一種纖花線紋香茶菜的有效成分檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法，該檢測方法包括采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色譜法的條件包括：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱；流動相：流動相A為甲醇，流動相B為0.1%（體積）的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：0~30min，流動相A為30%，流動相B為70%；30~70?min，流動相A為30%→50%，流動相B為70%→50%。該檢測方法通過高效液相色譜法成功地實(shí)現(xiàn)了對纖花線紋香茶菜中黃酮類和迷迭香酸有效成分含量的同時測定，能夠用來表征纖花線紋香茶菜的藥材質(zhì)量。
【專利說明】一種纖花線紋香茶菜的有效成分檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥材檢測領(lǐng)域，具體涉及一種纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖花線紋香茶菜屬唇形科香茶菜屬植物(Isodon lophanthoides (Buch.-Ham.ex D.Don) Hara var.graciliflora (Benth.) H.Hara),為中藥溪黃草的來源之一,其具有清熱利濕、退黃祛濕、涼血散瘀的功效，可以用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎等病癥，是我國南方地區(qū)治療乙型肝炎的常用草藥。目前，纖花線紋香茶菜雖然使用廣泛，但是查閱大量資料發(fā)現(xiàn)，《中國藥典》歷版均未收載?！稄V東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2011版和《廣西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載的纖花線紋香茶菜質(zhì)量鑒別主要是通過考察其性狀和薄層色譜法鑒別，單一依靠性狀和薄層鑒別難以確定纖花線紋香茶菜中有效成分的含量，辨別其質(zhì)量優(yōu)劣，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)纖花線紋香茶菜有效成分的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種纖花線紋香茶菜的有效成分檢測方法，該檢測方法是通過高效液相色譜法成功地實(shí)現(xiàn)了對纖花線紋香茶菜中黃酮類和迷迭香酸有效成分含量的同時測定，能夠用來表征纖花線紋香茶菜的藥材質(zhì)量。
[0004]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0005]一種纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法，該檢測方法包括采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色譜法的條件包括:
[0006]色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱；
[0007]流動相:流動相A為甲醇，流動相B為0.1% (體積)的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0008]所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比:
[0009](T30min，流動相A為30%，流動相B為70% ；
[0010]30?70 min,流動相 A 為 30% — 50%,流動相 B 為 70% — 50%。
[0011]優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件還包括:
[0012]流動相流速:0.5?1.5 ml/min ;優(yōu)選為 lml/min ；
[0013]色譜柱柱溫:15?40°C ;優(yōu)選為15?35°C ；
[0014]紫外檢測波長:20(T400nm ;優(yōu)選為270nm。
[0015]優(yōu)選地，在上述檢測方法中，上述高效液相色譜法的供試品溶液按照以下步驟來制備:
[0016]取纖花線紋香茶菜lg，置于IOOml錐形瓶，加入提取溶劑25ml，超聲提取30min，冷卻，定容，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μ m的微孔濾膜即得；
[0017]優(yōu)選地，所述提取溶劑選自70% (體積)甲醇水溶液、50% (體積)甲醇水溶液或無水甲醇。
[0018]優(yōu)選地，在上述檢測方法中，上述高效液相色譜法的對照品溶液按照以下步驟來制備:
[0019]取異夏佛塔苷對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；
[0020]取夏佛塔苷對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；
[0021]取迷迭香酸對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液。
[0022]具體而言，上述纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法包括以下步驟:
[0023]I)制備供試品溶液:
[0024]取纖花線紋香茶菜lg，置于IOOml錐形瓶，加入提取溶劑25ml，超聲提取30min，冷卻，定容，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μ m的微孔濾膜即得；
[0025]優(yōu)選地，所述提取溶劑選自70% (體積)甲醇水溶液、50% (體積)甲醇水溶液或無水甲醇。
[0026]2)制備對照品溶液:
[0027]取異夏佛塔苷對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；
[0028]取夏佛塔苷對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；
[0029]取迷迭香酸對照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液；
[0030]3)采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中黃酮類化合物和迷迭香酸的含量:
[0031]精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，所述高效液相色譜法的條件包括:
[0032]色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱；
[0033]流動相:流動相A為甲醇，流動相B為0.1% (體積)的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0034]所述梯度洗脫程序按如下，其中流動相的比例均為體積百分比:
[0035](T30min，流動相A為30%，流動相B為70% ；
[0036]30?70 min,流動相 A 為 30% — 50%,流動相 B 為 70% — 50%。
[0037]流動相流速:0.5?1.5 ml/min ;優(yōu)選為 lml/min ；
[0038]色譜柱柱溫:15?40°C ;優(yōu)選為15?35°C ；
[0039]紫外檢測波長:20(T400nm ;優(yōu)選為270nm。
[0040]本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，將黃酮類成分(即異夏佛塔苷和夏佛塔苷)和迷迭香酸確定為纖花線紋香茶菜中有效成分的檢測指標(biāo)，其中黃酮類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒和護(hù)肝等作用，迷迭香酸有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎作用。本發(fā)明進(jìn)而建立了一種有效檢測纖花線紋香茶菜中黃酮類成分和迷迭香酸的含量高效液相色譜法，該方法簡單、準(zhǔn)確，可以根據(jù)有效成分含量的測定結(jié)果反映出纖花線紋香茶菜藥材的功效。[0041]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法具有以下積極效果:
[0042](I)本發(fā)明將其含量測定的指標(biāo)選定為穩(wěn)定可控的黃酮類成分和迷迭香酸，而黃酮類成分和迷迭香酸為纖花線紋香茶菜中有代表性的主要成分，其含量高、性質(zhì)穩(wěn)定，作為標(biāo)示性成分控制纖花線紋香茶菜質(zhì)量具有較好的專屬性和質(zhì)量相關(guān)性；
[0043](2)相對于紫外分光光度法、薄層掃描法等而言，本發(fā)明的高效液相色譜法具有分辨率高、靈敏性高、重現(xiàn)性好、選擇性好，結(jié)果誤差小等優(yōu)點(diǎn)；
[0044](3)本發(fā)明的檢測方法對樣品的預(yù)處理快速，方便、易操作；
[0045](4)本發(fā)明的檢測方法實(shí)現(xiàn)了對纖花線紋香茶菜中黃酮類和迷迭香酸的定性、定量分析，填補(bǔ)了纖花線紋香茶菜的有效成分分析方面的研究空白；
[0046](5)不同的色譜條件、不同的處理方法對于藥材有效成分的檢測結(jié)果會有很大影響，本發(fā)明經(jīng)篩選優(yōu)選獲得的高效液相色譜法檢測條件和步驟可以準(zhǔn)確、簡便地測定纖花線紋香茶菜中異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0048]圖1為異夏佛塔苷對照品HPLC色譜圖；
[0049]圖2為夏佛塔苷和迷迭香酸對照品HPLC色譜圖；
[0050]圖3為實(shí)施例3第(I)項(xiàng)所示梯度洗脫條件下的供試品HPLC色譜圖；
[0051]圖4為實(shí)施例3第(2)項(xiàng)所示梯度洗脫條件下的供試品HPLC色譜圖；
[0052]圖5為實(shí)施例3第(3)項(xiàng)所示梯度洗脫條件下的供試品HPLC色譜圖；
[0053]圖6為等度洗脫供試品HPLC色譜圖；
[0054]圖7為異夏佛塔苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0055]圖8為夏佛塔苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0056]圖9為迷迭香酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0057]以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0058]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
[0059]以下各實(shí)施例中所使用的對照品來源如下:
[0060]異夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥ 98% ；
[0061]其它儀器及試劑:
[0062]采用Waters 2695-2996高效液相色譜系統(tǒng),包括:Empower工作站(Waters公司)，Dikma C18 (4.6 mmX 250 mm, 5 μ m)色譜柱，電子天平。
[0063]纖花線紋香茶菜全草來自廣州白云山和記黃埔中藥有限公司種植基地；
[0064]乙腈為色譜純，甲醇為分析純，磷酸為分析純，水為蒸懼水。[0065]實(shí)施例1
[0066]采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中的異夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸
含量:
[0067]I)制備對照品溶液:
[0068]精密稱取異夏佛塔苷對照品10mg，置于100mL容量瓶中，加入少量70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容至刻度，搖勻，配置成濃度為0.15mg/ml的異夏佛塔苷對照品溶液，并于4°C冰箱存放備用。
[0069]同法制得夏佛塔苷和迷迭香酸對照品溶液。
[0070]2)制備供試品溶液:
[0071]取纖花線紋香茶菜藥材lg，精密稱定，置于100mL錐形瓶，精密加入70% (體積)甲醇水溶液25ml，稱定重量，超聲提取30min，冷卻后，加70% (體積)甲醇水溶液補(bǔ)足重量，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μ m的微孔濾膜，并于4°C冰箱存放備用。
[0072]3)測定:精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，見圖1、圖2、圖5 ；
[0073]所述高效液相色譜法的條件包括:
[0074]色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱；
[0075]流動相:流動相A為甲醇，流動相B為0.1% (體積)的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0076]梯度洗脫程序按如下，其中流動相比例均為體積百分比:
[0077](T30min，流動相A為30%，流動相B為70% ；
[0078]30~70 min,流動相 A 為 30% — 50%,流動相 B 為 70% — 50%。
[0079]流動相流速:lml/min ;
[0080]流動相柱溫:15~35°C
[0081]紫外測定波長:270nm。
[0082]實(shí)施例2
[0083]本發(fā)明纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法的方法學(xué)考察:
[0084](I)線性關(guān)系
[0085]采用和實(shí)施例1相同的操作步驟和條件，分別精密量取異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸對照品溶液適量，進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量對色譜峰面積積分值進(jìn)行線性回歸處理，得異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的回歸直線方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表1，結(jié)果表明三者在相應(yīng)的范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，見圖7、圖8、圖9。
[0086]表1:線性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法，該檢測方法包括采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中異夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色譜法的條件包括: 色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱； 流動相:流動相A為甲醇，流動相B為0.1% (體積)的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫； 所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比: 0~30min，流動相A為30%,流動相B為70% ； 30~70 min,流動相A為30% — 50%,流動相B為70% — 50%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的條件還包括: 流動相流速:0.5"?.5 ml/min ;優(yōu)選為lml/min ； 色譜柱柱溫:15~40°C ;優(yōu)選為15~35°C ； 紫外檢測波長:20(T400nm ;優(yōu)選為270nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的供試品溶液按照以下步驟來制備: 取纖花線紋香茶菜lg，置于100ml錐形瓶,加入提取溶劑25ml,超聲提取30min,冷卻，定容，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μ m的微孔濾膜即得； 優(yōu)選地，所述提取溶劑選自70% (體積)甲醇水溶液、50% (體積)甲醇水溶液或無水甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的對照品溶液按照以下步驟來制備: 取異夏佛塔苷對照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液； 取夏佛塔苷對照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液； 取迷迭香酸對照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于，所述纖花線紋香茶菜有效成分的檢測方法包括以下步驟: 1)制備供試品溶液: 取纖花線紋香茶菜lg，置于100ml錐形瓶,加入提取溶劑25ml,超聲提取30min,冷卻，定容，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μ m的微孔濾膜即得； 優(yōu)選地，所述提取溶劑選自70% (體積)甲醇水溶液、50% (體積)甲醇水溶液或無水甲醇； 2)制備對照品溶液: 取異夏佛塔苷對照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液； 取夏佛塔苷對照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液； 取迷迭香酸對照品10mg ，置于100ml容量瓶中，加入70% (體積)甲醇水溶液溶解，定容，制成濃度為0.15mg/ml的溶液，作為對照品溶液； 3)采用高效液相色譜法測定纖花線紋香茶菜中黃酮類化合物和迷迭香酸的含量: 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，所述高效液相色譜法的條件包括: 色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑C18反相色譜柱； 流動相:流動相A為甲醇，流動相B為0.1% (體積)的磷酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫； 所述梯度洗脫程序按如下，其中流動相的比例均為體積百分比: 0~30min，流動相A為30%,流動相B為70% ； 30~70 min,流動相A為30% — 50%,流動相B為70% — 50% ； 流動相流速:0.5"!.5 ml/min;優(yōu)選為lml/min ; 色譜柱柱溫:15~40°C ;優(yōu)選為15~35°C ； 紫外檢測波長:20(T400nm·;優(yōu)選為270nm。
【文檔編號】G01N30/02GK103852526SQ201210506796
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月30日
【發(fā)明者】匡艷輝, 林青, 黃琳, 姚小華, 王德勤 申請人:廣州白云山和記黃埔中藥有限公司