用于組織再生的組織支架材料和制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了組織支架材料，所述組織支架材料具有一種密度的微球，所述微球嵌埋在不同密度的水凝膠中。所公開的材料具有改善的能力以促進用于傷口愈合和組織再生的細(xì)胞侵襲和血管形成。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)具有不同密度的組分的材料促進細(xì)胞侵入所述支架，所述細(xì)胞包括所需的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞。
【專利說明】用于組織再生的組織支架材料和制造方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年11月19日提交的美國臨時申請61/906,131的優(yōu)先權(quán)，其在此 整體并入本發(fā)明。
[0003] 公開背景
[0004] 通過自體或人工組織支架來優(yōu)化細(xì)胞指導(dǎo)長期以來是一個令人感興趣的主題。最 為流行且因此最為長久成功應(yīng)用的現(xiàn)成"組織工程化"產(chǎn)品均最初意在用作真皮替代支架。 市售的支架是非細(xì)胞的，且因此需要同時滿足宿主細(xì)胞侵襲以及血管形成的要求，以實現(xiàn) 持久的結(jié)合。因為此過程是比較久的，最少需要數(shù)周完成并需要必要的換藥、傷口固定和護 理，所以令人非常感興趣的是發(fā)展可優(yōu)化細(xì)胞侵襲率的更好的支架（Eppley，Plast Reconstr Surg. 107:757-762(2001) ;Wong等人，Plast Reconstr Surg. 121:1144-1152 (2008))〇
[0005] 當(dāng)前可獲得的非細(xì)胞真皮替代物可分為兩大類:來源于脫細(xì)胞真皮的產(chǎn)品、以及 基于天然來源的水凝膠的合成產(chǎn)品（Truong等人，J.Burns Wounds 4:e4(2005))〇
[0006] 市售的脫細(xì)胞真皮產(chǎn)品由脫細(xì)胞的尸體豬或人真皮制得。由于脫細(xì)胞過程，這些 產(chǎn)品包含具有完整基底膜的微通道內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)，其為天然真皮微血管的殘留部分。
[0007] 另一常用的真皮再生模板INTEGRA( Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)包含 由"表皮"半滲透性硅酮片層覆蓋的交聯(lián)I型牛膠原和軟骨素-6-硫酸鹽的合成"真皮"多孔 層。植入后，一旦真皮層已血管化，則用刃厚自體移植物替代娃酮片(Yannas等人，Science 215:174-176(1982))。不同于脫細(xì)胞真皮產(chǎn)品，INTEGRA是不具有內(nèi)部血管結(jié)構(gòu)的代表性產(chǎn) 品，而其特征在于其無規(guī)的孔隙度（平均孔徑30_120ym)(van der Veen等人，Burns 36: 305-321(2010))。
[0008] 使用當(dāng)前可獲得的組織替代支架的相關(guān)成本很高。例如，脫細(xì)胞真皮產(chǎn)品的制造 需要組織的采集和收獲，以及脫細(xì)胞和滅菌過程(Ng等人，Biomaterials 25:2807-2818 (2004))。此外，市售的組織支架是無血管的，且當(dāng)在復(fù)雜條件下(例如被輻照的傷口或具有 暴露硬件或骨的那些)使用時易于發(fā)生高失敗率。在此類復(fù)雜條件下，使用現(xiàn)有組織替代產(chǎn) 品不足以形成新血管。
[0009] 本領(lǐng)域高度需要改善的組織支架，所述組織支架促進新的周圍組織的優(yōu)化的細(xì)胞 侵襲和血管形成。
[0010] 發(fā)明公開概述
[0011] 本發(fā)明公開的是一類組織支架材料，其由具有嵌埋的微球的水凝膠制成。在所公 開的組織支架中，微球具有相對于水凝膠密度不同或更大的聚合物密度(w/v)，該差別密度 促進細(xì)胞侵入組織支架。在一個實施方式中，水凝膠包含第一聚合物且微球包含第二聚合 物，微球嵌埋在水凝膠中，且微球具有大于水凝膠的密度。
[0012] 第一和第二聚合物可獨立地選自由以下構(gòu)成的組:膠原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì) 酸鹽、纖維素、纖維蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚（乳酸） (PLA)、聚（己內(nèi)酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚（三亞甲基碳酸酯）、聚（對二氧環(huán)己酮)和聚（對 苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基）丙烷-癸二酸]、聚[對苯二酸雙 (羥乙基）酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚（氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二 醇）、微生物聚酯、聚(β-羥基鏈烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在實施例中，微球可包含 0.2%至2.0%、0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%?八的第二聚合物。在一個特定實施例 中，第二聚合物是膠原。微球的直徑可介于50-250μπι之間。微球可占組織支架材料的至少約 50體積％、60體積％或70體積％。微球還可包含生物活性因子，但在一些實施方式中，微球 不包含生物活性因子。生物活性因子可促進細(xì)胞侵襲、細(xì)胞生長或血管形成中的一種或多 種。
[0013] 在一個實施例中，水凝膠包含膠原。在一些實施例中，水凝膠包含0.1 %至0.6 %、 0.2至0.4 %或0.3 % w/v的量的膠原。組織支架材料可具有如下微球:所述微球具有0.2 %至 2.0%、0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%￥八的膠原，并嵌埋在具有0.1%至0.6%、0.2 至0.4%或0.3% %w/v膠原的水凝膠中。在一個實施方式中，組織支架材料具有如下微球， 所述微球具有〇. 6-1.0%w/v的膠原，并嵌埋在包含0.3%w/v膠原的水凝膠中。
[0014] 以上實施方式中的任意者的組織支架材料可為片材形式或為可流動形式。材料可 為例如厚度為〇. 5-3.0_或約1.0-2.0_的片材形式。所公開的組織支架材料可用于受試者 的傷口愈合或組織再生的方法中。
[0015] 本發(fā)明進一步公開的是通過將如上或在此公開的組織支架材料施用至有需求的 受試者的傷口或組織，從而在所述受試者中促進傷口愈合或組織再生的方法。可將所述組 織支架材料施用至例如受試者的具有外露骨、硬件或壞死組織的區(qū)域。
[0016] 本發(fā)明還公開的是制造組織支架材料的方法。所述方法包括以下步驟：（a)提供具 有微球的第一組合物和具有聚合物材料的第二組合物，所述第一組合物具有與所述第二組 合物不同的密度；（b)混合第一和第二組合物;和(c)使聚合物材料在混合物中交聯(lián)，以形成 具有嵌埋微球的水凝膠。第一和第二組合物可各自包含膠原(例如人膠原或牛膠原)作為聚 合物。膠原可為經(jīng)中和的膠原。微球可包含〇. 4%至1.2 %、或0.6-1.0 % w/v的膠原。微球可 進一步包含生物活性因子。第二組合物可包含0.1 %至0.6%、或0.3%w/v的膠原。交聯(lián)可通 過例如熱方法完成。
[0017]還公開的是通過以上提供并在本文進一步公開的方法制得的組織支架材料，以及 包含此類組織支架材料的傷口敷料。
[0018] 附圖簡述
[0019] 本專利或申請文件包含至少一幅彩圖。當(dāng)需要并支付必需費用時，具有彩圖的此 專利或?qū)＠暾埞_的副本將由事務(wù)所提供。
[0020] 圖1A-1C.植入后7天時，細(xì)胞浸潤MSS支架（C)，但未浸潤單獨的1%本體(bulk) (A)，且極少浸潤0.3 %本體(B)。
[0021] 圖2A-2C.移植后14天時，細(xì)胞顯示出極好的MSS支架浸潤(C)，但未浸潤超出1 %本 體的外部(A)，且僅顯示出適中的0.3%本體浸潤(B)。
[0022] 圖3A-3D.移植后7天時，對于在0.3 %本體中具有1 %微球的MSS支架(C)和在0.3 % 本體中具有〇. 6%微球的MSS支架(D)，細(xì)胞顯示出更完全的浸潤，對于在0.6%本體中0.4% 微球(A)和在0.2 %本體中0.4 %微球(B)，細(xì)胞顯示出較少的浸潤。
[0023] 圖4A-4B.移植后7天和14天時，在0.3 %本體中1 %微球的細(xì)胞浸潤(藍(lán)染，DAPI)包 含內(nèi)皮前體細(xì)胞CD31+細(xì)胞(紅染）。
[0024] 圖5A-5D.移植后7天時。（A-C)，在小鼠中的MSS、0.3%本體、1%本體和INTEGRA支 架的確認(rèn)。(D)，移植后支架的相對尺寸。
[0025] 圖6A-6C.移植后7天，細(xì)胞浸潤MSS支架直至支架的中心(A)，但未浸潤1 %本體(B) (除了支架裂開處外），且極少浸潤3 %本體(C)。
[0026]圖7.移植后7天。DAPI核染(藍(lán)色)證實了細(xì)胞侵入MSS的中心以及CD31 +內(nèi)皮前體 細(xì)胞(紅色）。
[0027] 圖8A-8E.移植后14天。（A-D)，在小鼠中的MSS、0.3 %本體、1 %本體和INTEGRA支架 的確認(rèn)。(E)，移植后支架的相對尺寸。
[0028]圖9A-9D.移植后14天。（A)，MSS支架中顯著的細(xì)胞侵襲。（B)，具有最小侵襲（除沿 著裂紋外）的1 %膠原。（C)，具有零星侵襲的0.3%膠原支架。（D)，在14天時INTEGRA也具有 較小的表觀侵襲。
[0029]圖10.每單位支架面積的細(xì)胞計數(shù)顯示出在7天和14天時，相對于1 %水凝膠(每單 位面積約3個和5個細(xì)胞)和0.3%水凝膠(每單位面積約3個和7個細(xì)胞），顯著更多的細(xì)胞侵 入所述MSS支架(每面積分別約7個細(xì)胞和10個細(xì)胞）。
[0030] 圖11A-11D.移植后28天。（A-C)，在小鼠中的MSS、0.3%本體、1 %本體和INTEGRA支 架的確認(rèn)。(D)，移植后支架的相對尺寸。注意0.3%水凝膠顯著收縮。
[0031] 圖12A-12D.移植后28天。（A)，MSS支架中極好的細(xì)胞侵襲。（B)，1 %膠原維持最小 侵襲(除沿著裂紋外）。（C)，0.3%膠原支架顯示出均勻適中的侵襲。（D)，INTEGRA也顯示出 合理的侵襲。
[0032]圖13.微球的掃描電子顯微鏡圖像。
[0033] 公開詳述
[0034] 本文公開的是組織支架材料，其具有改善的能力以促進用于傷口愈合和組織再生 的細(xì)胞侵襲和血管形成。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)具有不同密度的組分的材料促進細(xì)胞(包括所需的 細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞)侵入所述材料。
[0035] 術(shù)語"組織支架"、"組織支架材料"、"真皮替代物"、"真皮替代材料"和"材料"在本 文中可互換使用，指的是由生物相容性聚合物制得的細(xì)胞生長支持結(jié)構(gòu)。這些材料能夠通 過提供促進細(xì)胞侵襲和組織再生的生物相容性模板而再生受損組織。
[0036] 本文公開的組織支架材料由填充有微球的水凝膠支持物組成。微球具有與其所嵌 埋于其中的水凝膠不同的密度(所述密度測量為重量/體積或w/v)。在一個優(yōu)選實施方式 中，微球具有大于水凝膠的密度。然而，微球可具有小于水凝膠的密度。
[0037] 在本申請全文中，術(shù)語"約"和"大約"表明某值包含裝置、用于測定所述值的方法 的固有誤差變化，或者存在于研究受試者中的變化。在一個非限制性實施方式中，所述術(shù)語 被定義為在10%以內(nèi)，優(yōu)選5%以內(nèi)，更優(yōu)選1%以內(nèi)，且最優(yōu)選0.5%以內(nèi)。
[0038] 聚合物
[0039]本發(fā)明所公開的微球、水凝膠和組合物包含聚合物。微球和水凝膠可包含相同聚 合物，或可包含彼此不同的聚合物。"聚合物"是由重復(fù)亞單位組成的大分子。用于組織工程 的適宜的聚合物材料包括天然聚合物，例如膠原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鹽和纖維素;纖 維蛋白原；以及合成聚合物，包括聚酯（例如聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸） (卩6六）、聚（乳酸）（？1^)、聚（己內(nèi)酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、聚(對二氧 環(huán)己酮)和聚(對苯二甲酸丁二醇酯））；聚酯酰胺(例如HYBRANE S1200(DSM，荷蘭））；聚氨酯 (例如DEGRAPOL(Abmedica，意大利））；聚酸酐（例如聚[(羧基苯氧基）丙烷-癸二酸]);聚磷 酸酯（例如聚[對苯二酸雙(羥乙基)酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]);聚（原酸酯）；聚(氰基 丙烯酸烷基酯）；聚醚(例如聚（乙二醇））；微生物聚酯(例如聚(β_羥基鏈烷酸酯））；以及聚 (氨基酸）（例如酪氨酸衍生的聚碳酸酯）（綜述參見131"；[11等人，1111:.]\他11〇1116(1.8:3071-3091(2013))。在一個實施方式中，所述聚合物選自由以下構(gòu)成的組:膠原、透明質(zhì)酸、聚（乳 酸-共-乙醇酸）(PLGA)、聚（乙醇酸）(PGA)和聚(乳酸）(PLA)。優(yōu)選的聚合物是膠原和基于膠 原的生物材料，包括1、11、111、1￥和￥型膠原。特別優(yōu)選在人類受試者中使用人膠原和牛膠 原，例如人I型膠原或牛I型膠原。
[0040] 微球
[0041] "微球"是由聚合物制成的小顆粒。如本文所使用的術(shù)語"微球"包括可為球形或非 球形的小顆粒;因此，本申請中任何提及的"微球"可與術(shù)語"微結(jié)構(gòu)"互換使用，因為本文所 公開的微球同時包括球形和非球形小顆粒。雖然微球可包含lwn-lmm的任意直徑，但如本文 所公開的微球通常具有例如介于10-500μηι之間的直徑、介于50-250μηι之間的直徑、介于50-150μηι之間的直徑或介于100-200μηι之間的直徑。在一個實施方式中，組織支架材料中的微 球的尺寸和形狀相當(dāng)均勻，例如，給定支架中的所有微球大體上可為球形，并具有約50-150 μπι的直徑，或約100-200μπι的直徑。在另一實施方式中，給定支架中的微球的形狀可不同，例 如，一些可為扁平、彎曲、長圓或不規(guī)則形狀，而其它可為球形。在另一實施方式中，給定支 架中的微球的尺寸可不同，例如，尺寸不同可為10-500μηι直徑、或甚至1 -1 ΟΟΟμπι直徑。
[0042] 在一些實施例中，微球由0.2%至2.0%、0.4%至1.2%、0.4%至0.8%、或0.2%、 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、或1.0%￥八的選自以下的聚合物制得:膠 原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鹽、纖維素、纖維蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙 醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己內(nèi)酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、聚(對 二氧環(huán)己酮)和聚(對苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二 酸]、聚[對苯二酸雙(羥乙基)酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]、聚(原酸酯）、聚(氰基丙烯酸 烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_羥基鏈烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一個 特定實施方式中，聚合物是膠原。
[0043] 除聚合物外，微球可進一步包含生物活性因子。"生物活性因子"可為可刺激或促 進以下一項或多項的有機小分子、核酸或多肽:細(xì)胞侵襲、細(xì)胞生長、血管生成、血管形成、 神經(jīng)再生或細(xì)胞分化。生物活性因子可為例如，在制備組織支架材料之前包含在微球內(nèi)或 與微球的聚合物基質(zhì)混合的生長因子。在一個實施例中，生物活性因子是選自由以下構(gòu)成 的組的生長因子：神經(jīng)生長因子(NGF)、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、血小板衍化生長因子 (TOGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(ΝΤ-3)、腦源性生長因子(K)NF)、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF)、色素上皮細(xì)胞衍生因子(PEDF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生生長因子(GDNF)、血管生成素和紅細(xì) 胞生成素(ΕΡ0)。在另一實施例中，生物活性因子是核酸，例如反義siRNA分子。在其它實施 方式中，微球不包含其它生物活性因子。
[0044]水凝膠
[0045]術(shù)語"水凝膠"是指在水中大量溶脹卻不溶于水的廣泛類別的聚合物材料。通常， 通過在以下條件下在水溶液中聚合親水性單體而形成水凝膠:聚合物變得交聯(lián)，從而形成 足以膠凝溶液的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)。水凝膠更詳細(xì)地描述于Η 〇 f f m a η，D. S.，〃 Ρ ο 1 y m e r s i η Medicine and Surgery，''Plenum Press，New York，pp 33-44( 1974)中。
[0046]本文所公開的水凝膠可由以上提供的聚合物組成。在實施例中，水凝膠包含0.1% 至0.6 %、0.2至0.4%或0.3 % w/v的選自由以下構(gòu)成的組的聚合物:膠原、明膠、彈性蛋白、 透明質(zhì)酸鹽、纖維素、纖維蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚（乳 酸）（PLA)、聚（己內(nèi)酯）、聚（琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、聚(對二氧環(huán)己酮)和聚 (對苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[對苯二酸 雙(羥乙基)酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二 醇）、微生物聚酯、聚(β-羥基鏈烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一個實施例中，水凝膠 包含膠原。在一些實施例中，水凝膠包含0.1 %至0.6%、0.2至0.4%或0.3 %w/v的量的膠 原。
[0047]制造組織支架材料的方法
[0048] 本發(fā)明還公開的是制造組織支架材料的方法。所述方法包括以下步驟：（a)提供具 有微球的第一組合物和具有聚合物材料的第二組合物，第一組合物具有與第二組合物不同 的密度；（b)混合第一和第二組合物;和(c)使所述聚合物材料在所述混合物中交聯(lián)，以形成 具有嵌埋微球的水凝膠。
[0049] 為制造支架，將適合的聚合物摻入用于制造的組合物中。適合的聚合物包括天然 聚合物，例如膠原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鹽和纖維素;纖維蛋白原;和合成聚合物，包括 聚酯(例如聚(乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己內(nèi)酯）、聚 (琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、聚（對二氧環(huán)己酮）和聚(對苯二甲酸丁二醇酯））； 聚酯酰胺（例如HYBRANE S1200 (DSM，荷蘭））；聚氨酯（例如DEGRAP0L(Abmedica，意大利））； 聚酸酐(例如聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]);聚磷酸酯(例如聚[對苯二酸雙(羥乙基)酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]);聚（原酸酯）；聚（氰基丙烯酸烷基酯）；聚醚（例如聚（乙二 醇））；微生物聚酯（例如聚(β_羥基鏈烷酸酯））；和聚（氨基酸）（例如酪氨酸衍生的聚碳酸 酯）（綜述參見Marin等人，Int.J.Nanomed. 8: 3071-3091 (2013))。在一個實施方式中，所述 聚合物選自由以下構(gòu)成的組：膠原、透明質(zhì)酸、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸） (PGA)和聚(乳酸）（PLA)。優(yōu)選的聚合物是膠原和基于膠原的生物材料，包括I型、II型、III 型、IV型和V型膠原。特別優(yōu)選的是人膠原和牛膠原。牛I型膠原是市售的，例如來自Life Technologies，Inc ·。人I型膠原可例如作為VITR0C0L(Advanced Biomatrix，Inc ·，San D i e go，Ca 1 i for n i a)以凍干形式或溶液獲得。重組人膠原可例如作為COLLAGE膠原 (CollPlant Ltd.，Ness_Ziona，以色列）獲得。
[0050] 膠原可源自各種來源，例如人組織或牛組織。膠原可為被給予組織支架的受試者 自體的，并可提取自例如所述受試者的皮膚。一旦獲得適合的生物樣本(例如皮膚、胎盤、肌 腱或培養(yǎng)細(xì)胞），則可通過已知技術(shù)從所述樣本中提取膠原以形成原液。參見例如Epstein， J. Biol. Chem. 249:3225-3231 (1974)。膠原原液可在適當(dāng)溶液中包含膠原，所述溶液包含例 如0.1 %醋酸、或者厄爾鹽或漢克鹽、L-谷氨酰胺、HEPES和碳酸氫鈉。適當(dāng)介質(zhì)的一個例子 是Medium 199(M199)基介質(zhì)。此介質(zhì)可購自例如Sigma-Aldrich、Life Technologies和其 它細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)供應(yīng)商。膠原通常保持在高于最終濃度的儲備濃度下，例如對于水凝膠為 0.2 % -1.6 %膠原濃度，優(yōu)選0.3-0.5 %膠原，對于微球為0.6-2.0 %膠原。適于用于所公開 的方法中的膠原也是市售的。
[0051] 在一些實施方式中，在使用前中和膠原。可通過混合膠原原液與氫氧化鈉以達(dá)到 ρΗ7.2-7.6，優(yōu)選pH 7.4來中和膠原。此混合物可用油（例如礦物油）覆蓋，優(yōu)選每體積的具 有NaOH的膠原至少5體積的油，并冷藏儲存直至使用。
[0052] 為制造微球，高速混合具有油覆蓋層的聚合物(例如，膠原)組合物以形成水包油 乳液。所述聚合物組合物可進一步包含至少一種類型的如上文所公開的生物活性因子。然 后采用增加濃度的乙醇重復(fù)洗滌所述乳液，例如，首次洗滌采用50 %乙醇，第二次洗滌采用 80%乙醇，第三至第五次洗滌采用100%乙醇。首次洗滌包括與每體積膠原溶液至少5體積 的乙醇混合(例如通過在800-1500rpm下混合20-40分鐘），在2500-3500rpm下離心混合物δ-? 〇 分鐘 ，并 除去油 和醇層 。隨后 的洗滌 包括與 每體積 膠原溶 液至少 5 體 積的乙 醇混合 ，在 2500-3500rpm下離心混合物5-10分鐘，并除去醇層。在醇洗后，接著用至少5體積的冷鹽水 (例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))洗滌膠原3-5次。在除去最后的鹽水洗液后，通過洗滌而形成 的膠原微球組合物即可備用。
[0053] 用于水凝膠的聚合物可與用于制造微球的聚合物相同或不同。在一些實施方式 中，用于水凝膠的聚合物與用于微球的聚合物相同。在其它實施方式中，用于水凝膠的聚合 物與用于微球的聚合物不同。在一個優(yōu)選實施方式中，用于微球和水凝膠的聚合物均為膠 原。然而，無論微球和水凝膠是否具有相同或不同的聚合物，微球中的聚合物密度(w/v)將 不同于水凝膠"本體"中的聚合物密度(w/V)。
[0054] 為制造膠原水凝膠"本體"支架，混合膠原原液與氫氧化鈉以達(dá)到pH 7.2-7.6，優(yōu) 選pH7.4。然后此膠原組合物即可備用。
[0055] 為制造組織支架材料，將包含微球的第一組合物添加至模具或成形平臺。將包含 聚合物材料的形成水凝膠的第二組合物添加加至第一組合物。例如通過攪拌或移液混合所 述組合物，以實現(xiàn)均勻混合。然后通過適用于交聯(lián)聚合物的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如通過熱方法(在 35-45Γ，優(yōu)選37°C下培養(yǎng)20-40分鐘)或化學(xué)方法)交聯(lián)所述混合物。交聯(lián)后，組織支架材料 可立即使用或存作將來使用。
[0056]組織支架和敷料
[0057]還公開的是通過本文提供的方法制造的組織支架材料。制造組織支架的微球和水 凝膠各自包含選自由以下構(gòu)成的組的聚合物:膠原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鹽、纖維素、 纖維蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己內(nèi)酯）、 聚(琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、聚(對二氧環(huán)己酮)和聚(對苯二甲酸丁二醇酯）； 聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[對苯二酸雙(羥乙基)酯-正磷酸乙 酯/對苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙烯酸烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_ 羥基鏈烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。在一個實施方式中，所公開的組織支架材料的微 球和水凝膠各自包含膠原（例如人膠原或牛膠原）作為聚合物。所述膠原可為經(jīng)中和的膠 原。所述組織支架材料可為適用于注射入受試者的可流動形式，或為片材形式，例如厚度為 0.5_3. Omm，或 l_2mm 的片材。
[0058]在特定實施例中，組織支架材料可具有如下微球:所述微球具有0.2%至2.0%、 0.4%至1.2%、0.6%至1.0%或1.0%￥八的膠原，并嵌埋在具有0.1%至0.6%、0.2至0.4% 或0.3% %w/v膠原的水凝膠中。微球具有不同于(通常大于)水凝膠的密度。密度之間的差 異應(yīng)至少為25%。在一些實施方式中，當(dāng)相對于膠原密度比較微球密度時，所述差異為至少 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更多。在一個實施方式中， 組織支架材料具有如下微球:所述微球具有0.6-1.0 %w/v的膠原，并嵌埋在包含0.3 %w/v 膠原的水凝膠中。在另一個實施方式中，微球占組織支架材料的體積的至少約50%、60%或 70%。在進一步的實施方式中，微球包含生物活性因子，例如生長因子。
[0059] 進一步公開的是傷口敷料和醫(yī)療產(chǎn)品，所公開的組織支架材料被整合至所述傷口 敷料和醫(yī)療產(chǎn)品中。組織支架材料可嵌埋入敷料中，或沉積在敷料的一面上。敷料可進一步 包含一種或多種硅酮、紗布或其它覆蓋物，和/或抗生素、抗炎劑或鎮(zhèn)痛劑或其它藥膏以促 進治愈或減少疼痛。
[0060] 組織支架產(chǎn)品可進一步適當(dāng)?shù)匕b(例如在無菌包裝中），以用于傷口愈合或組織 再生。
[0061 ]治療方法
[0062] 本發(fā)明進一步公開的是通過將如本文所公開的組織支架材料施用至有需求的受 試者的傷口或組織在所述受試者中促進傷口愈合或組織再生的方法?？蓪⒔M織支架材料施 用至例如受試者的期望組織再生的任何區(qū)域，例如施用至開放傷口或在外科手術(shù)過程期 間。在優(yōu)選實施方式中，將所公開的組織支架施用至具有外露骨、硬件或壞死組織的機體區(qū) 域。
[0063] 本文所公開的組織支架可移除或原位保留。聚合物可為生物可降解的，且在此類 情況下其將逐漸溶解，留下新的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和由受試者的細(xì)胞形成的血管。
[0064]如本文所使用，術(shù)語〃受試者〃和〃患者〃可互換使用，并且是指動物，包括哺乳動 物，例如非靈長類(例如牛、豬、馬、貓、狗、鼠等)和靈長類(例如猴和人）。
[0065]通過以下非限制性實施例進一步闡釋本公開。 實施例
[0066]實施例1.微球/水凝膠支架的制造。
[0067]使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從鼠尾樣本提取I型膠原。使用銳剝離從鼠尾移除皮膚并將其丟棄。 然后，從尾部遠(yuǎn)端開始，通過破壞椎骨內(nèi)關(guān)節(jié)并上拉遠(yuǎn)端椎骨直至具有附接肌腱的遠(yuǎn)端椎 骨從剩余近端尾部分離，從而提取肌腱。然后將椎骨從肌腱銳剝離并將其丟棄。之后，將肌 腱置于70 %乙醇中。重復(fù)此過程直至尾內(nèi)的所有關(guān)節(jié)均被破壞且肌腱被提取。收集所提取 肌腱、稱重并置于無菌1L容器中。此后，將0.1 %醋酸添加至肌腱以達(dá)到75ml醋酸/g肌腱的 最終濃度，以便獲得15mg/mL(l.5%w/v)I型膠原的膠原原液。然后將膠原原液貯存在4C下， 并每日攪動約1分鐘，持續(xù)至少72小時。
[0068] 72小時后，將膠原原液等分入50mL圓錐管中，在4°C和8800rpm下離心90分鐘，并移 除和棄去任意丸粒。然后將最后的15mg/mL(l .5%w/v)膠原原液置于標(biāo)準(zhǔn)凍干器中并凍干 至少72小時。凍干后，在-4°C下貯存膠原原液直至使用。一旦使用，將該凍干膠原重懸浮于 0.1 %醋酸中至1 Omg/mL(1 % w/v)的濃度。使用前每日攪動該重懸浮膠原（約1分鐘），持續(xù)3 天。1.5% (w/v)膠原和0.384% (w/v)膠原的原液分別用于產(chǎn)生微球和0.3%水凝膠。
[0069] 為中和膠原以制造 1%微球，在冰上混合2ml 1.5%膠原與656μ1 IX M199介質(zhì) (Gibco/Life Technologies,Inc.)、300yl 10XM199介質(zhì)和44μ1 NaOH(或根據(jù)需要更多的 NaOH以調(diào)節(jié)pH至7.4)。用至少5倍體積(例如15ml)的礦物油覆蓋該混合物，并在4°C下貯存 直至使用。
[0070] 為制造微球，通過高速渦旋混合具有油覆蓋層的經(jīng)中和的膠原約5分鐘，以產(chǎn)生油 包水乳液。然后將乳液傾入燒瓶，與每體積的減去油的膠原溶液至少5體積的50%乙醇合 并，并用攪拌子在llOOrpm下攪拌30分鐘。然后將經(jīng)攪拌的混合物倒入50ml的管中，并在 3200rpm和4°C下離心7分鐘以形成油層和乙醇層，在所述油層和醇層間具有膠原薄層。除去 油層和醇層，用5體積的80 %乙醇洗滌膠原層，如上渦旋和離心，除去醇層，用5體積的100 % 乙醇洗滌，渦旋和離心，并除去醇層。然后用5體積的冷PBS洗滌膠原三回合，渦旋和離心，并 除去PBS。此過程期間，膠原微球形成。
[0071] 為制備用于水凝膠的膠原"本體"，在冰上混合391μ1 0.384%膠原與50.8μ1 IX 皿199介質(zhì)、5(^11(^1199介質(zhì)和8.6以1他0!1(或根據(jù)需要更多的似0!1以調(diào)節(jié)?!1至7.4)。然 后可使用此混合物如下制造支架。
[0072]為制造支架，使用具有7mm直徑和2.5mm深度的模具產(chǎn)生約96mm3的支架。為制造微 球支架，將通過以上方法制造的微球吸移入各孔中至充填各孔約半滿。每孔加入一滴膠原 本體，并通過攪拌與微球混合以形成嵌埋微球的水凝膠。然后在37°C下固化支架30分鐘。在 經(jīng)固化的支架上覆蓋磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)以防止進一步干燥。為制造"本體"支架，在沒有 微球的情況下將膠原本體加至模具至與具有微球的支架大致相同的水平。如上固化支架并 使用PBS覆蓋。
[0073] 根據(jù)開普勒密堆積球體猜想，支架體積的約74%應(yīng)包括較高密度的微球，本體膠 原水凝膠占據(jù)其余體積。
[0074] 實施例2.含微球的支架促進細(xì)胞浸潤。
[0075] 在植入前一天制造支架。將支架皮下植入8周齡野生型C57bl/6小鼠的背部。3只小 鼠移植如下總共4個支架:兩個為在0.3 %本體支架中1 %微球;一個1 %本體支架作為對照； 一個0.3%本體支架作為對照。7或14天后處死并收獲所有小鼠用作組織學(xué)分析。在埋入最 佳切割溫度復(fù)合物(0CT)介質(zhì)中的組織樣本上進行蘇木精和伊紅(H&E)染色以確認(rèn)細(xì)胞浸 潤入支架。
[0076]植入7天后，微球支架(MSS)顯示出橫跨支架整個深度的顯著且均勻的細(xì)胞侵襲 (圖1C)。相對地，細(xì)胞零星且僅部分侵入0.3%對照支架（圖1B)，并且未能侵入1%對照支 架，而是沿著所述支架的外圍增殖(圖1A)。
[0077]植入14天后，MSS顯示出橫跨支架深度的強勁的細(xì)胞侵襲（圖2C)。相對地，細(xì)胞零 星侵入〇.3%(w/v)膠原支架（圖2B)，并且完全未能侵入l%(w/v)膠原支架，而是僅保持局 限于外圍（圖2A)。
[0078] 實施例3.相對于水凝膠密度不同的微球密度促進細(xì)胞浸潤。
[0079] 如下制備在微球(MS)和水凝膠(H)中具有不同膠原密度(w/v)的微球支架：（A)在 0.3%!1中1%膠原15;(8)0.6%]\^/0.3%!1 ;(〇0.4%]\^/0.2%!1;(0)0.4%]\^/0.6%!1。參見 表1。
[0080] 表1.微球支架的密度
[0082]將MSS皮下植入成年小鼠的背部，并在植入后7天和14天時收獲用于免疫組織化 學(xué)。免疫組織化學(xué)分析確認(rèn)在所有MSS中的細(xì)胞浸潤（圖3A-3D)，在1 %MS/0.3 % Η和0.6 %MS 0.3%H中觀測到最大浸潤（圖3C-3D)。此外，植入7天和14天后在所有MSS中觀測到⑶31表達(dá) (圖4A-4B)，表示侵入的內(nèi)皮前體細(xì)胞和新生血管形成。
[0083] 實施例4 .MSS經(jīng)28天植入促進細(xì)胞浸潤。
[0084] 18只小鼠的每只小鼠如下接受4種皮下植入物(A-D): (A)MSS(在0.3%膠原本體中 1%膠原微球本體膠原水凝膠對照，（C)0.3%膠原水凝膠對照，和(D)INTEGRA真皮 再生模板（Integra LifeSciences，Plainsboro，NJ)的7mm直徑切片。在植入后第7、14和28 天時處死小鼠（每個時間點6只小鼠）。
[0085] 植入后7天時（圖5A-5D)，MSS、1 %膠原對照和INTEGRA支架相對于植入前保留相似 尺寸和形態(tài)，而0.3%膠原對照的尺寸顯著減小（圖。植入后1周時MSS的H&E染色顯示細(xì) 胞一路侵入支架的中心（圖6A)。相比之下，除了沿著材料已裂開的裂縫外，1%膠原支架無 侵襲（圖6B)。收縮的0.3%膠原支架中也具有最小侵襲（圖6C)。用CD31抗體（以確認(rèn)內(nèi)皮祖 細(xì)胞)和DAPI(以確認(rèn)浸潤細(xì)胞)對MSS模板進行熒光染色顯示，多種細(xì)胞類型（包括內(nèi)皮祖 細(xì)胞)在7天時已經(jīng)浸潤MSS支架（圖7)。在1 %和0.3 %水凝膠對照中未觀測到⑶31+細(xì)胞(數(shù) 據(jù)未示出）。
[0086] 14天后（圖8A-8E)，MSS、1 %膠原對照和INTEGRA支架仍然接近植入前尺寸，而 0.3%膠原對照的尺寸顯著減小（圖SEhMSS支架顯示出顯著的細(xì)胞侵襲（圖9A);除了沿著 裂紋外，1 %膠原顯示出最小侵襲（圖9B);且0.3 %膠原支架顯示出零星侵襲（圖9C)。 INTEGRA支架相比于MSS支架顯示出不那么強勁的侵襲（圖9D); INTEGRA支架的致密結(jié)構(gòu)在 為了 H&E染色的切片過程中導(dǎo)致支架剪切。
[0087] 每單位支架面積的細(xì)胞計數(shù)的比較（圖10)顯示在7天和14天時，相對于1%水凝膠 (每單位面積約3個和5個細(xì)胞)和0.3%水凝膠(每單位面積約3個和7個細(xì)胞），顯著更多的 細(xì)胞侵襲MSS支架(每單位面積分別約7個細(xì)胞和10個細(xì)胞）。
[0088] 植入后28天時（圖11六-110)肩33、1%膠原對照和11^^61^支架相比植入前尺寸略 微更小，而0.3 %膠原對照比在7天或14天時更?。▓D1 ID) JSS支架在第28天時顯示出良好 的細(xì)胞侵襲（圖12A)，1%膠原顯示出實質(zhì)上無侵襲（圖12B)，且0.3%膠原支架盡管其尺寸 小，但顯示出侵襲（圖12C)。INTEGRA支架也顯示出一些侵襲（圖12D)。
[0089]實施例5.微球的掃描電子顯微鏡。
[0090] 如實施例1中那樣制備微球并準(zhǔn)備用于掃描電子顯微鏡(SEM)。如圖13中所見，微 球的尺寸(介于50_300μπι之間）和形狀(一些為高度球形的，而其它的形態(tài)為不規(guī)則的）可不 同。
【主權(quán)項】
1. 一種組織支架材料，其包含水凝膠和微球，所述水凝膠包含第一聚合物且所述微球 包含第二聚合物，其中所述微球嵌埋在所述水凝膠中，且所述微球具有大于所述水凝膠的 密度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一和第二聚合物獨立地選自由以下構(gòu)成的 組:膠原、明膠、彈性蛋白、透明質(zhì)酸鹽、纖維素、纖維蛋白原、聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA)、 聚（乙醇酸）（PGA)、聚(乳酸）（PLA)、聚（己內(nèi)酯）、聚(琥珀酸丁二酯）、聚(三亞甲基碳酸酯）、 聚(對二氧環(huán)己酮)和聚(對苯二甲酸丁二醇酯）；聚酯酰胺、聚氨酯、聚[(羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]、聚[對苯二酸雙(羥乙基)酯-正磷酸乙酯/對苯二甲酰氯]、聚（原酸酯）、聚(氰基丙 烯酸烷基酯）、聚（乙二醇）、微生物聚酯、聚(β_羥基鏈烷酸酯)和酪氨酸衍生的聚碳酸酯。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二聚合物是膠原。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述第一聚合物是膠原。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球包含0.2%至2.0% w/V的所述第二聚合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組織支架材料，其中所述微球包含0.4%至1.2%w/v的所述第 二聚合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組織支架材料，其中所述微球包含0.6%至1.0%w/v的所述第 二聚合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球的直徑介于50-250μ m之間。9. 根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項所述的組織支架材料，其中所述水凝膠包含0.1 %至 0.6 % w/v的量的膠原。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球占組織支架材料的 體積的至少約70%。11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球包含0.4至1.2% w/v的膠原，且所述水凝膠包含0.2至0.6 % w/v的膠原。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組織支架材料，其中所述微球包含0.6-1.0%w/v的膠原，且 所述水凝膠包含〇. 3 % w/v的膠原。13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球進一步包含生物 活性因子。14. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的組織支架材料，其中所述微球不包含附加的生 物活性因子。15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的組織支架材料，其為片材形式或為可流動形式。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組織支架材料，其中所述材料為厚度為0.5-3.Omm的片材形 式。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的組織支架材料，其中所述材料為厚度為約1.0-2. Omm的片材 形式。18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所述的組織支架材料在受試者的傷口愈合或組織再生 方法中的用途。19. 一種在有需求的受試者中促進傷口愈合或組織再生的方法，其包括將權(quán)利要求1- 17中任一項所述的組織支架材料施用至所述受試者的傷口或組織。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中將所述組織支架材料施用至所述受試者的具有 外露骨、硬件或壞死組織的區(qū)域。21. -種制造組織支架材料的方法，其包括以下步驟： a. 提供包含微球的第一組合物和包含聚合物材料的第二組合物，所述第一組合物具有 與所述第二組合物不同的密度； b. 混合所述第一和第二組合物;和 c. 使所述聚合物材料在所述混合物中交聯(lián)，以形成具有嵌埋微球的水凝膠。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一和第二組合物各自包含膠原作為聚合 物。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述膠原是人膠原或牛膠原。24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述膠原是經(jīng)中和的。25. 根據(jù)權(quán)利要求21 -24中任一項所述的方法，其中所述微球包含0.4 %至1.2 % w/v的 膠原。26. 根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項所述的方法，其中所述第二組合物包含0.1 %至0.6 % w/v的膠原。27. 根據(jù)權(quán)利要求21 -26中任一項所述的方法，其中所述微球包含0.6-1.0 % w/v的膠 原，且所述第二組合物包含0.3 % w/v的膠原。28. 根據(jù)權(quán)利要求21-27中任一項所述的方法，其中所述交聯(lián)通過熱方法完成。29. -種通過權(quán)利要求21-28中任一項所述的方法制得的組織支架材料。30. -種敷料，其包含權(quán)利要求1-17或29中任一項所述的組織支架材料。
【文檔編號】A61L27/52GK105916528SQ201480073519
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月19日
【發(fā)明人】J·斯佩克特, A·D·斯托克, J·摩根
【申請人】康奈爾大學(xué)