專利名稱：一種降解煙堿的微生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解煙堿的微生物摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganii F4) 以及利用該微生物降解煙葉、煙葉浸提液和煙草廢棄物浸提液中煙堿的方法，屬于微生物 應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙堿又名尼古丁，是煙草中普遍存在的一種生物堿，也是卷煙和煙葉中的主要危 害成分(包括煙堿、蛋白質(zhì)、果膠、TSNA等)之一。它對(duì)人的中樞神經(jīng)有強(qiáng)烈的麻痹和刺激 作用，少量使用可使人產(chǎn)生興奮，大量使用則會(huì)引起頭暈、嘔吐、中毒癥狀，一次攝入量過(guò)多 會(huì)有致命的危險(xiǎn)，在吸煙過(guò)程中煙堿還會(huì)被亞硝化，生成煙草中特有的強(qiáng)烈的致癌劑N-亞 硝胺，它是煙葉和煙氣中主要致癌成分，也是煙草中特有的亞硝胺的重要前提物質(zhì)，對(duì)煙民 身體健康有嚴(yán)重影響。隨著人們對(duì)自身健康的日益關(guān)注及環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，從世界范 圍來(lái)看，大部分卷煙企業(yè)的卷煙都向低焦油和低煙堿的淡味卷煙方向發(fā)展對(duì)煙民身體健康 構(gòu)成威脅。我國(guó)的煙葉生產(chǎn)量平均約占世界總量的35%，卷煙產(chǎn)量約占世界總量的32%，現(xiàn) 階段吸煙人口約占世界總吸煙人口的25 %，總數(shù)高達(dá)3. 5億人。這些數(shù)據(jù)都穩(wěn)居世界第 一位。但中國(guó)卷煙出口總量只占世界份額的1. 8 %，煙葉出口總量占世界份額的3. 5 %，且 中國(guó)的煙草行業(yè)結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)品、品牌結(jié)構(gòu)也與大國(guó)身份很不相稱。這與我國(guó)部分煙草的質(zhì) 量偏低有著一定關(guān)系。部分煙草的煙堿含量偏高是導(dǎo)致其質(zhì)量偏低的一個(gè)方面，如我國(guó)烤 煙煙堿平均含量在3 % -4%，白肋煙高達(dá)6 %，而正常情況下烤煙應(yīng)低于3 %，白肋煙應(yīng)在 2%-4%。這導(dǎo)致我國(guó)高煙堿含量的煙葉大量積壓，從而給企業(yè)和國(guó)家?guī)?lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失，并造成資源浪費(fèi)，嚴(yán)重影響了我國(guó)卷煙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，在煙草生產(chǎn)加工的一系列過(guò) 程中，會(huì)產(chǎn)生大量煙堿濃度較高的固、液、氣態(tài)有毒的危險(xiǎn)廢物，未經(jīng)處理就直接排放會(huì)造 成嚴(yán)重的環(huán)境污染。通過(guò)農(nóng)業(yè)種植、化學(xué)浸提等途徑可以降低煙草中煙堿含量，但是這些方法的周期 很長(zhǎng)或者負(fù)面作用大影響其在降解煙草中煙堿的應(yīng)用。微生物在煙葉及土壤中廣泛存在， 易于從中篩選能高效降解煙草中煙堿的菌株，在提高煙葉品質(zhì)、降低煙堿含量、提高資源利 用率方面具有重大意義和廣泛的發(fā)展應(yīng)用前景。是解決煙草中煙堿對(duì)人體、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及 環(huán)境帶來(lái)危害的途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的部分煙葉、煙葉浸提液和煙草廢物浸提液 中的煙堿含量偏高的缺陷，提供一種能降解煙堿的微生物，并利用該微生物降低煙葉、煙葉 浸提液和煙草廢物浸提液中的煙堿含量、提高煙葉可利用性、降低煙草廢棄物中的煙堿含 量，減少環(huán)境污染的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明使用以下技術(shù)方案
一種降解煙堿的微生物名稱為摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganiiF4)，保藏 編號(hào)為 CGMCC NO. 3999。上述的降解煙堿的微生物的應(yīng)用在于將摩氏摩根氏菌F4配制成菌懸液，按煙葉 重量的5-15%或煙葉浸提液體積的10-20%或煙草廢棄物浸提液體積的10-20%接種，于 25-35°C、培養(yǎng)5-10d。在煙葉浸提液或煙草廢棄物浸提液接種后，同時(shí)在pH6. 5-7. 5(用HCl 或者NaOH調(diào)節(jié)pH)條件下，120-180r/min搖床培養(yǎng)。所述的摩氏摩根氏菌F4菌懸液的制備方法為在煙堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，然后將培 養(yǎng)液10000r/min離心lOmin，收集菌體，用50Mm，pH7. OPBS將離心后的菌體配制成菌懸液。所述的煙堿培養(yǎng)基配方=Nicotine0. 5-1. 5g，K2HPO4 12_15g，KH2PO4 3_5g， MgSO4 · 7H200. 1-0. 3g，微量元素溶液0. 3-0. 6mL,調(diào)pH至7. 0，分裝，滅菌；所述的微量元素 溶液是將 MnSO4 · 7Η20 0. 3-0. 5g, CaCl2 · 2H20 0. 1-0. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 1-0. 3g,用 0. Imo 1/ L HCl溶解并定容至100ml。所述的煙堿培養(yǎng)基配方優(yōu)選為=Nicotine1. Og, K2HPO4 13. 3g，KH2PO4 4g， MgSO4 · 7H200. 2g，微量元素溶液0. 5mL,調(diào)pH至7. 0，分裝，滅菌；所述的微量元素溶液是 將 MnSO4 · 7H200. 4g, CaCl2 · 2H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 2g，用 0. lmol/L HCl 溶解并定容至 100ml。在上述煙堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)摩氏摩根氏菌F4的條件為在室溫下接種，于25-35°C 下，在120-180rpm搖床中培養(yǎng)，優(yōu)選150rpm搖床中培養(yǎng)。所述的煙草廢棄物浸提液是將煙草廢棄物與水按照1 5的體積比例混合后浸泡 12h，調(diào)節(jié) pH 為 7. O。所述的煙葉浸提液是將煙葉與水按照1 5的體積比例混合后浸泡12h，調(diào)節(jié)pH 為 7. O。所述的摩氏摩根氏菌F4的獲得方法為稱取4. Og附著在煙草根部的土樣，加入到36mL 0. 85%的無(wú)菌生理鹽水的三角瓶 中，常溫振蕩30min后澄清lOmin，得到10—1倍菌液；取ImL 10—1倍菌液的上清液，加入到含 有9mL0. 85%無(wú)菌生理鹽水的試管中，搖勻，即得10_2倍的菌液；同理制取10_3倍的菌液。取 0. ImLlO-1UO-2與10_3倍菌液，分別涂布于已制好的選擇性培養(yǎng)基平板，30°C下培養(yǎng)4d。挑 選單個(gè)菌落進(jìn)一步劃線分離，重復(fù)操作，直到獲得純單一菌株并編號(hào)。將初篩得到的純菌株 分別接入裝有5mL液體煙堿培養(yǎng)基的試管中，搖床震蕩培養(yǎng)2d，制備菌液。再將各菌株菌液 加入裝有50mL液體煙堿培養(yǎng)基的三角瓶中，每菌株兩個(gè)平行，于30°C，200r/min的搖床振 蕩培養(yǎng)，以50mL未加煙堿的液體培養(yǎng)基作為空白，每2d測(cè)一次培養(yǎng)液中的煙堿含量，判定 菌株降解煙堿的能力。菌株F4在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落圓形、邊緣整齊，呈乳白色的奶油狀，表 面光滑濕潤(rùn)，凸起，不透明(如

圖1所示)。是桿菌，兩端鈍圓，無(wú)芽孢無(wú)莢膜(如圖2所 示)。其生理生化特性如下表1F4的生理生化特性
權(quán)利要求
一種降解煙堿的微生物，其特征在于所述的微生物名稱為摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganiiF4)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.3999。
2.權(quán)利要求1所述的降解煙堿的微生物的應(yīng)用，其特征在于將摩氏摩根氏菌F4配制 成菌懸液，按煙葉重量的5-15%或煙葉浸提液體積的10-20%或煙草廢棄物浸提液體積的 10-20%接種，于 25-35°C、培養(yǎng) 5_10d。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于在煙葉浸提液或煙草廢棄物浸提液 接種后同時(shí)在PH6. 5-7. 5條件下，120-180r/min搖床培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的摩氏摩根氏菌F4菌懸液的 制備方法為在煙堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，然后將培養(yǎng)液lOOOOr/min離心lOmin，收集菌體，用 50Mm, pH7. OPBS將離心后的菌體配制成菌懸液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的煙堿培養(yǎng)基配方Aicotine 0. 5-1. 5g, K2HPO4 12-15g, KH2PO4 3_5g，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 3g，微量元素溶液 0. 3-0. 6mL, 調(diào)pH至7. 0，分裝，滅菌；所述的微量元素溶液是將MnSO4 · 7Η20 0. 3-0. 5g，CaCl2 · 2H20 0. l-o. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 1-0. 3g，用 0. lmol/L HCl 溶解并定容至 100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的煙堿培養(yǎng)基配方 Nicotine 1. 0g, K2HPO4 13. 3g，KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，微量元素溶液 0. 5mL，調(diào) pH 至 7. 0，分裝，滅菌；所述的微量元素溶液是將 MnSO4 ·7Η20 0. 4g，CaCl2 ·2Η20 0. 2g，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0. 2g，用 0. lmol/LHCl 溶解并定容至 100ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于在煙堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)摩氏摩根氏菌 F4的條件為在室溫下接種，于25-35°C下，在120-180rpm搖床中培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用方法，其特征在于在煙堿培養(yǎng)基中培養(yǎng)摩氏摩根氏菌 F4的條件為在150rpm搖床中培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的煙草廢棄物浸提液是將煙草 廢棄物與水按照1 5的體積比例混合后浸泡12h，調(diào)節(jié)pH為7.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的煙葉浸提液是將煙葉與水按 照1 5的體積比例混合后浸泡12h，調(diào)節(jié)pH為7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種降解煙堿的微生物及其應(yīng)用，所述的微生物名稱為摩氏摩根氏菌F4(Morganella morganii F4)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.3999。將摩氏摩根氏菌F4配制成菌懸液，按煙葉重量的5-15％接種于25-35℃、培養(yǎng)5-10d；或按煙葉浸提液體積的10-20％或煙草廢棄物浸提液體積的10-20％接種，在25-35℃，pH6.5-7.5條件下，120-180r/min搖床培養(yǎng)5-10d。可使其中的煙堿分別降解56-68％、80-91％、84-96％。利用本發(fā)明降解煙堿不僅周期短、負(fù)面作用小，而且提高煙葉可利用性和資源利用率、降低了煙草廢棄物中的煙堿含量，減少了環(huán)境污染，因而在煙草加工、環(huán)保等方面具有較廣的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A24B15/20GK101993844SQ20101027577
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者周曙光, 周燕, 張文莉, 彭宇, 彭新輝, 易建華, 王修忠, 蒲文宣 申請(qǐng)人:湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司