0%蔗糖，10mg/L賴 氨酸，lmg/L胰蛋白酶抑制劑，作為校準(zhǔn)品。
[0091] 測定人血清或血漿中的脂蛋白（a)含量的方法：
[0092] 利用抗原和抗體反應(yīng)的特性，先將樣品預(yù)處理劑和樣本混合，于37°C孵育5分鐘， 使血清或血漿中的脂蛋白（a)抗原位點(diǎn)充分暴露出來；當(dāng)加入檢測劑中的鼠抗人脂蛋白 (a)單克隆抗體致敏的膠乳顆粒，抗體包被的膠乳與樣本中的脂蛋白（a)發(fā)生抗原和抗體 反應(yīng)，形成不溶的抗原抗體復(fù)合物，并產(chǎn)生一定的濁度，濁度與樣本中脂蛋白（a)的含量成 一定比例關(guān)系，在505nm主波長處測定吸光度，最后通過與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較和計(jì)算，從而 得出樣本中脂蛋白（a)的濃度。
[0093] 脂蛋白（a)試劑測定方法：
[0094] 采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，檢測波長為505nm。樣品預(yù)處理劑和檢測劑的用量分別為 200 μ 1和100 μ 1。樣本用量為3 μ 1 ;上升反應(yīng)，測定溫度為37°C。樣本與樣品預(yù)處理混勻 后，置37°C孵育3~5分鐘，讀取第一次吸光度；然后加入檢測劑，反應(yīng)5min后讀取第二次 吸光度。
[0095] 實(shí)施例1.抗-Lp (a)單抗的篩選
[0096] 對購得的抗_Lp (a)作篩選，具體如下：
[0097] 1.免疫雙擴(kuò)散檢定抗-Lp(a)單抗的特異性：將各單抗用生理鹽水統(tǒng)一稀釋至 0. 5mg/ml的蛋白濃度，加在梅花孔的中心孔，周圍六孔取去脂血漿樣本分別進(jìn)行1/2、1/4、 1/8、1/16、1/32稀釋，考察各單抗與去脂人血漿樣本反應(yīng)的特異性。
[0098] 結(jié)果如圖1所示，該抗體可以達(dá)到1/8稀釋倍數(shù)的效價(jià)，符合相應(yīng)靈敏度的要求。
[0099] 2.篩選：選擇同一粒徑的聚苯乙烯粒子，分別包被不同單抗，考察與校準(zhǔn)品的反 應(yīng)狀況。具體結(jié)果見表一：
[0100] 表一
[0101]
[0102](注：上表中 O.D.值為 1/lOmA。S0-S4 的定值依次為：0.0,220mg/L，290mg/L， 410mg/L，720mg/L)
[0103] 上述結(jié)果顯示，同一粒徑的粒子，包被同一包被量的單抗，以單抗3和單抗4的 Λ 0. D.為最高，取單抗3和單抗4做進(jìn)一步篩選。具體做法如下：分別取相同包被量的單 抗3和單抗4包被的膠乳試劑，考核反應(yīng)狀況。測定結(jié)果見表二。
[0104] 表二
[0105]
[0106] (注：上表中 O.D.值為 1/lOmA。S0-S5 的定值依次為：0.0,81mg/L，162mg/L， 324mg/L,648mg/L,810mg/L)
[0107] 測定結(jié)果顯示，與單抗4相比，單抗3具有更好的靈敏度和線性。
[0108] 3.批間確認(rèn)：不同批單抗3的測定結(jié)果比較。
[0109] 購買的不同批號的單抗3經(jīng)免疫雙擴(kuò)散檢定特異性合格，然后以相同工藝包被 后，不同批次的單抗3進(jìn)行比較，測定結(jié)果見表三。
[0110] 表三
[0111]
[0112] 測定結(jié)果顯示，兩批不同批次單抗3定標(biāo)結(jié)果以批1為X軸，以批2結(jié)果為Y軸， 兩者的相關(guān)性方程為：y = 〇. 9843x+155. 51 ;r = 0. 9943。兩批單抗測定結(jié)果之間一致性良 好。
[0113] 根據(jù)上述結(jié)果，基本確認(rèn)單抗3的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。
[0114] 4.單抗3的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：
[0115] 蛋白濃度：雙縮脲法測定蛋白濃度，不得低于lmg/ml。
[0116] 功能性測定：純化單抗包被于膠乳粒子上，測定結(jié)果必須滿足要求：測定濃度為 50±10mg/L的樣本時(shí)，在波長為505nm時(shí)吸光度變化（Λ 0· D.)應(yīng)大于等于0· 010A。
[0117] 實(shí)施例2.脂蛋白（a)定量測定試劑盒的制備和測定方法
[0118] 1.主要試劑和參考標(biāo)準(zhǔn)配制如下：
[0119] L 1脂蛋白（a)定量測定試劑盒樣品預(yù)處理劑配制：
[0120] 氯化鈉 250 niΜ HEPES 50 mM BSA 1.0% PEG8000 1.2% 葡聚糖 1.0% 吐溫-20 0.1% I丨丨丨拉Μ-100 0.1% Proclin-300 0 05%
[0121] pH 7. 4
[0122] 2.脂蛋白（a)定量測定試劑盒檢測劑制備：
[0123] 2. 1檢測劑中200nm膠乳粒子制備：
[0124] (1)取200nm膠乳粒子（10mg，10% )用MES緩沖液（pH 5. 0、50mM)洗滌離心一次， 加 0· 4ml MES(pH 5. 0、50mM)分散；
[0125] (2)加入 EDC 溶液（10mg/ml、0. 05ml)和 NHS 溶液（10mg/ml、0. 06ml)于 37°C混懸 反應(yīng)lh ;
[0126] (3)離心去除上清，用MES緩沖液（pH 5. 0、50mM)洗滌2次，再用HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)洗滌一次并加入0. 5ml HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)充分分散；
[0127] (4)加入鼠抗脂蛋白（a)單克隆抗體（lmg/ml，0. 5ml)于膠乳懸浮液中，于37°C混 懸反應(yīng)4h ;
[0128] (5)離心去除上清，用HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)洗滌3次，充分懸浮；
[0129] (6)加入甘氨酸溶液（2M、0.07ml)和乙醇胺（1M、0. 14ml)，于37°C混懸反應(yīng) 30min ；
[0130] (7)加入BSA溶液（200mg/ml、0. 1ml)，于4°C混懸反應(yīng)過夜；
[0131] (8)離心去除上清，并用50mM、pH 8.0HEPES緩沖液（含1.0%83厶、0.2%吐溫-20、 0· 15% 曲拉通-100、0· 03% Proclin-300)洗滌 3 次；
[0132] (9)最終加入50mM、pH8·0HEPES緩沖液（含l·0%BSA、0·2%吐溫-20、0·15%曲 拉通-100、0. 03% Proclin-300)定容至致敏膠乳粒子終濃度為0. 2%。
[0133] 2· 2檢測劑中105nm膠乳粒子的制備：
[0134] (1)取105nm膠乳粒子（10mg，10% )用MES緩沖液（pH 5. 0、50mM)洗滌離心一次， 加 0· 4ml MES(pH 5. 0、50mM)分散；
[0135] (2)加入 EDC 溶液（10mg/ml，0. 1ml)和 NHS 溶液（10mg/ml、0. 12ml)于 37°C混懸 反應(yīng)lh ;
[0136] (3)離心去除上清，用MES緩沖液（pH 5. 0、50mM)洗滌2次，再用HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)洗滌一次并加入0. 5ml HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)充分分散；
[0137] (4)加入鼠抗脂蛋白（a)單克隆抗體（lmg/ml，1ml)于膠乳懸浮液中，于37°C混懸 反應(yīng)4h ;
[0138] (5)離心去除上清，用HEPES緩沖液（pH 8. 0、50mM)洗滌3次，充分懸浮；
[0139] (6)加入甘氨酸溶液（2M、0. 14ml)和乙醇胺（1M，0. 28ml)，于37°C混懸反應(yīng) 30min ；
[0140] (7)加入BSA溶液（200mg/ml、0. 2ml)，于4°C混懸反應(yīng)過夜；
[0141] (8)離心去除上清，并用50mM、pH 8.0HEPES緩沖液（含1.0%83厶、0.2%吐溫-20、 0· 15% 曲拉通-100、0· 03% Proclin-300)洗滌 3 次；
[0142] (9)最終加入50mM、pH8·0HEPES緩沖液（含l·0%BSA、0·2%吐溫-20、0·15%曲 拉通-100、0. 03% Proclin-300)定容至致敏膠乳粒子終濃度為0. 5%。
[0143] (10)將上述兩種粒子按50:50 (V/V)混合，制備成脂蛋白（a)定量測定試劑盒檢測 劑。
[0144] 2. 3脂蛋白（a)試劑校準(zhǔn)品制備：
[0145] 脂蛋白（a)高值人血漿按一定比例用去脂血漿稀釋，并添加10%蔗糖，10mg/L賴 氨酸，lmg/L胰蛋白酶抑制劑，最終稀釋成5個(gè)濃度梯度。分別為75mg/L，150mg/L，320mg/ L，460mg/L，900mg/L 其中 Omg/L 為生理鹽水。
[0146] 3.采用