提取基因組DNA，但分離使用的凝膠由化學(xué)凝膠變更為物理凝膠，這一點(diǎn)與實(shí)施例1不同。
[0099]<物理凝膠的準(zhǔn)備>
在硅油(信越有機(jī)硅公司制KF-56)中，添加1%的12-羥基硬脂酸(和光純藥)作為凝膠劑，加熱至90°C，使其與硅油完全混和。然后，以將油的溫度下降至約60°C的狀態(tài)進(jìn)行保持。
[0100]<分離.提純用器件的制作>
在與實(shí)施例1同樣的聚丙烯管內(nèi)，從底部起依次裝填洗脫液150μ?、凝膠劑添加油20 μ L、第二清洗液150 μ L、凝膠劑添加油20 μ L、第一清洗液150 μ L、以及凝膠劑添加油20 μ L后，放冷至室溫，使油凝膠化。
[0101]< DNA的提取?分離操作>
使用裝填有上述物理凝膠的器件，通過(guò)與實(shí)施例1同樣的磁鐵操作，從人保存血進(jìn)行DNA的提取.分離操作。
[0102][實(shí)施例1與比較例1的對(duì)比]
通過(guò)分光光度計(jì)(島津制作所制“B1Specnano”)測(cè)定從實(shí)施例1以及比較例回收的洗脫液的UV吸收光譜。結(jié)果如圖5所示。
根據(jù)圖5可明確，使用了物理凝膠的比較例1中，220nm附近發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的吸收。這與細(xì)胞溶解液以及第一清洗液所含的胍鹽的吸收波長(zhǎng)一致。由此可知，比較例1中，試劑成分的除去不充分，DNA洗脫液的波長(zhǎng)260nm的吸光度與波長(zhǎng)280nm的吸光度之比(A2M/A2S。)為約1.4，DNA的純度較低。因此，將得到的DNA用于PCR等的反應(yīng)或其他分析時(shí)，上述雜質(zhì)可能會(huì)造成負(fù)面影響。
[0103]與此相對(duì)，使用了化學(xué)凝膠的實(shí)施例1中，沒(méi)有確認(rèn)到如比較例1般的在波長(zhǎng)220nm附近具有峰的吸收，明確確認(rèn)了 DNA在特異波長(zhǎng)260nm附近的吸收峰。實(shí)施例1的DNA洗脫液的A2M/A2S。為約1.7。從該結(jié)果可知，通過(guò)使用有機(jī)硅凝膠，可以提升B/F分離性，可以容易地高回收率地提取高純度的核酸。
[0104][實(shí)施例2]
實(shí)施例2中，使用磁珠，進(jìn)行酶免疫化學(xué)測(cè)定用試樣的調(diào)制。磁珠使用了蛋白G覆蓋磁性粒子(生命科技制，Dynabeads Protein G)。
[0105]<器件的制作>
為了在硼硅酸鹽玻璃制的毛細(xì)管(赫施曼實(shí)驗(yàn)室儀器制，ringcaps，200 yl)的管內(nèi)壁面涂覆有機(jī)硅，向管內(nèi)填充有機(jī)硅涂層劑(富士理化工制，硅化L-25溶液)，10分鐘后抽出液體。用蒸餾水清洗后，利用氮?dú)馐构軆?nèi)干燥。然后，將毛細(xì)管的一個(gè)末端的開口部用密封劑(cha-seal)堵住。從該毛細(xì)管的另一個(gè)開口部，從底部起依次裝填PBST溶液(0.02%Tween20含有磷酸緩沖食鹽水)60 μ L以及有機(jī)硅凝膠(KSG-15) 20 μ L。將其重復(fù)3次后，最后裝填PBST溶液40 μ L。為了防止氣泡混入管內(nèi)，以將毛細(xì)管垂直豎立的狀態(tài)裝填這些凝膠以及溶液。
[0106]<陽(yáng)性對(duì)照以及陰性對(duì)照的制作>
向分注有100 μ L的PBST的容量1.5 μ mL的聚丙烯管內(nèi)，添加3 μ L的磁珠懸濁液，用漩渦混合器使其懸濁。然后，進(jìn)行離心分離(1000rpm，5秒)，將管立在磁力座(生命科技公司制)上，靜置1分鐘后，除去上清液。然后，向管內(nèi)加入PBST 100mL，再次進(jìn)行懸濁、離心以及除去上清液。
[0107]接著，向管內(nèi)加入濃度調(diào)整為lOOpg/ μ L的AP (堿性磷酸酶)conjugateAnt1-Mouse IgG (Promega制)、以及1 %的BSA.PBS (含1 %牛血清白蛋白的磷酸緩沖食鹽水)溶液50 μ L，在管混合器上，室溫下孵化15分鐘，制成陽(yáng)性對(duì)照。此外，不加入ΑΡconjugate Ant1-Mouse IgG而僅加入了 BSA.PBS溶液的試劑制為陰性對(duì)照。
[0108]<分離操作>
從上述管狀器件的開口部，同時(shí)將上述的各對(duì)照液和磁珠投入器件內(nèi)，通過(guò)與實(shí)施例1同樣的磁性操作，向著器件的下端底部，以每秒0.5?5_的速度，使磁鐵沿著容器的側(cè)面移動(dòng)，操作磁珠。在各PBST溶液中，為了使磁珠分散在溶液中，重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的毛細(xì)管側(cè)面的磁鐵穿脫。最后，打開毛細(xì)管被cha-seal封閉的部分，將分散在PBST中的磁珠回收到管內(nèi)。
[0109]< ELISA 法分析 >
將操作后的裝有磁珠的管立到磁力座上，靜置1分鐘后，除去上清液，加入PNPP顯色試劑(賽默(Thermo)制)100 μ L，用漩渦混合器使得磁珠懸濁后，在管混合器上，室溫下進(jìn)行15分鐘堿性磷酸胸反應(yīng)。接著加入反應(yīng)停止劑(2Ν氫氧化鈉水溶液)50 μ L混合后，進(jìn)行離心(1000rpm，5秒)。將管立在磁力座上，靜置1分鐘后，抽取顯色反應(yīng)溶液50 μ L，用分光光度計(jì)(島津制作所制“B1Spec nano”)測(cè)定波長(zhǎng)405nm的吸光度。
[0110]陽(yáng)性對(duì)照(η = 3)的吸光度為9.297、9.254、9.311(平均9.287)，顯示出了與使用一般管的以往方法進(jìn)行B/F分離時(shí)(吸光度的平均值9.213)同樣的高值。另一方面，陰性對(duì)照(η = 2)的吸光度為0.314,0.329 (平均0.322)，是與以往方法進(jìn)行B/F分離時(shí)(吸光度的平均值0.331)同樣的低值。
[0111]實(shí)施例2的結(jié)果顯示，即使是固定了蛋白G的AP conjugate Goat ant1-Mouse IgG的粒子，在使其通過(guò)有機(jī)硅凝膠內(nèi)時(shí)，可以保持其固定狀態(tài)的同時(shí)進(jìn)行粒子操作，可以高效進(jìn)行B/F分離。此外，由于也不會(huì)產(chǎn)生來(lái)自凝膠的夾雜成分，因此可在極低的背景下進(jìn)行目標(biāo)成分的高靈敏度檢測(cè)。
[0112]從上述實(shí)施例1以及實(shí)施例2可以確認(rèn)，通過(guò)使得存在于一個(gè)水基液體內(nèi)的粒子通過(guò)化學(xué)凝膠而移動(dòng)至其他水基液體的操作，可以在不伴隨水基液體的情況下而僅僅使得粒子移動(dòng)，可以進(jìn)行B/F分離。此外可知，本發(fā)明中，可以在保持將目標(biāo)物質(zhì)固定于粒子的狀態(tài)下，不產(chǎn)生來(lái)自凝膠、水基液體的夾雜物的負(fù)面影響而進(jìn)行化學(xué)操作。另外，本發(fā)明的方法中，無(wú)須開閉容器，可以在1個(gè)器件內(nèi)密閉進(jìn)行多個(gè)化學(xué)操作，因此操作簡(jiǎn)便，還可以排除污染等的負(fù)面影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種粒子的操作方法，其特征在于，包括: 使存在于水基液體中的粒子被移動(dòng)至不溶或難溶于所述水基液體的凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟；以及 使存在于所述凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的所述粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)外部的步驟， 所述凝膠狀介質(zhì)是含有化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠。2.一種粒子的操作方法，其特征在于，包括: 使存在于水基液體中的粒子被移動(dòng)至不溶或難溶于所述水基液體的凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟；以及 使存在于所述凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的所述粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)外部的步驟， 所述凝膠狀介質(zhì)的稠度為340至475。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述凝膠狀介質(zhì)是含有化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的粒子的操作方法，其特征在于， 關(guān)于所述凝膠狀介質(zhì)，含有所述化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠是含有交聯(lián)型有機(jī)聚硅氧烷的有機(jī)硅凝膠。5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任意一項(xiàng)所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述凝膠狀介質(zhì)還含有油劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任意一項(xiàng)所述的粒子的操作方法，其特征在于， 在使所述粒子被從所述水基液體移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部時(shí)、以及使所述粒子在凝膠狀介質(zhì)內(nèi)被移動(dòng)時(shí)，附隨在所述粒子上的水基液體從所述粒子被分離。7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任意一項(xiàng)所述的粒子的操作方法，其特征在于， 在使所述粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)外部的步驟中，所述粒子被移動(dòng)至其他的水基液體中。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的粒子的操作方法，其特征在于， 在裝填有多個(gè)水基液體、各水基液體間隔著所述凝膠狀介質(zhì)的器件內(nèi)， 使存在于所述水基液體中的粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟、以及使存在于所述凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的粒子被移動(dòng)至其他水基液體中的步驟被多次進(jìn)行。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述多個(gè)水基液體中，至少有2個(gè)水基液體具有互不相同的組成。10.根據(jù)權(quán)利要求1?9中任意一項(xiàng)所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述粒子為磁性粒子，通過(guò)磁場(chǎng)的操作，進(jìn)行所述粒子的移動(dòng)。11.根據(jù)權(quán)利要求1?10中任意一項(xiàng)所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述粒子是可以選擇性地固定特定物質(zhì)的粒子。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的粒子的操作方法，其特征在于， 所述粒子可以選擇性地固定的物質(zhì)是從由核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂類、抗體、受體、抗原、配體以及細(xì)胞構(gòu)成的組中選擇的1個(gè)以上。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的粒子的操作方法，其特征在于， 在至少一個(gè)水基液體內(nèi)，進(jìn)行被所述粒子固定的核酸的洗脫。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的粒子的操作方法，其特征在于， 在至少一個(gè)水基液體內(nèi)，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。15.—種粒子操作器件，其特征在于，具有: 水基液體、在所述水基液體中為不溶性或難溶性的凝膠狀介質(zhì)、保持所述水基液體及所述凝膠狀介質(zhì)的容器、以及應(yīng)該在所述容器內(nèi)被移動(dòng)的粒子， 所述凝膠狀介質(zhì)是含有化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠。16.一種粒子操作器件，其特征在于，具有: 水基液體、在所述水基液體中為不溶性或難溶性的凝膠狀介質(zhì)、保持所述水基液體及所述凝膠狀介質(zhì)的容器、以及應(yīng)該在所述容器內(nèi)被移動(dòng)的粒子， 所述凝膠狀介質(zhì)的稠度為340至475。17.一種粒子操作器件制作用試劑盒，其是用于制作權(quán)利要求15或16所述的粒子操作用器件的試劑盒，所述粒子操作器件制作用試劑盒的特征在于， 含有水基液體、凝膠狀介質(zhì)以及粒子。
【專利摘要】本發(fā)明的粒子操作方法包括：使存在于水基液體中的粒子被移動(dòng)至不溶或難溶于所述水基液體的凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的步驟；以及存在于凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的粒子被移動(dòng)至凝膠狀介質(zhì)外部的步驟。凝膠狀介質(zhì)優(yōu)選為含有化學(xué)交聯(lián)聚合物的凝膠。此外，凝膠狀介質(zhì)的稠度優(yōu)選為340至475。一實(shí)施方式中，存在于水基液體中的粒子向凝膠狀介質(zhì)的移動(dòng)、以及凝膠狀介質(zhì)內(nèi)部的粒子向水基液體的移動(dòng)是在裝填有多個(gè)水基液體、各水基液體間隔著所述凝膠狀介質(zhì)的器件內(nèi)進(jìn)行的。
【IPC分類】C07K1/14, C12N1/00, B03C1/12, C12N15/09, G01N33/53, C12Q1/68, C07H21/04, B01J19/08
【公開號(hào)】CN105358688
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380077938
【發(fā)明人】大橋鐵雄, 小原收, 野中謙
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社島津制作所, 公益財(cái)團(tuán)法人上總Dna研究所
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2013年7月3日
【公告號(hào)】US20160201114, WO2015001629A1