)含子(ActI)組合的玉米H3C4組蛋白啟動子(Brignon等)，控制結(jié)合了NOS聚腺苷酸化位點(diǎn)的OTP-雙突變EPSP編碼區(qū)的表達(dá)。
3.構(gòu)建抗phosphinothricin基因(bar基因)的嵌合基因由bar基因編碼的phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)是一種能滅活除草劑phosphinothricin(PPT)的酶。PPT抑制谷氨酰胺合成，引起細(xì)胞內(nèi)氨的迅速堆積，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Tachibana等1986)。
用于引入耐受作為選擇劑的phosphinothricin的質(zhì)粒是通過將嵌合基因pDN 302插入從Promega公司購得的含有抗氨芐青霉素基因的2462pb載體pSP72(Genbank/DDBJ數(shù)據(jù)庫登錄號X65332)并而得到的。
質(zhì)粒pDM 302，4700bp，由CaoJ等Plant Cell Report 11586591.(1992)所描述。
該質(zhì)粒各的組分是-McElroy D(Plant Molecular Biology 15257-268 1990)描述的水稻肌動蛋白基因的啟動子，840bp-840 bp的水稻肌動蛋白基因第一外顯子-450 bp的水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子；-White J等(Nus.Acids Res.181862(1990)描述的從質(zhì)粒pIJ41404切下的600bp的bar基因編碼區(qū)；-胭脂氨酸合成酶(NOS)基因終止子，分離自質(zhì)粒pTi 37的NOS基因的聚腺苷酸化區(qū)域，250pb。(Bwvan M等核酸研究11369-385)4.玉米細(xì)胞的轉(zhuǎn)化用顆粒轟擊技術(shù)引入基因構(gòu)建物。根據(jù)Klein方法(Nature 32770-73，1987)在Qiagen柱上純化質(zhì)粒，然后共沉淀到鎢M10顆粒上。
將金屬顆粒，pRPA-RD-1002質(zhì)粒和上述實施例3中的質(zhì)?；旌希缓蟀凑誈ordon-Kamm WJ等(玉米細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和多產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的再生。The PlantCell第二卷603-618頁1990年7月)描述的方案，經(jīng)轟擊進(jìn)入玉米胚胎細(xì)胞。
5.基因和以bar基因作為選擇劑在草銨膦上選擇轟擊過的胼胝體，直到出現(xiàn)綠色的部分?？共蒌@膦的陽性胼胝體然后轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)體胚，然后根據(jù)Gordon-Kamm，WJ等所述的操作條件(ThePlant Cell第二卷603-618頁1990年7月)，將其置于有利于發(fā)芽的條件下。然后將幼植株移進(jìn)暖房以結(jié)籽。
6.分析轉(zhuǎn)化植物的后代上面所得轉(zhuǎn)化植物可算作部分轉(zhuǎn)基因植物，含有一個編碼OTP/HPPD的異源基因，使植物獲得耐異噁唑類(如isoxafutole)的特性。這些轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生花粉，使非轉(zhuǎn)基因野生玉米的胚珠受精。經(jīng)isoxaflutloe處理后在沙土上選擇所得的種子。
選擇方案如下將800ml Fontainebleau沙置于15×20cm盤中，澆水，加入每升水含5ml的Quinoligo(Quinoline)的營養(yǎng)液，維持濕潤度。每盤種20粒玉米種子，用isoxaflutole噴灑處理，劑量為每公頃100g活性物質(zhì)(每盤300μg)。然后收盤置于暖室中培養(yǎng)。栽培后測定植物毒性作用。按上述條件，非轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出100％植物毒性，而轉(zhuǎn)化植物不表現(xiàn)植物毒性。
進(jìn)行了一個比較性研究，采用20行本發(fā)明轉(zhuǎn)化的玉米和20行用相應(yīng)基因(其中編碼水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子的序列被編碼玉米adh I內(nèi)含子的序列替代)轉(zhuǎn)化的玉米。用很大劑量即每公頃200g活性物質(zhì)(600μg活性物質(zhì)/盤)isoxafutole處理后，得到如下結(jié)果本發(fā)明水稻肌動蛋白內(nèi)含子8/20行耐受玉米adh I內(nèi)含子 3/20行耐受與用本領(lǐng)域所知其它內(nèi)含子與同一玉米H3C4啟動子組合相比，以上結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化的單子葉植物中，本發(fā)明玉米H3C4啟動子與水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子的組合可顯著增加感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)。
序列表(ⅲ)序列數(shù)5(2)I SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1021堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/編碼玉米H3C4啟動子(B)位置1..1021(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1CTTATGTGCA CCATTTACTG TAATGCATAA TCATTTAATT GAATAGCAAA CTTTTCTATT 60ACTTCTTTAC TAACATAATT CTTGGTTTTA AAATTCAGTC CTCAACATTC ATTGCTCAAG 120TATAAGTTGA GACTGTCAAA ATTTACTATT TTATTTCTTC ATATTTTTTT TCCTTATACA 180CATTTTGGGC CTTACAATCC ATCATCTATA TCCATCCTTT CCGGTGTCCT CTAAAAGATT 240CCATCCTCTG AATCTTATTC CTCTCCAATA ACGTTCTCTA AATCAGGTCT CTATAAGCAA 300TACCTATATT AGAGACATTT TTTATTTTTT GTACATACAT ATTTGTCATA CTCTCAAATG 360CATTATACAT ATTTAGTTTT ACTAAACCGA TTATTTAAAG TATTCAAACG GATGAAGAAC 420TGTTTAGATA AATTCTATAT ATAGAGAATC CAGTAGCGTT CTCTAAATTT AGATGATTAT 480TTAGAGGACG CTGTTAGAAA ACGTAAAAAA TTCTTTGATT ATTTATATTT AGGGTAGAGT 540AGCCTTTATG CTTTATAGAT CTTTGGTGGA CCCAGCCTTA TACCGGTTAT TTTCGCGATT 600GCGCCTCTCA TTTTCACTCC AGCGCCCCAC ATTTTCACGT TTTCACCGAA GCGCCCAGCC 660TGCCTAACCA ACAAATTGGT ACGGTGGCGC GGTTTTCAAA AGAAGTCGGA AACCATCTGC 720ACCCACCGAC TAGTAGGCCC TCGGATCCTC CCTGATTAAG TCCTAGCCAA TAGGAGCCCA 780GAACCACCCA TCACGCGGAT CGTCCCTACG CTTCCACCTC ATCGGCGCCG TCCATCTCCA 840TCCAACACCT ATTCCGTTAC CTTGCCCATC CTCCGAAAAA ATTCTCGGCT CGCGCTCCGC 900ACCTACTACA AATACCCATC CCATCACGAC GCATCGCATC ACTGCCAAAT CCCCCAGAAA 960ATCAACACCT CCCAATTCCA CGCTGCCACC AACTCGCCGT CCTCCGCGCC AAGCACCAAA1020G1021(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度454堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/編碼水稻肌動蛋白內(nèi)含子1(B)位置1..454(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GTAACCACCC CGCCCCTCTC CTCTTTCTTT CTCCGTTTTT TTTTTCGTCT CGGTCTCGAT 60CTTTGGCCTT GGTAGTTTGG GTGGGCGAGA GCGGCTTCGT CGCCCAGATC GGTGCGCGGG120AGGGGCGGGA TCTCGCGGCT GGCGTCTCCG GGCGTGAGTC GGCCCGGATC CTCGCGGGGA180ATGGGGCTCT CGGATGTAGA TCTGATCCGC CGTTGTTGGG GGAGATGATG GGGCGTTTAA240AATTTCGCCA TGCTAAACAA GATCAGGAAG AGGGGAAAAG GGCACTATGG TTTATATTTT300TATATATTTC TGCTGCTGCT CGTCAGGCTT AGATGTGCTA GATCTTTCTT TCTTCTTTTT360GTGGGTAGAA TTTGAATCCC TCACCATTGT TCATCGGTAG TTTTTCTTTT CATGATTTGT420GACAAATGCA GCCTCGTGCG GAGCTTTTTT GTAG454(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1565堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特征
(A)名稱/編碼玉米H3C4啟動子(B)位置27..1047(ⅸ)特征(A)名稱/編碼水稻肌動蛋白內(nèi)含子1(B)位置1102..1555(ⅸ)特征(A)名稱/編碼合成克隆位點(diǎn)(B)位置1..26(ⅸ)特征(A)名稱/編碼合成結(jié)合序列(B)位置1048..1069(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3GAATTCCTGC AGGTCGACGG ATCCCCCTTA TGTGCACCAT TTACTGTAAT GCATAATCAT60TTAATTGAAT AGCAAACTTT TCTATTACTT CTTTACTAAC ATAATTCTTG GTTTTAAAAT 120TCAGTCCTCA ACATTCATTG CTCAAGTATA AGTTGAGACT GTCAAAATTT ACTATTTTAT 180TTCTTCATAT TTTTTTTCCT TATACACATT TTGGGCCTTA CAATCCATCA TCTATATCCA 240TCCTTTCCGG TGTCCTCTAA AAGATTCCAT CCTCTGAATC TTATTCCTCT CCAATAACGT 300TCTCTAAATC AGGTCTCTAT AAGCAATACC ATATTTAGAG ACATTTTTTA TTTTTTGTAC 360ATACATATTT GTCATACTCT CAAATGCATT ATACATATTT AGTTTTACTA AACCGATTAT 420TTAAAGTATT CAAACGGATG AAGAACTGTT TAGAAAAATT CTATATATAG AGAATCCAGT 480AGCGTTCTCT AAATTTAGAT GATTATTTAG AGGACGCTGT TAGAAAACGT AAAAAATTCT 540TTGATTATTT ATATTTAGGG TAGGGTAGCC TTTATGCTTT ATAGATCTTT GGTGGACCCA 600GCCTTATACC GGTTATTTTC GCGATTGCGC CTCTCATTTT CACTCCAGCG CCCCACATTT 660TCACGTTTTC ACCGAAGCGC CCAGCCTGCC TAACCAACAA ATTGGTACGG TGGCGCGGTT 720TTCAAAAGAA GTCGGAAACC ATCTGCACCC ACCGACTATT AGGCCCTCGG ATCCTCCCTG 780ATTAAGTCCT AGCCAATAGG AGCCCAGAAC CACCCATCAC GCGGATCGTC CCTACGCTTC 840CACCTCATCG GCGCCGTCCA TCTCCATCCA ACACCTATTC CGTTACCTTG CCCATCCTCC 900GAAAAAATTC TCGGCTCGCG CTCCGCACCT ACTACAAATA CCCATCCCAT CACGACGCAT 960CGCATCACTG CCAAATCCCC CAGAAAATCA ACACCTCCCA ATTCCACGCT GCCACCAACT 1020CGCCGTCCTC CGCGCCAAGC ACCAAAGGAA TTGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCTCCCC 1080CCTCCCCCTC CGCCGCCGCC GGTAACCACC CCGCCCCTCT CCTCTTTCTT TCTCCGTTTT 1140TTTTTTCGTC TCGGTCTCGA TCTTTGGCCT TGGTAGTTTG GGTGGGCGAG AGCGGCTTCG 1200TCGCCCAGAT CGGTGCGCGG GAGGGGCGGG ATCTCGCGGC TGGCGTCTCC GGGCGTGAGT 1260CGGCCCGGAT CCTCGCGGGG AATGGGGCTC TCGGATGTAG ATCTGATCCG CCGTTGTTGG 1320GGGAGATGAT GGGGCGTTTA AAATTTCGCC ATGCTAAACA AGATCAGGAA GAGGGGAAAA 1380GGGCACTATG GTTTATATTT TTATATATTT CTGCTGCTGC TCGTCAGGCT TAGATGTGCT 1440AGATCTTTCT TTCTTCTTTT TGTGGGTAGA ATTTGAATCC CTCAGCATTG TTCATCGGTA 1500GTTTTTCTTT TCATGATTTG TGACAAATGC AGCCTCGTGC GGAGCTTTTT TGTAGGTAGA 1560CC ATG 1565(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度85堿基對(B)類型合成寡核苷酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC60CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 85(2)SEQ ID NO5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度66堿基對(B)類型合成寡核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60TAGAGG 6權(quán)利要求
1．一段DNA序列，是使異源性基因在單子順植物的植物細(xì)胞中得以表達(dá)的5’端調(diào)節(jié)元件，其特征在于，在轉(zhuǎn)錄方向上包含的第一DNA序列即玉米H3C4啟動子序列的功能片段；第二DNA序列即水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子序列的功能片段。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于，所述玉米H3C4啟動子序列為玉米H3C4啟動子的AluI片段。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列，其特征在于，所述玉米H3C4啟動子序列的功能片段包括SEQ ID NOI所述的DNA序列或其同源序列。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的序列，其特征在于，所述玉米H3C4啟動子序列的功能片段由SEQ ID NOI所述的DNA序列構(gòu)成。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的序列，其特征在于，所述水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子的功能片段包含SEQ ID NO2所述的DNA序列或其同源序列。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的序列，其特征在于，所述水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子的功能片段由SEQ ID NO2所述DNA序列組成。
7．根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項所述的序列，其特征在于，在所述第一DNA序列和第二DNA序列之間含有一段中性DNA片段。
8．一段DNA序列，是使異源性基因在單子葉植物的植物細(xì)胞中得以表達(dá)的5’端調(diào)節(jié)元件，其特征在于，包含SEQ ID NO3所表示的DNA序列或其同源序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA序列，其特征在于，由SEQ ID NO3所表示的DNA序列構(gòu)成。
10．一種嵌合基因，包括編碼序列以及能在單子葉植物細(xì)胞或單子葉植物中發(fā)揮功能的位于3’端或5’端的異源性調(diào)節(jié)元件，其特征在于，所述5’端的調(diào)節(jié)元件包含權(quán)利要求1到9中任一項所述的DNA序列。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，所述編碼序列選自編碼可選擇標(biāo)記的基因、能賦于被轉(zhuǎn)化單子葉植物新農(nóng)學(xué)特點(diǎn)的基因，能改良被轉(zhuǎn)化單子葉植物農(nóng)學(xué)品質(zhì)的基因。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的嵌合基因，其特征在于，所述編碼序列是可賦于被轉(zhuǎn)化單子葉植物新農(nóng)學(xué)特點(diǎn)的基因，該基因選自抗除草劑耐基因；抗殺蟲劑基因和抗病基因。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合基因，其特征在于，所述抗除草劑基因選自抗雙丙氨酰膦的Bar基因，編碼抗除EPSPS除草劑的EPSPS的基因，編碼草甘膦氧化還原酶的基因和編碼抗除HPPD除草劑的HPPD的基因。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的嵌合基因，其特征在于，所述抗除草劑基因選自編碼所述EPSPS的基因和編碼所述HPPD的基因。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的嵌合基因，其特征在于，所述編碼EPSPS的基因選自雙突變EPSPS和CP4。
16．根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的嵌合基因，其特征在于，所述編碼EPSPS或HPPD的序列前面有一段編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的嵌合基因，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽為優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
18．一種嵌合基因，在轉(zhuǎn)錄方向上包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的5’端調(diào)節(jié)序列，它功能性地連接編碼融合蛋白即轉(zhuǎn)運(yùn)肽/感興趣蛋白的序列，后者功能性地連接3’端調(diào)節(jié)序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求16所述的嵌合基因，其特征在于，所述感興趣的蛋白是權(quán)利要求13～15中任一項所述的抗除草劑的酶。
20．根據(jù)權(quán)利要求18所述的嵌合基因，其特征在于，所述編碼融合蛋白即轉(zhuǎn)運(yùn)肽/感興趣蛋白的序列選自編碼OTP/雙突變EPSPS融合蛋白的序列和編碼OTP/CP4融合蛋白的序列。
21．編碼OTP/CP4融合蛋白的DNA序列。
22．OTP/CP4融合蛋白。
23．一種嵌合基因，在轉(zhuǎn)錄方向上包含保證編碼序列在植物中表達(dá)的合適的5’端調(diào)節(jié)序列，它功能性地連接編碼融合蛋白OTP/CP4的序列，后者任選地連接3’端調(diào)節(jié)序列。
24．一種用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的克隆或表達(dá)載體，其特征在于，除了權(quán)利要求10～20或23中任一項所述的嵌合基因外，還包含至少一個復(fù)制起點(diǎn)。
25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的載體，其特征在于，該載體是一種質(zhì)粒。
26．一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，其特征在于，以權(quán)利要求10至20或23中任一項所述的嵌合基因進(jìn)行整合。
27．一種植物細(xì)胞，其特征在于，它至少包含一個權(quán)利要求10至20或23中任一項所述的嵌合基因。
28．一種轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，它含有權(quán)利要求27所述的細(xì)胞。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，它再生自權(quán)利要求27所述的細(xì)胞。
30．根據(jù)權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于，它由權(quán)利要求28和29所述的轉(zhuǎn)化植物的培養(yǎng)和/或雜交而衍生得到。
31．根據(jù)權(quán)利要求28至30任一項所述的轉(zhuǎn)化植物的種子。
32．控制區(qū)域內(nèi)雜草的方法，所述區(qū)域有被嵌合基因轉(zhuǎn)化的種籽和植物，該嵌合基因包含抗特定除草劑的酶的編碼序列，此方法包括向所述區(qū)域施用所述特定除草劑，該除草劑對所述雜草有毒，但基本上不影響所述嵌合基因所轉(zhuǎn)化的種籽和植物，所述嵌合基因為權(quán)利要求13至20或23中任一項所界定的。
33．培養(yǎng)被嵌合基因轉(zhuǎn)化的植物的方法，該嵌合基因包含一段序列編碼權(quán)利要求13至20或23中任一項所述的抗特定除草的酶，該法包括在適合培養(yǎng)所述植物的區(qū)域播種所述轉(zhuǎn)化植物的種子，并向所述區(qū)域施用所述特定除草劑，該除草劑對雜草有毒，但基本上不影響所述種子或所述轉(zhuǎn)化植物，然后當(dāng)植物到達(dá)希望的成熟度時，收割培養(yǎng)的植物，并任選地從收割的植物中把分離出種子。
34．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，特定除草劑的施用在播種前，植物出苗前和出苗后進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段DNA序列,即可使異源性基因在單子葉植物細(xì)胞中表達(dá)的5’端調(diào)節(jié)元件。其特征是在轉(zhuǎn)錄方向上,它包含的第一DNA序列即玉米H3C4啟動子的功能片段;第二DNA序列即水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子序列的功能片段。本發(fā)明還涉及包含所述DNA序列的嵌合基因及由所述基因轉(zhuǎn)化的植物。
文檔編號C07K19/00GK1284999SQ9881378
公開日2001年2月21日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月24日
發(fā)明者R·德羅塞, G·弗雷西內(nèi) 申請人:阿方蒂農(nóng)科股份有限公司