專利名稱：一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的涉及一種重組人干擾素oc2b的高密度 發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
我國目前的高密度發(fā)酵水平和國外差距較大，發(fā)酵后菌體濃度和產(chǎn)物的 產(chǎn)量上與國際水平有很大的差異，例如生產(chǎn)重組人生長激素的重組大腸肝菌 發(fā)酵國內(nèi)能夠達到發(fā)酵后菌液OD600在50_60,而國外能夠達到120的水平， 目的產(chǎn)物的產(chǎn)量國內(nèi)只有0.4g/L,而國外能夠達到1.1g/L的水平。畢赤酵 母的高密發(fā)酵更有優(yōu)勢，可以在合成培養(yǎng)基中生長到OD值500以上，菌體體 積可占到發(fā)酵液體積的一半以上。
在高密發(fā)酵方面，大腸桿菌是最具代表性和應(yīng)用最廣的宿主系統(tǒng)，重組 大腸桿菌的高密度發(fā)酵技術(shù)在生產(chǎn)實踐中得到了廣泛應(yīng)用，并且取得了令人 驚喜的成果。但是在該技術(shù)實際應(yīng)用中還存在許多需要解決的問題。其中最 為嚴重的就是培養(yǎng)過程中菌體過早地衰老、自溶和外源基因不能充分表達、 比活性較低，這主要是細菌產(chǎn)生的有害的代謝廢物對重組菌的抑制作用。比如 乙酸是大腸桿菌的主要副產(chǎn)物，它對細菌生長和產(chǎn)物的表達都有抑制作用。乙 酸的產(chǎn)生與細胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)有關(guān)。 一般認為細菌在低比生 長速率條件下通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化作用的需求, 不會產(chǎn)生乙酸，而在高比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的 能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH2。這就產(chǎn)生過多乙酸。目前以 重組人干擾素a 2b為代表的生化藥物在國內(nèi)發(fā)酵罐實際操作中由于發(fā)酵過程 研究以及數(shù)據(jù)釆集與處理困難，發(fā)酵工藝優(yōu)化的基本思路仍停留在尋求培養(yǎng) 基的最優(yōu)配方和最佳的溫度、pH、等的靜態(tài)調(diào)控，其操作步驟繁瑣，菌體表 達低，菌量少。
重組人干擾素oc2b在全自動模塊式發(fā)酵系統(tǒng)中釆用代謝控制發(fā)酵的技術(shù) 正是解決其高密度發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵方法。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵方法，它是通過在線 檢測葡萄糖濃度控制營養(yǎng)的流加，使呼吸商值維持在0.9—1之間。同時，在 發(fā)酵過程中通過控制相對恒定的溶解氧以維持有機酸的低水平。
本發(fā)明所釆用的發(fā)酵罐是W14900瑞士比歐公司生產(chǎn)的450L全自動發(fā)酵 罐，所釆用的試劑均為普通化學(xué)試劑公司購買。乙酸濃度釆用離子色譜(美 國D i o n e x公司I C S 1 5 0 0離子色譜儀，I o n p a c A S 1 1 HC 4 x 2 5 Omm陰離子分析柱和IonpacAGll HC4x50 mm保護柱，電導(dǎo)檢測器檢測)檢測。葡萄糖濃度釆用瑞士比歐公司專用 ProcessTRACEl. 2在線葡萄糖分析儀檢測。目的蛋白測定釆用SDS-PAGE法， 釆用瑞典安發(fā)瑪西亞公司MINI VE電泳儀。
本發(fā)明所述的重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵方法包括如下步驟
(1) 按配方稱取規(guī)定重量的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3 )用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至5. 0-8. 0;
(4)發(fā)酵培養(yǎng)基在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC， 30分鐘)，補料培 養(yǎng)基在相應(yīng)專用坡璃補料瓶內(nèi)滅菌U15'C， 30分鐘)。 (5 )在接入合適的重組大腸桿菌進行培養(yǎng)；
(6) 本發(fā)酵工藝采用利用其全自動發(fā)酵監(jiān)控系統(tǒng)，將起始攪拌速度設(shè)為 200 - 700rpm、起始通氣量設(shè)為100 - 500L/min、起始罐壓設(shè)為0. 1 - 0. 5bar， 釆用計算機控制，將發(fā)酵過程全程溶解氧濃度控制在30%_75%之間。將攪拌 速度、通氣量、罐壓通過計算機與溶解氧濃度自動關(guān)聯(lián)，當(dāng)溶解氧濃度出現(xiàn) 波動，自動調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量和罐壓等參數(shù)使溶解氧濃度保持恒定。從 而保證了菌體的生長和目的產(chǎn)物的表達。
(7) 利用瑞士比歐公司全自動發(fā)酵系統(tǒng)的在線尾氣監(jiān)測系統(tǒng)和在線葡萄 糖分析儀，可隨時測定尾氣中氧和二氧化碳濃度，利用隨機專用軟件計算出整個發(fā)酵過程中的二氧化碳釋放率(CER)和C02的釋放率(CER),計算呼吸 商(RQ)，同時通過在線檢測葡萄糖濃度，自動控制葡萄糖補料速度，使呼吸 商(RQ)值維持在0.9-1之間。從而控制維持乙酸的低水平(2-6g/L)，保證
了菌體的生長和目的產(chǎn)物的表達。
(8 )對獲得菌體進行通用方法處理得到重組人干擾素oc 2b成品。
(三)有益效果
釆用本發(fā)明所述的高密度發(fā)酵方法，可以在發(fā)酵過程中避免或減少乙酸 的生成，從而減輕了乙酸的抑制作用，實現(xiàn)重組大腸桿菌高密度生長，提高 重組人干擾素oc 2b蛋白的產(chǎn)率。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例l重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基l:蛋白胨6g/L，酵母膏2g/L，葡萄糖O. 02%,甘油0. 6 %， Na2HP04 llg/L， NaH2P04 lg/L ， KH2 P04 4g/L， NaC12g/L， FeS04. 7H20 0. 01g/L， MgS04. 7H20 0. 02g/L， CaCl2 0. OOlg/L,, VBt 0. 01g/L， MnS04 0. 01 g/L、甘氨酸O. 2 g/L、甲硫氨酸O. 01 g /L。
補料培養(yǎng)基包括葡萄糖濃度15%,用量1%;甘油濃度45%，用量7%
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3 )用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至5. 0-8. 0;
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rc， 30分鐘)，補料培
養(yǎng)基在相應(yīng)專用玻璃補料瓶內(nèi)滅菌(115匸，30分鐘)；
(5) 在接入重組大腸桿菌進行培養(yǎng)；
(6) 采用利用其全自動發(fā)酵監(jiān)控系統(tǒng)，將起始攪拌速度設(shè)為200rpm、起 始通氣量設(shè)為100L/min、起始罐壓設(shè)為0. lbar,釆用計算機控制，將發(fā)酵過 程全程溶解氧濃度控制在35%之間。將攪拌速度、通氣量、罐壓通過計算機與溶解氧濃度自動關(guān)聯(lián)，當(dāng)溶解氧濃度出現(xiàn)波動，自動調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣 量和罐壓等參數(shù)使溶解氧濃度保持恒定。從而保證了菌體的生長和目的產(chǎn)物
的表達。
(7)利用瑞士比歐公司全自動發(fā)酵系統(tǒng)的在線尾氣監(jiān)測系統(tǒng)和在線葡 萄糖分析儀，可隨時測定尾氣中氧和二氧化碳濃度，利用隨機專用軟件計算
出整個發(fā)酵過程中的二氧化碳釋放率(CER)和C02的釋放率(CER)，計算呼 吸商(RQ)，同時通過在線檢測葡萄糖濃度，自動控制葡萄糖補料速度，使呼 吸商(RQ)值維持在0.9-1之間。獲得含重組人干擾素oc2b的菌體1962g，發(fā) 酵液乙酸含量〈3克/L，經(jīng)檢測菌體目的蛋白(重組人干擾素a2b)表達量 34. 46%。
(8)對獲得菌體進行洗滌、裂解、復(fù)性、提純等處理得到重組人干擾素 oc 2b成品。
實施例2:重組人干擾素oc2b的髙密度發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基2:蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，葡萄糖0. 5%，甘油1%， Na 2HP04 15g/L, NaH2P04 4g/L , KH2 P04 6g/L， NaCl 3g/L， FeS04. 7H20 0. 5g/L, MgS04. 7H20 0. 5g/L, CaCl2 0. 02g/L， ， VB丄0. 03g/L, MnS04 0. 05 g/L、 甘氨酸O. 5 g/L、甲硫氨酸O. 06 g/L。
本發(fā)明所釆用的補料培養(yǎng)基包括葡萄糖濃度35%,用量5%;甘油濃度 25%，用量2%
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至5. 0-8. 0;
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC, 30分鐘)，補料 培養(yǎng)基在相應(yīng)專用玻璃補料瓶內(nèi)滅菌(115°C, 30分鐘)。
(5) 在接入重組大腸桿菌進行培養(yǎng)，升到42匸培養(yǎng)； (6)采用全自動發(fā)酵監(jiān)控系統(tǒng)，將起始攪拌速度設(shè)為250rpm、起始通氣
量設(shè)為250L/min、起始罐壓設(shè)為0. 2bar,釆用計算機控制，將發(fā)酵過程全程 溶解氧濃度控制在25%之間。將攪拌速度、通氣量、罐壓通過計算機與溶解氧濃度自動關(guān)聯(lián)，當(dāng)溶解氧濃度出現(xiàn)波動，自動調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量和罐 壓等參數(shù)使溶解氧濃度保持恒定。從而保證了菌體的生長和目的產(chǎn)物的表達。
(7)利用瑞士比歐公司全自動發(fā)酵系統(tǒng)的在線尾氣監(jiān)測系統(tǒng)和在線葡
萄糖分析儀，可隨時測定尾氣中氧和二氧化碳濃度，利用隨機專用軟件計算
出整個發(fā)酵過程中的二氧化碳釋放率(CER)和C02的釋放率(CER)，計算呼 吸商(RQ)，同時通過在線檢測葡萄糖濃度，自動控制葡萄糖補料速度，使呼 吸商(RQ)值維持在0. 91之間。獲得含重組人干擾素o^b的菌體"63g,發(fā)酵 液乙酸含量<2.5克/L，經(jīng)檢測菌體目的蛋白(重組人千擾素oc2b)表達量 38. 17%。
(8)對獲得菌體進行洗滌、裂解、復(fù)性、提純等處理得到重組人干擾素 a 2b成品。
實施例3:重組人干擾素a2b的髙密度發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基3:蛋白胨18g/L，酵母膏8g/L,葡萄糖2%，甘油4%, Na 2HP04 27g/L, NaH2P04 7. 5g/L ， KH2 P04 6. 5g / L, NaC16. 5g / L, FeS04. 7H20 0. 08g/L， MgS04. 7H20 1. 2g/L， CaCl2 0. 01g/L， ， VB0. 1 g/L， MnS04 0. 1 g g/L、甘氨酸L2 g/L、甲硫氨酸O. 1 g g/L。
本發(fā)明所釆用的補料培養(yǎng)基包括葡萄糖濃度50%，用量8%;甘油濃度 15%，用量4%。
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至5. 0-8. 0;
(4) 發(fā)酵培養(yǎng)基在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC, 30分鐘)，補料培 養(yǎng)基在相應(yīng)專用玻璃補料瓶內(nèi)滅菌(115°C， 30分鐘)；
(5) 在接入合適的重組大腸桿菌進行培養(yǎng)，升到43'C; (6)釆用其全自動發(fā)酵監(jiān)控系統(tǒng)，將起始攪拌速度設(shè)為300rpm、起始通
氣量設(shè)為400L/min、起始罐壓設(shè)為0. 3bar，采用計算機控制，將發(fā)酵過程全 程溶解氧濃度控制在45%之間。將攪拌速度、通氣量、罐壓通過計算機與溶 解氧濃度自動關(guān)聯(lián)，當(dāng)溶解氧濃度出現(xiàn)波動，自動調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量和罐壓等參數(shù)使溶解氧濃度保持恒定。
(7) 利用瑞士比歐公司全自動發(fā)酵系統(tǒng)的在線尾氣監(jiān)測系統(tǒng)和在線葡萄
糖分析儀，隨時測定尾氣中氧和二氧化碳濃度，利用隨機專用軟件計算出整
個發(fā)酵過程中的二氧化碳釋放率(CER)和C02的釋放率(CER)，計算呼吸商 (RQ)，同時通過在線檢測葡萄糖濃度，自動控制葡萄糖補料速度，使呼吸商 (RQ)值維持在0. 9 - 1之間。獲得含重組人干擾素a 2b的菌體1643g,發(fā)酵液 乙酸含量<3.5克/L,經(jīng)檢測菌體目的蛋白(重組人干擾素oc2b)表達量 33. 27%。
(8) 對獲得菌體進行洗滌、裂解、復(fù)性、提純等處理得到重組人干擾素 a 2b成品。
實施例4對照實驗
發(fā)酵培養(yǎng)基4:蛋白胨10g/L,酵母膏4g/L，葡萄糖4 / ， NaC15g/L， 本發(fā)明所述的重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法包括如下 步驟
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC， 30分鐘)。
(5) 在接入重組大腸桿菌進行培養(yǎng)，獲得含重組人干擾素oc2b的菌體 1035g，發(fā)酵液乙酸含量〉5克/L，經(jīng)檢測菌體目的蛋白(重組人干擾素a2b) 表達量25. 14%。
(6) 對獲得菌體進行洗滌、裂解、復(fù)性、提純等處理得到重組人干擾素 a 2b成品。
權(quán)利要求
1、一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵方法，其特征在于通過在線檢測葡萄糖濃度控制營養(yǎng)的流加，使呼吸商值維持在0.9～1之間。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過程中通過控制相對恒定的溶解氧以維持有機酸的低水平。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵方法，通過在線檢測葡萄糖濃度控制營養(yǎng)的流加，使呼吸商值維持在0.9～1之間，并控制相對恒定的溶解氧，從而達到維持有機酸在低水平的目的，實現(xiàn)重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵。
文檔編號C12P21/02GK101591690SQ20081011368
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者春 吉, 周德勝, 張春麗 申請人:北京凱因科技股份有限公司