專利名稱：抑制血液凝固的抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎人類組織因子抗體，以及使用該抗體來抑制組織因子相關(guān)功能，例如血液凝固、血管新生、腫瘤轉(zhuǎn)移、及發(fā)炎。本發(fā)明特別涉及新穎抗體，該抗體可以高度親和力特異性結(jié)合天然人類組織因子，且防止第十因子(因子X)或第九因子(因子IX)的結(jié)合與活化。本發(fā)明抗體可用于多項(xiàng)應(yīng)用用途，特別是用于體內(nèi)減少血液凝固。
背景技術(shù)：
血液凝固可輔助止血，減少血液的流失。通常血液凝固需要有血管損傷、血小板凝集、凝血因子活化、及纖維蛋白的分解受抑制。凝血因子是通過一個(gè)級聯(lián)作用，該級聯(lián)涉及由血管損傷至血塊形成(概略參考L.Stryer，生物化學(xué)，第3版，渥華福曼(W.H.Freeman)公司，紐約及A.G.Gilman等人，治療學(xué)的藥理基礎(chǔ)第8版，麥克羅希爾(McGraw Hill)公司，紐約1311-1331頁)。
一般認(rèn)同因子X(FX)活化成為因子Xa(FXa)(或因子IX活化成為因子IXa)是血液凝固過程的關(guān)鍵步驟。通常FX(或FIX)系通過結(jié)合至包括組織因子(TF)的催化活性復(fù)合物而被轉(zhuǎn)成FXa(或FIXa)。TF是一種以控制方式表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)，TF結(jié)合因子VII/VIIa來產(chǎn)生催化活性復(fù)合物。于FXa媒介的(或FIXa媒介的)凝血酶原活化后出現(xiàn)血凝塊。通過將TF失活成為非天然形式，非天然形式無法最佳地產(chǎn)生TFFVIIa復(fù)合物，可最小化凝血。透過形成FXa(或FIXa)的凝血級聯(lián)的過度活化，相信會(huì)促成多種血栓，包括血管再狹窄。
血栓與侵入性醫(yī)療手術(shù)有關(guān)，侵入性醫(yī)療手術(shù)例如心臟手術(shù)(例如血管成形術(shù))、腹胸手術(shù)、動(dòng)脈手術(shù)、周邊血管繞道移植手術(shù)、移植物(例如血管支架或?qū)Ч?置放手術(shù)或動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)。此外，血栓可能伴隨著造成多種血栓栓塞疾病及凝血病變，例如中風(fēng)、肺栓塞(例如帶有栓塞的心房纖維震顫、心血管病或急性冠狀癥候群(例如不穩(wěn)定性心絞痛或心肌梗塞)、動(dòng)脈粥狀硬化或其它血栓梗阻病、深部靜脈血栓及彌漫性血管內(nèi)凝血。操縱體液也導(dǎo)致形成非期望的栓子，特別于輸血或體液采樣，以及設(shè)計(jì)體外循環(huán)的手術(shù)(例如心肺繞道手術(shù))及腎臟透析也導(dǎo)致形成栓子。
抗凝血?jiǎng)┏Ｓ脕砭徍突虮苊馀c血栓關(guān)聯(lián)的血塊。通過投予適當(dāng)抗凝血?jiǎng)┗蚱浠旌衔锟勺钚』蛳?，抗凝血?jiǎng)┌ㄏ愣顾匮苌?例如殺鼠靈(warfarin)、卡馬丁(Coumadin)或代卡馬洛(dicumarol)或帶電聚合物(例如肝素、低分子量肝素、水蛭素或類水蛭素(hirulog))或抗血小板劑(例如李歐波(ReoPro)、英特革林(Integrilin)、亞各司特(Aggrestat)、普拉威(Plavix)、提克里(Ticlid)或阿司匹林(aspirin))。參考Gilman等人，參見上文；R.J.Beigering等人，血液學(xué)年報(bào)，72177(1996)；J.D.Willerson，循環(huán)，94866(1996)。
但使用抗凝血?jiǎng)┙?jīng)常帶來副作用，例如出血、血管再梗阻、「白血塊」癥候群、刺激感、先天缺陷、血小板減少癥、及肝功能不良。長期投予抗凝血?jiǎng)┨貏e會(huì)提高致命性疾病的風(fēng)險(xiǎn)(例如參考Gilman等人，參見上文)。
若干具有抗血小板活性的抗體也可用來緩和各種血栓。例如李歐波是一種治療性抗體片段，李歐波例行性給藥來緩和多種血栓栓塞病，例如因血管成形術(shù)、心肌梗塞、不穩(wěn)定性心絞痛及冠狀動(dòng)脈狹窄等所引起的血栓栓塞病。此外，李歐波可用作為預(yù)防用藥，來降低心肌梗塞及心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)(J.T.Willerson，循環(huán)，94866(1996)；M.L.Simmons等人，循環(huán)，89596(1994))。
也已知若干抗凝血抗體。特別曾經(jīng)報(bào)告某些TF結(jié)合抗體可抑制血液凝固，推定TF結(jié)合抗體系通過干擾催化活性TFFVIIa復(fù)合物的組裝來抑制凝血(例如參考Jeske等人，SEM于血栓及血液，22213(1996)；Ragni等人，循環(huán)，931913(1996)；歐洲專利第0 420 937 B1號；W.Ruf等人，Throm.Haemosp，66529(1991)；M.M.Fiorie等人，血液，83127(1992))。
但目前的TF結(jié)合抗體有顯著缺點(diǎn)，因而不適合用作為抗凝血?jiǎng)＠缒壳癟F結(jié)合抗體不具有顯著結(jié)合親和力來獲得最佳抗凝血活性。因此對于多種血栓疾病，為了彌補(bǔ)TF結(jié)合抗體的此種結(jié)合親和力不足，必需投予無法接受的高劑量抗體來最小化血液的凝固。
如此希望有一種抗凝血抗體，其以高度親和力及選擇性結(jié)合天然人類TF，因而抑制非期望的血液凝固、及血塊的生成。進(jìn)一步希望有一種抗凝血抗體，其可防止因子X(或因子IX)與TFFVIIa復(fù)合物的結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)抗體通過以高度親和力及特異性結(jié)合天然人類TF而提供優(yōu)異抗凝血活性。本發(fā)明的抗體可于體內(nèi)有效抑制血液凝固。本發(fā)明抗體可單獨(dú)或呈TFFVIIa復(fù)合物形式結(jié)合天然人類TF，有效防止因子X(或因子IX)結(jié)合至TF或該復(fù)合物，因而減少血液的凝固。
優(yōu)選本發(fā)明的抗體為單克隆抗體，特異性結(jié)合天然人類TF的主要構(gòu)象抗原決定簇(conformational epitope)，該抗原決定簇提供意想不到的強(qiáng)力抗原決定簇。確實(shí)，本發(fā)明的優(yōu)選抗體可以比先前技術(shù)抗凝血抗體所具有的結(jié)合親和力，高至少約5倍，更典型高至少約10倍的結(jié)合親和力而結(jié)合至天然人類TF。此外，優(yōu)選本發(fā)明抗體對天然人類TF具有選擇性，實(shí)質(zhì)上不會(huì)結(jié)合至非天然TF或變性TF。H36.D2.B7(融合瘤ATCC HB-12255所分泌，通稱為H36)乃本發(fā)明的特佳抗體。
優(yōu)選本發(fā)明抗體結(jié)合TF，讓FX(或FIX)無法有效結(jié)合至TFFVIIa復(fù)合物，因此FX(或FIX)不會(huì)被有效轉(zhuǎn)成其活性形式(FXa或FIXa)。優(yōu)選本發(fā)明抗體通過有效阻斷FX(或FIX)的結(jié)合TF分子或接近TF分子而抑制TF功能。例如參考后文實(shí)施例3的結(jié)果。
優(yōu)選本發(fā)明抗體不會(huì)顯著抑制TF與因子VIIa間的交互作用或結(jié)合，或不會(huì)顯著抑制TFFVIIa復(fù)合物對FX及FIX以外的材料的活性。例如參考后文實(shí)施例4的結(jié)果。
本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明抗體的核酸。H36.D2.B7的可變區(qū)的核酸序列及氨基酸序列(SEQ ID NOS1-4)顯示于附圖第1A及1B圖。
在優(yōu)選方面，本發(fā)明提供抑制血液凝固及血塊生成的方法，以及降低人類TF濃度的方法。
通常，本發(fā)明抗體可用于調(diào)節(jié)實(shí)質(zhì)上任一種通過FX(或FIX)結(jié)合至TF或TFFVIIa復(fù)合物所媒介的生物反應(yīng)，包括前文討論的血液凝固、發(fā)炎、腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移及其它病癥。
本發(fā)明抗體特別可用于緩和多種血栓，特別預(yù)防或抑制血管再狹窄，或預(yù)防或抑制侵入性醫(yī)療手術(shù)例如動(dòng)脈手術(shù)或心臟手術(shù)(例如血管成形術(shù))后發(fā)生血栓。本發(fā)明抗體也用來減少或甚至有效消除于非手術(shù)性心血管病，因血液凝固活化所造成的血栓梗阻，該心血管病包括(但非限制性)冠狀動(dòng)脈病、急性冠狀癥候群(例如不穩(wěn)定性心絞痛或心肌梗塞)及動(dòng)脈粥狀硬化。本發(fā)明抗體也可用來減少或甚至有效消除因使用醫(yī)療設(shè)施(例如導(dǎo)管、血管支架或其它醫(yī)療裝置)造成的血液凝固。優(yōu)選本發(fā)明抗體可與多種抗凝血?jiǎng)┙M合物、抗血小板組合物及血栓溶解組合物兼容，因此允許以混合液方式給藥來增強(qiáng)或延長血液凝固的抑制效果。
本發(fā)明抗體也可用于哺乳類特別人類的體外循環(huán)做為抗凝血?jiǎng)Ｓ诖朔N方法，一或多種本發(fā)明抗體以足夠抑制凝血用量，于體外循環(huán)前或體外循環(huán)中，例如可能出現(xiàn)于心肺旁路手術(shù)、器官移植手術(shù)或其它長時(shí)間手術(shù)前或手術(shù)中給藥。
本發(fā)明抗體也可用作為藥物載劑，特別系用作為鎖定目標(biāo)與血塊交互作用的藥物，例如鏈激酶、組織胞質(zhì)素原活化劑(t-PA)或尿激酶。同理本發(fā)明抗體可通過共軛適當(dāng)毒素至抗體而用作為細(xì)胞毒劑。本發(fā)明抗體的共軛物也可用來降低哺乳動(dòng)物體特別為人體的組織因子濃度，使用方式系通過對哺乳類投予有效量的本發(fā)明抗體，該抗體共價(jià)鍵聯(lián)至細(xì)胞毒劑或效應(yīng)物分子來提供補(bǔ)體固定能力、及抗體相依性細(xì)胞媒介的胞毒性，如此抗體共軛物接觸可表達(dá)組織因子的細(xì)胞因而降低于哺乳動(dòng)物體的組織因子濃度。
本發(fā)明抗體也可用于活體診斷方法，包括天然人類TF的活體診斷用造影。
本發(fā)明抗體也可用于試管試驗(yàn)檢定分析，來檢測天然標(biāo)本包括體液(例如血漿或血清)或組織(例如生檢標(biāo)本)的天然TF。特別多種非同質(zhì)免疫檢定分析及同質(zhì)免疫檢定分析可以競爭方式或非競爭方式用來檢測生物標(biāo)本是否存在有天然TF，且優(yōu)選檢測天然TF的含量。
此等本發(fā)明的檢定分析高度可用于測定有凝血或血塊病人的存在或存在的可能。換言之，血液凝固通常伴隨有細(xì)胞表面的TF表達(dá)，且系由于細(xì)胞表面的TF表達(dá)結(jié)果，該等細(xì)胞例如為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及血管內(nèi)部的內(nèi)皮細(xì)胞。如此通過本發(fā)明的檢定分析檢測體液標(biāo)本的TF將可指征血液凝固。
本發(fā)明抗體也可用來由生物標(biāo)本制備實(shí)質(zhì)純質(zhì)的天然TF，特別天然人類TF。本發(fā)明抗體也可用于檢測的純化可表達(dá)天然TF的細(xì)胞。
本發(fā)明抗體也可用作為診斷試劑盒的一種組成元體，例如用來檢測生物標(biāo)本的天然TF且優(yōu)選定量天然TF。
本發(fā)明也提供可特異性結(jié)合至人類組織因子TF而形成復(fù)合物的人源化抗體。優(yōu)選具體實(shí)施例中，血液因子X或因子IX結(jié)合至復(fù)合物顯著受抑制。優(yōu)選人源化抗體包括至少一個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，且更佳一、二、三或四個(gè)此種鼠CDRs。此外提供此種人源化抗體的TF結(jié)合片段。
于另一方面，本發(fā)明提供抑制哺乳類動(dòng)物血液凝固的方法，包括對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的人源化抗體或其片段，其特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)來形成復(fù)合物。用于該方法的優(yōu)選抗體可顯著減少因子X或因子IX結(jié)合至復(fù)合物。優(yōu)選方法進(jìn)一步包括抗體與TF或TFFVIIa復(fù)合物間形成特異性復(fù)合物來抑制凝血。
本發(fā)明也提供抑制哺乳類動(dòng)物血液凝固的方法，包括對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的一種人源化抗體或其片段，其包含至少一個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。優(yōu)選用于該方法的人源化抗體可特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)來形成復(fù)合物。優(yōu)選結(jié)合至復(fù)合物的因子X或因子IX顯著減少。優(yōu)選方法進(jìn)一步包括形成抗體與TF間的特異性復(fù)合物來抑制凝血。
本發(fā)明的其它方面討論如后。


第1A及1B圖顯示H36.D2.B7的輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQID NOS1及3)及氨基酸序列(SEQ ID NOS2及4)，超可變區(qū)(CDRs或互補(bǔ)決定區(qū))的下方劃線(核酸序列下方劃單線，而氨基酸序列下方劃雙線)。
第2圖顯示藉ELISA或BIACore分析測得抗組織因子抗體的結(jié)合常數(shù)(Ka)及解離常數(shù)(Kd)。
第3圖顯示通過與抗組織因子抗體前培養(yǎng)來抑制TFFVIIa復(fù)合物媒介的FX的活化的抑制作用。
第4圖顯示藉抗組織因子抗體抑制TFFVIIa對FVIIa特異性產(chǎn)色基質(zhì)S-2288的活性的抑制作用。
第5圖顯示H36抗體于TF引發(fā)凝血檢定分析延長凝血酶原時(shí)間(PT)的能力。
第6A及6B圖以線圖顯示FXa的形成與H36抗體對rhTF摩爾比間的關(guān)系。第6A圖于添加FX前，H36與TFFVIIa復(fù)合物前培養(yǎng)。第6B圖H36、TFFVIIa及FX系同時(shí)添加。
第7圖顯示于J-82細(xì)胞活性檢定分析，藉H36抗體抑制TFFVIIa活性的抑制作用。
第8A及8B圖為墨點(diǎn)分析代表圖，顯示H36抗體結(jié)合rhTF的構(gòu)象抗原決定部位。線道1-天然rhTF、線道2-以8M尿素處理的天然rhTF、線道3-以8M尿素及5mM DTT處理的天然rhTF。第8A圖中墨點(diǎn)暴露約40秒；第8B圖中墨點(diǎn)暴露120秒。
第9A-B圖為略圖顯示人IgG1-cH36 HC可變區(qū)轉(zhuǎn)化載體及表達(dá)載體。HC轉(zhuǎn)化載體(9A)及HC表達(dá)載體(9B)。
第9C-D圖為略圖顯示人IgG4-cH36 HC可變區(qū)轉(zhuǎn)化載體及表達(dá)載體。HC轉(zhuǎn)化載體(9C)及HC表達(dá)載體(9D)。
第10A-B圖為略圖顯示cH36 LC可變區(qū)轉(zhuǎn)化載體及表達(dá)載體。LC轉(zhuǎn)化載體(10A)及LC表達(dá)載體(10B)。
第11圖為略圖顯示人源化抗-TF IgG1抗體表達(dá)載體(pSUN 34)的質(zhì)體映像圖。
第12A-D圖為略圖顯示部分人化及全部人化輕鏈(LC)可變區(qū)的序列。cH36的輕鏈CDR序列顯示于第12B-D圖。定名為「LC-09」的序列為全人化LC構(gòu)架區(qū)的代表。
第13A-D圖為部分人化及全部人化重鏈(HC)可變區(qū)的序列。cH36及HC-08的重鏈CDR序列顯示于第13B-D圖。定名為「HC-08 」的序列為完全人化HC構(gòu)架區(qū)。
第14A-B圖為略圖顯示人化IgG1抗組織因子抗體(hOAT)(IgG1)恒定區(qū)。
第15A-B圖為略圖顯示人化IgG4抗組織因子抗體(hFAT)(IgG4)恒定區(qū)。
具體實(shí)施例方式
如前文討論，本發(fā)明的優(yōu)選抗體可抑制對天然人類TF的實(shí)質(zhì)親和力。特別本發(fā)明的優(yōu)選抗體具有用于天然人類TF的解離常數(shù)(Ka，M-1)，藉表面質(zhì)?；蝮w分析(特別根據(jù)后文實(shí)施例1程序的百歐可(BIACore)分析)至少約為1×108，更佳藉表面質(zhì)?；蝮w分析測得至少約5×108，又更佳用于天然人類TF的Ka(Ka，M-1)藉表面質(zhì)?；蝮w諧振分析測得至少約為1×1010。此種本發(fā)明抗體的實(shí)質(zhì)結(jié)合親和力與先前報(bào)告抗體的遠(yuǎn)較低結(jié)合親和力形成尖銳對比。
就此方面而言，可使用相當(dāng)?shù)陀行舛鹊谋景l(fā)明抗體，例如相對低濃度抗體可用于試管試驗(yàn)檢定分析(例如后文實(shí)施例2的說明)用來視需要抑制TF功能(例如至少約95、98或99％抑制)。
優(yōu)選抗體對天然人類TF也有高度特異性，優(yōu)選不會(huì)實(shí)質(zhì)上結(jié)合非天然TF。優(yōu)選抗體例如藉標(biāo)準(zhǔn)墨點(diǎn)檢定分析測得不會(huì)實(shí)質(zhì)上結(jié)合非天然TF、或其它免疫上不相關(guān)分子(例如藉此墨點(diǎn)分析以視覺檢測未結(jié)合至非天然TF，或?qū)嵸|(zhì)未結(jié)合至天然TF)。此處所述「非天然TF」表示天然人類TF或重組人類TF其已經(jīng)使用趨混沌劑處理，故TF被變性。典型趨混沌劑包括清潔劑(例如SDS)、尿素組合二硫赤絲醇或β-巰基乙醇；胍鹽酸鹽等。H36、H36.D2或H36.D2.B7抗體不會(huì)實(shí)質(zhì)結(jié)合至此種非天然TF。例如參考后文實(shí)施例8結(jié)果，該例為墨點(diǎn)分析。
如前文討論，本發(fā)明的優(yōu)選抗體也結(jié)合TF，讓FX(或FIX)不會(huì)有效結(jié)合至TFFVIIa復(fù)合物，因此FX(或FIX)不會(huì)有效轉(zhuǎn)成其活性形式(FXa或FIXa)。特佳本發(fā)明抗體將強(qiáng)力抑制FX被TFFVIIa復(fù)合物活化，例如抑制達(dá)至少約50％，更佳至少約80％及又更佳至少約90％或95％，甚至于低TF濃度，例如低于約1.0nM TF，或甚至低于約0.20nM TF或0.10nM TF也可強(qiáng)力抑制，如藉標(biāo)準(zhǔn)試管結(jié)合檢定分析測定，例如后文實(shí)施例3所述，該檢定分析包括于有(亦即實(shí)驗(yàn)標(biāo)本)以及無(亦即對照標(biāo)本)本發(fā)明抗體存在下，讓FX(或FIX)接觸TFFVIIa復(fù)合物，以及測定實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與對照標(biāo)本FX轉(zhuǎn)成FXa(或FIX轉(zhuǎn)成FIXa)間的差異百分比。
本發(fā)明抗體當(dāng)用于揭示方法及檢定分析，優(yōu)選實(shí)質(zhì)為純質(zhì)。述及抗體為「實(shí)質(zhì)純質(zhì)」表示抗體或蛋白質(zhì)已經(jīng)與天然伴隨的成分分離。例如通過使用標(biāo)準(zhǔn)免疫親和純化技術(shù)或蛋白質(zhì)A親和純化技術(shù)，本發(fā)明抗體可通過使用天然TF作為抗原或蛋白質(zhì)A樹脂而由融合瘤培養(yǎng)純化。同理，天然TF可通過使用本發(fā)明抗體，使用標(biāo)準(zhǔn)免疫親和純化技術(shù)，而以實(shí)質(zhì)純質(zhì)形式獲得。特別當(dāng)總蛋白質(zhì)中的至少50％(于指定減低的總蛋白質(zhì)重量百分比)為本發(fā)明抗體或蛋白質(zhì)時(shí)，該抗體或蛋白質(zhì)為實(shí)質(zhì)純質(zhì)。優(yōu)選該抗體或蛋白質(zhì)至少占總蛋白的60wt％，更佳至少75wt％，又更佳至少90wt％，及最佳占總物質(zhì)的至少98wt％。純度方便藉已知方法檢定分析，該已知方法例如SDS(PAGE)凝膠電泳、管柱層析術(shù)(例如親和層析術(shù))或HPLC分析。
本發(fā)明優(yōu)選抗體(H36.D2.B7)的氨基酸序列(SEQ ID NOS1及3)及氨基酸序列(SEQ ID NOS2及4)顯示于附圖第1A及1B圖。SEQ ID NOS1及2分別為輕鏈可變區(qū)的核酸及氨基酸，以及SEQ ID NOS3及4分別為重鏈可變區(qū)的核酸及氨基酸，于全部序列下方有高度可變區(qū)(CDRs或互補(bǔ)決定區(qū))。
其它優(yōu)選本發(fā)明抗體具有實(shí)質(zhì)氨基酸序列同第1A及1B圖所示輕鏈序列或重鏈序列的任一者或二者。特別優(yōu)選抗體包括與SEQ ID NOS2及/或4具有至少約70％同構(gòu)型(氨基酸序列同源性)的抗體，更佳與SEQ ID NOS2及/或4有至少約80％或以上同構(gòu)型，又更佳于SEQ ID NOS2及/或4有約85、90或95％或以上同構(gòu)型的抗體。
優(yōu)選本發(fā)明抗體與SEQ ID NOS2及4的超可變區(qū)(于第1A及1B圖以下方劃雙線顯示)具有高度氨基酸序列同源性。特佳本發(fā)明抗體具有一、二或三個(gè)輕鏈可變區(qū)的超可變區(qū)，其與H36.D2.B7的輕鏈可變區(qū)的對應(yīng)超可變區(qū)「該等超可變區(qū)以下方劃線顯示于第1A圖如后1)LASQTID(SEQ ID NOS5)；2)AATNLAD(SEQID NOS6)；及3)QQVYSSPFT(SEQ ID NOS7)]中的一、二或三者有高度序列同源性(至少90％或95％氨基酸序列同源性)或?yàn)橥耆嗤?br> 特佳本發(fā)明抗體具有重鏈可變區(qū)的一、二或三個(gè)超可變區(qū)，其與H36.D2.B7的重鏈可變區(qū)的對應(yīng)超可變區(qū)「該等超可變區(qū)以下方劃線顯示于第1B圖如后1)TDYNVY(SEQ ID NO8)；2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO9)；及3)DVTTALDF(SEQ ID NO10)]中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％氨基酸序列同源性)或?yàn)橥耆嗤?br> 本發(fā)明核酸優(yōu)選長度(優(yōu)選至少約100、200或250堿基對)于下列中等苛刻條件(于此處稱作為「正常嚴(yán)苛度」條件)下足夠結(jié)合至SEQ ID NO1及/或SEQ ID NO3的序列使用包含20％甲醯胺于0.8M食鹽水/0.08M檸檬酸鈉(SSC)緩沖液的雜交緩沖液于37℃溫度，于37℃使用該SSC緩沖液洗滌一次時(shí)仍然保持結(jié)合。
更佳本發(fā)明核酸(至少約100、200或250堿基對)將于下列高等苛刻條件(于此處稱作為「高嚴(yán)苛度」條件)下足夠結(jié)合至SEQ ID NO1及/或SEQ ID NO3的序列使用包含20％甲醯胺于0.9M食鹽水/0.09M檸檬酸鈉(SSC)緩沖液的雜交緩沖液于42℃溫度，于42℃使用該SSC緩沖液洗滌兩次時(shí)仍然保持結(jié)合。
本發(fā)明核酸優(yōu)選包含至少20堿基對，更佳至少約50堿基對，又更佳本發(fā)明核酸包含至少約100、200、250或300堿基對。
通常優(yōu)選本發(fā)明核酸將表達(dá)本發(fā)明抗體，該抗體具有優(yōu)選結(jié)合親和力及其它如此處揭示的性質(zhì)。
優(yōu)選本發(fā)明核酸具有與第1A及1B圖所示輕鏈序列或重鏈序列中的任一者或二者的實(shí)質(zhì)序列同源性。特別，優(yōu)選核酸包含一序列其具有與SEQ ID NOS1及/或3，至少70％同構(gòu)型(核酸序列同源性)，更佳與SEQ ID NOS1及/或3約80％或以上同構(gòu)型，又更佳與SEQ ID NOS1及/或3具有約85、90或95％或以上的同構(gòu)型。
特佳本發(fā)明的核酸序列與SEQ ID NOS1及3的超可變區(qū)(以下方劃線顯示于第1A及1B圖)有高度序列同源性。特佳核酸包括編碼抗體輕鏈可變區(qū)，以及具有一、二或三個(gè)序列其編碼超可變區(qū)，以及與編碼H36.D2.B7的對應(yīng)超可變區(qū)「該等超可變區(qū)以下方劃線顯示于第1A圖如后1)CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQID NO11)；2)GCTGCCACCAACTTGGCAGAT(SEQ ID NO12)；及3)CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(SEQ ID NO13)]的編碼序列中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％核酸序列同源性)或?yàn)橥耆嗤?br> 特佳核酸也編碼抗體重鏈可變區(qū)，以及具有一、二或三個(gè)序列其編碼超可變區(qū)，以及與編碼H36.D2.B7的對應(yīng)超可變區(qū)[該等超可變區(qū)以下方劃線顯示于第1A圖如后1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO14)；2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO15)；及3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO16)]的編碼序列中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％核酸序列同源性)或?yàn)橥耆嗤?br> 本發(fā)明核酸經(jīng)分離，通常組織存在于一指定分量的總核酸至少約0.5％，優(yōu)選至少約2％及更佳至少約5％重量比。特別純質(zhì)的核酸組成存在于一指定分量總核酸的至少約10％，優(yōu)選至少約30％，及更佳至少約60％重量比。純質(zhì)核酸組成存在于一指定分量總核酸的至少約80％，優(yōu)選至少約90％，及更佳至少約95％重量比。
本發(fā)明抗體可通過業(yè)界一般已知技術(shù)制備，典型產(chǎn)生天然TF的純化標(biāo)本，典型為天然人類TF，優(yōu)選為純化重組人類組織因子(rhTF)。以截頭重組人類組織TF或「rhTF」(由243氨基酸組成，且缺胞質(zhì)領(lǐng)域)特佳用于產(chǎn)生本發(fā)明抗體?？贵w也可由免疫原性勝產(chǎn)生，該勝包含一或多個(gè)天然TF的抗原決定部位，而非天然TF不具有該等抗原決定部位。此處述及「天然TF」包括此種TF標(biāo)本，包括此種rhTF。如前文討論，通常以單克隆抗體為佳，但也可使用多株抗體。
特別抗體可通過使用天然人類TF的純化標(biāo)本或如前文討論的免疫原性勝 ，單獨(dú)使用或與載劑復(fù)合用來免疫接種哺乳動(dòng)物而制備。適當(dāng)哺乳動(dòng)物包括典型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如綿羊、山羊、兔、天竺鼠、大鼠及小鼠。以大鼠及小鼠特別以小鼠用來獲得單克隆抗體為佳。抗體可藉多種適當(dāng)途徑例如皮下注射、腹內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射或皮內(nèi)注射等多種途徑的任一種投予哺乳類。最佳免疫接種時(shí)間間隔、免疫接種劑量等可于相當(dāng)寬廣范圍改變，可基于此處揭示以實(shí)驗(yàn)決定。典型程序涉及經(jīng)數(shù)個(gè)月時(shí)間注射抗原數(shù)次?？贵w系藉標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由經(jīng)免疫接種動(dòng)物的血清收集，抗體經(jīng)衰減來找出對天然人類TF的特異性抗體。單克隆抗體可于可產(chǎn)生抗體的細(xì)胞制造，以及通過形成融合瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)融合技術(shù)用來產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞制造。參考Huse等人，自然，256456(1975)。典型地如此涉及抗體產(chǎn)生性細(xì)胞與永生細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞)融合來制造雜交細(xì)胞。另外，單克隆抗體可藉Huse等人，科學(xué)，2561275(1989)的方法而由細(xì)胞制造。
一種適當(dāng)方案使用包含經(jīng)純化的rhTF復(fù)合物組合物腹內(nèi)免疫接種小鼠，進(jìn)行約2至7個(gè)月時(shí)間。然后由免疫接種小鼠取出脾細(xì)胞。切除脾細(xì)胞的前，來自免疫接種小鼠的血清用來檢定分析rhTF的特異性抗體力價(jià)。然后切除的小鼠脾細(xì)胞融合至適當(dāng)同質(zhì)或非同質(zhì)(優(yōu)選為同質(zhì))帶有一個(gè)標(biāo)記的淋巴細(xì)胞系，該標(biāo)記例如為次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核酸轉(zhuǎn)移酶缺陷(HGPRT-)或胸腺苷激酶缺陷(TK-)。優(yōu)選采用骨髓瘤細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞系。骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合，例如以約1至4個(gè)骨髓瘤細(xì)胞對脾細(xì)胞的比例混合。細(xì)胞可藉聚乙二醇(PEG)方法融合。參考G.Kohler等人，自然，參見上文。如此轉(zhuǎn)化的融合瘤于培養(yǎng)基生長例如于RPMI-1640生長。參考G.E.More等人，美國內(nèi)科協(xié)會(huì)期刊199549(1967)。融合瘤于融合程序后生長，融合瘤例如藉放射性免疫檢定分析或酶免疫檢定分析篩選是否分泌可特異性結(jié)合至醇rhTF的抗體，例如抗體經(jīng)選擇其可結(jié)合至純化后的rhTF，但不會(huì)結(jié)合至非天然TF。優(yōu)選使用ELISA進(jìn)行篩檢。于此等篩檢時(shí)顯示陽性結(jié)果的融合瘤可藉限制稀釋法擴(kuò)大及轉(zhuǎn)化。優(yōu)選進(jìn)行進(jìn)一步篩檢來選出于溶液以及于人類體液樣本中可結(jié)合至rhTF的抗體。經(jīng)分離的抗體可藉任一種適當(dāng)免疫學(xué)技術(shù)(包括親和層析術(shù))進(jìn)一步純化。可制造特佳H36.D2.B7抗體的融合瘤培養(yǎng)已經(jīng)遵照布達(dá)佩斯條約保藏于美國種型培養(yǎng)收集會(huì)(ATCC)，馬里蘭州10852洛克維爾，公園草皮大道12301號。融合瘤培養(yǎng)系于1997年1月8日保藏于ATCC，被指定保藏號ATCCHB-12255。
供人類治療用，希望制造嵌合型抗體衍生物，例如組合非人動(dòng)物可變區(qū)及人恒定區(qū)的抗體分子，藉此讓該抗體比對應(yīng)的非嵌合型抗體對人類的免疫原性較低?？芍苽涠喾N類型的此種嵌合型抗體，例如包括制造人類可變區(qū)嵌合體，其中部分可變區(qū)，特別為抗原結(jié)合領(lǐng)域的保留區(qū)屬于人類來源，只有超可變區(qū)才非人類來源。也參考人化嵌合型抗體及其制造方法的討論，參見S.L.Morrison，科學(xué)，2291202-1207(1985)；Oi等人，生物技術(shù)，4214(1986)；Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozbor等人，今日免疫學(xué)，47279(9183)；Olsson等人，酶學(xué)方法，93-16(1982)。此外，可采用基因轉(zhuǎn)化小鼠。例如已經(jīng)形成攜帶有人類抗體人類的基因轉(zhuǎn)化小鼠，該小鼠可以天然人類TF免疫接種。此種經(jīng)過免疫接種的基因轉(zhuǎn)化小鼠所得脾細(xì)胞隨后用來形成融合瘤，融合瘤分泌人類單克隆抗體，如前文說明，該單克隆抗體與天然人類TF特異性反應(yīng)。參考N.Lonberg等人，自然，368856-859(1994)；L.L.Green等人，自然遺傳學(xué)，713-21(1994)；S.L.Morrison，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，816851-6855(1994)。
編碼本發(fā)明抗體的核酸也可通過聚合酶連鎖反應(yīng)制備(參考后文實(shí)施例1揭示的引子)。概略參考Sambrook等人，分子轉(zhuǎn)化(第2版，1989年)。此種核酸也可藉已知方法合成，例如藉磷酸三酯合成(參考寡核苷酸合成，IRL出版社(M.J.Gait編輯，1984))或使用市售自動(dòng)化寡核苷酸合成儀合成。此種制備所得本發(fā)明核酸可用來藉已知技術(shù)表達(dá)本發(fā)明抗體。例如編碼本發(fā)明抗體的核酸可藉已知方法結(jié)合于適當(dāng)載體，該結(jié)合方法例如通過使用限剪酶來于載體制作切口供插入組合物，接著接合。含有所插入的核酸序列的載體，該核酸序列適合以操作式鍵聯(lián)至激活子序列，隨后被導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。概略參考Sambrook等人，參見上文。適當(dāng)載體的選擇可基于轉(zhuǎn)化方案相關(guān)因素通過實(shí)驗(yàn)做選擇。例如載體需與使用的宿主細(xì)胞可兼容，且具有該使用的宿主細(xì)胞的適當(dāng)復(fù)制子。此外，載體需可容納所插入的核酸序列。適當(dāng)宿主細(xì)胞包括寬廣多種真核細(xì)胞或原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)等。
本發(fā)明抗體的分子量將依據(jù)若干因素決定，該等因素例如抗體的期望用途，以及抗體是否包括共軛或重組稠合毒素、藥物或可檢測的標(biāo)記等。此外分子量將依據(jù)抗體的轉(zhuǎn)譯后修改(若有)(例如糖化)的本質(zhì)及程度決定。修改系依據(jù)用來表達(dá)的宿主而改變，大腸桿菌制造未經(jīng)糖化抗體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制造糖化抗體。通常本發(fā)明抗體具有分子量約20至150kDa。此種分子量方便藉分子篩選方法測定，分子篩選方法例如為SDS-PAGE凝膠電泳，接著為蛋白質(zhì)染色或西方墨點(diǎn)分析。
「本發(fā)明抗體」或其它類似術(shù)語表示全免疫球蛋白，及可結(jié)合天然TF的其免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包括抗原決定簇(亦即可由抗體特異性結(jié)合的抗原決定部位，該抗體可辨識(shí)可特異性結(jié)合天然人類TF的天然人類TF)?？贵w片段例如包括Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2通過還原免疫球蛋白的雙硫鍵衍生而得的「半分子」、單鏈免疫球蛋白，或其它適當(dāng)抗原決定片段(例如參考Bird等人，科學(xué)242-424頁(1988)；Huston等人，PNAS，(USA)，855879(1988)；Webber等人，分子免疫學(xué)，32249(1995))?？贵w或其免疫活性片段可為動(dòng)物抗體(例如嚙齒類動(dòng)物如小鼠或大鼠抗體)或嵌合型抗體(參考Morrison等人，PNAS，816851(1984)；Jones等人，自然，321-522頁(1986))。以本發(fā)明的單鏈抗體為佳。
同理，「本發(fā)明的核酸」表示可表達(dá)而獲得本發(fā)明抗體的核苷酸序列，此種術(shù)語特別表示前文定義。
如前文討論，本發(fā)明抗體可投予哺乳類，優(yōu)選投予靈長類如人類，來預(yù)防或減少由于TF媒介的凝血活化所造成的血栓梗阻病癥，典型本發(fā)明抗體系于組合物，該組合物包括一或多種醫(yī)藥上可接受的無毒載劑如無菌水或食鹽水、二醇類如聚乙二醇、植物來源的油類等。特別可生物兼容、可生物分解的丙交酯聚合物、丙交酯乙交酯共聚物、或聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物為有用的賦形劑，用來控制此處所述含抗體組合物的釋放。其它可能有用的給藥系統(tǒng)包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透壓幫浦及可植入輸注系統(tǒng)及微脂粒。通常本發(fā)明的抗凝血?jiǎng)┙M合物系呈溶液或懸浮液形式(或凍干形式，其可重新調(diào)制為溶液或懸浮液)，優(yōu)選包括約0.01％至10％(w/w)本發(fā)明抗體，更佳包括約0.01％至5％(w/w)抗體?？贵w可呈組合物的唯一活性成分投予，或呈混合液投予，該混合液包括一種或多種其它抗凝血?jiǎng)?例如肝素、水蛭素或類水蛭素、香豆素、殺鼠靈)、抗血小板劑(例如阿司匹林、普拉威、提克里、李歐波、英特革林、或亞各司特)、或血栓溶解劑(例如組織胞質(zhì)素原活化劑、鏈激酶及尿激酶)。此外，本發(fā)明抗體可于投予一或多種適當(dāng)抗凝血?jiǎng)?、抗血小板劑或血栓溶解劑的前或的后投予，來增?qiáng)或延長期望的抗凝血活性。
也如前文討論，本發(fā)明抗體可用來減少由于使用醫(yī)療裝置例如留置裝置如導(dǎo)管、血管支架等可能造成的血液凝固。一種優(yōu)選方法中，該醫(yī)療裝置可于接觸體液的前使用本發(fā)明抗體(例如呈1毫克/毫升食鹽水溶液)處理。另外或此外，本發(fā)明抗體可以凝血足夠減少用量與體液組合。
根據(jù)本發(fā)明的治療性抗凝血?jiǎng)┙M合物適合以腸道外或靜脈給藥形式，特別以液態(tài)溶液劑劑型使用。此種組合物方便以單位劑量給藥，可根據(jù)制藥界已知方法制備。參考雷明頓制藥科學(xué)(默克出版公司，賓州伊士頓(1980年))?！竼挝粍┝俊挂辉~表示本發(fā)明的治療性組合物系以適合用于靈長類例如人類的單位劑量的實(shí)體分開單位使用，每個(gè)單位含有經(jīng)過計(jì)算可產(chǎn)生預(yù)定療效的預(yù)定量活性物質(zhì)，組合所需稀釋劑或載劑。單位劑型系依據(jù)多項(xiàng)因素決定，該等因素包括欲治療的血栓類型及嚴(yán)重程度、個(gè)體凝血系統(tǒng)利用抗體的能力，以及期望FX(或FIX)活化的抑制程度或中和程度。抗體的精確給藥量將由臨床醫(yī)師的判定決定，但單位劑量通常系依據(jù)給藥途徑?jīng)Q定，單位劑量系于10納克/千克體重至50毫克/千克體重每日，更典型于100納克/千克體重至約10毫克/千克體重每日的范圍。此種初期投予與追加接種的方案也有多種變化，典型為初次投予，接著為1小時(shí)或數(shù)小時(shí)間隔藉注射或其它投予方式投予重復(fù)劑量。另外，連續(xù)靜脈輸注或間歇靜脈輸注足以維持抗體的血中濃度至少由約10納摩爾濃度至10微摩爾濃度。
某些情況下，可能希望修改本發(fā)明抗體來提供預(yù)定生物、化學(xué)或物理性質(zhì)。特別將抗體共軛(亦即共價(jià)鍵聯(lián))至藥劑(例如纖維蛋白分解藥物如t-PA、鏈激酶或尿激酶)來提供纖維蛋白分解活性，或?qū)⒖贵w共軛至鎖定目標(biāo)化學(xué)劑例如纖維蛋白結(jié)合領(lǐng)域。此種鍵聯(lián)可藉數(shù)種方法達(dá)成，包括使用鍵聯(lián)分子如非同質(zhì)雙官能蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，如SPDP、甲二醯亞胺等或藉重組方法達(dá)成鍵聯(lián)。
除了藥物例如纖維蛋白分解劑的外，本發(fā)明抗體也可共軛至例如植物來源或細(xì)菌來源的毒素，例如白喉毒素(亦即DT)、痢疾毒素、相思子毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素、皂素、假單胞桿菌外毒素(PE)、北美商陸抗病毒蛋白或潔洛寧(gelonin)。此種毒素的生物活性片段為業(yè)界眾所周知，例如包括DT A鏈及蓖麻毒素A鏈。毒素也可為于細(xì)胞表面有活性的化學(xué)劑，例如磷脂酶(磷脂酶C)。至于另一例，毒素可為化學(xué)治療藥例如文德辛(vendesine)、文克斯汀(vincristine)、文拉斯汀(vinblastin)、美索崔塞(methotrexate)、阿利亞霉素(adriamycin)、阿霉素(doxirubicin)、布利歐霉素(bleomycin)或西斯拉汀(cisplatin)；或毒素可為放射性核種例如碘-131、釔-90、錸-188或鉍-212(概略參考Moskaug等人，生物化學(xué)期刊，26415709(1989)；I.Pastan等人，細(xì)胞，47641(1986)；Pastan等人，重組毒素作為新穎治療劑，生物化學(xué)年報(bào)綜論，61331(1992)；嵌合型毒素Olsnes及Phil，藥物治療學(xué)，25355(1982)；公告PCT申請案第WO94/29350號；公告PCT申請案第WO94/04689號；及美國專利第5,620,939號)。此外如前文討論，除了毒素外，本發(fā)明抗體可共軛至效應(yīng)物分子(例如IgG1或IgG3)來當(dāng)投予哺乳類時(shí)提供補(bǔ)體固定能力及抗體相依性細(xì)胞媒介的胞毒性。
此種抗體-胞毒素或效應(yīng)物分子共軛物可以治療有效量投予哺乳類，優(yōu)選為靈長類例如人類，此處該哺乳類動(dòng)物已知具有或懷疑具有可表達(dá)TF的腫瘤細(xì)胞、免疫系統(tǒng)細(xì)胞、或內(nèi)皮。此種腫瘤細(xì)胞、免疫系統(tǒng)細(xì)胞及內(nèi)皮例如包括乳癌及肺癌、單核細(xì)胞及血管內(nèi)皮。
本發(fā)明抗體除了前文說明之外也可共軛至多種其它藥劑，例如藥物、酵素、激素、可結(jié)合至放射性核種的螯合劑以及其它可用于疾病診斷或治療的蛋白質(zhì)及多。用于診斷目的，本發(fā)明抗體可以加可檢測標(biāo)記或未加標(biāo)記使用。例如寬廣多種標(biāo)記適合用來以可檢測方式標(biāo)記抗體，該等標(biāo)記例如放射性核種、螢光、酶、酶基質(zhì)、酶輔因子、酶抑制劑、配位子例如半抗原等。
也提供診斷方法包括體內(nèi)診斷造影[例如參考A.K.Abbas，細(xì)胞及分子免疫學(xué)，328頁(華比桑德(W.B.Saunders)公司，1991年)]。用于大部分體內(nèi)造影用途，本發(fā)明可使用例如125I、32P、99Tc或其它可檢測標(biāo)記以可檢測方式標(biāo)記，以及隨后抗體投予哺乳類特別為人類經(jīng)歷一段足夠允許該抗體接觸預(yù)定目標(biāo)的時(shí)間。然后個(gè)體藉已知程序例如掃描攝影分析掃描，來檢測抗體的結(jié)合情況。分析可輔助多種血栓，特別前文揭示的血栓的診斷與治療。該方法于結(jié)合心臟手術(shù)特別血管成形術(shù)或其它手術(shù)，該等手術(shù)可能形成非期望的血塊使用時(shí)特別有用，可觀察血塊的發(fā)展及移動(dòng)。
本發(fā)明抗體也可用于由生物標(biāo)本制備實(shí)質(zhì)純質(zhì)(例如至少約90％純質(zhì)，優(yōu)選至少約96％或97％純質(zhì))天然TF，特別天然人類TF。例如可如前文說明獲得天然TF(例如參考L.V.M.Rao等人，血栓研究，56109(1989))，將該溶液混合包含該抗體的固體撐體形成偶合反應(yīng)混合物純化獲得。固體撐體包括板壁，例如微力價(jià)孔板，以及包含下列材料或由下列材料組成的撐體聚苯乙烯、聚氯乙烯、交聯(lián)葡萄聚糖(如希法德士(Sephadex)法瑪西雅(Pharmacia)精細(xì)化學(xué)品公司)、瓊脂糖、聚苯乙烯珠粒(亞伯特實(shí)驗(yàn)室(Abbott Laboratories))、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺呈交聯(lián)形式、硝基纖維素或尼龍等。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)，以實(shí)質(zhì)純質(zhì)形式由固體撐體分離TF。(概略參考Harlow及Lane參見上文及Lane參鍵上文及Ausubel等人參見上文)。
也如前文討論，本發(fā)明抗體可用來檢測生物標(biāo)本的天然人類TF，特別檢測凝血相關(guān)的天然TF。生物標(biāo)本例如包括血漿、血清、唾液、尿液、糞便、陰道分泌物、膽汁、淋巴、眼房水、腦脊髓液、細(xì)胞培養(yǎng)基及組織，特別為血管組織例如心臟組織。標(biāo)本適合來自患有或懷疑患有血栓且優(yōu)選為血管再狹窄的哺乳動(dòng)物，該血栓或血管再狹窄系關(guān)聯(lián)下列情況，例如侵入性醫(yī)療手術(shù)如經(jīng)皮穿管腔冠狀動(dòng)脈手術(shù)、心肺繞道手術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、周邊血管繞道移植、重建手術(shù)或整型手術(shù)、關(guān)節(jié)置換術(shù)；心臟病例如心肌梗塞、心肌病、瓣膜性心臟病、穩(wěn)定性心絞痛、不穩(wěn)定性心絞痛、或栓塞引起的心房纖維震顫；凝血病變包括彌漫性血管內(nèi)凝血、深部靜脈血栓、醫(yī)療裝置如血管支架或心導(dǎo)管的置放；休克(例如敗血性休克癥候群)、血管外傷、肝病、出血性腦中風(fēng)、中暑、惡性疾病(例如胰癌、卵巢癌、或小細(xì)胞肺癌)、狼瘡、子癇、血管周圍梗阻病及腎臟病。
用于此等檢定分析，本發(fā)明抗體可根據(jù)已知方法使用適當(dāng)原子或分子以可檢測方式標(biāo)記，標(biāo)記原子或分子例如為放射性碘、氚、生物素、或可產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的反應(yīng)劑，例如抗特應(yīng)基因型抗體附著于酶(如β-半乳糖苷酶或辣根過氧化酶)，或螢光標(biāo)記(例如螢光素或若丹明)。于生物標(biāo)本接觸經(jīng)過可檢測方式標(biāo)記的抗體后，任何未反應(yīng)的抗體可由生物標(biāo)本分離，標(biāo)記(或產(chǎn)物)可藉習(xí)知免疫學(xué)方法檢測，檢測方法包括抗體捕捉檢定分析、抗體夾層檢定分析、RIA、ELISA、免疫沉淀法、免疫吸附法等方法(參考Harlow及Lane，參見上文；Ausubel等人，參見上文)。任何標(biāo)記(或產(chǎn)物)超過于適當(dāng)對照標(biāo)本檢測得的量，指征生物標(biāo)本存在有天然TF，特別存在有血塊。例如本發(fā)明抗體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)(例如抗體捕捉檢定分析、ELISA、抗體夾層檢定分析、RIA、免疫沉淀法、免疫吸附法等)，以可檢測方式標(biāo)記來檢測且優(yōu)選為定量檢測天然TF。某些情況下，特別當(dāng)使用組織時(shí)，免疫學(xué)技術(shù)包括以已知實(shí)質(zhì)上可維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用劑(例如稀甲醛)固定組織。概略參考Ausubel等人，分子生物學(xué)流行方案，約翰威利父子公司，紐約(1989)；Harlow及Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，CSH出版公司，紐約(1988)。
本發(fā)明抗體可用于檢測且純化可表達(dá)天然TF的細(xì)胞，該等細(xì)胞包括纖維母細(xì)胞、腦細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如單核細(xì)胞)、上皮及若干惡性細(xì)胞。優(yōu)選細(xì)胞的檢測與純化方法包括習(xí)知免疫學(xué)方法(例如流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量方法如FACS，及免疫淘洗法)。可表達(dá)天然TF的實(shí)質(zhì)純質(zhì)細(xì)胞群可用于臨床及研究，例如建立培養(yǎng)細(xì)胞用來篩檢TF結(jié)合抗體。
本發(fā)明提供試驗(yàn)及診斷試劑盒，用來檢測試驗(yàn)標(biāo)本特別為體液如血液、血漿等或如前述組織，檢測天然TF，特別天然人類TF。優(yōu)選試劑盒包括本發(fā)明的經(jīng)可檢測標(biāo)記抗體。診斷試劑盒可以任一種可接受的免疫學(xué)格式例如ELISA格式，用來檢測生物標(biāo)本中是否存在有天然TF或天然TF存在量。
如前文討論，本發(fā)明也提供人源化抗體，人源化抗體特異性結(jié)合至人組織因子來形成結(jié)合復(fù)合物。組織因子可為天然或重組組織因子(rHTF)。優(yōu)選因子X或因子IX的結(jié)合至復(fù)合物受到抑制。于優(yōu)選本發(fā)明的具體實(shí)施例中，人源化抗體對hTF具有親和常數(shù)(Kd)小于約1nM，優(yōu)選小于約0.5nM及更佳由約0.01nM至約0.4nM。參考后文實(shí)施例11，有關(guān)測定人源化抗體親和常數(shù)的額外信息。「特異性結(jié)合」一詞表示人源化抗體與TF形成可檢測的復(fù)合物，藉標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)如RIA、西方墨點(diǎn)或ELISA技術(shù)未檢測得其它抗原。
本發(fā)明的其它人源化抗體的進(jìn)一步特征為藉標(biāo)準(zhǔn)凝血酶原(PT)凝固時(shí)間測定，可增加血液凝固時(shí)間達(dá)至少約5秒。優(yōu)選具體實(shí)施例中，人源化抗體與檢定分析的含量為約5nM至約75nM，及更佳約10nM至約50nM。例如參考后文實(shí)施例11(說明如何使用人源化抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PT凝血檢定分析)。
根據(jù)本發(fā)明的額外優(yōu)選人源化抗體具有對組織因子優(yōu)選為天然人類TF的結(jié)合特異性系約略等于或大于來自H36.D2.B7的抗體(以ATCC保藏號HB-12255保藏)。也優(yōu)選人源化抗體具有對TF的結(jié)合親和力系約略等于或大于來自H36.D2.B7的抗體(以ATCC保藏號HB-12255保藏)。結(jié)合特異性及親和力的測定方法為業(yè)界已知，包括后述特定檢定分析。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步人源化抗體包括至少一個(gè)鼠互補(bǔ)測定區(qū)(CDR)。如一般了解，免疫球蛋白輕鏈及重鏈共享某些結(jié)構(gòu)類似性，例如各自包括四區(qū)(FR1-4)構(gòu)架，其序列為相對保留性。各個(gè)FR1-4(FR1、FR2、FR3、FR4)系以三個(gè)CDRs亦即CDR1、CDR2、CDR3共價(jià)連接。一般了解四個(gè)FRs大為具有β片組態(tài)，互連的CDRs形成回路連結(jié)β片結(jié)構(gòu)，某些情況下構(gòu)成β片結(jié)構(gòu)的一部分。大部分CDRs維持接近于毗鄰FRs，與來自相對輕鏈或重鏈的對應(yīng)CDRs輔助形成抗原決定部位。已經(jīng)揭示寬廣多種CDRs及FRs。例如參考Kabat等人，免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列，美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部，美國政府印刷所(1987年)。
也參考EP-A-0239400及美國專利第5,985,279號(說明制造變化抗體的方法，其中CDRs系由FR以外的不同物種衍生而得)。
「人源化」一詞表示一種免疫球蛋白，其包括人類構(gòu)架區(qū)以及一或多個(gè)來自非人來源的CDRs，通常為嚙齒類動(dòng)物如大鼠或小鼠免疫球蛋白。提供CDRs的非人免疫球蛋白稱作為「供體」，而人類免疫球蛋白稱作為「受體」。如同于某些免疫球蛋白的TF結(jié)合片段，無需存在有恒定區(qū)。優(yōu)選恒定區(qū)(若存在時(shí))實(shí)施例系與人免疫球蛋白恒定區(qū)相同，亦即相對于氨基酸序列的同源性至少約90％，優(yōu)選至少約95％相同或以上。如此，幾乎全部人化免疫球蛋白的各部分(CDRs可能例外)實(shí)質(zhì)上皆系與天然人類免疫球蛋白序列的對應(yīng)部分完全相同。
「人源化抗體」一詞表示一種抗體其包括人化輕鏈及人化重鏈免疫球蛋白。此種抗體的制造方法及使用方法已經(jīng)討論如前。參考S.L.Morrison，參見上文；Oi等人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor等人，參見上文；Olsson等人，參見上文；及前文引用的其它參考文獻(xiàn)。
例如人源化抗體的說明例包括1)輕鏈及重鏈構(gòu)架(FRs)，其各自氨基酸序列于對應(yīng)人類FRs至少約90％相同且優(yōu)選至少95％相同；2)至少一個(gè)CDR系來自小鼠，且優(yōu)選全部CDRs皆來自小鼠；以及3)免疫球蛋白恒定區(qū)與對應(yīng)人類免疫球蛋白恒定區(qū)至少約90％同源性且優(yōu)選至少約95％同源性。須了解由于結(jié)果所得人源化抗體預(yù)期可結(jié)合至可提供CDRs的供體抗體的相同抗原，供體抗體已經(jīng)藉「人化」方法而人化。
進(jìn)一步須了解此處提供的人源化抗體可具有一或多個(gè)視需要可為連續(xù)或非連續(xù)的保留性氨基酸取代。例如此種取代典型對抗原結(jié)合功能或其它免疫球蛋白結(jié)合功能實(shí)質(zhì)具有極少或無影響。「保留取代」一詞包括多種型式，表示下列的組合glyala；valileleu；aspglu；asngln；serthr，lysarg；及phetyr。
其它人源化抗體具有可變區(qū)，其氨基酸序列與一或多種天然人類免疫球蛋白序列的對應(yīng)可變區(qū)具有至少70％同源性(例如約73％至75％同源性)。
根據(jù)本發(fā)明的額外人源化抗體于整個(gè)抗體具有與一或多種人類抗體至少90％同源性。
更特定本發(fā)明的人源化抗體為其中構(gòu)架(FRs)1、2、3及4與第12A圖所示輕鏈FR序列(SEQ ID NO.＿)至少約90％氨基酸序列同源性，且優(yōu)選至少約95％或以上的同源性。優(yōu)選該序列于第12A圖顯示為「LC-09」。進(jìn)一步優(yōu)選人源化抗體包括輕鏈恒定區(qū)其具有氨基酸序列于第14A或15A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)至少約90％同源性，且優(yōu)選至少約95％或以上序列同源性。其它特定人源化抗體為各個(gè)構(gòu)架(FRs)1、2、3及4具有于第13A圖所示重鏈序列(SEQ ID NO.＿)至少約90％氨基酸序列同源性且優(yōu)選約95％或以上同源性。優(yōu)選該序列于第13A圖顯示為「HC-08」。
其它人源化抗體具有重鏈恒定區(qū)，該恒定區(qū)于第14B或第15B圖所示序列(SEQID NO.＿)至少約90％氨基酸序列同源性，且優(yōu)選約95％或以上同源性。
若干具體實(shí)施例中，人源化抗體具有IGGL(HOAT)或IgG4(HFAT)同型基因。參考實(shí)施例9。
本發(fā)明也提供此處揭示人源化抗體的功能片段。優(yōu)選片段以親和常數(shù)(Kd)小于約1nM，優(yōu)選小于約0.5nM及更佳由約0.01nM至約0.4nM特異性結(jié)合TF。特佳為抗原結(jié)合Fab、Fab’、及F(ab)2片段。
如此處討論，本發(fā)明包含人源化抗體，其包括至少一個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，例如CDR1、CDR2、CDR3。
優(yōu)選具體實(shí)施例中，抗體特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)而形成復(fù)合物。典型地，因子X或因子IX結(jié)合至TF或TFFVIIa，被TFFVIIa的活化受到抑制。如前述，優(yōu)選CDRs(輕鏈及重鏈)系來自嚙齒類動(dòng)物來源，典型系來自小鼠。
本發(fā)明的人源化抗體的優(yōu)選具體實(shí)施例中，抗體進(jìn)一步包括至少一個(gè)人類構(gòu)架(FR)區(qū)。優(yōu)選全部FR區(qū)(輕鏈及重鏈)皆為人類來源。
更特定具體實(shí)施例中，重鏈超可變區(qū)的第一CDR(CDR1)具有與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。典型地，重鏈超可變區(qū)的第二CDR(CDR2)具有與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。也優(yōu)選重鏈超可變區(qū)的第三CDR(CDR3)具有與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。
兩個(gè)核酸序列間的同源性可通過檢視及/或使用習(xí)知計(jì)算機(jī)軟件如BLAST或FASTA測定。
本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，輕鏈超可變區(qū)的第一CDR(CDR1)具有與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。典型地，輕鏈超可變區(qū)的第二CDR(CDR2)具有與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。也優(yōu)選輕鏈超可變區(qū)的第三CDR(CDR3)具有與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且優(yōu)選至少與該序列具有約95％或以上的同源性。
此外本發(fā)明的人源化抗體包括重鏈超可變區(qū)的第一構(gòu)架(FR1)，該FR1與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1 HC-08」至少具有同源性90％。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R1包含至少一種如下氨基酸變化E1至Q；Q5至V；P9至G；LI1至V；V12至K；Q19至R；及T24至A。優(yōu)選FR1包括2、3、4、5或6個(gè)該等變化，全部氨基酸變化對多項(xiàng)用途為優(yōu)選。
其它本發(fā)明的人源化抗體包括重鏈超可變區(qū)的第二構(gòu)架(FR2)，該FR2與第13A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2 HC-08」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R2包含至少一種下列氨基酸變化41H至P；及44S至G。優(yōu)選FR2包括此二種氨基酸變化。
本發(fā)明也包含人源化抗體其中重鏈超可變區(qū)的第三構(gòu)架(FR3)，該FR3與第13A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3 HC-08」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R3包含至少一種下列氨基酸變化76S至T；77T至S；80F至Y；82H至E；84N至S；87T至R；89D至E；及91S至T。優(yōu)選FR3包括兩種、三種、四種、五種或六種氨基酸變化，以全部七種氨基酸變化通常為優(yōu)選。
本發(fā)明的特色也包含人源化抗體其中第四構(gòu)架(FR4)，該FR4與第13A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4 HC-08」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R4包含至少一種下列氨基酸變化113L至V。
此外本發(fā)明的人源化抗體包括輕鏈超可變區(qū)的第一構(gòu)架(FR1)，該FR1與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1 LC-09」至少具有同源性90％。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R1包含至少一種如下氨基酸變化11Q至L；15L至V；17E至D；及18至R。優(yōu)選FR1包括兩種或三種氨基酸變化，而以全部四種氨基酸變化為優(yōu)選。
其它本發(fā)明的人源化抗體包括輕鏈超可變區(qū)的第二構(gòu)架(FR2)，該FR2與第12A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2 LC-09」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R2包含至少一種下列氨基酸變化37Q至L。
本發(fā)明也包含人源化抗體其中輕鏈超可變區(qū)的第三構(gòu)架(FR3)，該FR3與第12A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3 LC-09」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R3包含至少一種下列氧基酸變化70K至D；74K至T；80A至P；84A至V；及85N至T。優(yōu)選FR3包括兩種、三種或四種氨基酸變化，以全部五種氨基酸變化通常為優(yōu)選。
另外，本發(fā)明的人源化抗體包括第四構(gòu)架(FR4)，該FR4與第12A圖所示序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4 LC-09」至少90％同源性，且優(yōu)選與該序列具有約95％或以上同源性。一具體實(shí)施例中，F(xiàn)R4包含至少一種下列氨基酸變化100A至Q及106L至I。
本發(fā)明也包含前述人源化抗體的人TF結(jié)合片段。此等片段例如包括Fab、Fab’及F(ab)2。
特定具體實(shí)施例中，本發(fā)明包含人源化抗體，及包括至少一個(gè)嚙齒類動(dòng)物互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，通常為小鼠。優(yōu)選該抗體特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)，來形成復(fù)合物，其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TF/VIIa及藉TF/VIIa活化受到抑制。也優(yōu)選人源化抗體于重鏈包括下列成分中的至少一種，且更佳包括全部a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，d)第一構(gòu)架(FR1)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1HC-08」至少95％相同，e)第二構(gòu)架(FR2)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2HC-08」至少95％相同，f)第三構(gòu)架(FR3)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3HC-08」至少95％相同，及g)第四構(gòu)架(FR4)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4HC-08」至少95％相同。
特定具體實(shí)施例中，也優(yōu)選人源化抗體于輕鏈包括下列成分中的至少一種，且優(yōu)選包括全部h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，k)第一構(gòu)架(FR1)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1LC-09」至少95％相同，
l)第二構(gòu)架(FR2)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2LC-09」至少95％相同，m)第三構(gòu)架(FR3)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3LC-09」至少95％相同，及n)第四構(gòu)架(FR4)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4LC-09」至少95％相同。優(yōu)選人源化抗體進(jìn)一步包括第14A圖(SEQ ID NO.＿)或第15A圖(SEQ ID NO.＿)的輕鏈恒定序列。也優(yōu)選，抗體包括第14B圖(SEQ ID NO.＿)或第15B圖(SEQ ID NO.＿)的重鏈恒定區(qū)。
本發(fā)明也有特色在于一種人源化抗體于重鏈包括下列成分中的至少一種，且優(yōu)選包括全部a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，d)第一構(gòu)架(FR1)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1HC-08」完全相同，e)第二構(gòu)架(FR2)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2HC-08」完全相同，f)第三構(gòu)架(FR3)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3HC-08」完全相同，及g)第四構(gòu)架(FR4)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4HC-08」完全相同。
一具體實(shí)施例中，也優(yōu)選人源化抗體于輕鏈包括下列成分中的至少一種，且優(yōu)選包括全部h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，k)第一構(gòu)架(FR1)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR1LC-09」完全相同，l)第二構(gòu)架(FR2)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR2LC-09」完全相同，
m)第三構(gòu)架(FR3)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR3LC-09」完全相同，及n)第四構(gòu)架(FR4)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)為「FR4LC-09」完全相同。優(yōu)選人源化抗體進(jìn)一步包括第14A圖(SEQ ID NO.＿)或第15A圖(SEQ ID NO.＿)的輕鏈恒定序列。也優(yōu)選，抗體包括第14B圖(SFQ ID NO.＿)或第15B圖(SEQ ID NO.＿)的重鏈恒定區(qū)。
本發(fā)明的人源化抗體除了完整抗體的外，可呈多種適當(dāng)形式存在；包括例如Fv、Fab及F(ab’)2以及雙官能雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，歐洲免疫期刊17，105(1987))；及呈單鏈存在[例如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，85，5879-5883(1988)及Bird等人，科學(xué)242，423-426(1988)，以引用方式并入此處]。[參考Hood等人，免疫學(xué)，Benjamin，，N.Y.2.sup.nd ed.(1984)，Harlow及Lane，抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)及Hunkapiller及Hood，自然，323，15-16(1986)，以引用方式并入此處]。
「嵌合型抗體」一詞或相關(guān)術(shù)語包括復(fù)數(shù)型，表示抗體，其輕鏈基因及重鏈基因典型已經(jīng)藉基因工程而由屬于不同種屬的免疫球蛋白基因片斷組合而成。例如來自小鼠單克隆抗體基因的可變(V)片斷可接合至人類恒定(C)片斷如γ1γ3。典型治療嵌合型抗體為來自小鼠抗體如V領(lǐng)域或抗原結(jié)合領(lǐng)域及來自人抗體的C領(lǐng)域或效應(yīng)物領(lǐng)域組成的雜交蛋白質(zhì)，但也可使用其它總哺乳動(dòng)物。特佳嵌合型抗體為此處揭示的cH36小鼠-人嵌合體。
本發(fā)明的人源化抗體可視需要為多株抗體或單克隆抗體，可具有IgG1或IgG4同基因型。
此處揭示的人源化抗體可藉包括前文參照的一種策略或組合策略制造。例如參考S.L.Morrison，參見上文；Oi等人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor等人，參見上文；Olsson等人，參見上文；及前文引用的其它參考文獻(xiàn)。
一種辦法中，采用四個(gè)一般步驟來人源化抗體。第一，小鼠抗體輕鏈及重鏈的氨基酸序列來自cH36小鼠-人嵌合型抗體。第二，cH36抗體通過測定何者人抗體構(gòu)架區(qū)可獲得「最佳匹配」而人化，「最佳匹配」表示最類似對應(yīng)的小鼠構(gòu)架氨基酸序列。第三，將相關(guān)輕鏈及重鏈FR序列人化；以及第四，轉(zhuǎn)移感染且表達(dá)編碼人化輕鏈或重鏈的經(jīng)分離的核酸(或人化輕鏈及重鏈，例如參考后述mega載體)。
某些情況下，有限數(shù)目的人化免疫球蛋白的構(gòu)架氨基酸經(jīng)選擇為與供體位置氨基酸相同，而非與受體位置氨基酸相同。此項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)系提升包括人化免疫球蛋白鏈抗體的親和力。也參考美國專利第5,985,279；5,693,762號；及EP-A0239400(揭示制造人源化抗體的概略方法)。
特別以應(yīng)用「最佳匹配」辦法來人化嵌合型抗組織因子抗體cH36為特佳。此種辦法中，第1A及1B圖(SEQ ID NOS2及4)顯示的鼠輕鏈及鼠重鏈可變序列用來搜尋(「比對」)全部可來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，有關(guān)該等人抗體可變領(lǐng)域序列而該等序列系與鼠可變序列最具有同構(gòu)型。例如參考Kabat等人，參見上文。多種易得的計(jì)算機(jī)程序可用來執(zhí)行此項(xiàng)步驟，例如BLAST、FASTA等程序及相關(guān)程序。輕鏈及重鏈的構(gòu)架1、2、3及4特別令人感興趣，原因在于此等部位最為眾所周知保有于抗原結(jié)合適當(dāng)方向性的CDRs。搜尋結(jié)果的輸出，典型為與查詢的小鼠序列最具有同構(gòu)型的序列、對各個(gè)序列的同構(gòu)型百分比、以及各個(gè)人序列與對應(yīng)小鼠序列的對正程度的窗體。分析通常系于輕鏈及重鏈獨(dú)立進(jìn)行。
根據(jù)「最佳匹配」辦法，查詢小鼠構(gòu)架序列與數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)人類構(gòu)架序列間的氨基酸不匹配數(shù)目最小化。大部分情況下，適當(dāng)人類構(gòu)架區(qū)系基于下列相同性標(biāo)準(zhǔn)選擇。于輕鏈，小鼠FR1的氨基酸序列系與對應(yīng)人類FR1至少約80％相同；小鼠FR2與對應(yīng)人類FR2至少約90％；小鼠FR3與對應(yīng)人類FR3至少約90％；以及小鼠FR4與對應(yīng)人類FR4至少約75％。以及于重鏈，小鼠FR1的氨基酸序列系與對應(yīng)人類FR1至少約80％相同；小鼠FR2與對應(yīng)人類FR2至少約85％；小鼠FR3與對應(yīng)人類FR3至少約70％；以及小鼠FR4與對應(yīng)人類FR4至少約90％。典型地當(dāng)評估類似的候選人類構(gòu)架序列時(shí)，以保留性氨基酸取代為佳。發(fā)現(xiàn)當(dāng)考慮此等因素時(shí)，結(jié)果所得人類構(gòu)架可作為嵌合型cH36抗體的人化的良好參考點(diǎn)。
也優(yōu)選，根據(jù)「最佳匹配」辦法，于輕鏈及重鏈的全部人類構(gòu)架皆系衍生自可能的相同人類抗體克隆。
一旦已經(jīng)決定所需人類構(gòu)架，使用重組聚合酶連續(xù)反應(yīng)(PCR)技術(shù)來于輕鏈及重鏈二鏈進(jìn)行期望的氨基酸取代。典型地制造寡核苷酸，用來將小鼠可變領(lǐng)域構(gòu)架突變成為含有所需殘基。采用有多種不同長度的寡核苷酸。參考WO92/07075有關(guān)重組PCR方法及相關(guān)方法的廣義揭示。
通常，常規(guī)PCR用來轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入轉(zhuǎn)化部位或診斷用核酸內(nèi)切酶部位，以及改變位于可變區(qū)末端的氨基酸殘基。以PCR為主的突變用來特別于殘基位在可變區(qū)中央時(shí)，一次改變多個(gè)氨基酸殘基。部位取向突變用來一次導(dǎo)入一或二個(gè)氨基酸取代。于各步驟，部分人化克隆經(jīng)過定序，部分可變區(qū)后來轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體。更特別的進(jìn)行此等操控方法述于實(shí)施例乙節(jié)。
于進(jìn)行前述「最佳匹配」辦法來人化嵌合型cH36抗體后，編碼構(gòu)架及/或CDR的突變后的核酸聯(lián)結(jié)至編碼輕鏈或重鏈恒定區(qū)的適當(dāng)DNA。然后此等組合物轉(zhuǎn)化入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移感染入宿主細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳類細(xì)胞。此等步驟系使用業(yè)界已知的重組技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)達(dá)成。如此本發(fā)明的人源化抗體可藉后述廣義方法制備(a)制備第一表達(dá)載體，其包括一個(gè)適合表達(dá)宿主的復(fù)制子，以及一個(gè)工作式連結(jié)至DNA序列的適當(dāng)激活基因，其編碼Ig重鏈或輕鏈的至少一個(gè)可變領(lǐng)域，該可變領(lǐng)域包含根據(jù)「最佳匹配」辦法制備的人化構(gòu)架區(qū)1-4及來自cH36抗體的鼠CDRs1-3，(b)制備一第二可復(fù)制表達(dá)載體，其包括一適當(dāng)激活基因工作式聯(lián)結(jié)至一DNA序列，該DNA序列分別至少編碼互補(bǔ)Ig輕鏈或重鏈的可變領(lǐng)域，該可變領(lǐng)域包含根據(jù)「最佳匹配」辦法制備的人化構(gòu)架區(qū)1-4及來自cH36抗體的鼠CDRs1-3；(c)以第一制備所得載體或二載體轉(zhuǎn)移感染一細(xì)胞系；以及(d)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)移感染后的細(xì)胞系來制造經(jīng)過改變的抗體。
優(yōu)選于步驟(a)及(b)的DNA序列編碼來自人抗體鏈的適當(dāng)恒定領(lǐng)域。適當(dāng)同基因型例如包括IgG1及IgG4。
另外，本發(fā)明的適當(dāng)人源化抗體的制備方式，系通過制備單一可復(fù)制「mega」載體，其包括適當(dāng)激活基因工作式連結(jié)至一DNA序列，其編碼Ig重鏈或輕鏈的至少一個(gè)可變領(lǐng)域，該可變領(lǐng)域包含根據(jù)「最佳匹配」辦法制備的人化構(gòu)架區(qū)1-4及來自cH36抗體的鼠CDRs1-3。優(yōu)選該mega載體進(jìn)一步包括適當(dāng)激活基因工作式連結(jié)至一DNA序列，其編碼互補(bǔ)Ig輕鏈或重鏈的至少一個(gè)可變領(lǐng)域，該可變領(lǐng)域包含根據(jù)「最佳匹配」辦法制備的人化構(gòu)架區(qū)1-4及來自cH36抗體的鼠CDRs1-3。mega載體的使用經(jīng)常系適合用于需要由單一載體表達(dá)人源化抗體的本發(fā)明的具體實(shí)施例。
其它方法也極為適合用于制造本發(fā)明的人源化抗體及片段。一具體實(shí)施例中，該方法包括下列至少一個(gè)步驟，且優(yōu)選包括全部步驟a)比較來自嚙齒類動(dòng)物抗體的輕鏈構(gòu)架的氨基酸序列與對應(yīng)人類抗體構(gòu)架序列(優(yōu)選為小鼠抗體)的集合，b)由該集合選出與對應(yīng)嚙齒類動(dòng)物輕鏈構(gòu)架具有最大氨基酸序列同源性(亦即至少于70％序列同源性)的人類構(gòu)架序列，c)突變編碼嚙齒類動(dòng)物輕鏈構(gòu)架的DNA片斷來編碼一種人化輕鏈構(gòu)架，其具有氨基酸序列系與步驟b)選定的人類構(gòu)架序列實(shí)質(zhì)相同(亦即至少約95％相同)，d)對嚙齒類動(dòng)物輕鏈的個(gè)別構(gòu)架重復(fù)步驟a)至c)，來產(chǎn)生多個(gè)DNA序列，其中各個(gè)序列編碼一種人化輕鏈構(gòu)架，其中于步驟b)選定的對應(yīng)人類構(gòu)架序列個(gè)別系由相同或不同的人抗體制備，e)將步驟d)制造的編碼人化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成為一第一載體，其編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的輕鏈可變區(qū)；以及f)于足夠制造人源化抗體的條件下，將組裝后的抗體導(dǎo)入一適當(dāng)宿主內(nèi)。優(yōu)選用于該方法的輕鏈構(gòu)架序列包括此處揭示的特定小鼠輕鏈構(gòu)架及人化輕鏈構(gòu)架。
一具體實(shí)施例中，前述人源化抗體制造方法進(jìn)一步包括至少一個(gè)下列步驟且優(yōu)選全部步驟g)比較來自嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈構(gòu)架的氨基酸序列與對應(yīng)人類抗體構(gòu)架序列的集合，h)由該集合選出與對應(yīng)嚙齒類動(dòng)物重鏈構(gòu)架具有最大氨基酸序列同源性(亦即至少于70％序列同源性)的人類構(gòu)架序列，i)突變編碼嚙齒類動(dòng)物重鏈構(gòu)架的DNA片斷來編碼一種人化重鏈構(gòu)架，其具有氨基酸序列系與步驟h)選定的人類構(gòu)架序列實(shí)質(zhì)相同(亦即至少約95％相同)；以及j)對嚙齒類動(dòng)物重鏈的個(gè)別構(gòu)架重復(fù)步驟g)至i)，來產(chǎn)生多個(gè)DNA序列，其中各個(gè)序列編碼一種人化重鏈構(gòu)架。優(yōu)選于步驟h)選定的對應(yīng)人類構(gòu)架序列個(gè)別系由相同或不同的人抗體制備。優(yōu)選用于該方法的重鏈構(gòu)架序列包括此處揭示的特異性小鼠重鏈構(gòu)架及人化重鏈構(gòu)架。
更特別制造人源化抗體的方法包括將步驟j)制造的編碼人化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成為一第二載體，其編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)；以及于足夠制造人源化抗體的條件下，將組裝后的第一及第二載體導(dǎo)入宿主內(nèi)。
如前文討論，經(jīng)常需要由單一載體來表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體，該單一載體偶爾稱作為「mega」載體。一具體實(shí)施例中，該方法包括將步驟j)制造的編碼人化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的第一載體；以及進(jìn)一步將組裝后的第一載體于足夠制造人源化抗體的條件下導(dǎo)入宿主內(nèi)。
「組裝」或「組裝后」一詞表示使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來將編碼人化構(gòu)架的本DNA序列導(dǎo)入載體內(nèi)。此種組裝可藉一種辦法或多種辦法的組合進(jìn)行，該等辦法包括(但非限制性)將迭代變化導(dǎo)入單一構(gòu)架序列將各片段剪接在一起(通過使用限剪核酸內(nèi)切酶及接合酶剪接)，或通過合成DNA合成技術(shù)進(jìn)行組裝。概略參考Harlow及Lane參見上文及Ausubel等人參見上文。
前述制造人源化抗體的方法可使用幾乎任一種可接受的突變發(fā)生技術(shù)實(shí)施。特別如上步驟c)及i)的一者或二者可采用部位取向突變發(fā)生方法或標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，來使用適當(dāng)人類氨基酸置換構(gòu)架的預(yù)定嚙齒類動(dòng)物氨基酸。典型地修改后的(人化)構(gòu)架序列系對應(yīng)由基因庫選出的人類構(gòu)架序列。
人源化抗體可使用任一種重組表達(dá)系統(tǒng)制備，例如前文于S.L.Morrison參見上文；Oi等人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor等人，參見上文；Olsson等人，參見上文；及其它前文引述的參考文獻(xiàn)揭示的重組表達(dá)系統(tǒng)。
例如本發(fā)明的適當(dāng)核酸編碼此處揭示的人源化抗體或其片段的重鏈或輕鏈中的至少一種。典型地，核酸為包括該經(jīng)分離的核酸的重組DNA載體。DNA載體典型進(jìn)一步包括一表達(dá)控制多核苷酸序列，其以工作式連結(jié)至人化免疫球蛋白編碼序列，包括天然關(guān)聯(lián)的激活基因區(qū)、或非同質(zhì)激活基因區(qū)。優(yōu)選表達(dá)控制序列為真核激活基因系統(tǒng)于可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移感染真核宿主細(xì)胞的載體，但也可使用原核宿主用的控制序列。一旦載體已經(jīng)結(jié)合于適當(dāng)宿主，宿主被維持于適合高度表達(dá)核酸序列的條件下，若有所需，輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二元體或完好抗體、結(jié)合片段或其它免疫球蛋白形式的收集與純化說明如后。
最終可表達(dá)所需人源化抗體的本發(fā)明核酸序列可由多種不同多核苷酸(基因體或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等)及其組成元體(例如V、J、D及C區(qū))形成，以及藉多種不同方法制造。接合適當(dāng)基因體序列及合成序列為最常見的制法，但也可使用cDNA序列。例如參考S.L.Morrison，參見上文；Oi等人，參見上文；Teng等人，參見上文；Kozbor等人，參見上文；Olsson等人，參見上文；歐洲專利公告案第0239400號及Riechmann，L.等人，自然，332，323-327(1988)；及其中引述的參考文獻(xiàn)。
一具體實(shí)施例中，適當(dāng)DNA表達(dá)載體包括一或多個(gè)選擇標(biāo)記例如四環(huán)素(tetracycline)、安比西林(ampicillin)或新霉素(neomycin)，使允許檢測以所需DNA序列轉(zhuǎn)化的該等細(xì)胞(例如參考美國專利第4,704,362號，該案以引用方式并入此處)。大腸桿菌屬于特別可用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的多核苷酸的一種原核宿主。其它適合使用的微生物宿主包括(但非限制性)細(xì)菌如枯草桿菌(Bacillus subtilus)及其它腸細(xì)菌科如沙門氏菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)、多種假單胞桿菌屬(Pseudomonas species)及其它微生物例如放線菌(如鏈絲菌屬(Streptomyces species))、酵母(例如釀母菌屬(Saccharomyces species))或真菌(例如曲菌屬(Aspergillus species))。此等原核宿主中也可制造表達(dá)載體，其典型含有可與宿主細(xì)胞兼容的表達(dá)控制序列(例如激活基因及復(fù)制起點(diǎn))。此外，存在有多種眾所周知的激活基因的任一者，例如乳糖激活基因系、色氨酸(trp)激活基因系、β-內(nèi)醯胺激活基因系或來自噬菌體λ的激活基因系。激活基因典型可控制表達(dá)，選擇性使用操縱基因序列控制表達(dá)，具有核糖體結(jié)合部位序列等供引發(fā)以及完成轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯。其它微生物如酵母也可用于表達(dá)。以釀母菌為優(yōu)選宿主，適當(dāng)載體具有表達(dá)控制序列如激活基因包括3-磷酸甘油酸激酶及其它糖分解酶以及視需要包括復(fù)制起點(diǎn)、終結(jié)序列等。植物(例如阿拉伯草屬(Arabidopsis)、煙草屬(Nicotinia)等)及植物細(xì)胞培養(yǎng)也可用來表達(dá)及制造本發(fā)明抗體。
除了前述以微生物為主的系統(tǒng)外，哺乳類組織細(xì)胞培養(yǎng)也可用來表達(dá)及制造本發(fā)明的多(參考Winnacker，由基因至克隆，VCH出版社，紐約州紐約，(1987年)，其引用方式并入此處)。
多種情況下以真核細(xì)胞通常為優(yōu)選，典型為CHO細(xì)胞系、多種COS細(xì)胞系、NSO細(xì)胞、BK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞，優(yōu)選為骨髓瘤細(xì)胞系等或融合瘤的轉(zhuǎn)化B細(xì)胞。此等細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列如復(fù)制起點(diǎn)、激活基因及促進(jìn)子(Queen等人，免疫學(xué)綜論，89，46-68(1986))，以及需要的處理信息部位例如核糖體結(jié)合部位、RNA剪接部位、聚腺苷化部位及轉(zhuǎn)錄終結(jié)基因序列。優(yōu)選表達(dá)控制序列為衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳突瘤病毒、細(xì)胞巨病毒等的激活基因。
實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選DNA載體包括下列以工作式聯(lián)結(jié)的序列抗生素抗藥性標(biāo)記例如安比西林抗藥性F1起點(diǎn)及重鏈(HC)或輕鏈(LC)可變區(qū)。該可變區(qū)可插入適當(dāng)HC表達(dá)載體，其包括以操作式聯(lián)結(jié)的下列序列HC可變區(qū)、人IgG1或IgG4恒定區(qū)、第一多A部位、SV40激活基因、抗生素抗藥性標(biāo)記例如新霉素抗藥性、第二多A部位、細(xì)胞巨病毒(CMV)激活基因/促進(jìn)子及適當(dāng)前導(dǎo)子序列。
額外優(yōu)選DNA載體包括LC可變區(qū)，以工作式聯(lián)結(jié)至嚙齒類動(dòng)物κ插入序列(例如小鼠)，該插入序列系工作式聯(lián)結(jié)至適當(dāng)人κ恒定區(qū)；及抗生素抗藥性標(biāo)記例如新霉素抗藥性。
如前文討論，由單一核酸表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體經(jīng)常高度有用。優(yōu)選DNA載體偶爾于此處稱作為「mega」載體，其序列包括下列成分以工作式聯(lián)結(jié)SV40激活基因、抗生素抗藥性標(biāo)記如新霉素、第一多A部位、第一CMV激活基因/促進(jìn)子、LC可變區(qū)、嚙齒類動(dòng)物κ插入序列(例如小鼠)、人κ表達(dá)序列、第二多A部位、第二CMV激活基因/促進(jìn)子、HC可變序列及人類IgG1或IgG4重鏈恒定區(qū)。此種mega載體的特例為后文于實(shí)施例說明的人源化抗TF IgG1抗體表達(dá)載體。也參考第11圖。
以下三種核酸載體pSUN36(人源化抗-TF抗體Ig G1-HC表達(dá)載體)、pSUN37(人源化抗-TF抗體Ig G4-HC表達(dá)載體)及pSUN38(人源化抗-TF抗體LC表達(dá)載體)已經(jīng)遵照布達(dá)佩斯條約保藏于美國種型培養(yǎng)收集會(huì)(ACTT)，于維吉尼亞州20110-2209馬娜薩司，布得瓦大學(xué)10801號。載體被指定如下保藏號PTA-3727(pSUN36)；PTA-3728(pSUN37)；及PTA-3729(pSUN38)。
多種適當(dāng)宿主細(xì)胞可用來制造此處揭示的人源化抗體及片段。一具體實(shí)施例中，該方法包括提供一宿主細(xì)胞被轉(zhuǎn)移感染以1)一編碼人源化抗體或其片段輕鏈的第一表達(dá)載體，以及一編碼人源化抗體或其片段重鏈的第二表達(dá)載體；或2)一單一表達(dá)載體其編碼人源化抗體或其片段的輕鏈及重鏈二者；將該宿主細(xì)胞維持于可表達(dá)各鏈的生長條件下；以及分離人源化抗體或其片段。
例如經(jīng)轉(zhuǎn)移感染而產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞系可為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、BK細(xì)胞系或NSO細(xì)胞系。進(jìn)一步可接收的細(xì)胞系包括經(jīng)辨識(shí)的永生哺乳類細(xì)胞系，優(yōu)選為淋巴來源細(xì)胞系，例如骨髓瘤細(xì)胞系、融合瘤細(xì)胞系、三合瘤細(xì)胞系或四合瘤細(xì)胞系。細(xì)胞系也包含正常淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞，其已經(jīng)使用病毒如EB病毒(Epstein-Barr virus)轉(zhuǎn)化而永生化。曾經(jīng)報(bào)告使用CHO細(xì)胞來表達(dá)多種蛋白質(zhì)的方法。例如參考Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77 4216-4220(1980))及WO87/04462。NSO細(xì)胞也優(yōu)選，說明如下實(shí)施例乙節(jié)。
雖然用來產(chǎn)生人源化抗體的細(xì)胞系優(yōu)選為哺乳類細(xì)胞系，但另外也可使用任何其它細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞。特別預(yù)期可使用大腸桿菌衍生的細(xì)菌種系。
一旦由適當(dāng)細(xì)胞來源表達(dá)，全抗體、其二元體、個(gè)別輕鏈及重鏈或本發(fā)明的其它免疫球蛋白形式(如功能化人源化抗體片段)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序回收及純化。此等程序包括(但非限制性)硫酸銨沉淀、親和管柱、管柱層析術(shù)、凝膠電泳等(概略參考Scopes，R.，蛋白質(zhì)純化，史賓基凡拉革(Springer-Verlag)，紐約(1982))。實(shí)質(zhì)純質(zhì)的本發(fā)明人源化抗體及其片段具有至少約90至95％同構(gòu)型，以具有約98至99％或以上同構(gòu)型用于大部分藥物用途為優(yōu)選。一旦純化后，部分純化或視需要純化為均質(zhì)后，人源化抗體可供治療用，或用于發(fā)展及進(jìn)行檢定分析程序、免疫螢光染色等(概略參考免疫學(xué)方法第I及II期，Lefkovits及Pernis編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約州紐約(1979年及1981年))。
優(yōu)選純化本人源化抗體的方法涉及習(xí)知親和層析術(shù)及離子交換層析術(shù)，優(yōu)選系使用重組蛋白質(zhì)A西法羅司(Sepharose)(已知人Ig G Fc對其具有高度親和力)。含抗體部分經(jīng)收集，接受進(jìn)一步離子交換層析術(shù)，優(yōu)選使用Q西法羅司進(jìn)行離子交換層析術(shù)。含蛋白質(zhì)畸峰的抗體經(jīng)匯集，對適當(dāng)溶液或緩沖液例如PBS滲析。
根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體及其片段可藉一種方法或多種標(biāo)準(zhǔn)方法的組合來測試其功能。優(yōu)選試驗(yàn)檢定分析TF功能的抑制。優(yōu)選方法偶爾于此處稱作為「標(biāo)準(zhǔn)凝血酶原時(shí)間」檢定分析等相關(guān)名詞。標(biāo)準(zhǔn)凝血酶原時(shí)間(PT)檢定分析典型涉及以下至少一個(gè)且優(yōu)選全部步驟a)組合TF及因子VIIa而形成結(jié)合復(fù)合物，b)于可形成因子Xa(或因子IXa)的條件下，讓結(jié)合復(fù)合物接觸因子X(或因子IX)，c)因子Xa接觸凝血酶原來產(chǎn)生凝血酶原，優(yōu)選系于Va及脂質(zhì)存在下接觸。
進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PT檢定分析是優(yōu)選TF來源于市面上可以商品名印奴文(Innovin)獲得。血液因子的優(yōu)選來源為人血漿制劑稱作西拙(Ci-Trol)凝血控制。
此處提供的人源化抗體及其片段易于檢定分析試驗(yàn)。一整份經(jīng)純化后的抗體或片段優(yōu)選為約200nM至約2000nM添加至該方法，優(yōu)選系于步驟a)的前添加，但于檢定分析的其它點(diǎn)添加對某些用途亦優(yōu)選。典型地，人源化抗體或其片段添加至Ci-Trol凝血控制，接著添加TF。
包括全I(xiàn)gG、Fab、Fab’、F(ab)2及單鏈抗體(包含人源化抗體的抗原結(jié)合可變區(qū))的高度優(yōu)選人源化抗體及其片段，當(dāng)以至少約1nM至約20nM，優(yōu)選約5nM至約15nM及更優(yōu)選約10nM存在于標(biāo)準(zhǔn)檢定分析時(shí)，將延長凝血時(shí)間至少約5秒。典型對照為進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PT檢定分析，而未添加任何抗體或其片段。額外優(yōu)選的本發(fā)明抗體及片段比例對照組，可達(dá)成至少約90％抑制TF-相依性凝血，優(yōu)選達(dá)成至少約95％抑制或以上。標(biāo)準(zhǔn)PT檢定分析的特例述于實(shí)施例。
雖然前文已經(jīng)說明本發(fā)明的治療性抗凝血?jiǎng)┙M合物的范圍，但預(yù)期涵蓋其它包括人源化抗體及其片段的組合物。例如此種抗體及其片段可用作為唯一治療劑，或組合一或多種其它人源化抗體或其片段來達(dá)成預(yù)定結(jié)果。此種抗體及片段也可組合其它抗體使用，特別為可與細(xì)胞上該病相關(guān)的其它標(biāo)記反應(yīng)的人類單克隆抗體。
前文已經(jīng)說明寬廣多種本發(fā)明抗體及其片段的主要使用范圍，例如用來檢測生物標(biāo)本的天然TF，用來檢測及純化可表達(dá)TF的細(xì)胞，以及用來預(yù)防或治療醫(yī)療病情，例如人類病人的非期望的凝血。實(shí)際上，人源化抗體可用作為分開給藥組合物結(jié)合其它抗凝血?jiǎng)┦褂?，其它抗凝血?jiǎng)┌ò⑺酒チ?、香豆素、肝素、水蛭素或類水蛭素。也包含共同投予抗血小板?例如李歐波(ReoPro)、英特革林(Integrilin)、亞各司特(Aggrestat)、普拉威(Plavix)、及/或提克里(Ticlid)及/或血栓溶解劑(例如組織胞質(zhì)素原活化劑、鏈激酶及尿激酶)。
于具體實(shí)施例中其中此處所述治療性抗凝血?jiǎng)┙M合物包括一或多種人源化抗體或片段，該組合物包括抗體或其混合液溶解于可接受的載劑優(yōu)選為水性載劑的溶液。前文已經(jīng)敘述多種水性載劑，例如水、經(jīng)緩沖的水、0.4％食鹽水、0.3％甘胺酸等。此等溶液優(yōu)選為無菌，且通常不含顆粒物質(zhì)。組合物可藉習(xí)用的眾所周知的滅菌技術(shù)滅菌。組合物可含有所需醫(yī)藥上可接受的輔劑物質(zhì)，來近似生理?xiàng)l件，該等物質(zhì)例如為pH調(diào)節(jié)劑及緩沖劑、毒性調(diào)整劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。本調(diào)配劑的抗體濃度可有寬廣變化，例如由低于約0.5％，通常于或至少約1％至高達(dá)15％或20％重量比，將根據(jù)選用的特定給藥模式主要系依據(jù)流體容積、黏度等選用。概略參考雷明頓制藥科學(xué)，參見上文。
若有所需，此處所述治療性抗凝血?jiǎng)┙M合物可經(jīng)凍干供儲(chǔ)存，而于使用前于適當(dāng)載劑重新調(diào)制。此項(xiàng)技術(shù)顯示可有效用于習(xí)知免疫球蛋白。任一種適當(dāng)凍干技術(shù)及重新調(diào)制技術(shù)皆可采用。熟諳技藝人士了解凍干及重新調(diào)制可能導(dǎo)致不等程度的抗體活性喪失(例如使用習(xí)知免疫球蛋白、IgM抗體的活性喪失大于IgG抗體)，須調(diào)整用量濃度來補(bǔ)償。
用于若干預(yù)防性用途，將治療性抗凝血?jiǎng)┙M合物投予尚未出現(xiàn)任何可檢測的疾病狀態(tài)的病人，將有助于提升對疾病的抵抗力。此種用量定義為「預(yù)防性有效劑量」。于此種用途，精確用量再度系依據(jù)病人健康狀況及全面性免疫力狀態(tài)決定，但通常劑量系于每病人每劑0.1至25毫克特別0.5至2.5毫克的范圍。優(yōu)選預(yù)防性用途系用來預(yù)防預(yù)定接受侵入性醫(yī)療手術(shù)后預(yù)防非期望的凝血。
如前文討論，本發(fā)明也提供試劑盒，其包括本抗體或其片段。一具體實(shí)施例中，人源化抗體或其片段可用來對抗TF抗原，或用來檢測TF抗原。如此，可提供一或多種人源化抗體其片段或單鏈抗體，通常呈凍干形式于容器提供。此種抗體、片段或單鏈抗體可共軛至前述標(biāo)記或毒素，或未經(jīng)共軛，此等抗體或其片段與緩沖劑(如Tris、硫酸鹽、碳酸鹽等)、安定劑、殺生物劑、惰性蛋白(如血漿白蛋白)等共同含括于試劑盒。通常此等材料的存在量基于活性抗體含量低于約5％重量比；通常存在總量基于抗體濃度至少約為0.001％wt.。經(jīng)常需要含括惰性增量劑或賦形劑來稀釋活性成分，賦形劑的存在量系占總組合物的約1％至99％wt.。若于檢定分析采用可結(jié)合至嵌合型抗體的第二抗體，則第二抗體通常系存在于分開小瓶。第二抗體典型共軛至標(biāo)記，且以前述抗體調(diào)配物的類似方式調(diào)配。試劑盒通常包括一組使用指征。
如前文討論，本發(fā)明也提供于哺乳類，優(yōu)選為靈長類例如人類病人抑制血液凝固的方法。
例如于一具體實(shí)施例中，該方法包括對哺乳類投予治療有效量的此處提供的人源化抗體或其片段中的至少一種且優(yōu)選為一、二或三者，其特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)而形成復(fù)合物。典型地，因子X或因子IX結(jié)合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。大部分具體實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成抗體與TF間的特定復(fù)合物來抑制凝血。
也提供抑制哺乳類動(dòng)物凝血的方法，包括對哺乳類投予治療有效量的此處揭示的人源化抗體或其片段。典型地抗體及其片段特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)而形成復(fù)合物；進(jìn)一步，其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。大部分具體實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成抗體與TF間的特定復(fù)合物來抑制凝血。
更特定實(shí)施例中，本發(fā)明提供抑制哺乳類動(dòng)物凝血的方法，包括對哺乳類投予治療有效量的此處揭示的人源化抗體或其片段。典型地抗體及其片段特異性結(jié)合至人類組織因子(TF)而形成復(fù)合物；進(jìn)一步，其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。優(yōu)選，人源化抗體或其片段于重鏈包括下列成分中的至少一種，優(yōu)選為全部a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，d)第一構(gòu)架(FR1)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1HC-08」至少為95％相同，e)第二構(gòu)架(FR2)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2HC-08」至少為95％相同，f)第三構(gòu)架(FR3)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3HC-08」至少為95％相同，g)第四構(gòu)架(FR4)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4HC-08」至少為95％相同。
本發(fā)明的更特定具體實(shí)施例中，人源化抗體于輕鏈包括下列成分中的至少一種，且包括全部下列成分h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少為95％相同，k)第一構(gòu)架(FR1)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1LC-09」至少為95％相同，l)第二構(gòu)架(FR2)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2LC-09」至少為95％相同，m)第三構(gòu)架(FR3)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3LC-09 」至少為95％相同，n)第四構(gòu)架(FR4)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4LC-09」至少為95％相同，o)輕鏈恒定區(qū)，其與第14A圖(SEQ ID NO.＿)或第15A圖(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列至少為95％相同；以及p)重鏈恒定區(qū)，其與第14B圖(SEQ ID NO.＿)或第15B圖(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列至少為95％相同。
前述方法的更特定具體實(shí)施例中，人源化抗體或其片段于重鏈包括下列成分中的至少一種，優(yōu)選為全部a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，d)第一構(gòu)架(FR1)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1HC-08」完全相同，e)第二構(gòu)架(FR2)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2HC-08」完全相同，f)第三構(gòu)架(FR3)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3HC-08」完全相同，g)第四構(gòu)架(FR4)其系與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4HC-08」完全相同；以及于輕鏈h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，
i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，k)第一構(gòu)架(FR1)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1LC-09」完全相同，l)第二構(gòu)架(FR2)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2LC-09」完全相同，m)第三構(gòu)架(FR3)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3LC-09」完全相同，n)第四構(gòu)架(FR4)其系與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4LC-09」完全相同，o)輕鏈恒定區(qū)，其與第14A圖(SEQ ID NO.＿)或第15A圖(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列完全相同，以及p)重鏈恒定區(qū)，其與第14B圖(SEQ ID NO.＿)或第15B圖(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列完全相同。
本發(fā)明也提供多種于生物標(biāo)本檢測組織因子(TF)的方法。一具體實(shí)施例中，該方法包括于可形成復(fù)合物的條件下，讓生物標(biāo)本與此處揭示的人源化抗體或其片段接觸，以及檢測該復(fù)合物作為指示TF存在于生物標(biāo)本。
此處所述參考文獻(xiàn)全文以引用方式并入此處。
后文非限制性實(shí)施例系供舉例說明本發(fā)明。后文實(shí)施例中及它處，述及抗體H36及H36.D2。該等抗體系與H36.D2.B7相同的抗體，但H36系衍生自母克隆，H36.D2系來自一次克隆，而H36.D2.B7系來自二次克隆。此三克隆就抑制TF能力或其它物理性質(zhì)而言，未見任何差異。通常使用時(shí)，H36常用來指征由任一克隆或可產(chǎn)生抗體的相關(guān)細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗-TF抗體。
實(shí)施例1-抗-rhTF單克隆抗體的制備及轉(zhuǎn)化抗rhTF的單克隆抗體制備如后。
A.免疫接種及追加接種五頭BALB/c雌小鼠使用各10微克脂質(zhì)化經(jīng)純化的rhTF免疫接種。小鼠最初使用漢特氏最大力價(jià)佐劑(Hunter’s Titermax adjuvant)藉腹內(nèi)注射敏化。三次最終追加接種系以0.85％氯化鈉投予。追加接種分別系于初次敏化后的2、5.5及6.5個(gè)月注射。全部追加接種皆由腹內(nèi)投予，但第一劑采用皮下注射。最終追加接種20系于融合前3日給予，給予20微克。
B.小鼠脾淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合來自經(jīng)rhTF免疫接種的BALB/c小鼠脾臟的淋巴細(xì)胞使用PEG1500融合至X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細(xì)胞。暴露于PEG后，細(xì)胞于37℃于熱失活胎牛血清培養(yǎng)1小時(shí)。然后融合細(xì)胞再懸浮于RPMI1640，于37℃與10％二氧化碳共同培養(yǎng)隔夜。細(xì)胞于次日使用RPMI1640接種，且補(bǔ)充巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
C.ELISA展開ELISA免疫接種孔板涂覆以100微升重組組織因子(0.25微克/毫升)于以碳酸鹽為主的緩沖液。全部步驟皆系于室溫進(jìn)行?？装逡訠SA阻斷，洗滌，然后加入試驗(yàn)標(biāo)本及對照?？乖?抗體結(jié)合系通過孔板與山羊抗小鼠HRP共軛物(杰克森(Jackson)免疫研究實(shí)驗(yàn)室)共同培養(yǎng)，然后使用ABTS過氧化酶基質(zhì)系統(tǒng)(克克格及派瑞(Kirkegaard and Perry)實(shí)驗(yàn)室)檢測。于自動(dòng)孔板讀取器于405納米波長讀取吸光比。
D.rhTF融合瘤細(xì)胞系的穩(wěn)定化融合后兩周，開始藉特異性rhTF ELISA篩檢融合瘤群落。新群落的篩檢連續(xù)三周。每1至2周測試陽性克隆的抗體的持續(xù)制造，直到冷凍15株穩(wěn)定克隆為止。
E.一次轉(zhuǎn)化及二次轉(zhuǎn)化對各株陽性穩(wěn)定融合瘤進(jìn)行限制稀釋轉(zhuǎn)化，來獲得一次克隆。細(xì)胞經(jīng)解凍，于培養(yǎng)生長一段短時(shí)間，然后由10細(xì)胞/孔稀釋成0.1細(xì)胞/孔。一次克隆藉抗-rhTFELISA測試，5至6株陽性克隆經(jīng)擴(kuò)大及冷凍。
抗-rhTF抗體H36.D2.B7的二次克隆系來自一次克隆H36.D2，如前文說明制備及儲(chǔ)存于液態(tài)氮。于96孔微力價(jià)孔板準(zhǔn)備一次克隆的四種不同稀釋，亦即5細(xì)胞/孔、2細(xì)胞/孔、1細(xì)胞/孔、0.5細(xì)胞/孔來開始二次轉(zhuǎn)化。細(xì)胞于IMDM組織培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)基含有下列添加劑20％胎牛血清(FBS)，2mM L-麩胺，100單位/毫升青霉素(penicillin)，100微克/毫升鏈霉素(streptomycin)，1％GMS-S，0.075％NaHCO3。為了測定可分泌抗-rhTF抗體的克隆，來自0.2細(xì)胞/孔微力價(jià)孔板5個(gè)個(gè)別孔的上清液于生長2周后抽出，藉如前文說明的ELISA檢定分析來測試是否存在有抗-rhTF抗體。全部5株于ELISA檢定分析皆顯示陽性結(jié)果，以H36.D2.B7為最佳抗體制造株。全部5克隆皆于RPMI培養(yǎng)基內(nèi)調(diào)適及擴(kuò)大，該培養(yǎng)基含有下列添加劑10％FBS，2mM L-麩胺，100單位/毫升青霉素，100微克/毫升鏈霉素及1％GMS-S，0.075％NaHCO3及0.013毫克/毫升草醯乙酸。H36.D2.B7系藉蛋白質(zhì)A親和層析術(shù)而由細(xì)胞培養(yǎng)的上清液純化，于FX活化檢定分析試驗(yàn)其抑制TFVIIa的能力。結(jié)果指征H36.D2.B7具有與H36.D2抗體的相同抑制。全部細(xì)胞皆系儲(chǔ)存于液態(tài)氮。
F.由H36.D2.B7分離全部RNA269微克全部RNA系由2.7×105H36.D2.B7融合瘤細(xì)胞分離。全部RNA的分離系如RNeasy Midi試劑盒(RNeasy Midi Kits)方案進(jìn)行，該試劑盒來自奎金(Qiagen)公司。RNA樣本儲(chǔ)存于-20℃水中至需用時(shí)。
G.cDNA的合成及H36.D2.B7基因可變區(qū)的轉(zhuǎn)化為了獲得cDNA的第一股，制備反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物含有5微克如前述分離的全部RNA，反向引子亦即用于重鏈(HC)的JS300(全部引子識(shí)別如后)及用于輕鏈(LC)的OKA 57，RNase抑制劑，dNTP’s，DTT及上標(biāo)II反錄酶；該反應(yīng)混合物于42℃培養(yǎng)1小時(shí)。然后反應(yīng)試管于65℃培養(yǎng)15分鐘來終止轉(zhuǎn)錄。冷卻后，加入五單位RNase H，讓反應(yīng)于37℃培養(yǎng)20分鐘。cDNA樣本儲(chǔ)存于-70℃至需用時(shí)。
分開進(jìn)行PCR(聚合酶連鎖反應(yīng))來轉(zhuǎn)化來自如上制備的cDNA的抗-rhTFH36.D2.B7的HC及LC二者的可變區(qū)(該等HC及LC可變區(qū)的核酸序列及氨基酸序列分別顯示于第1A及1B圖)。進(jìn)行三回合PCR。第一回合使用HC的正向引子JS002及反向引子JS300于96℃、53℃及72℃進(jìn)行PCR35周期。對LC則使用正向引子JS009及反向引子OKA57，于96℃、63℃及72℃進(jìn)行PCR35周期。第二回合HC及LC二者的PCR系如同第一回合進(jìn)行，但pMC-18用作為HC正向引子，以及pMC-15用作為LC正向引子。第三回合使用H36HCF及H36HCR作為HC引子于96℃、60-65℃及72℃進(jìn)行PCR30周期。對LC，使用H36LCF及H36LCR引子，于96℃、58℃及72℃進(jìn)行PCR30周期。
使用下列引子來轉(zhuǎn)化H36.D2.B7的HC及LC的可變區(qū)。OKA575’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC-3’(SEQ ID NO17)JS3005’-GAARTAVCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO18)JS0095’-GGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCMCARTC-3’(SEQ ID NO19)JS0025’-ATTTCAGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTYCARCTKC ARCARYC-3’(SEQID NO20)pMC-155’-CCCGGGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKG-3’(SEQ ID NO21)pMC-185’-CCCGGGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTC-3’(SEQ ID NO22)H36HCF5’-ATATACTCGCGACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGATCCAGCTGCAGCAGTC-3’(SEQ ID NO23)H36HCR5’-GACCTGAATTCTAAGGAGACTGTGAGAGTGG-3’(SEQ ID NO24)H36LCF5’-TTAATTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO25)H36LCR5’-TAATCGTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGC TTGGTCC-3’(SEQID NO26)
其中于前述SEQ ID NOS17至26K為G或T；M為A或C；R為A或G；S為C或G；V為A、C或G；W為A或T；Y為C或T。
實(shí)施例2-本發(fā)明抗體的結(jié)合活性采用如上實(shí)施例1制備的本發(fā)明的抗體。rhTF分子于大腸桿菌表達(dá)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法藉免疫親和層析術(shù)純化(參見Harlow及Lane，參見上文，Ausubel等人，參見上文)。藉ELISA及表面胞質(zhì)體諧振(亦即BIACore)檢定分析測定抗體的結(jié)合常數(shù)(Ka)及解離常數(shù)(Kd)(例如參考Harlow及Lane，參見上文，Ausubel等人，參見上文；Altschuh等人，生物化學(xué)，316298(1992)；及法瑪西亞(Pharmacia)生物傳感器公司揭示的BIACore方法)。用于BIACore檢定分析，rhTF根據(jù)制造商指征制動(dòng)于生物傳感器芯片。各抗體常數(shù)系于四種抗體濃度(0.125nM、0.25nM、0.5nM及1nM)測定。
蛋白質(zhì)濃度系藉標(biāo)準(zhǔn)檢定分析(M.M.Bradford，分析生物化學(xué)，72248(1976))使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品及市售染料試劑(拜雷公司(Bio-Rad))測定。
第2圖顯示各抗-TF抗體的結(jié)合常數(shù)及解離常數(shù)。測試的抗TF抗體中，抗體H36具有最高結(jié)合速率(Ka＝3.1×1010M-1)及最低解離速率(Kd＝3.2×1011M)。
實(shí)施例3-FXa特異性基質(zhì)檢定分析通常此處所述實(shí)驗(yàn)系使用rhTF進(jìn)行，該rhTF系使用磷脂基膽堿(0.07毫克/毫升)及磷脂基絲胺酸(0.03毫克/毫升)于70/30w/w比于50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％牛血清白蛋白(BSA)于37℃脂質(zhì)化30分鐘。預(yù)先形成的TFFVIIa復(fù)合物的備用溶液的制法系將5nM脂質(zhì)化rhTF及5nM FVIIa于37℃培養(yǎng)30分鐘。TFFVIIa復(fù)合物分成整份，儲(chǔ)存于-70℃至需用時(shí)。純化后的人類因子VII、VIIa及FX系來自酶研究實(shí)驗(yàn)室。下述緩沖液用于全部FXa及FVIIa檢定分析25mM西比(Hepes)NaOH、5mM CaCl2、150mM NaCl、0.1％BSA、pH7.5。
篩檢單克隆抗體阻斷TFVIIa媒介的FX活化成為FXa的能力。FX的活化系于二連續(xù)步驟進(jìn)行。于第一步驟(FX活化)，于Ca+2存在下檢定分析FX轉(zhuǎn)成FXa。于第二步驟(FXa活性檢定分析)，F(xiàn)X的活化藉EDTA淬熄，F(xiàn)Xa的形成系使用FXa特異性產(chǎn)色基質(zhì)(S-2222)測定。S-2222及S-2288(參見后文)產(chǎn)色原系來自可莫基尼(Chromogenix)公司(法瑪西亞西帕(Pharmacia Hepar)公司分銷)。FX的活化系于1.5毫升微離心管進(jìn)行，將反應(yīng)與0.08nM TFVIIa共同培養(yǎng)可與抗-rhTF抗體共同前培養(yǎng)，或與緩沖液對照共同前培養(yǎng)。隨后反應(yīng)于37℃培養(yǎng)30分鐘，然后加入30nMFX，接著又于37℃培養(yǎng)10分鐘。FXa活性系于96孔微力價(jià)孔板測定。由步驟1取出20微升樣本，混合各孔內(nèi)等容積EDTA(500mM)，接著加入0.144毫升緩沖液及0.016毫升5mM S-2222基質(zhì)。讓反應(yīng)又于37℃培養(yǎng)15-30分鐘。然后反應(yīng)以0.05毫升50％乙酸淬熄，隨后記錄各反應(yīng)于405納米的吸光比。TFFVIIa活性的抑制系由實(shí)驗(yàn)樣本(加抗體)及對照樣本(不含抗體)的OD405nm值求出。若干實(shí)驗(yàn)中，抗-rhTF抗體、TFFVIIa及FX同時(shí)添加來檢測結(jié)合競爭作用。第3圖顯示H36.D2MAb(粗體)抑制TFFVIIa對FX的活性至比其它接受試驗(yàn)的抗-rhTF Mabs至顯著更高程度(95％)。
實(shí)施例4-FVIIa特異性基質(zhì)檢定分析單克隆抗體進(jìn)一步藉FVIIa特異性檢定分析篩檢。本檢定分析中，5nM脂質(zhì)化rhTF首先于96孔微力價(jià)孔板，與緩沖液(對照組)或50nM抗體(實(shí)驗(yàn)組)于37℃共同培養(yǎng)30分鐘，然后混合5nM純化后的FVIIa(VT＝0.192毫升)，接著于37℃培養(yǎng)30分鐘。然后8微升20mM FVIIa特異性基質(zhì)S-2288備用溶液添加至各孔(終濃度0.8mM)。隨后反應(yīng)于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。于使用0.06毫升50％乙酸淬熄反應(yīng)后，測量于405納米的吸光比。由實(shí)驗(yàn)樣本及對照樣本的OD405nm值求出TFFVIIa活性的抑制百分比。
第4圖顯示當(dāng)抗體與TF前培養(yǎng)(于FVIIa添加前培養(yǎng))、或抗體添加至TF與FVIIa前培養(yǎng)(添加抗體前前培養(yǎng))時(shí)，H36抗體不會(huì)顯著阻斷TFFVIIa對S-2288基質(zhì)的活性。如此指征H36不會(huì)干擾TF與FVIIa間的交互作用(結(jié)合)，H36也不會(huì)抑制TFFVIIa對勝基質(zhì)的活性。
實(shí)施例5-凝血酶原時(shí)間(PT)檢定分析經(jīng)過鈣化的血漿于添加血栓生成素(TF)后數(shù)秒時(shí)間內(nèi)將凝固；稱作為「凝血酶原時(shí)間」(PT)的現(xiàn)象。長期PT典型為抗凝血活性的有用指針(例如參考Gilman等人，參見上文)。
H36.D2抗體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，使用市售人血漿(Ci-Trol控制(Ci-Trol Control)，I級來自巴斯特(Baxter)診斷公司)，研究影響PT的活性。凝血反應(yīng)系于CA+2存在下添加脂質(zhì)化rhTF而引發(fā)凝血反應(yīng)。凝血時(shí)間系藉自動(dòng)凝血定時(shí)器(MLA伊萊左(Electra)800)監(jiān)視。PT檢定分析系將0.2毫升脂質(zhì)化rhTF(于50mM Tris-HCl、pH7.5緩沖液，含有0.1％BSA、14.6mM CaCl、0.07毫克/毫升磷脂基膽堿及0.03毫克/毫升磷脂基絲胺酸)至塑料雙孔容器而引發(fā)。雙孔容器各含0.1毫升與0.01毫升緩沖液(對照樣本)或抗體(實(shí)驗(yàn)樣本)前培養(yǎng)1-2分鐘。藉H36.D2抗體抑制TF媒介的凝血系使用TF標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，其中l(wèi)og[TF]系對log凝血時(shí)間作圖。
第5圖顯示H36.D2抗體實(shí)質(zhì)上可抑制TF引發(fā)的人血漿凝血。H36.D2抗體顯著延長PT時(shí)間，顯示抗體為TF引發(fā)凝血的有效抑制劑(高達(dá)約99％抑制作用)。
實(shí)施例6-FX與H36.D2抗體競爭結(jié)合至TFFVIIa復(fù)合物于TFFVIIa、FX與H36.D2抗體間進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)。第6A圖顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中預(yù)先形成的TFFVIIa復(fù)合物(0.08nM)于緩沖液于37℃前培養(yǎng)30分鐘，緩沖液分別包括0.02nM、0.04nM、0.08nM及0.16nM H36.D2單克隆抗體。然后FX(30nM)添加至TFFVIIa與H36.D2抗體混合物，讓混合物又于37℃培育10分鐘。FX的活化如先前說明使用EDTA淬熄。如此產(chǎn)生的FXa系藉如上實(shí)施例3所述的FXa特異性檢定分析測定。
第6B圖顯示遵照前述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，但H36.D2抗體、預(yù)先形成的TFFVIIa及FX系同時(shí)添加來開始FX活化檢定分析。
第6A及6B圖所示資料，顯示H36.D2抗體與FX競爭結(jié)合至預(yù)先形成的TFFVIIa復(fù)合物。
實(shí)施例7-于細(xì)胞培養(yǎng)TF活性的抑制J-82是一種可豐富表達(dá)天然人類TF為細(xì)胞表面蛋白的人類膀胱癌細(xì)胞系(來自ATCC)。為了了解H36.D2抗體是否可阻止FX結(jié)合至顯示于細(xì)胞表面的天然TF，于FVII存在下，于微力價(jià)孔板進(jìn)行J-82 FX活化檢定分析(參考D.S.Fair等人，生物化學(xué)期刊26211692(1987))。于各孔加入2×105細(xì)胞，與50納克FVII、緩沖液(對照樣本)或抗TF抗體(實(shí)驗(yàn)樣本)于37℃培養(yǎng)2小時(shí)。隨后各孔以緩沖液洗滌，于室溫添加0.3毫升FX(0.05毫克/毫升)至各孔經(jīng)歷30分鐘時(shí)間。某些情況下，于FX的同時(shí)添加抗體，來檢測對天然TF的結(jié)合競爭。隨后取出0.05毫升整份，添加至96孔微力價(jià)孔板的新孔，孔內(nèi)含有0.025毫升100mM EDTA。FXa活性系藉前文實(shí)施例3所述FXa特異性檢定分析測定。于J-82細(xì)胞表面，TF活性的抑制作用系于無抗體存在下(對照樣本)及有抗體存在下(實(shí)驗(yàn)樣本)的OD405nm求出。
第7圖顯示H36.D2抗體結(jié)合表達(dá)于J-82細(xì)胞膜的天然TF，且抑制TF媒介的FX的活化。結(jié)果指征抗體與FX競爭顯示于細(xì)胞表面的天然TF。
由如下實(shí)施例8的資料，結(jié)果也顯示H36.D2抗體可結(jié)合于細(xì)胞膜的天然TF的構(gòu)象抗原決定部位。
實(shí)施例8-H36.D2抗體特異性結(jié)合至天然rhTFH36.D2抗體結(jié)合至天然rhTF及非天然rhTF的評估系藉簡化墨點(diǎn)檢定分析進(jìn)行。特別，rhTF于如下三種緩沖液各自稀釋為30微克/毫升10mM Tris-HCl，pH 8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0及8M尿素；以及10mM Tris-HCl，pH8.0，8M尿素及5mM二硫赤絲醇。于Tris緩沖液培養(yǎng)可保持rhTF呈天然形式，而使用8M尿素及5mM二硫赤絲醇產(chǎn)生非天然rhTF(變性rhTF)。各樣本于室溫培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，米里普伊目比倫(Millipore Immobilon)(7×7厘米截面)膜以甲醇預(yù)先濕潤，接著以25mM Tris，pH10.4，含20％甲醇濕潤。于膜風(fēng)干后，各試樣(30微克/毫升)約0.5微升、1微升及2微升施用至該膜及風(fēng)干。通過含5％(w/v)脫脂乳及5％(w/v)NP-40的PBS阻斷膜的后，膜使用H36.D2抗體探測，接著與山羊抗小鼠IgG過氧化酶共軛物(來自杰克森免疫研究實(shí)驗(yàn)室)共同培養(yǎng)。與ECL西方墨點(diǎn)試劑，根據(jù)制造商指征(阿莫山(Amersham)公司)培養(yǎng)后，使用塑料薄膜(沙朗包裹膜(SaranWarp))包裹，曝光于X光底片經(jīng)歷不等時(shí)間。
第8A圖顯示于Tris緩沖液、或Tris緩沖液加8M尿素(第1及2線道)存在下，H36.D2單克隆抗體結(jié)合天然TF的構(gòu)象抗原決定部位。接受自動(dòng)放射性攝影曝光40秒。但當(dāng)天然TF使用8M尿素及5mM DTT變性時(shí)，H36.D2的結(jié)合顯著減少或消除(第三線道)。第8B圖為過度曝光自動(dòng)放射性照片，顯示H36.D2抗體殘余結(jié)合至非天然(亦即變性)rhTF。過度曝光約曝光120秒。單獨(dú)使用8M尿素處理由于TF的兩個(gè)雙硫鍵不會(huì)被還原，可能只導(dǎo)致天然rhTF的部分變性。也可能部分變性的TF于尿素被去除時(shí)，于后來的墨點(diǎn)處理過程中再折回天然構(gòu)型。此等結(jié)果可明白區(qū)別不會(huì)結(jié)合變性TF的優(yōu)選本發(fā)明抗體，比先前報(bào)告的抗體，先前報(bào)告的抗體不會(huì)選擇性結(jié)合至構(gòu)象抗原決定部位，但可結(jié)合至變性TF(參考美國專利5,437,864，其中第18圖西方墨點(diǎn)分析顯示結(jié)合至藉SDS變性的TF)。
實(shí)施例9-抗組織因子抗體的人化先前實(shí)施例說明如何制造及使用稱作為H36.D2(如前文討論，偶爾也稱作為H36)的特定鼠抗體。本例顯示如何制造及使用該抗體的人化版本。人化H36抗體有多種用途，包括有助于降低人抗鼠抗體(HAMA)免疫反應(yīng)的可能。此等非期望的反應(yīng)及其它反應(yīng)造成H36抗體用于人類治療應(yīng)用時(shí)的問題。
A.嵌合型抗組織因子抗體(cH36)的制備前述H36抗體為IgG2a鼠抗體。H36首先轉(zhuǎn)成臨床發(fā)展用鼠-人嵌合型抗體。為了達(dá)成此項(xiàng)目的，H36的踵鏈基因及輕鏈基因經(jīng)轉(zhuǎn)化(參考美國專利第5,986,065號)。重鏈可變區(qū)融合至人IgG4恒定(Fc)領(lǐng)域，輕鏈可變區(qū)融合至人κ輕鏈恒定領(lǐng)域。結(jié)果所得IgG4κ嵌合型抗體標(biāo)示為Sunol-cH36。對于H36或cH36用于慢性病病人的多項(xiàng)用途，以完全人化cH36為佳，故其將減少或消除任何人抗小鼠抗體免疫反應(yīng)。cH36的人化說明如后。
B.cH36抗體的人化嵌合型抗組織因子抗體cH36的人化系使用「最佳匹配」方法達(dá)成。此種方法利用具有已知氨基酸序列的大量人類IgGs可由公開數(shù)據(jù)庫取得故占盡優(yōu)勢。于cH36的小鼠中可變區(qū)及輕可變區(qū)的個(gè)別構(gòu)架與于Kabat數(shù)據(jù)庫(參考http//immuno.bme.nwu.edu)的對應(yīng)人構(gòu)架比對。使用如下標(biāo)準(zhǔn)來選出供人化用的預(yù)定人IgG構(gòu)架(1)不匹配的氨基酸數(shù)目維持盡可能低。(2)「光標(biāo)」區(qū)段內(nèi)部的氨基酸(此區(qū)段的氨基酸可調(diào)整CDR結(jié)構(gòu)，以及微調(diào)于抗原的匹配。參考Foote，J.及Winter，G.，分子生物學(xué)期刊224，(2)487-499 )保持不變。(3)評比類似候選者時(shí)保留氨基酸取代較有利。用于此比對的匹配程序參考Kabat’s首頁于immuno.bme.nwu.edu)(Johnson G，Wu T.「Kabat數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用未來方向」核酸研究(2001)29205-206)。該程序可找出小鼠序列與Kabat數(shù)據(jù)庫的人序列間的同質(zhì)區(qū)且校準(zhǔn)該同質(zhì)區(qū)。通過使用此種獨(dú)特最佳匹配方法，預(yù)期目標(biāo)IgG的人化輕鏈或重鏈可變區(qū)可具有全部四種FRs，該等FRs系衍生自少至一個(gè)人IgG分子或多達(dá)四個(gè)不同人IgG分子。
(i)人IgGκ輕鏈可變區(qū)構(gòu)架的選擇cH36 LC的各個(gè)構(gòu)架的氨基酸序列系與Kabat數(shù)據(jù)庫中的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的對應(yīng)FR的氨基酸序列比對。最佳匹配的FR系基于前述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作選擇。
具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.005191的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 LC FRI。具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.019308的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 LC FR2。于cH36 LC FR1作下列突變來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.005191的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列Q11L、L15V、E17D、S18R。對cH36 LC FR2作一個(gè)突變Q37L來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.019308的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(參考表1A有關(guān)序列信息)。
具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.038233的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 LC FR3。具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.004733的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 LC FR4。于cH36 LC FR3作下列突變來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.038233的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列K70 D、K74T、A80P、V84A、N85T。對cH36 LC FR4作兩個(gè)突變A100Q及L106I來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.004733的人IgGκ輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(參考表1B有關(guān)序列信息)。
(i)人IgGκ重鏈可變區(qū)構(gòu)架的選擇cH36 HC的各個(gè)構(gòu)架的氨基酸序列系與Kabat數(shù)據(jù)庫中的人IgGκ重鏈可變區(qū)的對應(yīng)FR的氨基酸序列比對。最佳匹配的FR系基于前述三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)作選擇。
具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.000042的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 HC FR1。具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.023960的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 HC FR2。于cH36 HC FR1作下列突變來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.000042的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列E1 Q、Q5 V、P9 G、L11V、V12 K、Q19 R、T24 A。對cH36 LHC FR2作二個(gè)突變H41P及S44G來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.023960的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(參考表2A有關(guān)序列信息)。
具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.037010的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 HC FR3。具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.000049的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列選用于人化cH36 HC FR4。于cH36 HC FR3作下列突變來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.037010的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列S76 T、T77 S、F80 Y、H82 E、N84 S、T87 R、D89 E、S91 T。對cH36 HC FR2作一個(gè)突變L113 V來匹配具有Kabat數(shù)據(jù)庫ID No.000049的人IgGκ重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(參考表2B有關(guān)序列信息)。
表1A及1BcH36與人輕鏈(LC)FR序列的比較表1A

表1B

表2A及2BcH36與人重鏈(HC)FR序列的比較表2A

表2B

一旦已經(jīng)決定了期望的人構(gòu)架，使用以下三項(xiàng)技術(shù)來于輕鏈及重鏈達(dá)成預(yù)定氨基酸取代(1)使用常規(guī)PCR來轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入轉(zhuǎn)化部位或診斷核酸內(nèi)切酶部位，以及來改變位在可變區(qū)末端的氨基酸殘基。(2)以PCR為主的突變發(fā)生作用，用來一次改變多個(gè)氨基酸殘基，特別此等氨基酸殘基位在可變區(qū)中央。(3)部位取向突變發(fā)生，用來一次導(dǎo)入一或二個(gè)氨基酸取代。遵照史左基因(Stratagene’s)「快速改變部位取向突變發(fā)生試劑盒」(型號200518)所述方案進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。
于各步驟后，部分人化克隆經(jīng)過定序，部分可變區(qū)隨后被轉(zhuǎn)化于表達(dá)載體。質(zhì)體tKMC180用來表達(dá)LC突變株，以及pJRS355或pLAM356載體分別用來表達(dá)HC突變株為IgG1或IgG4。然后部分克隆經(jīng)組合以及于COS細(xì)胞一過性表達(dá)，藉ELISA測定表達(dá)程度。
抗-TF重及輕可變區(qū)最終完整人化形式轉(zhuǎn)化成為偶爾稱作為「mege載體」，以及轉(zhuǎn)移感染入CHO細(xì)胞及NSO細(xì)胞供IgG表達(dá)。然后適當(dāng)細(xì)胞系用來產(chǎn)生足夠分析量的人源化抗-TF。所得人化版本來源100％皆為人類來源(當(dāng)不考慮CDR序列時(shí))。人化IgG4κ版本標(biāo)示為hFAT(人化IgG4抗組織因子抗體)，IgG1κ版本標(biāo)示為hOAT(人化IgG1抗組織因子抗體)。此等完全人化的cH36版本意圖用來治療慢性適應(yīng)癥例如血栓、癌癥及發(fā)炎病。
C.抗-TF抗體重鏈的人化1.PCR擴(kuò)大且轉(zhuǎn)化入抗-TF mAb cH36重鏈(HC)可變區(qū)的pGem T-easy系使用質(zhì)體pJAIgG4TF.A8(嵌合型H36的表達(dá)載體)作為樣板，以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2進(jìn)行。引子TFHC1s2導(dǎo)入起始字碼子上游的BsiW1部位，也將構(gòu)架(FR)1的氨基酸E1改變成為Q。引子TFHC1as2將氨基酸變化L113改變成V導(dǎo)入FR4。此步驟獲得組合物HC01。
2.使用先前組合物(HC01)其如下四個(gè)引子進(jìn)行以PCR為主的突變發(fā)生，產(chǎn)生組合物HC02。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC7as。下游PCR使用引子TFHC7s及TFHC1as2。重疊PCR使用上游PCR產(chǎn)物及下游PCR產(chǎn)物作為樣板，以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2獲得HC02。使用引子TFHC7s及TFHC7as，將兩種氨基酸改變導(dǎo)入FR2H41至P及S44至G。
3.使用HC02作為樣板及如下四種引子的以PCR為主的突變發(fā)生產(chǎn)生組合物HC03。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC5as2。下游PCR使用引子TFHC5s及TFHC1as2。使用上游PCR產(chǎn)物及下游PCR產(chǎn)物作為樣板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2的PCR，獲得HC03。使用引子TFHC5s及TFHC5as2于FR3導(dǎo)入三種氨基酸變化T87至R、D89至E及S91至T。BglII部位也導(dǎo)入位置87。
4.使用引子TFHC2s及TFHC3as及HC03于pGem作為樣板，進(jìn)行PCR放大。TFHC2s位在pGem轉(zhuǎn)化部位上游。TFHC3as位在構(gòu)架3，于FR3導(dǎo)入兩個(gè)氨基酸變化H82至E及N84至S。結(jié)果所得PCR帶轉(zhuǎn)化入pGem，然后適當(dāng)大小的插子使用BsiW1及BglII消化。此片段轉(zhuǎn)化入HC03，獲得HC04。
5.使用HC04作樣板及使用下列引子進(jìn)行以PCR為主的突變發(fā)生，結(jié)果獲得HC05。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC6as。下游PCR使用引子TFHC6s及TFHC1as2。使用上游PCR產(chǎn)物及下游PCR產(chǎn)物作為樣板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2進(jìn)行突變發(fā)生PCR，獲得HC05。此步驟導(dǎo)入下列氨基酸變化于FR3S76至T、T77至S及F80至Y。
6.使用HC05作為樣板及下列四種引子的以PCR為主的突變發(fā)生產(chǎn)生HC06。上游PCR使用引子TFHC2s及TFHC2as2。下游PCR使用引子TFHC3s2及TFHC1as2。使用TFHC2as2的擴(kuò)大導(dǎo)入氨基酸變化于FR1P9至G。引子TFHC3s2改變Q19成為R及T24成為A。使用上游及下游PCR產(chǎn)物作樣板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2的PCR獲得HC06。
7.于FR1位置2由I點(diǎn)突變變成M，系于HC06組成期間自發(fā)導(dǎo)入。使用HC06作為樣板，以及使用TFHC1s3及TFHC1as2作為引子的PCR擴(kuò)大，可校正此種錯(cuò)誤取代，也導(dǎo)入氨基酸變化于FR1Q5至V。所得組合物為HC07。
8.組合物HC08系通過使用HC07作樣板以及使用下列引子進(jìn)行以PCR為主的突變發(fā)生而制成。TFHC2s及TFHC2as3用于上游產(chǎn)物。下游產(chǎn)物先前使用TFHC1s3及TFHC1as2擴(kuò)大(參考步驟7)。使用引子TFHC2as3于FR1導(dǎo)入兩個(gè)氨基酸變化L11至V及V12至K。自發(fā)點(diǎn)突變結(jié)果于CDR2位置64導(dǎo)入F改變成為L。進(jìn)一步篩檢及定序所得組合物HC08R1，具有F正確序列于CDR2位置64。
9.藉部位取向突變由HC07產(chǎn)生兩個(gè)組合物HC11及HC12。使用兩種互補(bǔ)引子TFHC8sP及TFHC8asP連同使用CH07作為樣板來制造CH11，CH11含有三個(gè)氨基酸變化于FR1G9 P、L11至V及V12至K。然后HC11經(jīng)過甲基化及管柱純化來用于下一回合部位取向突變發(fā)生。使用CH11作為樣板、及使用互補(bǔ)引子TFHC9sL及TFHC0asL的PCR，產(chǎn)生HC12，HC12具有突變于FR1由V11至L。
10.組合物HC09系由HC12衍生而得，通過使用HC12作樣板、及使用互補(bǔ)引子TFHC10sK及TFHC10asK進(jìn)行PCR衍生。HC09含有氨基酸變化K12至V于FR1。
11.組合物HC10系由HC09制造。使用HC09作為樣板及互補(bǔ)引子LV-1及LV-2的PCR，結(jié)果獲得產(chǎn)生HC10，其于FR1含有突變由L11突變至V。
各突變步驟后，部分人化或完全人化克隆經(jīng)定序，部分可變區(qū)后來轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體。pJRS355或pLAM356載體用來表達(dá)HC突變株融合至人IgG1或IgG4至Fc。
第13A圖摘要說明步驟1-11，顯示于FR1-4導(dǎo)入遞增氨基酸變化。HC08的外，全部其它重鏈突變株及cH36含有F于CDR2的位置64。HC08于位置64具有突變由F突變成L。第13B-D圖顯示重鏈CDR序列。
用于重鏈人化的引子TFHC1s25’TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC3’TFHC1as25’AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG3’TFHC7s5’GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG3’TFHC7as5’CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC3’TFHC5s5’GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG3’TFHC5as25’CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC3’TFHC3as5’GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’
TFHC6s5’CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG3’TFHC6as5’CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG3’TFHC2as25’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC3’TFHC3s25’CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC3’TFHC1s35’TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC3’TFHC2as35’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC3’TFHC9sL5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG3’TFHC9asL5’CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’TFHC8sP5’GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC3’TFHC8asP5’GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3’TFHC10sK5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC3’TFHC10asK5’GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’LV-15’CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG3’LV-25’CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG3’D.抗-TF抗體輕鏈的人化1.使用質(zhì)體pJAIgG4TF.A8(嵌合型H36的表達(dá)載體)作為樣板以及引子TFLC1s2.1及TFLC1as2進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟導(dǎo)入編碼區(qū)上游的轉(zhuǎn)化部位AgeI。也于FR4導(dǎo)入L106I突變。此步驟獲得組合物L(fēng)C03。
2.使用互補(bǔ)引子TFLC5s及TFLC5as及使用LC03作為樣板進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。此步驟導(dǎo)入突變Q37L與FR2，加入PstI部位供診斷目的。此種新組合物定名為LC04。
3.使用LC04作為樣板以及使用引子TFHC2s及TFLC2as1進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟產(chǎn)生片段A其將用于步驟6。此步驟于FR1導(dǎo)入Q11L及L15V突變。
4.使用LC04作樣板及使用引子TFLC1s2.1及TFLC1asR進(jìn)行PCR擴(kuò)大。如此導(dǎo)入KpnI部位于LC可變區(qū)末端。此PCR片段轉(zhuǎn)化入pGEM，獲得pGEM04K，其將用于步驟6。
5.使用LC04作為樣板及使用引子TFLC2s及TFLC4as進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟產(chǎn)生片段C其將用于步驟6。此步驟導(dǎo)入三個(gè)突變E17D、S18R于FR1及A100Q于FR4。
6.使用片段A及片段C作為樣板，及使用引子TFLC2s及TFLC4as，進(jìn)行以PCR為主的突變發(fā)生，獲得片段D。片段D轉(zhuǎn)化入pGEM04K，獲得組合物L(fēng)C05。
7.使用pGEM04K作樣板及使用引子TFLC1s2.1及TFLC4as，進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟產(chǎn)生片段H，其隨后被轉(zhuǎn)化入pGEM04K。如此導(dǎo)入A100Q突變于FR4，組合物定名為LC06。
8.使用LC06作為樣板其使用引子TFLC1s2.1及TFLC3as，進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟產(chǎn)生片段I，其將用于步驟10。如此導(dǎo)入K70D及K74T突變于FR3。
9.使用LC06作為樣板其使用引子TFLC3s2及TFLC4as，進(jìn)行PCR擴(kuò)大。此步驟產(chǎn)生片段F，其將用于步驟10。如此導(dǎo)入A80P突變于FR3。
10.使用片段I及片段F作為樣板，及使用引子TFLC1s2.1及TFLC4as進(jìn)行PCR，獲得片段J。片段J轉(zhuǎn)化入pGEM獲得組合物L(fēng)C07。
11.使用互補(bǔ)引子TFLC08sds及TFLC08sdsa及使用LC07作為樣板，進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。此步驟導(dǎo)入突變V84A及N85T于FR3。此組合物定名為LC08。
12.來自含有突變Q11L、L15V、E17D、S18R及Q37L的LC09的AgeI至EcoO109I片段轉(zhuǎn)化入LC08。如此獲得組合物L(fēng)C09。
13.使用LC09作為樣板及使用互補(bǔ)引子LC105及LC103，進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。此步驟將T85N突變導(dǎo)入FR3，獲得組合物L(fēng)C10。
14.使用LC10作為樣板及使用互補(bǔ)引子LC115及LC113，進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。此步驟將D70K突變導(dǎo)入FR3。如此獲得組合物L(fēng)C11。
15.使用LC11作為樣板及使用互補(bǔ)引子LC125a及LC123a，進(jìn)行部位取向突變發(fā)生。此步驟將K42Q突變導(dǎo)入FR2。如此獲得組合物L(fēng)C12。
于各個(gè)突變步驟后，部分人化LC克隆、或全部人化LC克隆經(jīng)定序，部分可變區(qū)后來轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體tKMC180。
第12A圖摘述步驟1-15，顯示導(dǎo)入輕鏈FR1-4的遞增氨基酸變化。第12B-D圖顯示輕鏈CDR序列。
用于輕鏈人化的寡核苷酸引子TFLC1as25’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG3’TFLC1s2.15’ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC3’TFLC5s5’GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG3’TFLC5as
5’CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’TFLC2as15’CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG3’TFLC1asR5’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG3’TFLC2s5’CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC3’TFLC4as5’GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG3’TFLC3as5’GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC3’TFLC3s25’CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC3’TFLC08sds5’GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG3’TFLC08sdsa5’CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC3’LC1055’CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC3’LC1035’GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG3’LC1155’CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC3’LC1135’GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG3’LC125a5’CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG3’LC123a5’CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG3’第14圖顯示輕鏈(第14A圖)及重鏈(第14B圖)的hOAT(人化cH36-IgG1)恒定區(qū)序列。第15圖顯示輕鏈(第15A圖)及重鏈(第15B圖)的hFAT(人化cH36-IgG4)恒定區(qū)序列。各圖中，構(gòu)架4(FR4)可變區(qū)的最末氨基酸殘基連結(jié)至hOAT及hFAT的第一氨基酸殘基。
實(shí)施例10人源化抗-TF抗體的表達(dá)與純化部分人化及全部人化LC克隆及HC克隆轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體。質(zhì)體tKMC180(參考第10A-B圖)用來表達(dá)融合至人κ鏈的LC突變株，pJRS355(參考第9A-B圖)或pLAM356(參考第9C-D圖)載體用來表達(dá)融合至人IgG1或融合至人IgG4的Fc的HC突變株。HC克隆及LC克隆的若干組合隨后共同轉(zhuǎn)移感染COS細(xì)胞。于COS細(xì)胞一過性表達(dá)的IgGs藉ELISA檢定分析全I(xiàn)gG的產(chǎn)量以及結(jié)合至TF。
最終抗-TF重及輕可變區(qū)(HC08與LC09的組合)的最終完全人化形式轉(zhuǎn)化入蘇諾(Sunol’s)Mega表達(dá)載體(pSUN34，參考第11圖)，以及轉(zhuǎn)移感染CHO細(xì)胞及NSO細(xì)胞供IgG表達(dá)。轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生IgG4κ或IgG1κ人源化抗-TF抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移感染細(xì)胞系。然后選出的穩(wěn)定細(xì)胞系用來制造足夠分析量的人源化抗-TF。所得人化版本約95％為人類來源(不考慮CDR序列)。人化IgG4κ版本標(biāo)示為hFAT(人化IgG 4抗組織因子抗體)及IgG1κ版本標(biāo)示為hOAT(人化IgG1抗組織因子抗體)。完全人化cH36版本意圖用于治療慢性適應(yīng)癥例如癌癥及發(fā)炎疾病。
可表達(dá)hOAT(HC08與LC09的組合)的NSO細(xì)胞系的一(OAT-NSO-P10A7)經(jīng)解凍，于15毫升試管內(nèi)補(bǔ)充10％FBS的10毫升IMDM培養(yǎng)基增量及離心。細(xì)胞丸粒再懸浮于10毫升新鮮培養(yǎng)基，送至T25燒瓶，于37℃于5％二氧化碳培養(yǎng)。為了制備足量細(xì)胞來接種中空纖維生物反應(yīng)器，細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大獲得總量6×108細(xì)胞。生物反應(yīng)器系遵照制造商的指征手冊架設(shè)。收獲的細(xì)胞制作成丸粒，再懸浮于60毫升含35％FBS的IMDM，注射入生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外部空間。每日監(jiān)視葡萄糖及乳酸鹽濃度，收獲材料經(jīng)離心及匯集。收獲材料藉ELISA檢定分析測試抗-TF抗體濃度。然后含有抗-TF抗體(hOAT)的匯集樣本如后述純化與分析。
A.重組蛋白質(zhì)A西法羅司(rProtein A Sepharose)快速流層析術(shù)重組人源化抗-TF單克隆抗體系由二輕鏈與二重鏈組成。重鏈為小鼠可變區(qū)(未經(jīng)變更或如前述經(jīng)人化)與人IgG1或IgG4 Fc領(lǐng)域的融合；而輕鏈含有小鼠可變區(qū)(未變更或如前述經(jīng)人化)及人類κ領(lǐng)域。明確了解人IgG Fc區(qū)對蛋白質(zhì)A或重組蛋白質(zhì)A(rProteinA)有高度親和力。
含有人源化抗-TF抗體(hOAT)的收獲匯集物通過對每毫升樣本添加0.08毫升1M Tris-HCl、pH8.0而調(diào)整至pH8.0±0.1。然后樣本通過低蛋白質(zhì)結(jié)合0.22微米過濾膜過濾(例如那金(Nalgene)無菌拋棄式組織培養(yǎng)過濾單元，具有聚醚膜，來自那吉努克(Nalge Nunc)國際公司型號167-0020)。于施用樣本后重組蛋白質(zhì)A管柱(來自法瑪西亞公司)以5倍床容積的20mM Tris-HCl、pH8.0洗滌，來去除未結(jié)合的材料如培養(yǎng)基蛋白質(zhì)。因收獲的培養(yǎng)基含有高含量牛血清，故使用階段式pH梯度洗滌來由管柱去除牛IgG。階段式pH梯度系通過提高緩沖液B(100mM乙酸于緩沖液A(100mM乙酸鈉)的相對濃度而達(dá)成。典型pH階段式洗滌系采用20％、40％及60％緩沖液B。使用100％緩沖液B洗提管柱，基于A280來收集洗提分。匯集的洗提分藉添加1M Tris堿而調(diào)整至pH8.5。
B.Q西法羅司快速流層析術(shù)陰離子離子交換層析術(shù)可根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷而極為有效地分離蛋白質(zhì)。來自重組蛋白質(zhì)A管柱的洗提出且pH經(jīng)過調(diào)整的樣本以2倍容積水稀釋，檢驗(yàn)pH且調(diào)整至8.5。然后樣本載荷至5毫升(1.6×2.5厘米)Q西法羅司快速流管柱，以20mM Tris-HCl、pH8.5平衡，管柱使用(1)5倍床容積的20mM Tris-HCl、pH8.5洗滌；及(2)4倍床容積20mM Tris-HCl、pH8.5含100mM NaCl洗滌。然后使用床容積的20mM Tris-HCl、pH8.5含500mM NaCl洗提IgG。匯集蛋白質(zhì)畸峰，使用超濾裝置將緩沖液交換成為PBS。
使用相同轉(zhuǎn)移感染法、細(xì)胞培養(yǎng)法及純化法，也制造hFAT且經(jīng)純化。
實(shí)施例11人源化抗-TF抗體的性質(zhì)A.藉人源化抗-TF抗體抑制TF功能抗-TF抗體的關(guān)鍵性質(zhì)的一系可抑制組織因子引發(fā)血液凝固的能力。純化后的hOAT及hFAT于標(biāo)準(zhǔn)PT檢定分析測定其抑制TF活性的能力。PT檢定分析廣用來量測組織因子相依性凝血時(shí)間。本檢定分析原理為組織因子TF與血漿因子VIIa形成復(fù)合物。然后此種復(fù)合物活化因子X成為FXa；然后FXa將凝血酶原于因子Va及磷脂質(zhì)存在下轉(zhuǎn)成凝血酶。凝血酶最終導(dǎo)致形成血塊。于標(biāo)準(zhǔn)PT檢定分析，脂質(zhì)化TF添加至血漿來引發(fā)凝血，藉歐嘉農(nóng)泰尼卡(OrganonTeknika)Coag-A-Mate凝血分析儀或其相當(dāng)裝置記錄凝血。
抗-TF抗體H36藉獨(dú)特機(jī)轉(zhuǎn)抑制人TF活性。H36結(jié)合至TF(自由態(tài)或復(fù)合因子VIIa)，讓因子X及因子IX結(jié)合至TFVIIa復(fù)合物受抑制，如此FX及FIX藉TFVIIa的活化受阻斷(參考美國專利第5,986,065號)。于PT試驗(yàn)，添加至人血漿的抗-TF抗體凝血時(shí)間的延長，明白指征此種TF相依性凝血受抑制。凝血時(shí)間系與TF活性量有關(guān)。通過測定一系列稀釋的TF的PT凝血時(shí)間，產(chǎn)生TF標(biāo)準(zhǔn)曲線。由TF標(biāo)準(zhǔn)曲線資料，測定TF活性受抗-TF抗體的抑制作用。
試劑印奴文(型號68100-392)及西拙凝血控制第一級(型號68100-336)系來自VWR。脂質(zhì)化重組人TF系如實(shí)施例3所述制造。
方法PT試驗(yàn)系使用凝血分析儀于37℃進(jìn)行。PT反應(yīng)的引發(fā)系通過添加0.2毫升脂質(zhì)化重組人組織因子(例如印奴文)至含0.1毫升緩沖液(50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA)或抗-TF抗體的0.1毫升人血漿(西拙控制第一級)而引發(fā)。
1.根據(jù)制造商指征添加純水至印奴文小瓶。試劑溫?zé)嶂?7℃。儲(chǔ)存于4-8℃，試劑可穩(wěn)定數(shù)日。
2.添加1毫升純水至各個(gè)西拙小瓶?；旌现寥芙狻Ｈ羰褂枚嘤谝粋€(gè)小瓶，則將多個(gè)小瓶組合入一個(gè)容器(例如一根10毫升試管)。1毫升西拙可進(jìn)行5次檢定分析(各次檢定分析使用2×0.1毫升＝0.2毫升)。西拙可儲(chǔ)存于冰上維持?jǐn)?shù)小時(shí)時(shí)間。
3.由抗-TF抗體備料，使用50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA制造一系列抗-TF抗體溶液(200mM至1600mM)。
4.添加10微升50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA或10微升稀釋后的抗-TF至雙孔容器的各孔，孔內(nèi)含有0.1毫升西拙。使用具有0.1毫升梢端的滴量管來混合各孔。確?？變?nèi)無氣泡。于抗-TF(緩沖液)與血漿(西拙)混合后，藉添加0.2毫升印奴文至血漿于10分鐘以內(nèi)測定凝血時(shí)間。
5.用于TF標(biāo)準(zhǔn)曲線，首先使用50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA將印奴文(100％ TF)稀釋成20％、10％、5％及2.5％。然后如步驟4但使用稀釋后的印奴文樣本進(jìn)行PT檢定分析。
表3為cH36、hOAT及hFAT對PT凝血時(shí)間的影響摘要。與表4資料比較，cH36、hOAT及hFAT顯示極為強(qiáng)力的TF功能抑制作用。于蛋白質(zhì)濃度高于12.9nM時(shí)，全部抗體皆達(dá)成約95％抑制。表3結(jié)果也指征通過前述方法，抗-TF的人化亦即cH36的人化不會(huì)對cH36的抑制活性造成顯著影響，原因在于如對cH36所見，hFAT及Hoat顯示抑制TF相依性凝血能力極為類似。
表3.藉嵌合型抗體(cH36)及人源化抗-TF抗體(hFAT及hOAT)#對凝血酶原時(shí)間的影響

#全部檢定分析皆使用表4的相同100％TF活性(濃度)樣本表4.凝血時(shí)間及相對組織因子活性(濃度)

B.親和常數(shù)的測定人源化抗-TF抗體對TF的親和力系使用表面質(zhì)?；蝮w共振(BIAcore來自法瑪西亞生物傳感器公司)測定，該傳感器具有重組人組織因子共價(jià)制動(dòng)于CM5傳感器芯片上。親和常數(shù)為藉BIAcore計(jì)算機(jī)軟件，由四種抗-TF單克隆抗體濃度(0.125nM、0.25nM、0.5nM及1nM)求出的平均資料。表5指征通過前述方法抗-TF的人化亦即cH36的人化不會(huì)對cH36與TF的親和力造成任何顯著影響，原因在于cH36與hFAT對TF有類似的親和力的故。
表5.抗-TF抗體的名目親和力及解離常數(shù)


已經(jīng)參照優(yōu)選具體實(shí)施例說明本發(fā)明的細(xì)節(jié)。但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮此處揭示了解可于本發(fā)明的精髓及范圍內(nèi)做出修改及改良。
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合至人組織因子(TF)以形成復(fù)合物的人源化抗體，其中因子X或因子IX與復(fù)合物結(jié)合，而且FX或FIX被TF:FVIIa的活化受抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體具有對TF的解離常數(shù)(Kd)小于約0.5nM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體的進(jìn)一步特征為通過標(biāo)準(zhǔn)凝血酶原(PT)凝血檢定分析，于抗體濃度小于15nM，可延長凝血時(shí)間達(dá)至少約5秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體具有對TF的結(jié)合特異性約等于或大于從ATCC保藏號HB-12255保藏的細(xì)胞系H36.D2.B7所得的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體具有對TF的結(jié)合親和力約等于或大于以ATCC保藏號HB-12255保藏的細(xì)胞系H36.D2.B7所得的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體包含至少一個(gè)完全小鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體包含至少一個(gè)完全人構(gòu)架(FR)區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體與人抗體具有至少約90％氨基酸序列同源性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該人源化抗體的可變區(qū)具有與人抗體可變區(qū)至少約70％氨基酸序列同源性。
10.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中各構(gòu)架(FRs)1、2、3及4具有與第12A圖(SEQ ID NO._)所述輕鏈(FR)序列至少約95％氨基酸序列同源性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體包含一個(gè)輕鏈恒定區(qū)，其具有與第14A或15A圖(SEQ ID NO._)所示序列至少約95％氨基酸序列同源性。
12.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中各構(gòu)架(FRs)1、2、3及4具有與第13A圖(SEQ ID NO._)所述重鏈序列至少約95％氨基酸序列同源性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體進(jìn)一步包含一個(gè)重鏈恒定區(qū)，其具有與第14B或15B圖(SEQ ID NO._)所示序列至少約95％氨基酸序列同源性。
14.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體具有IgG1(hOAT)及IgG4(hFAT)同基因型。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體的人組織因子結(jié)合片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15項(xiàng)的人組織因子結(jié)合片段，其中該片段為Fab、Fab’或F(ab)2。
17.一種人源化抗體，包含至少一個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中該抗體特異性結(jié)合至人組織因子(TF)來形成一種復(fù)合物，其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TF:FVIIa，并且由TF:FVIIa激發(fā)的活化受抑制。
18.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中全部互補(bǔ)決定區(qū)(輕鏈及重鏈)皆為鼠互補(bǔ)決定區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體進(jìn)一步包含至少一個(gè)人構(gòu)架(FR)區(qū)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中全部構(gòu)架(輕鏈及重鏈)的氨基酸序列皆為人構(gòu)架，或2個(gè)氨基酸取代以內(nèi)為人構(gòu)架。
21.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第一CDR(CDR1)是與第13B圖(SEQ ID NO._)所示CDR1的氨基酸序列至少95％相同。
22.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第二CDR(CDR2)系與第13C圖(SEQ ID NO._)所示CDR2的氨基酸序列至少95％相同。
23.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第三CDR(CDR3)系與第13D圖(SEQ ID NO._)所示CDR3的氨基酸序列至少95％相同。
24.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第一CDR(CDR1)系與第12B圖(SEQ ID NO._)所示CDR1的氨基酸序列至少95％相同。
25.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第二CDR(CDR2)系與第12C圖(SEQ ID NO._)所示CDR2的氨基酸序列至少95％相同。
26.根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第三CDR(CDR3)系與第12D圖(SEQ ID NO._)所示CDR3的氨基酸序列至少95％相同。
27.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第一構(gòu)架(FR1)系與第13A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
28.根據(jù)權(quán)利要求27項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR1包含下列氨基酸變化中的至少一種E1至Q；Q5至V；P9至G；L11至V；V12至K；Q19至R；及T24至A。
29.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第二構(gòu)架(FR2)系與第13A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
30.根據(jù)權(quán)利要求29項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR2包含下列氨基酸變化中的至少一種41H至P；以及44S至G。
31.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第三構(gòu)架(FR3)系與第13A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
32.根據(jù)權(quán)利要求31項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR3包含下列氨基酸變化中的至少一種76S至T；77T至S；80F至Y；82H至E；84N至S；87T至R；89D至E；以及91S至T。
33.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該重鏈超可變區(qū)的第四構(gòu)架(FR4)系與第13A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
34.根據(jù)權(quán)利要求33項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR4包含如下氨基酸變化113L至V。
35.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該輕鏈超可變區(qū)的第一構(gòu)架(FR1)系與第12A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
36.根據(jù)權(quán)利要求35項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR1包含下列氨基酸變化中的至少一種11QL至L；15L至V；17E至D；以及18至R。
37.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該輕鏈超可變區(qū)的第二構(gòu)架(FR2)系與第12A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
38.根據(jù)權(quán)利要求37項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR2包含如下氨基酸變化37Q至L。
39.根據(jù)權(quán)利要求19項(xiàng)的人源化抗體，其中該輕鏈超可變區(qū)的第三構(gòu)架(FR3)系與第12A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
40.根據(jù)權(quán)利要求39項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR3包含如下氨基酸變化70K至D、74K至T、80A至P、84A至V及85N至T。
41.根據(jù)權(quán)利要求40項(xiàng)的人源化抗體，其中該輕鏈超可變區(qū)的第四構(gòu)架(FR4)系與第12A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
42.根據(jù)權(quán)利要求41項(xiàng)的人源化抗體，其中該FR4包含如下氨基酸變化100A至Q；及106L至I。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求17項(xiàng)的人源化抗體的人組織因子結(jié)合片段。
44.根據(jù)權(quán)利要求43項(xiàng)的人組織因子結(jié)合片段，其中該片段為Fab、Fab’或F(ab)2。
45.一種人源化抗體，其包含至少一個(gè)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中該抗體特異性結(jié)合至人組織因子(TF)而形成一種復(fù)合物，以及進(jìn)一步其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，在重鏈上該抗體包含a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，d)第一構(gòu)架(FR1)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，e)第二構(gòu)架(FR2)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，f)第三構(gòu)架(FR3)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，以及g)第四構(gòu)架(FR4)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同。
46.根據(jù)權(quán)利要求45項(xiàng)的抗體，在輕鏈上進(jìn)一步包含h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，k)第一構(gòu)架(FR1)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，l)第二構(gòu)架(FR2)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，m)第三構(gòu)架(FR3)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，以及n)第四構(gòu)架(FR4)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同。
47.根據(jù)權(quán)利要求45項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含第14A圖(SEQ ID NO._)或第15A圖(SEQ ID NO._)的輕鏈恒定序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求45項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含第14B圖(SEQ ID NO._)或第15B圖(SEQ ID NO._)的重鏈恒定區(qū)。
49.一種根據(jù)權(quán)利要求45項(xiàng)的人源化抗體的人組織因子結(jié)合片段。
50.根據(jù)權(quán)利要求45項(xiàng)的人組織因子結(jié)合片段，其中該片段為Fab、Fab’或F(ab)2。
51.一種人源化抗體，其在重鏈上包含a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，d)第一構(gòu)架(FR1)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，e)第二構(gòu)架(FR2)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，f)第三構(gòu)架(FR3)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及g)第四構(gòu)架(FR4)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及以及在輕鏈上h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，k)第一構(gòu)架(FR1)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，l)第二構(gòu)架(FR2)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，m)第三構(gòu)架(FR3)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，以及n)第四構(gòu)架(FR4)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同。
52.根據(jù)權(quán)利要求51項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含第14A圖(SEQ ID NO._)或第15A圖(SEQ ID NO._)的輕鏈恒定序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求51項(xiàng)的抗體，進(jìn)一步包含第14B圖(SEQ ID NO._)或第15B圖(SEQ ID NO._)的重鏈恒定序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求51項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體具有IgG1或IgG4同基因型。
55.一種權(quán)利要求4項(xiàng)的人源化抗體的人組織因子結(jié)合片段。
56.根據(jù)權(quán)利要求55項(xiàng)的人組織因子結(jié)合片段，其中該片段為Fab、Fab’或F(ab)2。
57.根據(jù)權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，其中該抗體為單克隆抗體。
58.一種單鏈抗體，包含權(quán)利要求1項(xiàng)的抗體的超可變區(qū)。
59.一種經(jīng)分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體的重鏈或輕鏈中的至少一種。
60.一種重組載體，其包含權(quán)利要求59項(xiàng)的經(jīng)分離的核酸。
61.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求60項(xiàng)的重組載體。
62.一種組合物，包含權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體，以及至少一種醫(yī)藥上可接受的載劑。
63.一種抑制哺乳類動(dòng)物血液凝固的方法，該方法包含對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其系特異性結(jié)合至人組織因子(TF)而形成復(fù)合物，其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，該方法進(jìn)一步包括介于抗體與TF間形成一種特定復(fù)合物來抑制血液的凝固。
64.一種于哺乳類抑制血液凝固的方法，該方法包含對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的根據(jù)權(quán)利要求7項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中該抗體或其片段特異性結(jié)合至人組織因子(TF)而形成復(fù)合物，以及進(jìn)一步其中因子X或因子IX結(jié)合至TF或TF:FVIIa以及藉TF:FVIIa的活化受抑制，該方法進(jìn)一步包括介于抗體與TF間形成一種特定復(fù)合物來抑制血液的凝固。
65.一種抑制哺乳類動(dòng)物血液凝固的方法，該方法包含對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的人源化抗體或其片段，其中該抗體特異性結(jié)合至人組織因子(TF)而形成一種復(fù)合物，而且其中因子X或因子IX結(jié)合至組織因子(TF)或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，該抗體或片斷在重鏈上包含a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，d)第一構(gòu)架(FR1)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，e)第二構(gòu)架(FR2)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，f)第三構(gòu)架(FR3)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，g)第四構(gòu)架(FR4)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同；以及于輕鏈，h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，k)第一構(gòu)架(FR1)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，l)第二構(gòu)架(FR2)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，m)第三構(gòu)架(FR3)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，n)第四構(gòu)架(FR4)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少為95％相同，o)輕鏈恒定區(qū)，，其與第14A圖(SEQ ID NO._)或第15A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同，以及p)重鏈恒定區(qū)，，其與第14B圖(SEQ ID NO._)或第15B圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
66.一種抑制哺乳類動(dòng)物血液凝固的方法，該方法包含對該哺乳類動(dòng)物投予有效量的人源化抗體或其片段，其中該抗體特異性結(jié)合至人組織因子(TF)而形成一種復(fù)合物，以及進(jìn)一步其中因子X或因子IX結(jié)合至組織因子(TF)或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，該抗體在重鏈包含a)第一CDR(CDR1)其與第13B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其與第13C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其與第13D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，d)第一構(gòu)架(FR1)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，e)第二構(gòu)架(FR2)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，f)第三構(gòu)架(FR3)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，g)第四構(gòu)架(FR4)，其與第13A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及在輕鏈包含h)第一CDR(CDR1)其與第12B圖所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其與第12C圖所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其與第12D圖所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，k)第一構(gòu)架(FR1)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，l)第二構(gòu)架(FR2)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，m)第三構(gòu)架(FR3)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，n)第四構(gòu)架(FR4)，其與第12A圖所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，o)輕鏈恒定區(qū)，，其與第14A圖(SEQ ID NO._)或第15A圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列完全相同，以及p)重鏈恒定區(qū)，，其與第14B圖(SEQ ID NO._)或第15B圖(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列完全相同。
67.一種在生物樣本檢測組織因子(TF)的方法，該方法系于可形成復(fù)合物的條件下，讓一種生物樣本與權(quán)利要求1項(xiàng)的抗體接觸，以及檢測該復(fù)合物作為組織因子在生物樣本的指征。
68.一種制造權(quán)利要求1項(xiàng)的人源化抗體的方法，其中該方法包含提供一宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞經(jīng)以下列任一者轉(zhuǎn)化1)一編碼該人源化抗體或其片段輕鏈的第一表達(dá)載體，以及一編碼該人源化抗體或其片段重鏈的第二表達(dá)載體，或2)編碼該人源化抗體或其片段的輕鏈與重鏈二者的單一表達(dá)載體；將該宿主細(xì)胞保持在可表達(dá)各鏈的生長條件下；以及分離該人源化抗體或其片段。
69.一種制造人源化抗體的方法，其中該抗體包含a)比較來自嚙齒類動(dòng)物抗體的輕鏈構(gòu)架的氨基酸序列與相應(yīng)人類抗體構(gòu)架序列的集合，b)由該集合選出與相應(yīng)嚙齒類動(dòng)物輕鏈構(gòu)架具有最大氨基酸序列同源性的人類構(gòu)架序列，c)突變編碼嚙齒類動(dòng)物輕鏈構(gòu)架的DNA片斷來編碼一種人源化輕鏈構(gòu)架，其具有氨基酸序列是與步驟b)選定的人類構(gòu)架序列實(shí)質(zhì)相同，d)對嚙齒類動(dòng)物輕鏈的個(gè)別構(gòu)架重復(fù)步驟a)至c)，來產(chǎn)生多個(gè)DNA序列，其中各個(gè)序列編碼一種人化輕鏈構(gòu)架，其中于步驟b)選定的對應(yīng)人類構(gòu)架序列個(gè)別是由相同或不同的人抗體制備，e)將步驟d)制造的編碼人化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成為一第一載體，其編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的輕鏈可變區(qū)；以及f)于足夠制造人源化抗體的條件下，將組裝后的載體導(dǎo)入一適當(dāng)宿主內(nèi)。
70.根據(jù)權(quán)利要求69項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包含g)比較來自嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈構(gòu)架的氨基酸序列與對應(yīng)人類抗體構(gòu)架序列的集合，h)由該集合選出與對應(yīng)嚙齒類動(dòng)物重鏈構(gòu)架具有最大氨基酸序列同源性的人類構(gòu)架序列，i)突變編碼嚙齒類動(dòng)物重鏈構(gòu)架的DNA片斷來編碼一種人化重鏈構(gòu)架，其具有氨基酸序列是與步驟h)選定的人類構(gòu)架序列實(shí)質(zhì)相同；以及j)對嚙齒類動(dòng)物重鏈的個(gè)別構(gòu)架重復(fù)步驟g)至i)，來產(chǎn)生多個(gè)DNA序列，其中各個(gè)序列編碼一種人化重鏈構(gòu)架，其中于步驟h)選定的對應(yīng)人類構(gòu)架序列個(gè)別系由相同或不同的人抗體制備。
71.根據(jù)權(quán)利要求70項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包含將步驟j)制造的編碼人源化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成為一第二載體，其編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)；以及在足夠制造人源化抗體的條件下，將組裝后的第一及第二載體導(dǎo)入宿主內(nèi)。
72.根據(jù)權(quán)利要求70項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包含將步驟j)制造的編碼人源化構(gòu)架序列的DNA序列，組裝成編碼至少嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的第一載體；以及進(jìn)一步將組裝后的第一載體在足夠制造人源化抗體的條件下導(dǎo)入宿主內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明包括抗體，該抗體通過以高度親和力及特異性結(jié)合天然人類TF而提供優(yōu)異抗凝血活性。本發(fā)明的抗體可于體內(nèi)有效抑制血液凝固。本發(fā)明抗體可結(jié)合天然人類TF，或?yàn)閱为?dú)TF、或呈TFFVIIa復(fù)合物形式存在，有效防止因子X或FIX結(jié)合至TF或該復(fù)合物，因而減少血液的凝固。優(yōu)選本發(fā)明抗體可特異性結(jié)合天然人類TF的主要構(gòu)象抗原決定部位，該抗原決定部位提供意想不到的強(qiáng)力抗原決定簇。本發(fā)明也提供結(jié)合至該TF的人源化抗體及其片段。
文檔編號C07K16/36GK1599624SQ02824258
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月29日
發(fā)明者焦建安, H·C·王, E·L·涅韋斯, L·A·莫斯克拉 申請人:蘇諾爾分子公司