肺炎鏈球菌的檢測(cè)的制作方法
【專利說(shuō)明】肺炎鏈球菌的檢測(cè)
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)是脈毒癥（sepsiS)的致病劑，并且能夠 特異性檢測(cè)其在血液中的存在將會(huì)是方便的。肺炎鏈球菌還是社區(qū)獲得性肺炎 (community-acquired pneumonia)的主要成因。非常重要的是，能夠區(qū)分肺炎鏈球菌與鏈 球菌族群的其他成員，從而確定樣品中存在的任何鏈球菌是否實(shí)際上對(duì)應(yīng)于致病肺炎鏈球 菌種，或?qū)?yīng)于宿主中組成性地存在的不引起疾病的其他無(wú)害鏈球菌種。
[0003] 已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試W檢測(cè)肺炎鏈球菌并且將其與鏈球菌族群的其他成員區(qū)分 (Wessels 等人，J. Clin.Microbiol. 2012年4 月，第50卷，第4期，1171-1177)。運(yùn)些包括培養(yǎng) 物測(cè)試和常規(guī)生物化學(xué)和表型測(cè)試，如革蘭氏染色形態(tài)、奧普托欣敏感性、菌落形態(tài)、和羊 血瓊脂上的α-溶血。所使用的另外的技術(shù)包括:MALDI-T0F(MS基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行 時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry))、若干基因的序列分析、和包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定在內(nèi)的分子測(cè)定。然而，歸因于 不同種之間的高度序列相似性，運(yùn)些技術(shù)中的大多數(shù)不能將肺炎鏈球菌與鏈球菌族群的其 他成員區(qū)分。其他技術(shù)包括用于檢測(cè)鏈球菌屬細(xì)菌的基于基因 rpoB區(qū)域的擴(kuò)增的分子方 法。在EP 1558637和EP 1694861中提供了運(yùn)種方法的兩個(gè)具體實(shí)例。
[0004] EP 1558637利用巧oB基因的724bp片段(在W0 2004/041841 中顯示為沈Q IDN212 )，用于檢測(cè)可能存在于樣品中的鏈球菌屬細(xì)菌?？蒞通過指定片段的擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行運(yùn)樣的檢 測(cè)。然而，沒有為鏈球菌屬的不同種的特異性檢測(cè)提供特定的探針。
[0005] 在EP1694861中，利用對(duì)于所有鏈球菌屬的種常見的一對(duì)引物擴(kuò)增rpoB基因的片 段。從而得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而如在W上EP 1558637中的，與可W存在于樣品中的特定種無(wú)關(guān)。 在本情況中，提供了探針，其預(yù)期用于肺炎鏈球菌和釀脈鏈球菌（Streptococcus pyogenes)的特異性檢測(cè)（相應(yīng)WO 2005/059156的表3)。然而，一些探針之間的最小序列差 異可W證實(shí)W下是困難的:運(yùn)樣的探針可W實(shí)際上用于它們祀向的兩種不同鏈球菌種的特 異性檢測(cè)（例如：SEQ IDN24和SEQ IDN95的探針，分別對(duì)應(yīng)于釀脈鏈球菌和肺炎鏈球菌， 僅有兩個(gè)核巧酸的差異）。沒有提供對(duì)應(yīng)于鏈球菌屬的其他種的其他探針。
[0006] 考慮到W上信息，需要提供基于探針雜交的用于相對(duì)于鏈球菌屬的其他種特異性 檢測(cè)肺炎鏈球菌的有效方法。換句話說(shuō)，非常理想的是提供允許差異檢測(cè)樣品中存在的肺 炎鏈球菌的的方法，即與鏈球菌屬的其他種相區(qū)別的肺炎鏈球菌的特異性檢測(cè)。
[0007] 發(fā)明概述
[000引本發(fā)明要解決的問題是提供用于檢測(cè)樣品中存在的肺炎鏈球菌的方法，其允許特 異性地區(qū)分肺炎鏈球菌與鏈球菌屬的其他種。
[0009] 解決方案基于同時(shí)使用包含SEQ IDN叫和SEQ (參見W下表1)或由其組成 的探針W檢測(cè)樣品中肺炎鏈球菌的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針由SEQ IDN&1:或SEQ ID 組成。
[0010] 如W上所指出的，在鏈球菌屬的不同種之間存在高序列相似性；當(dāng)試圖通過探針 雜交檢測(cè)肺炎鏈球菌并且將其與其他鏈球菌種特異性區(qū)分時(shí)，運(yùn)種情況構(gòu)成了沉重的負(fù) 擔(dān)。SEQ IDN21和SEQ 10^?的探針W及因此的本發(fā)明的各種方面允許有效地檢測(cè)肺炎鏈 球菌并且將肺炎鏈球菌與鏈球菌屬的至少W下種區(qū)分：星座鏈球菌（S化eptococcus(S.) constellatus)、咽峽炎鏈球菌（S.anginosus)、輕型鏈球菌（S.mitis)、解沒食子酸鏈球菌 (S. gallolyticus)、停乳鏈球菌（S. dysgalactiae)、釀脈鏈球菌（S.pyogenes)、豬鏈球菌 (S. suis)、中鏈球菌（S. intermedins)、血鏈球菌（S. sanguinis)、口腔鏈球菌（S.oralis)和 副血鏈球菌（5.9日招3日雌11；[]113)。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的各種方面，通過與如SEQ ID：N21和SEQ IDN22中定義的兩個(gè)探針的 雜交進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，用于肺炎鏈球菌的特異性檢測(cè)。僅當(dāng)樣品中存在的DNA對(duì)應(yīng)于肺炎鏈球 菌時(shí)，才發(fā)生與運(yùn)兩種探針的結(jié)合。在沒有或僅一種SEQ IDN21和SEQ 的探針結(jié)合 樣品中存在的DNA的情況下，該DNA不對(duì)應(yīng)于肺炎鏈球菌，而是對(duì)應(yīng)于鏈球菌屬的其他種。唯 一的例外是含有輕型鏈球菌的DNA的樣品的情況，在運(yùn)種情況中，樣品DNA與SEQ IDN:叫的 探針結(jié)合，還在一定水平上發(fā)生了DNA與SEQ IDN^的探針的結(jié)合，但是比與SEQ IDN91的 探針結(jié)合低得多的程度(參見W下實(shí)施例2)。"低得多的程度"理解為意味著與利用SEQ ID N21獲得的結(jié)合水平相比20 % W下的結(jié)合水平。
[0012] 表1.
[0013]
[0014] 如由表1的SEQ IDN23、SEQ IDN94和SEQ ID護(hù)5定義的探針也結(jié)合肺炎鏈球菌 的核酸。然而，已經(jīng)證實(shí)它們是非特異性的，因?yàn)樗鼈円踩我獾亟Y(jié)合鏈球菌屬的其他種的核 酸，而不遵循任何類型的可預(yù)測(cè)模式。
[0015] 發(fā)明人不清楚現(xiàn)有技術(shù)水平中或探針序列中存在任何線索（pointer)，w解釋為 什么與SEQ IDN叫和SEQ 的探針的同時(shí)雜交會(huì)導(dǎo)致W將會(huì)允許將其與鏈球菌屬的其 他種W特定方式區(qū)分的方式檢測(cè)肺炎鏈球菌。在解鏈溫度、核巧酸的數(shù)量、％GC(表1)方面 或運(yùn)些探針區(qū)別于肺炎鏈球菌野生型序列的核巧酸數(shù)量方面沒有要發(fā)現(xiàn)的解釋(表2)。
[0016] 表2. SEQ IDN21至5的探針區(qū)別于肺炎鏈球菌野生型序列和鏈球菌屬的其他種的 序列的核巧酸數(shù)量：
[0017]
[
[0019] 有時(shí)已經(jīng)檢測(cè)了某些種的序列的不同變體。運(yùn)是為什么有時(shí)某個(gè)探針區(qū)別于鏈球 菌的某個(gè)種的序列的核巧酸數(shù)量在兩個(gè)值之間的范圍內(nèi)的原因。
[0020] 發(fā)明人因此已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，利用如由SEQ IDN21和SEQ IDN22定義的探針同時(shí) 溫育允許檢測(cè)肺炎鏈球菌并且特異性地區(qū)分肺炎鏈球菌與鏈球菌屬的其他種。因此，SEQ IDN^l和SEQ IDN22的探針的同時(shí)使用提供了對(duì)于樣品中肺炎鏈球菌的特異性檢測(cè)的問 題的解決方案。運(yùn)對(duì)于將肺炎鏈球菌與其他微生物相區(qū)分是非常重要的;尤其是，與宿主中 組成性地存在的并且不引起疾病的無(wú)害鏈球菌種(尤其是呼吸道中的）相區(qū)分。運(yùn)對(duì)于作為 脈毒癥的致病劑存在于血液中的肺炎鏈球菌的檢測(cè)來(lái)說(shuō)也是重要的。
[0021] 本發(fā)明的方面之一因此對(duì)應(yīng)于一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品中肺炎鏈球菌的方法，所述 方法包括使所述樣品與由SEQ IDN-91和SEQ IDN92定義的探針接觸。探針可W設(shè)置在微陣 列中。
[0022] 本發(fā)明的第二方面對(duì)應(yīng)于一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品中肺炎鏈球菌的試劑盒，其中所 述試劑盒包含一個(gè)陣列容器或一組陣列容器，其各自包含其中設(shè)置SEQ ID神η和SEQ ID N22的探針的微陣列。
[0023] 本發(fā)明的第Ξ和第四方面分別對(duì)應(yīng)于探針組，所述探針組包括探針SEQ IDN^l和 SEQ IDN22,并且對(duì)應(yīng)于一種微陣列，所述微陣列包含該探針組。另一個(gè)方面設(shè)及由SEQ ID N21組成的分離的核酸序列并且設(shè)及包含SEQ IDN21的微陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的 核酸序列用可檢測(cè)部分標(biāo)記。另一個(gè)方面設(shè)及由SEQ 10^^嗎組成的分離的核酸序列并且設(shè) 及包含SEQ IDN22的微陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸序列用可檢測(cè)部分標(biāo)記。另一 個(gè)方面設(shè)及包含沈Q IDN^I和/或沈Q IDN?2的組合物。
[0024] 本發(fā)明的另外的方面對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的方法、試劑盒、微陣列、分離的核酸序列或探 針組用于檢測(cè)肺炎鏈球菌W及用于診斷患者中由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的感染的用途。尤其是， 感染是脈毒性感染或呼吸道感染。
[0025] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及一種用于診斷患者中由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的感染的方 法，所述方法包括使來(lái)自所述患者的樣品與由SEQ IDN^l和SEQ IDN02定義的探針接觸。
[0026] 附圖簡(jiǎn)述
[0027] 圖1.
[0028] 圖1示出了本發(fā)明的實(shí)施例1的擴(kuò)增產(chǎn)物(事先變性)與具有包含本發(fā)明的SEQ ID N21和SEQ IDN22的探針的微陣列雜交的可視化。
[0029] 被矩形包圍的"斑點(diǎn)"對(duì)應(yīng)于SEQ IDN21和SEQ IDN92的探針的位置。在被每個(gè)矩 形包圍的兩個(gè)"斑點(diǎn)"中，第一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ IDN21，并且第二個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ IDN22。矩形外 顯示信號(hào)的"斑點(diǎn)"對(duì)應(yīng)于位置標(biāo)記物。
[0030] 含有肺炎鏈球菌的實(shí)施例1的樣品在對(duì)應(yīng)于SEQ IDlsfl和SEQ 的探針的兩 個(gè)位置處顯示陽(yáng)性信號(hào)并且具有相等的強(qiáng)度。運(yùn)歸因于樣品的擴(kuò)增并變性的DNA與運(yùn)兩種 探針的特異性結(jié)