專利名稱：：一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素ctb基因及其霍亂核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因及其霍亂核酸疫苗。
背景技術(shù)：
：核酸疫苗(nucleicacidvaccine)又名基因疫苗(genevaccine)或腿疫苗(DNAvaccine),其本質(zhì)是含有病原體保護(hù)抗原基因的真核表達(dá)載體，當(dāng)它被導(dǎo)入動物機(jī)體后，可被動物細(xì)胞所攝取并表達(dá)病原體的抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體對該蛋白的免疫反應(yīng)。作為近幾年來新興的一種疫苗，它以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)吸引著人們(l)抗原合成和遞呈過程與病原的自然感染相似，通過MHCI類和II類分子直接遞呈免疫系統(tǒng)。特別是特異性CD8+淋巴細(xì)胞(CTL)的免疫反應(yīng)，這是滅活疫苗和亞單位疫苗不能比擬的；(2)免疫原的單一性，只有編碼所需抗原基因?qū)爰?xì)胞得到表達(dá)，載體本身沒有抗原性。而重組的病毒載體疫苗除了目的基因表達(dá)外，還有龐大而復(fù)雜的載體蛋白；(3)易于構(gòu)建和制備，穩(wěn)定性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)。但是目前用來構(gòu)建核酸疫苗的目的基因絕大多數(shù)來自于病毒或細(xì)菌等原核生物，而疫苗的研究和應(yīng)用對象主要為真核生物，例如小鼠，獼猴或人類等高級哺乳動物。由于原核生物與真核生物在密碼子使用偏好上存在差異，導(dǎo)致用來構(gòu)建核酸疫苗的病原體基因在哺乳動物宿主體內(nèi)不能有效表達(dá)，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)作用，這是導(dǎo)致目前核酸疫苗免疫原性較低的原因之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，設(shè)計一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因及其霍亂核酸疫苗。.本發(fā)明的技術(shù)方案是-一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因，序列為SEQIDNO.l。一種霍亂核酸疫苗，其特征在于該疫苗由序列為SEQIDNO.l的霍亂腸毒素CTB基因和真核表達(dá)載體組成。所述的真核表達(dá)載體可為任何一種DNA疫苗載體，本發(fā)明使用載體pJW4303，但本發(fā)明并不局限于此載體。本發(fā)明提供的密碼子優(yōu)化的霍亂核酸疫苗的構(gòu)建包括如下步驟.-(1)密碼子優(yōu)化的CTB基因的設(shè)計和合成首先用基因軟件MacVector7.2分析編碼霍亂腸毒素的基因序列，找出其密碼子使用偏好以及與哺乳動物密碼子使用偏好和與大腸桿菌密碼子使用偏好不同的密碼子位點(diǎn)。對于哺乳動物和大腸桿菌使用偏好相同的密碼子，用哺乳動物和大腸桿菌都偏好的密碼子替代霍亂弧菌CTB基因中使用偏好不同的密碼子位點(diǎn)，然后人工根據(jù)具體載體克隆需要，進(jìn)一步調(diào)整基因順序，設(shè)計出密碼子優(yōu)化的CTB基因序列，并經(jīng)過基因公司的化學(xué)合成得到了密碼子優(yōu)化的CTB基因。此密碼子優(yōu)化的序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列將與原有的CTB氨基酸序列保持一致。例如霍亂弧菌CTB基因組中編碼異亮氨酸lie的三聯(lián)體密碼子主要是ATT，而在人類、小鼠等高級哺乳動物基因組中主要是ATC，在大腸桿菌中也主要是ATC，在密碼子優(yōu)化時會選用哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌都偏好的密碼子ATC。優(yōu)化后的目的基因序列為SEQIDNO.l，優(yōu)化前的序列為SEQIDN0.2，編碼的氨基酸序列為SEQIDN0.3。(2)對基因公司提供的含有目標(biāo)序列的重組載體pUC18/CTB進(jìn)行酶切，用DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0，大連寶生物公司)回收純化約375bp的目的片段。(3)將步驟(2)得到的CTB基因片段克隆到真核表達(dá)載體pJW4303中，得到重組質(zhì)粒pJW4303/CTB。經(jīng)對重組質(zhì)粒pJW4303/CTB的純化、酶切和測序鑒定后，確定得到了密碼子優(yōu)化后的CTB核酸疫苗。本發(fā)明的有益效果發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于經(jīng)密碼子優(yōu)化后的霍亂腸毒素B亞單位基因，不但可以用于構(gòu)建核酸疫苗而且顯著提高了該基因在哺乳動物宿主體內(nèi)的蛋白表達(dá)量，所構(gòu)建的核酸疫苗有效的刺激了宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)；而且由于在序列設(shè)計時相應(yīng)地兼顧了大腸桿菌的密碼子使用偏好，經(jīng)計算機(jī)軟件MacVector7.2以用于在大腸桿菌中表達(dá)CTB蛋白，可顯著提高該基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)水平，這為以后在原核生物大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。圖l野生型和密碼子優(yōu)化CTB基因的密碼子偏好性比較圖1A野生型和密碼子優(yōu)化CTB基因在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的偏好的比較(指數(shù)〉1為哺乳動物細(xì)胞所偏好)，縱坐標(biāo)表示偏好指數(shù)，橫坐標(biāo)表示核苷酸序列位置。左圖為野生型CTB基因，右圖為密碼子優(yōu)化的CTB基因。圖1B野生型和密碼子優(yōu)化CTB基因在大腸桿菌表達(dá)偏好的比較(指數(shù)>1為大腸桿菌所偏好)，縱坐標(biāo)表示偏好指數(shù)，橫坐標(biāo)表示核苷酸序列位置。左圖為野生型CTB基因，右圖為密碼子優(yōu)化的CTB基因。圖2CTB蛋白的Westernblot分析圖2A用Westernblot分析免疫兔血清中CTB特異性抗體應(yīng)答所用抗原為CTB蛋白，所用抗血清為免疫兔血清，稀釋度為l:200。圖2BWesternblot分析CTB蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)CTB:CTBDNA疫苗；Vector:pJW4303，抗原為上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞裂解液，所用抗血清為免疫兔血清，稀釋度為l:200。圖3Balb/c小鼠CTB特異性IgG抗體應(yīng)答時間曲線箭頭表示免疫時間點(diǎn)；左圖CTBDNA疫苗組，共六條曲線，每條曲線代表一只小鼠的免疫應(yīng)答時間曲線；右圖空載體對照組，共五條曲線，每條曲線代表一只小鼠的免疫應(yīng)答時間曲線。圖4新西蘭白兔血清CTB特異性IgG抗體應(yīng)答時間曲線箭頭表示免疫時間點(diǎn)，每條曲線代表一只新西蘭白兔的免疫應(yīng)答時間曲線。、■、A分別代表CTBDNA疫苗免疫的3只新西蘭白兔，、□、A代表空載體免疫的3只新西蘭白兔。圖5乳鼠保護(hù)試驗O標(biāo)記的曲線表示免疫前兔血清l:l稀釋霍亂弧菌進(jìn)行的乳鼠保護(hù)試驗的乳鼠存活率與時間的關(guān)系曲線；參表示免疫兔血清l:l稀釋霍亂弧菌進(jìn)行的乳鼠保護(hù)試驗的乳鼠存活率與時間的關(guān)系曲線，曲線旁的女女表示該組與空載體組相比存活率有顯著差異P〈0.01;A表示免疫兔血清l:10稀釋霍亂弧菌進(jìn)行的乳鼠保護(hù)試驗的乳鼠存活率與時間的關(guān)系曲線，5曲線旁的女表示該組與空載體組相比存活率有顯著差異P〈0.05;口表示免疫兔血清1:50稀釋霍亂弧菌進(jìn)行的乳鼠保護(hù)試驗的乳鼠存活率與時間的關(guān)系曲線。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1.密碼子優(yōu)化的CTB基因的設(shè)計和合成首先用基因軟件MacVectoi"7.2分析編碼霍亂腸毒素B亞單位(CTB)的基因序列，找出其密碼子使用偏好以及與哺乳動物密碼子使用偏好和大腸桿菌不同的密碼子位點(diǎn)。對于哺乳動物和大腸桿菌使用偏好相同的密碼子,用哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌都偏好的密碼子替代霍亂弧菌CTB基因中使用偏好不同的密碼子位點(diǎn)，然后人工根據(jù)具體載體克隆需要，進(jìn)一步調(diào)整基因順序，設(shè)計出密碼子優(yōu)化的CTB基因序列。此密碼子優(yōu)化的基因序列所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列將與原有的CTB氨基酸序列保持一致。密碼子優(yōu)化的CTB基因由大連寶生物公司合成，裝入載體pUC18，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pUC18/CTB。經(jīng)測序證實合成的序列正確。為了明確顯示進(jìn)行密碼子優(yōu)化的位點(diǎn),現(xiàn)將CTB密碼子優(yōu)化后的核酸疫苗與密碼子優(yōu)化前的核酸疫苗目的基因序列進(jìn)行對比。密碼子優(yōu)化后的核酸疫苗與密碼子優(yōu)化前的核酸疫苗基因序列比較如下(*為終止密碼子)優(yōu)化前ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATAT優(yōu)化后ATGAT^AAATT卩GG卩GT&TT￡TT2AC^GT&CTQ,TCSGCCTAQ氨基酸MIKLKFGVFFTVLLSSAY優(yōu)化前GCACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACA優(yōu)化后GCgCAGAC^CC￡CAQAA^AT￡AC￡GA￡￡TGTGgGCGGAQTACCACAACAC^氨基酸AHGTPQNITDLCAEYHNT優(yōu)化前CAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGA優(yōu)化后CA￡AT^CA^AC^CT&AA￡GA卩AA^AT^TT^T(^TA￡AC￡GAQTC^CTgGC&GG卩氨基酸QIHTLNDKIFSYTESLAG優(yōu)化前AAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAA優(yōu)化后AA&GAGATGATCATQAC￡TT^AAGAA卩GG￡GCgAC2TT^CAQGTQGAQ氨基酸KREMAIITFKNGATFQVE優(yōu)化前GTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAG優(yōu)化后GTQCCQGG￡AGSCA卩CA卩AT^GA￡TC^CAQAA&AAAGC￡AT2GAQATGAAG6氨基酸VPGSQHIDSQKKAIERMK優(yōu)化前GATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTA優(yōu)化后GAGACCCTGAT^GC^TAgCTCACgGAgGC￡AAgGTCGAgAAG,TG旦GT^氨基酸DTLRIAYLTEAKVEKLCV優(yōu)化前TGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTAA優(yōu)化后TGGAA￡AAQA(^CC2CA^GCgATgGCgGC^ATfAGgATGGCQAAfTAA氨基酸WNNKTPHAIAAISMAN*上述密碼子優(yōu)化的CTB基因與野生型比較發(fā)生了偏好性改變。從圖1中可以看出，與野生型基因相比，密碼子優(yōu)化的基因中哺乳動物細(xì)胞偏好的密碼子和大腸桿菌偏好的密碼子出現(xiàn)頻率增加，但是其編碼的CTB氨基酸序列不變，從而使其更適于在哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌中的蛋白表達(dá)。實施例2.CTBDNA疫苗構(gòu)建將質(zhì)粒pJW4303和pUC18/CTB(由大連寶生物公司合成)用PstI和BamHI分別進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為lOxBufferTango4pL，10xBSA4pL，質(zhì)粒(pJW4303或pUC18/CTB)20pL,PstllpL，BamHIlpL，補(bǔ)水至40jxL。酶切產(chǎn)物經(jīng)7g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0，大連寶生物公司)分別回收純化約375bp的目的片段和線性化的pJW4303。將電泳后瓊脂糖凝膠置于紫外檢測儀下，切下含目的DNA的凝膠，分析天平稱膠塊的質(zhì)量，按lmg-lpL計算膠塊的體積。加入3倍體積的011-IBuffer,置于75'C水浴中加熱融化膠塊，每隔2min混勻一次，直至膠塊完全融化，加入1/2011-1811任61"體積的011-IIBuffer,充分混勻溶液。將離心吸附柱安置在收集管上，轉(zhuǎn)移混合溶液至吸附柱中，靜置2min，3600rpm，離心lmin。棄濾液，加入500pLRinseA液，3600rpm，離心30s。棄濾液，加入700ixLRinseB液，3600rpm，離心30s，重復(fù)洗滌一次?？罩?2000rpm，離心lmin，將吸附柱安置在Ep管上，讓乙醇完全揮發(fā)干凈。在吸附膜的中央，加入25pL洗脫緩沖液，靜置60s。12000rpm，離心lmin，此時Ep管中的洗脫液即為目的DNA溶液。測定DNA溶液的濃度，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析割膠純化效果，洗脫液保存在-2(TC冰箱中備用。用T4DNA連接酶將約375bp的目的片段和線性化的pJW4303連接，構(gòu)建pJW4303/CTB重組表達(dá)質(zhì)粒。即為本文結(jié)果中提及的CTBDNA疫苗。連接反應(yīng)體系為10xT4DNALigaseBufferlpL，線性化的pJW4303lpL,純化目的片段7pL，T4DNALigaselpL，混勻，16'C放置16h。連接物轉(zhuǎn)化HBIOI感受態(tài)細(xì)胞。實施例3.重組質(zhì)粒pJW4303/CTB鑒定3.1pJW4303/CTB轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細(xì)胞1)將10pL連接物加入到裝有l(wèi)OOpLHB101感受態(tài)細(xì)胞的Ep管中，輕輕拍動管壁數(shù)次，充分混勻，冰浴30min。2)將Ep管置于42。C水浴中90s，立即轉(zhuǎn)至冰浴，靜置2min。3)向Ep管中緩慢加入LB培養(yǎng)基0.5mL,37°C，80rpm振搖，培養(yǎng)45min。4)將菌液涂布在含氨芐青霉素(O.lg/L)的LB平板上，37°C，培養(yǎng)過夜。3.2篩選陽性克隆隨機(jī)挑取5個單菌落，分別接種于5只培養(yǎng)試管(含O.lg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中，37°C，250rpm振搖，培養(yǎng)過夜。3.3小量提取重組質(zhì)粒pJW4303/CTB(質(zhì)粒小量提取試劑盒QIAGENPlasmidMiniKit(50),Qiagen公司)1)將3.2中搖過夜的細(xì)菌在無菌超凈臺中緩慢吸到1.51111離心管中，培養(yǎng)試管中剩下少量菌液保存于4"C。2)離心管中菌液，常溫下6000g，離心10min,棄上清，收集細(xì)菌。3)加入25(Hil重懸緩沖液于細(xì)菌沉淀，反復(fù)振搖，直至看不到細(xì)菌團(tuán)塊，細(xì)菌全部重懸于溶液中。4)加入250pl裂解緩沖液到上述菌體重懸液體中，溫和顛倒5-6次，溶液呈均勻藍(lán)色，靜置5min。5)加入35(HU平衡緩沖液于(4)中得到的液體中，溫和顛倒5-6次，藍(lán)色溶液消失，溶液分層，上層為結(jié)實的乳白色團(tuán)塊，下層為清亮液體，室溫靜置2min。6)12000g，離心10min，吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一離心管。該條件下離心10min。7)將上清液加入到離心吸附柱中，12000g，離心lmin，棄濾液。8)吸附柱再12000g，離心lmin，棄去濾過液體。9)向離心吸附柱中加入洗滌緩沖液25pl，12000g，離心lmin，收集濾液。10)再將步驟9重復(fù)操作1次。811)兩次收集的液體中即含有質(zhì)粒。3.4小量提取質(zhì)粒pJW4303/CTB進(jìn)行酶切鑒定質(zhì)粒pJW4303/CTB用萬awiH單酶切，尸WI和Ba附/H進(jìn)行雙酶切，&cI單酶切。雙酶切總反應(yīng)體系(10nL):10xBufferTangolpL，10xBSAlpL，質(zhì)粒(0.22mg/mL)2pL，戶Wl0.25pL，5am//10.25pL，補(bǔ)水至10nL。單酶切體系(10pL):10xBufferTangolpL，質(zhì)粒(0.22mg/mL)2pL，B"w/H或SacI0.5pL，補(bǔ)水至l(HtL。37°C孵育lh，加入1ixL10xLoadingbuffer終止酶切反應(yīng)，10g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將鑒定正確的細(xì)菌送上海生工測序，測序正確細(xì)菌劃三次平板，保存兩個單克隆細(xì)菌。實施例4.核酸疫苗的大量制備(質(zhì)粒大提試劑盒為QIAGENPlasmidMegaKit(5)，Qiagen公司)1)吸取鑒定正確的細(xì)菌保存液5^iL接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm，過夜生長。2)按l:500將1)中培養(yǎng)菌液接種于1000ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm，過夜生長。3)第二天將細(xì)菌移到250ml離心瓶中，4°C、6000g離心15min，棄上清，收集細(xì)菌。4)50ml緩沖液Pl重懸細(xì)菌沉淀，反復(fù)振搖，直至看不到細(xì)菌團(tuán)塊，細(xì)菌全部重懸于溶液中。5)50ml緩沖液P2加入重懸液體于離心瓶，溫和顛倒5-6次，溶液呈均勻藍(lán)色，靜置5min。6)50ml緩沖液P3加入上述混合液體中，溫和顛倒5-6次，藍(lán)色溶液消失，溶液分層，上層為結(jié)實的乳白色團(tuán)塊，下層為清亮液體，冰上放置30min。7)4'C，20000g，離心30min，保留上清，轉(zhuǎn)移至另一離心瓶。該條件下再將上清液離心10min。8)平衡緩沖液QBT35ml濕潤平衡提取柱。9)將(7)中得到的上清加入提取柱，自然過柱，棄去濾過液體。10)加入洗滌緩沖液QC200ml，自然過柱，棄去濾過液體。11)加入洗脫緩沖液QF35ml，自然過柱，收集濾過液體。12)向收集液體中加入24.5ml異丙醇，4。C，15000g，離心30min，棄上清。13)用7ml70。/。乙醇重懸離心管中沉淀，常溫15000g離心10min，棄去上清。14)將有沉淀的離心管于超凈臺自然晾干，lml生理鹽水溶解。915)紫外分光光度法(波長260nm280nm)定量質(zhì)粒含量。16)加入洗脫緩沖液QF35ml，再將柱子洗脫l次。17)為提高吸附柱的利用率，第二天用自配的溶液按1-15的步驟再進(jìn)行1次質(zhì)粒大量提取。18)將兩次提取的質(zhì)?；旌?，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。實施例5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞用含10。/。胎牛血清的含雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基37。C，5%(302飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用2.5g/L胰酶消化后，以1.0><106個細(xì)胞(6mL)接種于60mm培養(yǎng)皿中，待生長至80%融合時開始轉(zhuǎn)染。依據(jù)PEI轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，取PEI50nL，加入到93(HiL含雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，另取8.0嗎pJW4303/CTB重組質(zhì)粒加入到上述培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫，孵育15min，然后將lmlPEI/DNA復(fù)合物加到培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動使混合均勻，同時以pJW4303空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照，10h后可更換不含血清含雙抗的DMEM培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72h后進(jìn)行Westernblot分析。分析結(jié)果如圖2B所示。圖中顯示CTBDNA疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可在裂解物提取液中檢出特異性蛋白的表達(dá)。其單體的表觀分子量約為13kDa，陰性對照空載體pJW4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的裂解物沒有特異性蛋白存在。印跡分析表明，CTBDNA疫苗可以在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞收獲吸取細(xì)胞上清液，2500rpm，室溫，離心10min，吸取上清-2(TC凍存。用PBS(濃度10mM，pH7.2)將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中洗脫，收集細(xì)胞懸液，2500rpm，室溫，離心10min，棄上清，加入裂解液(50mMTris-HClPh7.6，150mMNaCl，1。/。Triton，用前加入2%100mMPMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min，12000rpm，4°C，離心60min，收集上清液，-2(TC凍存。實施例6.密碼子優(yōu)化霍亂腸毒素B亞單位核酸疫苗的免疫原性的研究在密碼子優(yōu)化的CTB核酸疫苗構(gòu)建和表達(dá)成功后，通過對試驗動物(如小鼠、家兔等)進(jìn)行核酸疫苗免疫，檢測密碼子優(yōu)化的霍亂核酸疫苗的免疫原性。用ELISA和Westernblot檢測CTB抗原特異的抗體免疫應(yīng)答。本研究所用動物包括兩種類型，Balb/c小鼠和新西蘭兔。由于免疫家兔可以產(chǎn)生大量的免疫血清，可以足夠進(jìn)行抗體檢測和抗體被動保護(hù)作用的研究，并且家兔腸段結(jié)扎試驗10可以進(jìn)行疫苗免疫主動保護(hù)作用的研究。因此，在本發(fā)明涉及免疫保護(hù)的研究中，將用家兔免疫作為動物模型。而小鼠飼養(yǎng)方便，免疫時單人容易操作，采血簡單，因此選用小鼠為本實驗另一種動物模型。用兩種動物驗證CTBDNA疫苗(pJW4303/CTB)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體具有普遍性，在多種動物免疫均有誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的作用。6.1Balb/c小鼠免疫，實驗設(shè)計見表l:表1CTBDNA疫苗和空載體免疫Balb/c小鼠和分組<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用CTBDNA疫苗和空載體(pJW4303)對照各免疫一組Balb/c小鼠。肌肉注射、活體基因?qū)敕绞矫庖?，保證針頭插入深度2mm，注入疫苗，觀察注射局部隆起，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(技術(shù)參數(shù)電壓50V，脈沖次數(shù)正反各3次，波寬30ms，頻率30Hz)，以小鼠腿部肌肉發(fā)生抖動視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0和2周進(jìn)行DNA免疫，于每次免疫前和末次免疫后兩周采血及收集血清。用ELISA方法檢測血清中CTB特異的IgG抗體反應(yīng)，評價CTBDNA疫苗在小鼠動物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫的能力。Balb/c小鼠CTB特異性IgG抗體應(yīng)答時間曲線如圖3所示。圖中結(jié)果顯示CTB組小鼠第一次免疫后兩周，外周血中就可以檢測到CTB特異性IgG抗體，第二次免疫后兩周抗體水平顯著升高，最高抗體滴度達(dá)到l:364500。空載體pJW4303免疫小鼠的血清未檢測到CTB特異性抗體，結(jié)果證實CTB免疫后在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗原特異性的抗體應(yīng)答。箭頭表示免疫時間點(diǎn)，每條曲線代表一只小鼠，左圖CTBDNA疫苗組，右圖空載體對照組，空載體組的五條曲線幾乎重疊。6.2新西蘭兔免疫，實驗設(shè)計見表2:表2CTBDNA疫苗和空載體免疫家兔和分組<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用CTBDNA疫苗和空載體(pJW4303)對照各免疫一組新西蘭兔。肌肉注射、活體基因?qū)敕绞矫庖?，保證針頭插入深度2mm，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因?qū)雰x進(jìn)行體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(技術(shù)參數(shù)電壓100V，脈沖次數(shù)正反各6次，波寬60ms，頻率60Hz)，以兔子腿部肌肉發(fā)生抖動視為電轉(zhuǎn)染有效。于第0和2周進(jìn)行DNA免疫，于每次免疫前和末次免疫后兩周采血及收集血清和糞便。用ELISA方法檢測血清和糞便中CTB特異的IgG抗體反應(yīng)，評價CTBDNA疫苗在家兔動物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液和粘膜免疫的能力。新西蘭白兔血清CTB特異性IgG抗體應(yīng)答時間曲線如圖4所示。圖中顯示CTBDNA疫苗和空載體pJW4303分別免疫3只新西蘭兔，于0，2，4，8周免疫，免疫前和免疫后2周收集血清。第一次免疫后2周CTBDNA疫苗組3只兔子血清中均可檢測到CTB特異性IgG，且隨著免疫次數(shù)的增加，CTBDNA疫苗組兔血清CTB特異性抗體水平逐漸增高，第四次免疫后2周時抗體平均最高滴度為l:1093500，但3只空載體免疫兔子的血清未檢測到抗體應(yīng)答。箭頭表示免疫時間點(diǎn)。實施例7.免疫應(yīng)答檢測7.1ELISA檢測血清中和糞便中CTB特異性IgG:1)CTB抗原包被ELISA板(使用PBSpH7.2-7.4作為包被液,CTB蛋白濃度為lpg/ml)，每孔100pl，4°C，過夜。2)棄包被液，用1XPBST洗板5次(PBST構(gòu)成為10mMPBS和0.05%Tween-20)。3)5%脫脂奶粉(PBS，0.05%Tween-20，5%脫脂奶粉)37°C,封閉1h，每孔200nl。4)棄封閉液，用1XPBST洗板5次。5)—抗為待檢測血清，起始稀釋度為1:500，再進(jìn)行1:3倍比稀釋。每孔加入100pl，37°C，孵育lh。(一抗稀釋液4%乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。如果一抗為糞便上清，進(jìn)行l(wèi):4稀釋，37。C孵育lh，每孔加入100pl。6)棄一抗，用1XPBST洗板5次。7)生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(濃度為lmg/ml，1:1000),每孔加入100pl，37°C，孵育lh。(二抗稀釋液:4%乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。8)棄二抗，用1XPBST洗板5次。9)HRP標(biāo)記鏈親和素(濃度為lmg/ml，1:2000)，每孔加入100pl，37°C，孵育1h。(稀釋液:4°/。乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。10)棄HRP標(biāo)記鏈親和素，用1XPBST洗板5次。11)TMB顯色(TMB溶液配方TMB片劑1片，O.IM磷酸枸櫞酸緩沖液(pH值為5.0)5ml，雙蒸水5ml，30%雙氧水2^1)每孔加入100nl，室溫，3.5min，每孔加入50pl121M的H2SCU終止顯色。12)酶標(biāo)儀測定并記錄各孔A450值，計算復(fù)孔平均值，以免疫前血清OD值的2.1倍作為cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0.05也去除。7.2Westernblot檢測血清中特異性IgG:1)CTBDNA疫苗轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞裂解液上清，pJW4303轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞裂解液上清2(Vl(如果抗原為CTB蛋白，取5嗎，稀釋到20nl)，加入5x上樣緩沖液5W，100°C，煮沸10min。2)首先制備15%的分離膠(7.5ml30%丙烯酰胺溶液，3.7mllMTris/ClpH8.8，150|xl10%SDS，150^110%過硫酸氨，6plTEMED)，灌膠，液面頂端加入水，室溫下聚合2030min。3)倒棄水，再制備5%的積層膠(960^130%丙烯酞胺溶液，740^1lMTris/ClPH6.8，60|xl10%SDS，6(Hil10%過硫酸氨，5plTEMED)，在積層膠上插入梳齒，待膠完全凝聚后，拔下梳齒。4)將上述處理好的樣品加入15%膠中進(jìn)行電泳，20mA，lh，40mA，2h。5)膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，100v，lh。6)轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉封閉，37°C，lh。7)用lxPBST洗膜兩次。8)將膜浸在l:500稀釋的血清中，4°C，過夜。9)棄掉血清，用lxPBST洗膜6次，每次10min。10)棄掉洗液，加入l:10000稀釋HPR標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37°C，lh。11)棄掉二抗，用lxPBST洗膜6次，每次10min。12)發(fā)光劑加到膜上，暗室顯影，結(jié)果見圖2。實施例8.乳鼠保護(hù)實驗研究8.1菌株分離霍亂弧菌由江蘇省疾病控制中心提供，從其保留的霍亂流行株凍干粉挑選10株細(xì)菌，在無菌超凈臺將細(xì)菌溶解于生理鹽水中，將細(xì)菌懸液接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37°C，孵育過夜，再挑取單克隆劃三次平板，取適量菌做玻片凝集試驗，分離出01群Eltor霍亂弧菌4株，兩株稻葉，分別為E.V.T220和391。兩株小川，分別為丫48.65和^6。8.2霍亂弧菌毒素基因鑒定8.2.1模板的制備將待檢菌株在普通營養(yǎng)瓊脂平板上37'C培養(yǎng)18-24小時，刮取2-3個菌落于200^1滅菌去離子水中混勻，煮沸15-30min,冷卻后10000rpm，離心2min，取上清用于PCR擴(kuò)增。8.2.2Ol群毒素基因檢測目的檢測我們分離的霍亂弧菌所含有的毒力基因，鑒定毒力菌株。因為霍亂弧菌最重要的兩個毒力基因為霍亂腸毒素A亞單位和毒素共調(diào)菌毛A亞單位，前者可引起水樣腹瀉，后者主要與細(xì)菌在腸道黏附有關(guān)，所以本研究中也主要檢測霍亂腸毒素A亞單位和毒素共調(diào)菌毛A亞單位這兩個毒力基因，鑒定出含這兩種毒力基因的霍亂弧菌來進(jìn)一步做攻毒試驗。(1).引物序列霍亂腸毒素A亞單位基因(564bp)的上游引物序列為SEQIDN0.4;下游引物序列為SEQIDN0.5;毒素共調(diào)菌毛A亞單位基因(lkb)的上游引物序列為SEQIDN0.6，下游引物序列為SEQIDN0.7。(2).反應(yīng)體系上游引物2ul下游引物2ul10Xbuffer5ul15mraolMgcl2110腸1d,s"1Taq酶(3U/ul)0.5u1模板1P1去離子水15ul總體系20ul實驗體系以￡.co/z'HB101為陰性對照。(3).反應(yīng)條件94。C5min94。C30秒、58°C30秒卜72°C60秒，72。C10min1430個循環(huán)通過以上PCR方法擴(kuò)增毒力基因后發(fā)現(xiàn)我們選取的01群Eltor型霍亂弧菌兩株稻葉(E.V.T220和391)和兩株小川(分別為V格65和V56)均含有CTB和TcpA兩種毒力基因。8.2.3確定50%致死量時所需要的霍亂弧菌的濃度1)出生35dCD-l乳鼠移離母鼠3h;2)通過灌胃注入50^d埃爾托型霍亂弧菌(菌量從2xl()Scfli/ml2xl0Scfu/ml)，將乳鼠置于3(TC的屏障中；3)每36h觀察一次，直到48h;4)確定50%致死劑量的霍亂弧菌濃度。8.3乳鼠保護(hù)試驗1)V格65型霍亂弧菌(江蘇省疾病控制中心保存霍亂01群菌株)劃平板，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上37-C培養(yǎng)18-24h，刮取菌落，將細(xì)菌懸液接種于LB培養(yǎng)基中，37"C培養(yǎng)16h，麥?zhǔn)蠞岫葍x調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度為lxl08cfU/ml;2)霍亂弧菌分別與免疫前和免疫血清混合(將免疫前和免疫血清56'C,孵育30min滅活補(bǔ)體)37。C，孵育lh;3)向乳鼠胃內(nèi)分別灌入5倍LD50的霍亂弧菌+熱滅活免疫前血清液體，5倍LD50的霍亂弧菌+熱滅活免疫血清液體，觀察48h內(nèi)每組中死亡的乳鼠量，記錄各時間點(diǎn)乳鼠的數(shù)量，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知CTB核酸疫苗免疫的家兔血清可以阻斷霍亂弧菌的致病作用，對乳鼠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。實施例中所涉及的試劑信息如下表:Taq酶T4DNA連接酶DNAmarker(DL3000)限制性內(nèi)切酶^mi/1，尸WI和SacIDNA凝膠回收試劑盒DMEM高糖培養(yǎng)基Promega公司Promega公司大連寶生物公司Fermentas公司大連寶生物公司Hyclone公司15RPM1640細(xì)胞培養(yǎng)液Hyclone公司胎牛血清Gibico公司質(zhì)粒小量提取試劑盒Qiagen公司粒大量提取試劑盒Qiagen公司PEIInvitrogen公司HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgGBD公司HRP標(biāo)記的鏈親和素SouthemBiotech公司HRP標(biāo)記的羊抗兔IgGSouthernBiotech公司生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgGSouthemBiotech公司生物素標(biāo)記的羊抗兔IgGSouthernBiotech公司CTBproteinSigma公司TMB片劑Sigma公司16<110〉黃祖瑚、徐桂芳〈120〉一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因及其霍亂核酸疫苗〈160〉7<210〉1〈211〉375〈212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉密碼子優(yōu)化的CTB基因序列〈400〉1atgatcaagctgaaattcggggcaccccgcagaacatcacctgaacgacaaaatcttctcatcaccttcaagaacggcgctcccagaagaaagccatcgagccaaggtgg卿agctgtgagcatggcg3sctaa<210>2〈211>375〈212〉腿〈213〉天然序列來源于霍亂弧菌(Kz'力T7'oc力o7erae)<220〉<223>霍亂弧菌(Kz7^'oc力o7e/"3e)的CTB基因序列〈400〉2atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatgcacat60ggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacg120ctaaatgataagateittttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatc180attacttttaagastggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagat240tcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaa300gctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaatt360agtatggcaaattaa375<210〉3〈211〉124<212〉PRT〈213〉天然序列來源于霍亂弧菌(K/6ri'oc力o7erae)<220>〈223〉霍亂腸毒素B亞單位基因編碼的氨基酸序列cgtgttcttcaccgtgctgccgacctgtgcgccgagtaccctacaccgagtccctggcgggaccttccaggtggaggtgcgcgcatg肪ggacaccctgccgtgtgggiac朋caagEiccctgagctccgcctacgcccac60acaacacccagatccacacc120gcaagcgcgagatggccatc180cgggcagccagcacatcgac240gcatcgcctacctgaccgag300cgcacgccatcgcggccatc360375〈400〉3MetlieLys1SerAlaTyrLeuLysPheGlyValPhePheThrValLeuLeu510AlaHisGlyThrProGinAsnlieThrAspLeu2025AlaGluTyrHisAsnThrGinlieHisThrLeuAsnAspLys3540PheSerTyrThrGluSerLeuAlaGlyLysArgGluMetAla5055lieThrPheLysAsnGlyAlaThrPheGinValGluValPro6570SerGinHislieAspSerGinLysLysAlalieGluArgMet8085AspThrLeuArglieAlaTyrLeuThrGluAlaLysValGlu95100LeuCysValTrpAsnAsnLysThrProHisAlalieAlaAla110115Ser15Cys30lie45lie60Gly75Lys90Lys105lie120SerMetAlaAsn<210>4〈211〉22〈212〉廳〈213〉人工序列〈220〉〈223〉霍亂腸毒素A亞單位基因上游引物〈400〉4cgggcagattctagacctcctg22〈210〉5<211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列18〈220>〈223〉霍亂腸毒素A亞單位基因下游引物〈400〉5cgatgatcttggagcattcccac23<210>6〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉毒素共調(diào)菌毛A亞單位基因上游引物〈400〉6ccctctctatgtgaatgttgc21<210〉7<211>21<212〉DNA<213〉人工序列〈220>〈223>毒素共調(diào)菌毛A亞單位基因下游引物<400〉7ctctaactcccagcagcgacc2權(quán)利要求1、一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因，序列為SEQIDNO.1。2、一種霍亂核酸疫苗，其特征在于該疫苗由序列為SEQIDNO.l的霍亂腸毒素CTB基因和真核表達(dá)載體組成。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的霍亂核酸疫苗，其特征在于所述的真核表達(dá)載體可為任何一種DNA疫苗載體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的霍亂核酸疫苗，其特征在于所述的真核表達(dá)載體為pJW4303。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種密碼子優(yōu)化的霍亂腸毒素CTB基因及其霍亂核酸疫苗。該CTB基因兼顧了哺乳動物細(xì)胞和大腸桿菌密碼子使用偏好，所涉及的霍亂核酸疫苗由該CTB基因和真核表達(dá)載體pJW4303組成。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的CTB基因，不但可以用于構(gòu)建核酸疫苗，顯著提高該基因在哺乳動物宿主體內(nèi)的蛋白表達(dá)量，所構(gòu)建的核酸疫苗有效的刺激了宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)；而且該基因可以用于在大腸桿菌中表達(dá)CTB蛋白，為以后在原核生物大腸桿菌中進(jìn)行蛋白提取或純化奠定基礎(chǔ)。文檔編號A61K39/106GK101538574SQ20091003108公開日2009年9月23日申請日期2009年4月27日優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日發(fā)明者山盧,徐桂芳,王世霞,黃祖瑚申請人:黃祖瑚;徐桂芳